PT2674494E

PT2674494E - Molécula de arn em cadeia simples com esqueleto licíclico contendo azoto

Info

Publication number: PT2674494E
Application number: PT131841785T
Authority: PT
Inventors: Tadaaki Ohgi; Hirotake Hayashi; Hisao Shirohzu; Tomohiro Hamasaki; Akihiro Itoh; Hiroshi Suzuki
Original assignee: Bonac Corp
Priority date: 2010-08-03
Filing date: 2011-07-28
Publication date: 2015-02-27
Also published as: JPWO2012017919A1; TW201219570A; ES2527660T3; JP4965745B2; KR20180040728A; HK1189910A1; ES2443346T3; JP2013034470A; CN104004018A; CN103052711B; KR20180040727A; JP5555346B2; EP2436767A1; EP2639307A8; EP2639307A2; EP2436767B1; WO2012017919A1; KR101849801B1; KR101894701B1; TWI515294B

Description

DESCRIÇÃO "Molécula de ARN em cadeia simples com esqueleto aliciclico contendo azoto"

Campo técnico 0 presente invento refere-se a uma molécula de ácido nucleico em cadeia simples que inibe expressão génica. Em particular, o presente invento refere-se a uma molécula de ácido nucleico em cadeia simples com um esqueleto aliciclico contendo azoto, uma composição contendo a molécula de ácido nucleico em cadeia simples e o uso da molécula de ácido nucleico em cadeia simples.

Especialidade prévia

Conhece-se ARN de interferência (ARNi), por exemplo como técnica para inibir expressão génica (Fire, et ai., Nature, 19 de Fevereiro de 1998; 391 (6669) : p. 806-811) . A inibição de expressão génica por ARN de interferência é em geral efectuada por administração de uma molécula de ARN em cadeia dupla curta a uma célula ou semelhante, por exemplo. A molécula de ARN em cadeia dupla é geralmente denominada ARNsi (ARN de interferência pequeno). Foi relatado que não só ARNsi, mas também uma molécula de ARN circular que se torna parcialmente em cadeia dupla por hibridação intermolecular pode também inibir expressão génica (publicação de patente U.S. No. 2004-058886). No entanto, as moléculas de ARN usadas nestas técnicas para induzir a inibição da expressão génica têm os seguintes problemas.

Primeiramente, de modo a produzir ARNsi, é necessário sintetizar uma cadeia em sentido e uma cadeia em anti-sentido separadamente e hibridar estas cadeias no final do processo. Assim, há um problema de baixa eficiência de fabrico. Além disso, quando se administra ARNsi a uma célula, é necessário administrar o ARNsi à célula, ao mesmo tempo que se inibe a dissociação em ARN em cadeia simples, o que requer a tarefa trabalhosa de estabelecer as condições para manusear o ARNsi. Por outro lado, a molécula de ARN circular tem um problema no facto da sua síntese ser difícil.

Estas moléculas de ARN são compostas basicamente por resíduos de nucleótido. Presentemente, de modo a conferir alguma função às moléculas de ARN ou para marcar as moléculas de ARN, não existe outra forma senão modificar qualquer dos seus componentes, i.e., uma base, um resíduo de açúcar ou um grupo fosfato do(s) resíduo (s) de nucleótido (s) . Assim, no desenvolvimento de fármacos e semelhantes que usam ARN de interferência, é muito difícil alterar as moléculas de ARN de modo a conferir-lhes uma função adicional ou para as marcar, mantendo a sua função de inibir a expressão génica.

Kumar et al, Organic Letters, vol.3, no.9, 1269-1272, 2001 relatam a síntese de análogos de ADN baseados em pirrolidina, quirais e carregados positivamente. Apresenta-se a síntese de (2S, 4S) e (2R, 4R) ácido timina-l-ilpirrolidina-N-acético, a sua incorporação específica de local em quimera PNA:ADN e PNA e o estudo das suas propriedades de ligação com sequências de ADN/ARN complementares. Lonkar e Kumar, Bioorg. Med. Chem. Lett. 14(2004), 2147-2149 relatam a concepção e síntese de novo PNA de piperidina quiral a partir de 4-hidroxi-L-prolina de ocorrência natural. Explora-se a reacção de expansão de anel estéreo-específica para obter o derivado de piperidina de seis lados a partir do derivado de pirrolidina de cinco lados para esta síntese. O PNA resultante constrangido conformacionalmente é usado para a síntese de meros mistos de PNA e o conceito é consubstanciado por estudos de UV-Tm dos complexos PNA2:ADN resultantes. WO 98/16550 refere-se a ácidos nucleicos peptídicos quirais que hibridam fortemente com ácidos nucleicos complementares e têm potencial como agentes anti-gene e anti-em sentido e ferramentas em biologia molecular. WO 03/068798 A2 refere-se a análogos de oligonucleótido que incluem moléculas de ácido nucleico proteicas (PNA). Os PNA são caracterizados por incluírem uma variedade de tipos de moléculas, tais como, por exemplo, ácidos nucleicos peptídicos de hidroxiprolina (HypNA) e ácidos nucleicos peptídicos de serina (SerNA). WO 2004/090108 refere-se a um agente ARNi compreendendo uma sequência em sentido e uma sequência em anti-sentido, em que o agente compreende uma modificação estabilizadora, tal como um grupo catiónico, e a sequência em anti-sentido tem como alvo um ARN expresso no rim. WO 2006/088490 refere-se a um ribonucleósido substituído com um grupo fosfonamidite na posição 3' . Em determinadas concretizações, a fosfonamidite é uma alquilfosfonamidite. WO 2006/088490 também se refere a um oligonucleótido em cadeia dupla compreendendo pelo menos uma ligação não fosfato. As ligações não fosfato representativas incluem ligações fosfonato, hidroxilamina, hidroxilo-hidrazinilo, amida e carbamato. Em determinadas concretizações, a ligação não fosfato é uma ligação fosfonato.

Sumário sucinto do invento

Tendo o exposto anteriormente em mente, é um objectivo do presente invento proporcionar uma nova molécula de ácido nucleico que pode ser produzida fácil e eficazmente e pode inibir expressão génica.

De modo a atingir o objectivo anterior, o presente invento proporciona uma molécula de ARN em cadeia simples compreendendo uma sequência de inibição de expressão que inibe a expressão de um gene alvo, em que: a molécula compreende: uma região (Xc), uma região ligante (Lx) e uma região (X); a região (X) compreende a sequência de inibição de expressão; a região (Xc) é complementar à região (X); e a região ligante (Lx) é representada pela seguinte fórmula (I) :

em que: X1 e X2 são cada independentemente H2, 0, S ou NH; Y1 e Y2 são cada independentemente uma ligação simples, CH2, NH, 0 ou S; R3 é um átomo de hidrogénio ou substituinte que está ligado a C-3, C-4, C-5 ou C-6 num anel A; L1 é uma cadeia alquileno composta por n átomos e um átomo de hidrogénio num átomo de carbono de alquileno pode ou não ser substituído por OH, 0Ra, NH2, NHRa, NRaRb, SH ou SRa, ou L1 é uma cadeia de poliéter obtida por substituição de pelo menos um átomo de carbono na cadeia de alquileno por um átomo de oxigénio, desde que: quando Y1 é NH, 0 ou S, um átomo ligado a Y1 em L1 é carbono, um átomo ligado a OR1 em L1 é carbono e os átomos de oxigénio não são adjacentes entre si; L2 é uma cadeia de alquileno composta por m átomos e um átomo de hidrogénio num átomo de carbono de alquileno pode ou não ser substituído por OH, 0RC, NH2, NHRC, NRcRd, SH ou SRC, ou L2 é uma cadeia de poliéter obtida por substituição de pelo menos um átomo de carbono na cadeia de alquileno por um átomo de oxigénio, desde que: quando Y2 é NH, 0 ou S, um átomo ligado a Y2 em L2 é carbono, um átomo ligado a OR2 em L2 é carbono e os átomos de oxigénio não são adjacentes entre si;

Ra, Rb, Rc e Rd são cada independentemente um substituinte ou um grupo protector; 1 é 1 ou 2; m é um número inteiro na gama de 0 a 30; n é um número inteiro na gama de 0 a 30; as regiões (Xc) e (X) estão cada ligadas à região ligante (Lx) através de -OR1- ou -OR2-; e R1 e R2 podem estar ou não presentes e, quando estão presentes, R1 e R2 são cada um independentemente um resíduo de nucleótido ou a estrutura da fórmula (I). O presente invento também proporciona uma composição para inibir a expressão de um gene alvo. A composição contém a molécula de ARN em cadeia simples de acordo com o presente invento. O presente invento também proporciona uma composição farmacêutica contendo a molécula de ARN em cadeia simples de acordo com o presente invento. O presente invento também proporciona um método in vitro para inibir a expressão de um gene alvo, em que o método compreende o uso da molécula em cadeia simples de acordo com o presente invento, de ARN em que opcionalmente o método compreende administrar a molécula em cadeia simples a uma célula, um tecido ou um órgão in vitro; ou a expressão do gene alvo é inibida por indução do ARN de interferência. O presente invento também proporciona uma molécula de ARN para uso num método para tratar uma doença, em que: a molécula de ARN é a molécula de ARN em cadeia simples de acordo com o presente invento; e a molécula de ARN em cadeia simples inclui, como sequência de inibição de expressão, que inibe expressão de um qene que causa a doença.

Usando a molécula de ARN em cadeia simples do presente invento é possível inibir a expressão de um gene. Adicionalmente, dado que a molécula de ARN em cadeia simples não é circular, pode ser sintetizada facilmente. Igualmente, dado que é uma cadeia simples, não é preciso uma etapa de hibridação necessária na produção de uma cadeia dupla, de modo que pode ser produzida eficazmente. Além disso, dado que a região ligante inclui nucleótido(s) que não é(são) resíduo(s) de nucleótidos, tornam-se possíveis não apenas alterações convencionais a resíduos de nucleótido, por exemplo, mas também alterações tais como, por exemplo, a modificação da região ligante.

Foram os inventores do presente invento que verificaram pela primeira vez que a expressão génica pode ser inibida de acordo com a estrutura da molécula de ARN em cadeia simples do presente invento. Especula-se que o efeito de inibição génica da molécula de ARN em cadeia simples do presente invento é causado por um fenómeno semelhante a interferência de ARN. Deve salientar-se contudo que a inibição da expressão génica no presente invento não se limita, nem restringe a interferência de ARN.

Descrição sucinta dos esquemas [FiG.l] A figura 1 apresenta representações esquemáticas ilustrativas de um exemplo de uma molécula de ARN em cadeia simples do presente invento.

[FiG.2] A figura 2 apresenta representações esquemáticas ilustrativas de um exemplo da molécula de ARN em cadeia simples do presente invento.

[FiG.3] A figura 3 apresenta representações esquemáticas ilustrativas de outros exemplos da molécula de ARN em cadeia simples do presente invento.

[FiG.4] A figura 4 é um gráfico que apresenta o nivel de expressão relativa do gene GAPDH num exemplo do invento.

[FiG.5] A figura 5 é um electroforetograma que apresenta a estabilidade noutro exemplo do invento.

[FiG.6 ] A figura 6 é um gráfico que apresenta o nivel de expressão relativa do gene GAPDH ainda noutro exemplo do presente invento.

[FiG.7] A figura 7 apresenta os resultados de electroforese, que indicam a reactividade de uma proteína Dicer com ARN em cadeia simples ainda noutro exemplo do presente invento.

[FiG.8] A figura 8 é um gráfico que apresenta o nível de expressão relativa do gene GAPDH em células A549 ainda noutro exemplo do presente invento.

[FiG.9] A figura 9 é um gráfico que apresenta o nível de expressão relativa do gene GAPDH em células 293 no exemplo do presente invento.

[FiG.10] A figura 10 é um gráfico que apresenta o nível de expressão relativa do gene GAPDH em células HCT116 ainda noutro exemplo do presente invento.

[FiG.ll] A figura 11 é um gráfico que apresenta o nível de expressão relativa do gene GAPDH em células HCT116 ainda noutro exemplo do presente invento.

[FiG.12] A figura 12 é um gráfico que apresenta o nível de expressão relativa do gene TGF- 1 ainda noutro exemplo do presente invento.

[FiG.13] A figura 13 é um gráfico que apresenta o nível de expressão de TGF- 1 por unidade de peso pulmonar em cada grupo de administração ainda noutro exemplo do presente invento.

[FiG.4] A figura 14A é um gráfico que apresenta a quantidade de TNF- numa amostra BALF em cada grupo de administração no exemplo do presente invento. A figura 14B é um gráfico que apresenta a quantidade de IFN- numa amostra BALF em cada grupo de administração no exemplo do presente invento.

[FiG.15] A figura 15 é um electroforetograma que apresenta resistência a ribonuclease ainda noutro exemplo do presente invento.

[FiG.16] A figura 16 é um electroforetograma que apresenta resistência a nuclease S7 ainda noutro exemplo do presente invento.

[FiG.17] A figura 17 apresenta ARN em cadeia simples usados num exemplo de referência.

[FiG.18] A figura 18 é um gráfico que apresenta o nivel de expressão relativa do gene GAPDH no exemplo de referência.

[FiG.19] A figura 19 é um gráfico que apresenta o nivel de expressão relativa do gene TGF 1 noutro exemplo de refêBcia.

[FiG.20] A figura 20 é um gráfico que apresenta o nivel de expressão relativa do gene LAMA1 ainda noutro exemplo de referência.

[FiG.21] A figura 21 é um gráfico que apresenta o nivel de expressão relativa do gene LMNA ainda noutro exemplo de referência.

[FiG.22] A figura 22 apresenta ARN em cadeia simples usados ainda noutro exemplo de referência.

[FiG.23] A figura 23 é um gráfico que apresenta o nivel de expressão relativa do gene GAPDH no exemplo de referência.

Modo para levar o invento à prática

As expressões usadas no presente fascículo têm o significado usado geralmente na especialidade, salvo indicação em contrário.

1. Molécula ssPN A molécula de ARN em cadeia simples do presente invento é, tal como descrito anteriormente, uma molécula de ARN em cadeia simples incluindo: uma sequência de inibição de expressão que inibe expressão de um gene alvo. A molécula em cadeia simples de ARN inclui: uma região (X); uma região ligante (Lx); uma região interna (Xc) . A região ligante (Lx) está ligada entre as regiões (Xc) e (Xc) . A região (X) inclui a sequência de inibição de expressão.

No presente invento, "inibição de expressão de um gene alvo" significa interrupção da expressão do gene alvo, por exemplo. 0 mecanismo pelo qual se consegue inibição não é limitado em particular e pode ser regulação negativa ou silenciamento, por exemplo. A inibição da expressão do gene alvo pode ser verificada por: uma diminuição da quantidade de um produto de transcrição derivado do gene alvo; uma diminuição da actividade do produto de transcrição; uma diminuição da quantidade de um produto de tradução gerado a partir do gene alvo; uma diminuição da actividade do produto de tradução; ou semelhantes, por exemplo. As proteínas podem ser proteínas maduras, proteínas precursoras antes de serem sujeitas a processamento ou modificação pós-tradução, ou semelhantes, por exemplo. A molécula de ARN em cadeia simples do presente invento doravante também pode ser denominada "molécula ssPN" do presente invento. A molécula ssPN do presente invento pode ser usada para inibir a expressão de um gene alvo in vivo ou in vitro, por exemplo, de modo que também pode ser denominada uma "molécula ssPN para inibir a expressão de um gene alvo" ou "inibidor da expressão de um gene alvo". Além disso, a molécula ssPN do presente invento pode inibir a expressão de um gene alvo, por exemplo, por interferência de ARN, de modo que também pode ser denominada uma "molécula ssPN para interferência de ARN", "molécula ssPN para indução de interferência de ARN" ou "agente de interferência de ARN ou agente de indução de interferência de ARN". Além disso, de acordo com o presente invento, é possível inibir um efeito secundário, tal como indução de interferão, por exemplo.

Na molécula ssPN do presente invento, a extremidade 5' e a extremidade 3' não estão ligadas entre si. Assim, a molécula ssPN do presente invento também pode ser denominada uma "molécula de ácido nucleico linear em cadeia simples".

Na molécula ssPN do presente invento, a sequência de inibição de expressão é uma sequência que apresenta uma actividade de inibir a expressão de um gene alvo quando se introduz a molécula ssPN do presente invento numa célula in vivo ou in vitro, por exemplo. A sequência de inibição de expressão não é particularmente limitada e pode ser estabelecida como adequado dependendo do tipo de gene alvo cuja expressão se pretende inibir. Como sequência de inibição de expressão, pode usar-se por exemplo uma sequência envolvida em ARN de interferência causada por ARNsi, tal como adequado. Em geral, a interferência de ARN é um fenómeno no qual um ARN longo em cadeia dupla (ARNds) é clivado numa célula por Dicer para produzir um ARN em cadeia dupla (ARNsi: ARN de interferência pequeno) composto por cerca de 19 a 21 pares de bases e com uma extremidade 3' protuberante e um dos ARN em cadeia simples que constitui o ARNsi liga-se a um ARNm alvo para degradar o ARNm, pelo que a tradução de ARNm é inibida. Como sequência do ARN em cadeia simples do ARNsi que se liga ao ARNm alvo, foram relatados vários tipos de sequências para vários tipos de genes alvo, por exemplo. No presente invento, por exemplo, a sequência do ARN em cadeia simples do ARNsi pode ser usada como a sequência de inibição de expressão.

Deve salientar-se que o fulcro do presente invento não é a informação de sequência da sequência de inibição de expressão para o gene alvo. De facto, o presente invento refere-se à estrutura de uma molécula de ácido nucleico para permitir conferir uma actividade de inibição de gene alvo pela sequência de inibição de expressão para funcionar numa célula, por exemplo. Assim, no presente invento, podem usar-se não só as sequências do ARN em cadeia simples do ARNsi conhecidas na altura de apresentação do presente pedido, mas também sequências que serão identificadas no futuro como a sequência de inibição de expressão, por exemplo. A sequência de inibição de expressão de preferência é pelo menos 90% complementar, com maior preferência 95% complementar, ainda com maior preferência 98% complementar e especialmente de preferência 100% complementar a uma região predeterminada do gene alvo, por exemplo. Quando a sequência de inibição de expressão satisfaz a complementaridade descrita anteriormente, pode reduzir-se suficientemente um efeito fora do alvo, por exemplo.

Seguidamente apresentam-se exemplos específicos da sequência de inibição de expressão: quando o gene alvo é o gene GAPDH, pode usar-se, por exemplo, uma sequência de 19 meros apresentada em SEQ ID NO: 4; quando o gene alvo é o gene TGF- 1 pode usar-se, por exemplo, uma sequência de 21 meros apresentada em SEQ ID NO: 18; quando o gene alvo é o gene LAMA1 pode usar-se, por exemplo, uma sequência de 19 meros apresentada em SEQ ID NO: 6; e quando o gene alvo é o gene LMNA, pode usar-se, por exemplo, uma sequência de 19 meros apresentada em SEQ ID NO: 30. 5' -GUUGUCAUACUUCUCAUGG-3' (SEQ ID NO: 4) 5' -AAAGUCAAUGUACAGCUGCUU-3' (SEQ ID NO: 18) 5' -AUUGUAACGAGACAAACAC-3' (SEQ ID NO: 6) 5' -UUGCGCUUUUUGGUGACGC-3' (SEQ ID NO: 30)

Especula-se que a inibição da expressão de um gene alvo pela molécula ssPN do presente invento é conseguida por interferência de ARN. Deve contudo salientar-se que o presente invento não está de forma alguma limitado a este mecanismo.

Contrariamente ao denominado ARNsi, a molécula ssPN do presente invento não é introduzida numa célula ou semelhante sob a forma de ARNds composto por dois ARN em cadeia simples e nem sempre é necessário clivar a sequência de inibição de expressão na célula, por exemplo. Assim, pode afirmar-se que a molécula ssPN do presente invento apresenta, por exemplo, uma função do tipo de interferência de ARN. A molécula ssPN do presente invento pode inibir um efeito secundário, tal como indução de interferão in vivo e apresenta excelente resistência a nuclease, por exemplo.

Na molécula ssPN do presente invento, a região ligante é representada, por exemplo, pela fórmula (I) seguinte.

Na fórmula (I), por exemplo, X1 e X2 são cada independentemente H2, 0, S ou NH; Y1 e Y2 são cada independentemente uma ligação simples, CH2, NH, 0 ou S; R3 é um átomo de hidrogénio ou substituinte que está ligado a C-3, C-4, C-5 ou C-6 num anel A; L1 é uma cadeia alquileno composta por n átomos, e o(s) átomo(s) de hidrogénio no(s) átomo(s) de carbono num alquileno pode (m) ou não ser substituído (s) por OH, 0Ra, NH2, NHRa, NRaRb, SH ou SRa, ou, L1 é uma cadeia poliéter obtida por substituição de pelo menos um átomo de carbono da cadeia alquileno por um átomo de oxigénio, desde que: quando Y1 é NH, 0 ou S, um átomo ligado a Y1 em L1 é carbono, um átomo ligado a OR1 em L1 é carbono e os átomos de oxigénio não são adjacentes entre si; L2 é uma cadeia alquileno composta por m átomos e o(s) átomo(s) de hidrogénio no(s) átomo(s) de carbono do alquileno podem ou não ser substituídos por OH, 0RC, NH2, NHRC, NRcRd, SH ou SRc, ou L2 é uma cadeia poliéter obtida por substituição de pelo menos um átomo de carbono na cadeia alquileno por um átomo de oxigénio, desde que: quando Y2 é NH, 0 ou S, um átomo ligado a Y2 em L2 é carbono, um átomo ligado a OR2 em L2 é carbono e os átomos de oxigénio não são adjacentes entre si;

Ra, Rb, Rc e Rd são cada independentemente um grupo substituinte ou um grupo protector; 1 é 1 ou 2; m é um número inteiro na gama de 0 a 30; n é um número inteiro na gama de 0 a 30; as regiões (Xc) e (X) estão cada ligadas à região ligante (Lx) através de -OR1- ou -OR2-; e R3 e R2 podem estar ou não presentes e, quando estão presentes, R1 e R2 são cada independentemente um resíduo de nucleótido ou a estrutura da fórmula (I).

Na fórmula (I), X1 e X2 são cada independentemente fb, O, S ou NH, por exemplo. Na fórmula (I), "X1 é H2" significa que X1 forma CH2 (um grupo metileno) conjuntamente com um átomo de carbono ao qual se liga X1. O mesmo se aplica a X2.

Na fórmula (I), Y1 e Y2 são cada independentemente uma ligação simples, CH2, NH, O ou S.

Na fórmula (I), 1 no anel A é 1 ou 2. Quando 1 = 1, o anel A é um anel de cinco lados que é, por exemplo, o esqueleto pirrolidina. O esqueleto pirrolidina é, por exemplo, um esqueleto prolina, um esqueleto prolinol ou semelhante e os exemplos específicos incluem estruturas divalentes do esqueleto prolina e do esqueleto prolinol. Quando 1= 2, o anel A é um anel de seis lados que é, por exemplo, o esqueleto piperidina. O anel A pode estar na forma L ou na forma D, por exemplo.

Na fórmula (I), R3 é um átomo de hidrogénio ou substituinte que está ligado a C-3, C-4, C-5 ou C-6 no anel A. Quando R3 é um substituinte, pode haver mais do que um substituinte R3, dois ou mais subst ituintes R3, ou nenhum substituinte R3, e quando há vários substituintes R3, eles podem ser iguais ou diferentes. 0 substituinte R3 é, por exemplo, um halogénio, OH, OR4, NH2, NHR4, NR4R5, SH, SR4, um grupo oxo (=0) ou semelhantes. R4 e R5 são cada qual um grupo substituinte ou um grupo protector e podem ser iguais ou diferentes. Os exemplos de substituintes incluem halogénios, alquilos, alcenilos, alcinilos, aloalquilos, arilos, heteroarilos, arilalquilos, cicloalquilos, cicloalcenilos, cicloalquilalquilos, ciclilalquilos, hidroxialquilos, alcoxialquilos, aminoalquilos, heterociclilalcenilos, heterociclilalquilos, heteroarilalquilos, sililos e sililoxialquilos. 0 mesmo se aplica doravante. 0 substituinte R3 pode ser qualquer dos substituintes listados anteriormente. 0 grupo protector é um grupo funcional que inactiva um grupo funcional altamente reactivo, por exemplo. Os exemplos do grupo protector incluem grupos protectores conhecidos. Relativamente ao grupo protector, pode encontrar-se a descrição na literatura (J. F. W. McOmie, "Protecting Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, London e New York, 1973), por exemplo. 0 grupo protector não é especialmente limitado e os seus exemplos incluem um grupo terc-butildimetilsililo (TBDMS), um grupo bis(2-acetoxietiloxi)metilo (ACE), um grupo tri-isopropilsililoximetilo (TOM), um grupo 1- (2- cianoetoxi)etilo (CEE), um grupo 2-cianoetoximetilo (CEM), um grupo tolilsulfoniletoximetilo (TEM) e um grupo dimetoxitritilo (DMTr). Quando R3 é OR4, o grupo protector não é especialmente limitado e os seus exemplos incluem um grupo TBDMS, um grupo ACE, um grupo TOM, um grupo CEE, um grupo CEM e um grupo TEM. Outros exemplos do grupo protector incluem grupos contendo sililo representados pela fórmula a ser apresentada no parágrafo [0275]. 0 mesmo se aplica doravante.

Na fórmula (I), L1 é uma cadeia alquileno composta por n átomos. Um ou mais átomos de hidrogénio num ou mais átomos de carbono de alquileno podem ou não ser substituídos por OH, 0Ra, NH2, NHRa, NRaRb, SH ou SRa, por exemplo. Alternativamente, L1 pode ser uma cadeia poliéter obtida por substituição de pelo menos um átomo de carbono na cadeia alquileno por um átomo de oxigénio. Uma cadeia poliéter é, por exemplo, polietilenoglicol. Quando Y1 é NH, 0 ou S, um átomo ligado a Y1 em L1 é carbono, um átomo ligado a OR1 em L1 é carbono e os átomos de oxigénio não são adjacentes entre si. Isto é, por exemplo, quando Y1 é 0, este átomo de oxigénio e o átomo de oxigénio em L1 não são adjacentes entre si e o átomo de oxigénio em OR1 e o átomo de oxigénio em L1 não são adjacentes entre si.

Na fórmula (I), L2 é uma cadeia alquileno composta por m átomos. Um ou mais átomos de hidrogénio de um ou mais átomos de carbono de alquileno podem ou não ser substituídos por OR, 0RC, NH2, NHRC, NRcRd, SH ou SRC, por exemplo. Alternativamente, L2 pode ser uma cadeia poliéter obtida por substituição de pelo menos um átomo de carbono na cadeia alquileno por um átomo de oxigénio. Quando Y2 é NH, 0 ou S, um átomo ligado a Y2 em L2 é carbono, um átomo ligado a OR2 em L2 é carbono e os átomos de oxigénio não são adjacentes entre si. Isto é, por exemplo, quando Y2 é 0, este átomo de oxigénio e o átomo de oxigénio em L2 não são adjacentes entre si e o átomo de oxigénio em OR2 e o átomo de oxigénio em L2 não são adjacentes entre si. n de L1 e m de L2 não são especialmente limitados e o limite inferior de cada um deles pode ser 0, por exemplo, e o limite superior dos mesmos não é especialmente limitado, nem podem ser considerados adequados dependendo do comprimento pretendido para a região ligante (Lx), por exemplo. Por exemplo, do ponto de vista do custo de fabrico, rendimento e semelhantes, nem são cada de preferência 0 a 30, com maior preferência 0 a 20 e ainda com maior preferência 0 a 15. n e m podem ser iguais (n = m) ou diferentes, n + m é, por exemplo, 0 a 30, de preferência 0 a 20 e com maior preferência 0 a 15.

Ra, Rb, Rc e Rd são, por exemplo, cada independentemente um grupo substituinte ou um grupo protector. O grupo substituinte e o grupo protector são iguais tal como descrito anteriormente, por exemplo.

Na fórmula (I), cada átomo de hidrogénio independentemente pode ser substituídos por um halogénio tal como Cl, Br, F ou 1, por exemplo.

As regiões (Xc) e (X) estão cada qual ligadas à região ligante (Lx) através de -OR1- ou -OR2-, por exemplo. R1 e R2 podem ou não estar presentes. Quando R1 e R2 estão presentes, R1 e R2 são cada independentemente um resíduo de nucleótido ou a estrutura representada pela fórmula (I). Quando R1 e/ou R2 é um resíduo de nucleótido, a região ligante (Lx) é composta pelo resíduo não nucleotídico com a estrutura da fórmula (I) excluindo o resíduo de nucleótido R1 e/ou R2 e o(s) resíduo(s) de nucleótido, por exemplo. Quando R1 e/ou R2 é a estrutura representada pela fórmula (I), a estrutura da região ligante (Lx) é tal que, por exemplo, dois ou mais dos resíduos não nucleotídicos com a estrutura da fórmula (I) estão ligados entre si. 0 número das estruturas da fórmula (I) pode ser 1, 2, 3 ou 4, por exemplo. Quando a região ligante (Lx) inclui várias estruturas, as estruturas da fórmula (I) podem estar ligadas entre si directamente ou através do(s) resíduo(s) de nucleótido(s), por exemplo. Por outro lado, quando R1 e R2 não estão presentes, a região ligante (Lx) é composta por resíduo não nucleotídico com a estrutura da fórmula (I) apenas, por exemplo. A combinação das regiões (Xc) e (X) com -OR1- e -OR2- não é especialmente limitada e pode ser qualquer das seguintes condições, por exemplo.

Condição (1): as regiões (Xc) e (X) estão ligadas à estrutura da fórmula (I) através de -OR2- e -OR1-, respectivamente.

Condição (2): as regiões (Xc) e (X) estão ligadas à estrutura da fórmula (I) através de -OR1- e -OR2-, respectivamente.

Os exemplos da estrutura da formula (I) incluem as estruturas das seguintes formulas (I — 1) a (1-9) . Nas seguintes formulas, n e m são iguais aos da formula (I) . Nas seguintes fórmulas q é um número inteiro de 0 a 10.

Nas fórmulas (I — 1) a (1-9), n, m e q não são especialmente limitados e são tal como descrito anteriormente. Os exemplos específicos são os seguintes: na fórmula (I — 1) , n = 8; na fórmula (1-2), n = 3; na fórmula (1-3), n = 4 ou 8; na fórmula (1-4), n = 7 ou 8; na fórmula (1-5), n = 3 e m = 4; na fórmula (1-6), n = 8 e m = 4; na fórmula (1-7), n = 8 e m = 4; na fórmula (1-8), n=5em=4; ena fórmula (1-9), q = 1 e m = 4. A fórmula seguinte (I-4a) apresenta um exemplo da fórmula (1-4) (n = 8) e a fórmula seguinte (I-8a) apresenta um exemplo da fórmula (1-8) (n = 5, m = 4).

Na molécula ssPN do presente invento, a região (Xc) é complementar à região (X). Assim, na molécula ssPN do presente invento, pode formar-se uma cadeia dupla por dobra da região (Xc) em direcção à região (X) e auto-hibridação das regiões (Xc) e (X) . A molécula ssPN do presente invento pode formar uma cadeia dupla intramolecularmente, tal como descrito anteriormente. Assim, a estrutura da molécula ssPN é totalmente diferente da estrutura de um ARN em cadeia dupla obtido por hibridação de dois ARN em cadeia simples independentes, tal como ARNsi usados convencionalmente em ARN de interferência, por exemplo.

Na molécula ssPN do presente invento, por exemplo, apenas a região (Xc) pode dobrar para formar uma cadeia dupla com a região (X) ou pode formar-se outra cadeia dupla noutra região. Doravante, a molécula ssPN anterior, i.e., a molécula ssPN na qual ocorre formação de cadeia dupla numa localização, denomina-se "primeira molécula ssPN" e a última molécula ssPN, i.e., a molécula ssPN na qual a formação de cadeia dupla ocorre em duas localizações, denomina-se "segunda molécula ssPN".

Apresentam-se seguidamente exemplos da primeira e segunda moléculas ssPN. Deve salientar-se contudo que o presente invento não está limitado a estes exemplos ilustrativos.

(1) Primeira molécula ssPN A primeira molécula ssPN é uma molécula incluindo a região (X), a região (Xc) e a região ligante (Lx), por exemplo. A primeira molécula ssPN pode incluir a região (Xc), a região ligante (Lx) e a região (X) nesta ordem do lado 5' para o lado 3' , ou pode incluir a região (Xc) , a região ligante (Lx) e a região (X) nesta ordem do lado 3' para o lado 5' , por exemplo.

Na primeira molécula ssPN, a região (Xc) é complementar à região (X) . Apenas é necessário que a região (Xc) tenha uma sequência complementar à região completa ou parte da região (X) . Preferentemente, a região (Xc) inclui ou é composta por uma sequência complementar à região completa ou parte da região (X) . A região (Xc) pode ser perfeitamente complementar à região completa ou parte da região (X) ou uma ou algumas bases na região (Xc) podem ser não complementares às mesmas, por exemplo.

Preferentemente, a região (Xc) é perfeitamente complementar à mesma. A expressão "uma ou algumas bases" significa, por exemplo, 1 a 3 bases, de preferência 1 base ou 2 bases.

Na primeira molécula ssPN, a sequência de inibição de expressão está incluída na região (X), tal como descrito anteriormente. A primeira molécula ssPN pode incluir uma sequência de inibição de expressão ou duas ou mais sequências de inibição de expressão, por exemplo.

No último caso, a primeira molécula ssPN pode incluir, por exemplo: duas ou mais sequências de inibição de expressão idênticas para o mesmo gene alvo; duas ou mais sequências de inibição de expressão diferentes para o mesmo gene alvo; ou duas ou mais sequências de inibição de expressão diferentes para genes alvo diferentes. Quando a primeira molécula ssPN inclui duas ou mais sequências de inibição de expressão, as posições das sequências de inibição de expressão respectivas não está especialmente limitada e pode ser na região (X) ou nas regiões (X) e (Xc). Quando a primeira molécula ssPN inclui duas ou mais sequências de inibição de expressão para genes alvo diferentes, a primeira molécula ssPN pode inibir as expressões de dois ou mais tipos de genes alvo diferentes, por exemplo. A figura 1 apresenta representações esquemáticas que ilustram um exemplo da primeira molécula ssPN. A figura IA é uma representação esquemática que apresenta a ordem das respectivas regiões na molécula ssPN, como um exemplo ilustrativo. A figura 1B é uma representação esquemática que apresenta o estado em que se forma uma cadeia dupla na molécula ssPN. Tal como apresentado na figura 1B, na molécula ssPN forma-se uma cadeia dupla entre as regiões (Xc) e (X) e a região Lx tem uma estrutura em ansa dependendo do seu comprimento. As representações esquemáticas apresentadas na figura 1 ilustram meramente a ordem pela qual as respectivas regiões estão ligadas e a relação de posição das regiões respectivas que formam a cadeia dupla e não limitam os comprimentos das respectivas regiões, a forma da região ligante (Lx) e semelhantes, por exemplo.

Na primeira molécula ssPN, o número de bases em cada uma das regiões (X) e (Xc) não é especialmente limitado. Os exemplos dos comprimentos das respectivas regiões apresentam-se seguidamente. No entanto, deve salientar-se que o presente invento não está de modo algum a tal limitado. No presente invento, "o número de bases" significa o "comprimento", por exemplo e também pode ser denominado "comprimento de bases". No presente invento, por exemplo, a gama numérica relativa ao número de bases divulga todos os números inteiros positivos dentro dessa gama. Por exemplo, a descrição "1 a 4 bases" divulga todos de "1, 2, 3 e 4 bases" (o mesmo se aplica doravante). A região (Xc) pode ser perfeitamente complementar à região completa da região (X), por exemplo. Neste caso, significa que, por exemplo, a região (Xc) é composta por uma sequência de bases complementares à região completa que se estende da extremidade 5' à extremidade 3' da região (X) . Por outras palavras, significa que a região (Xc) tem o mesmo comprimento de bases da região (X) e todas as bases na região (Xc) são complementares a todas as bases na região (X).

Além disso, a região (Xc) pode ser perfeitamente complementar a parte da região (X), por exemplo. Neste caso significa que, por exemplo, a região (Xc) é composta por uma sequência de bases complementar à parte da região (X) . Por outras palavras, significa que a região (Xc) é composta por uma sequência de bases cujo comprimento de bases é mais curto do que o comprimento de bases da região (X) em uma ou mais bases e todas as bases na região (Xc) são complementares a todas as bases na parte da região (X). A parte da região (X) de preferência é uma região com uma sequência de bases composta por bases sucessivas com inicio na base da extremidade (a Ia base) no lado da região (Xc), por exemplo.

Na primeira molécula ssPN, a relação entre o número de bases (X) na região (X) e o número de bases (Xc) na região (Xc) satisfaz a condição (3) ou (5), por exemplo. No caso anterior, especificamente, a seguinte condição (11) é satisfeita, por exemplo. X>Xc (3) X-Xc=l a 10, de preferência 1, 2 ou 3, com maior preferência 1 ou 2 (11) X= Xc (5) O número de bases na sequência de inibição de expressão é, por exemplo, 19 a 30, de preferência 19, 20 ou 21. Na (s) região(õs) incluindo a sequência de inibição de expressão, por exemplo, a sequência de inibição de expressão pode ter adicionalmente uma sequência adicional no seu lado 5' e/ou lado 3' . 0 número de bases na sequência adicional é, por exemplo, 1 a 31, de preferência 1 a 21 e com a maior preferência 1 a 11. 0 número de bases na região (X) não é especialmente limitado. 0 limite inferior do número de bases na região (X) é, por exemplo, 19 e o limite superior da mesma é, por exemplo, 50, de preferência 30 e com maior preferência 25. Especificamente, o número de bases na região (X) é, por exemplo, 19 a 50, de preferência 19 a 30 e com maior preferência 19 a 25. O número de bases na região (Xc) não é especialmente limitado. O limite inferior do número de bases na região (Xc) é, por exemplo, 19, de preferência 20 e com a maior preferência 21 e o limite superior da mesma é, por exemplo, 50, com maior preferência 40 e ainda com maior preferência 30.

Na molécula ssPN do presente invento, o comprimento da região ligante (Lx) não é especialmente limitado. O comprimento da região ligante (Lx) é de preferência tal que, por exemplo, as regiões (X) e (Xc) podem formar uma cadeia dupla. O comprimento total da primeira molécula ssPN não é especialmente limitado. Na primeira molécula ssPN, o limite inferior do número de bases do número total de bases (o número de bases na molécula ssPN completa) é, por exemplo, 38, de preferência 42, com maior preferência 50, ainda com maior preferência 51 e particularmente 30, de preferência 52 e o limite superior da mesma é, por exemplo, 300, de preferência 200, com maior preferência 150, ainda com maior preferência 100 e especialmente de preferência 80. Na primeira molécula ssPN, o limite inferior do número total de bases excluindo as da região ligante (Lx) é, por exemplo, 38, de preferência 42, com maior preferência 50, ainda com maior preferência 51 e especialmente de preferência 52 e o limite superior da mesma é, por exemplo, 300, de preferência 200, com maior preferência 150, ainda com maior preferência 100 e especialmente de preferência 80.

(2) Segunda molécula ssPN A segunda molécula ssPN é uma molécula que inclui adicionalmente uma região (Y) e uma região (Yc) que é complementar à região (Y), além da região (X), a região ligante (Lx) e a região (Xc), por exemplo. Na segunda molécula ssPN, uma região interior (Z) é composta pela região (X) e pela região (Y) que estão ligadas entre si. A descrição relativa à primeira molécula ssPN também se aplica à segunda molécula ssPN, salvo indicação em contrário. A segunda molécula ssPN pode incluir, por exemplo, a região (Xc), a região ligante (Lx), a região (X) , a região (Y) e a região (Yc) nesta ordem desde o lado 5' ao lado 3' . Neste caso, a região (Xc) também é denominada "região do lado 5' (Xc)"; a região (X) na região interior (Z) também é denominada "região interior do lado 5' (X) "; a região (Y) na região interior (Z) também é denominada "região interior 3' (Y)"; e a região (Yc) também é denominada uma "região do lado 3' (Yc)".

Alternativamente, a segunda molécula ssPN pode incluir, por exemplo, a região (Xc), a região ligante (Lx), a região (X), a região (Y) e a região (Yc), nesta ordem desde o lado 3' para o lado 5' . Neste caso, a região (Xc) também é denominada "região do lado 3' (Xc)"; a região (X) na região interna (Z) também é denominada uma "região interior do lado 3' (X) "; a região (Y) na região interior (Z) também é denominada uma "região interior 5' (Y)"; e a região (Yc) também é denominada "região do lado 5' (Yc)".

Tal como descrito anteriormente, a região interna (Z) é composta pelas regiões (X) e (Y) que estão ligadas entre si, por exemplo. As regiões (X) e (Y) estão ligadas directamente entre si sem qualquer sequência intermédia no meio, por exemplo. A região interior (Z) é definida como sendo "composta pelas regiões (X) e (Y) que estão ligadas entre si" meramente para indicar o contexto da sequência entre a região do lado 5' (Xc) e a região do lado 3' (Xc).

Na segunda molécula ssPN, a região (Xc) é complementar à região (X) . Só é necessário que a região (Xc) tenha uma sequência complementar à região completa ou parte da região (X) . Preferentemente, a região (Xc) inclui ou é composta por uma sequência complementar à região completa ou parte da região (X) . A região (Xc) pode ser perfeitamente complementar à região completa ou parte da região (X) ou uma ou algumas bases na região (Xc) podem não ser complementares à mesma, por exemplo. Preferentemente, a região (Xc) é perfeitamente complementar à mesma. A expressão "uma ou algumas bases" significa, por exemplo, 1 a 3 bases, de preferência 1 base ou 2 bases.

Na segunda molécula ssPN, a região (Yc) é complementar à região (Y) . Apenas é necessário que a região (Yc) tenha uma sequência complementar à região completa ou parte da região (Y) . Preferentemente, a região (Yc) inclui ou é composta por uma sequência complementar à região completa ou parte da região (Y) . A região (Yc) pode ser perfeitamente complementar à região completa ou parte da região (Y) ou uma ou algumas bases na região (Yc) podem não ser complementares à mesma, por exemplo. Preferentemente, a região (Yc) é perfeitamente complementar à mesma. A expressão "uma ou algumas bases" significa, por exemplo, 1 a 3 bases, de preferência 1 base ou 2 bases.

Na segunda molécula ssPN, a região (X) inclui a sequência de inibição de expressão. A segunda molécula ssPN pode incluir uma sequência de inibição de expressão, ou duas ou mais sequências de inibição de expressão, por exemplo.

Quando a segunda molécula ssPN inclui duas ou mais sequências de inibição de expressão, as posições das respectivas sequências de inibição de expressão não são especialmente limitadas. Podem estar na região (X) e na região (Xc) ou podem estar na região (X) e qualquer região diferente da região (Xc).

Na segunda molécula ssPN, as regiões (Yc) e (Y) podem estar ligadas entre si directa ou indirectamente, por exemplo. No primeiro caso, as regiões (Yc) e (Y) podem estar ligadas directamente por ligação fosfodiéster ou semelhante, por exemplo. No último caso, a segunda molécula ssPN pode estar configurada de modo a ter uma região ligante (Ly) entre as regiões (Yc) e (Y) e as regiões (Yc) e (Y) estarão ligadas através da região ligante (Ly), por exemplo.

Quando a segunda molécula ssPN tem a região ligante (Ly), a região ligante (Ly) pode ser um ligante composto pelo(s) resíduo(s) de nucleótido(s) ou um ligante com uma estrutura não nucleotídica contendo pelo menos um de um esqueleto pirrolidina e um esqueleto piperidina. 0 esqueleto pirrolidina pode ser o esqueleto de um derivado de pirrolidina obtido por substituição de pelo menos um carbono que constitui o anel de cinco lados da pirrolidina, por exemplo. No caso de substituição, é preferível substituir o(s) carbono (s) diferente(s) de C-2, por exemplo. 0 carbono pode ser substituído por azoto, oxigénio ou enxofre, por exemplo. 0 esqueleto pirrolidina pode conter, por exemplo, uma ligação dupla carbono-carbono ou uma ligação dupla carbono-azoto, por exemplo, no anel de cinco lados de pirrolidina. No esqueleto pirrolidina, os carbonos e azoto que constituem o anel de cinco lados da pirrolidina podem cada qual ter hidrogénio ligado ou um substituinte a ser descrito seguidamente a si ligado, por exemplo. A região ligante (Ly) pode estar ligada às regiões (Y) e (Yc) através, por exemplo, de qualquer grupo no esqueleto pirrolidina, de preferência qualquer dos átomos de carbono ou azoto no anel de cinco lados e com maior preferência o carbono na posição 2 (C-2) ou azoto no anel de cinco lados. Os exemplos do esqueleto pirrolidina incluem esqueletos de prolina e esqueletos de prolinol. Os esqueletos de prolina, os esqueletos de prolinol e semelhantes são excelentes em termos de segurança porque são substâncias presentes nos organismos vivos e seus redutores, por exemplo. 0 esqueleto piperidina pode ser o esqueleto de um derivado de piperidina obtido por substituição de pelo menos um carbono que constitui o anel de seis lados da piperidina, por exemplo. No caso de substituição, é preferível substituir o(s) carbono(s) diferente(s) de C-2, por exemplo. 0 carbono pode ser substituído por azoto, oxigénio ou enxofre, por exemplo. 0 esqueleto piperidina pode conter, por exemplo, uma ligação dupla carbono-carbono ou uma ligação dupla carbono-azoto, por exemplo, no anel de seis lados de piperidina. No esqueleto piperidina, os carbonos e azoto que constituem o anel de seis lados da piperidina podem cada qual ter hidrogénio ligado ou um substituinte a ser descrito seguidamente a si ligado, por exemplo. A região ligante (Ly) pode estar ligada às regiões (Y) e (Yc) através, por exemplo, de qualquer grupo no esqueleto piperidina, de preferência qualquer átomo de carbono ou azoto no anel de seis lados e com maior preferência no carbono da posição 2 (C—2) ou azoto no anel de seis lados. A região ligante (Ly) pode ser representada pela fórmula (I), por exemplo, e todas as descrições relativas à fórmula (I) apresentadas anteriormente relativas à região ligante (Lx) também se aplicam à região ligante (Ly).

As regiões (Yc) e (Y) estão cada qual ligadas à região ligante (Ly) através de -OR1- ou -OR2-, por exemplo. Na região ligante (Ly) , R1 e R2 podem ou não estar presentes, tal como região ligante (Lx) descrita anteriormente. A combinação das regiões (Xc) e (X) com -OR1- e -OR2- e a combinação das regiões (Yc) e (Y) com -OR1- e -OR2- não são especialmente limitadas e podem ser qualquer das seguintes condições, por exemplo.

Condição (1): as regiões (Xc) e (X) estão ligadas à estrutura da fórmula (I) através de -OR2- e -OR1-, respectivamente; e as regiões (Yc) e (Y) estão ligadas à estrutura da fórmula (I) através de -OR1- e -OR2-, respectivamente.

Condição (2): as regiões (Xc) e (X) estão ligadas à estrutura da fórmula (I) através de -OR2- e -OR1-, respectivamente; e as regiões (Yc) e (Y) estão ligadas à estrutura da fórmula (I) através de -OR2- e -OR1-, respectivamente.

Condição (3): as regiões (Xc) e (X) estão ligadas à estrutura da fórmula (I) através de -OR1- e -OR2-, respectivamente; e as regiões (Yc) e (Y) estão ligadas à estrutura da fórmula (I) através de -OR1- e -OR2-, respectivamente.

Condição (4): as regiões (Xc) e (X) estão ligadas à estrutura da fórmula (I) através de -OR1- e -OR2-, respectivamente; e as regiões (Yc) e (Y) estão ligadas à estrutura da fórmula (I) através de -OR2- e -OR1-, respectivamente. A figura 2 apresenta representações esquemáticas que ilustram um exemplo da segunda molécula ssPN contendo a região ligante (Ly). A figura 2A é uma representação esquemática que apresenta a ordem das respectivas regiões do lado 5' para o lado 3' na molécula ssPN, como um exemplo ilustrativo. A figura 2B é uma representação esquemática que apresenta o estado em que se formam cadeias dupla na molécula ssPN. Tal como apresentado na figura 2B, na molécula ssPN formam-se cadeias duplas entre as regiões (Xc) e (X) e entre as regiões (Y) e (Yc) e a região Lx e a região Ly têm cada qual uma estrutura em ansa dependendo dos seus comprimentos. As representações esquemáticas apresentadas na figura 2 ilustram meramente a ordem pela qual as respectivas regiões estão ligadas e a relação de posição das regiões respectivas que formam a cadeia dupla e não limitam os comprimentos das respectivas regiões, a forma da região ligante e semelhantes, por exemplo. Adicionalmente, embora a região (Xc) seja no lado 5' da figura 2, a posição da região (Xc) não está a tal limitada e a região (Xc) pode estar no lado 3' .

Na segunda molécula ssPN, o número de bases em cada uma das regiões (Xc), (X), (Y) e (Yc) não é especialmente limitado. Apresentam-se seguidamente exemplos dos comprimentos das regiões respectivas. Deve salientar-se contudo que o presente invento não está de modo algum a tal limitado.

Tal como descrito anteriormente, a região (Xc) pode ser complementar à região completa da região (X), por exemplo. Neste caso é preferível, por exemplo, que a região (Xc) tenha o mesmo comprimento de bases do que a região (X) e seja composta por uma sequência de bases complementar à região completa da região (X) . É mais preferível que a região (Xc) tenha o mesmo comprimento de bases do que a região (X) e que todas as bases na região (Xc) sejam complementares a todas as bases na região (X), i.e., que a região (Xc) seja perfeitamente complementar à região (X), por exemplo. Deve salientar-se contudo que a configuração da região (Xc) não está a tal limitada e uma ou algumas bases na região (Xc) podem não ser complementares às bases correspondentes na região (X), por exemplo, tal como descrito anteriormente.

Além disso, tal como descrito anteriormente, a região (Xc) pode ser complementar a parte da região (X), por exemplo. Neste caso é preferível, por exemplo, que a região (Xc) tenha o mesmo comprimento de bases do que a parte da região (X) , i.e., a região (Xc) seja composta por uma sequência de bases cujo comprimento de bases é mais curto do que o comprimento de bases da região (X) em uma ou mais bases. É mais preferível que a região (Xc) tenha o mesmo comprimento de bases do que a parte da região (X) e todas as bases na região (Xc) sejam complementares a todas as bases na parte da região (X), i.e., a região (Xc) seja perfeitamente complementar à parte da região (X), por exemplo. A parte da região (X) de preferência é uma região com uma sequência de bases composta por bases sucessivas com início na base da extremidade (a Ia base) no lado da região (Xc) na região (X), por exemplo.

Tal como descrito anteriormente, a região (Yc) pode ser complementar à região completa da região (Y) , por exemplo.

Neste caso, é preferível, por exemplo, que a região (Yc) tenha o mesmo comprimento de bases do que a região (Y) e seja composta por uma sequência de bases complementar à região completa da região (Y) . É mais preferível que a região (Yc) tenha o mesmo comprimento de bases do que a região (Y) e que todas as bases na região (Yc) sejam complementares a todas as bases na região (Y) , i.e., a região (Yc) seja perfeitamente complementar à região (Y) , por exemplo. Deve salientar-se contudo que a configuração da região (Yc) não está a tal limitada e uma ou algumas bases na região (Yc) podem não ser complementares às bases correspondentes na região (Y) , por exemplo, tal como descrito anteriormente.

Adicionalmente, tal como descrito anteriormente, a região (Yc) pode ser complementar a parte da região (Y), por exemplo. Neste caso, é preferível, por exemplo, que a região (Yc) tenha o mesmo comprimento de bases do que a parte da região (Y) , i.e., a região (Yc) seja composta por uma sequência de bases cujo comprimento de bases é menor do que o comprimento de bases da região (Y) por uma ou mais bases. É mais preferível que a região (Yc) tenha o mesmo comprimento de bases do que a parte da região (Y) e todas as bases na região (Yc) sejam complementares a todas as bases na parte da região (Y) , i.e., a região (Yc) seja perfeitamente complementar à parte da região (Y) , por exemplo. A parte da região (Y) de preferência é uma região com uma sequência de bases composta por bases sucessivas com início na base na extremidade (a Ia base) no lado da região (Yc) na região (Y), por exemplo.

Na segunda molécula ssPN, a relação entre o número de bases (Z) na região interna (Z) e o número de bases (X) na região (X) e o número de bases (Y) na região (Y), e a relação entre o número de bases (Z) na região interna (Z) e o número de bases (X) na região (X) e o número de bases (Xc) na região (Xc) satisfaz as condições das expressões (1) e (2), por exemplo. Z=X+Y (1) Z>Xc+Yc (2)

Na segunda molécula ssPN, a relação de comprimento entre o número de bases (X) na região (X) e o número de bases (Y) na região (Y) não é especialmente limitada e satisfaz qualquer das condições das seguintes expressões, por exemplo. X=Y (19) X<Y (20) X>Y (21)

Na segunda molécula ssPN, a relação entre o número de bases (X) na região (X) e o número de bases (Xc) na região (Xc), e a relação entre o número de bases (Y) na região (Y) e o número de bases (Yc) na região (Yc) satisfaz qualquer das seguintes condições (a) a (d), por exemplo. (a) As condições das expressões (3) e (4) são satisfeitas . X>Xc (3) Y=Yc (4) (b) As condições das expressões (5) e (6) são satisfeitas . X=Xc (5) Y>Yc (6) (c) As condições das expressões (7) e (8) são satisfeitas . X>Xc (7) Y>Yc (8) (d) As condições das expressões (9) e (10) são satisfeitas . X=Xc (9) Y=Yc (10)

Nas condições anteriormente descritas (a) a (d) , a diferença entre o número de bases (X) na região (X) e o número de bases (Xc) na região (Xc), e a diferença entre o número de bases (Y) na região (Y) e o número de bases (Yc) na região (Yc) de preferência satisfaz as seguintes condições (a) a (d), por exemplo. (a) As condições das expressões (11) e (12) são satisfeitas. X-Xc= 1 a 10, de preferência 1, 2, 3 ou 4 e com maior preferência 1, 2 ou 3 (11) Y-Yc=0 (12) (b) As condições das expressões (13) e (14) são satisfeitas . X-Xc= 0 (13) Y-Yc=l a 10, de preferência 1, 2, 3 ou 4 e com maior preferência 1, 2 ou 3 (14) (c) As condições das expressões (15) e (16) são satisfeitas . X-Xc= 1 a 10, de preferência 1, 2, ou 3 e com maior preferência 1 ou 2 (15) Y-Yc=l a 10, de preferência 1, 2, ou 3 e com maior preferência 1 ou 2 (16) (d) As condições das expressões (17) e (18) são satisfeitas . X-Xc=0 (17) Y-Yc=0 (18)

Relativamente às segundas moléculas ssPN que satisfazem as condições (a) a (d) , apresentam-se exemplos das suas estruturas respectivamente nas representações esquemáticas da figura 3. A figura 3 apresenta as moléculas ssPN incluindo as regiões ligantes (Lx) e (Ly). A figura 3A apresenta um exemplo da molécula ssPN que satisfaz a condição (a) ; a figura 3B apresenta um exemplo da molécula ssPN que satisfaz a condição (b) ; a figura 3C apresenta um exemplo da molécula ssPN que satisfaz a condição (c); e a figura 3D apresenta um exemplo da molécula ssPN que satisfaz a condição (d) . Na figura 3, as linhas pontilhadas indicam um estado em que se formam cadeias duplas por auto-hibridação. As moléculas ssPN apresentadas na figura 3 são todas dirigidas a exemplos em que a relação entre o número de bases (X) na região (X) e o número de bases (Y) na região (Y) satisfaz "X < Y" da expressão (20). Deve salientar-se, contudo, que a relação não está a tal limitada e "X =Y" da expressão (19) ou "X > Y" da expressão (21) podem ser satisfeitas. As representações esquemáticas apresentadas na figura 3 ilustram meramente a relação entre as regiões (X) e (Xc) e a relação entre as regiões (Y) e (Yc) e não limitam o seu comprimento, forma e semelhantes de cada região e a presença ou ausência da região ligante (Ly), por exemplo.

Cada uma das moléculas ssPN que satisfaz as condições (a) a (c) está configurada de modo que, por exemplo, quando se formam as cadeias duplas pelas regiões (Xc) e (X) e pelas regiões (Yc) e (Y), respectivamente, a região interna (Z) inclui pelo menos uma base que não pode ser alinhada com qualquer das regiões (Xc) e (Yc) . Na região interna (Z) , a base que não está alinhada (uma base que não forma a cadeia dupla) é doravante também denominada "base desemparelhada". Na figura 3, apresenta-se uma região composta por base (s) desemparelhada(s) como "F". 0 número de bases na região (F) não é especialmente limitado. 0 número de bases (F) na região (F) é o seguinte, por exemplo: "Xc - X" no caso da molécula ssPN que satisfaz a condição (a) ; "Y -Yc" no caso da molécula ssPN que satisfaz a condição (b); e o total de "Xc - X" e "Y -

Yc" no caso da molécula ssPN que satisfaz a condição (c).

Por outro lado, a molécula ssPN que satisfaz a condição (d) está configurada de modo que, por exemplo, a região completa da região interna (Z) está alinhada com as regiões (Xc) e (Yc), por outras palavras, a região completa da região interna (Z) forma uma cadeia dupla. Na molécula ssPN que satisfaz a condição (d), a extremidade 5' da região (Xc) e a extremidade 3' da região (Yc) não estão ligadas entre si. 0 número total de bases na região (Xc), de bases na região (Yc) e de bases desemparelhadas (F) na região interna (Z) é igual ao número das bases na região interna (Z) . Assim, o comprimento da região (Xc) e o comprimento da região (Yc) podem ser determinados como adequados dependendo do comprimento da região interna (Z), do número das bases desemparelhadas e das posições das bases desemparelhadas, por exemplo. 0 número das bases na região interna (Z) é 19 ou mais, por exemplo. 0 limite inferior do número de bases é, por exemplo, 19, de preferência 20 e com maior preferência 21. O limite superior do número de bases é, por exemplo, 50, de preferência 40 e com maior preferência 30. Um exemplo especifico do número de bases na região interna (Z) é 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30. Quando a região interna (Z) inclui a seguência de inibição de expressão, a condição anterior é preferível, por exemplo. A região interna (Z) inclui a seguência de inibição de expressão. O número de bases da seguência de inibição de expressão é, por exemplo, 19 a 30, de preferência 19, 20 ou

21. A sequência de inibição de expressão pode além disso ter uma sequência adicional no seu lado 5' e/ou no lado 3' . O número de bases na sequência adicional é, por exemplo, 1 a 31, de preferência 1 a 21, com maior preferência 1 a 11 e ainda com maior preferência 1 a 7. O número de bases na região (Xc) é, por exemplo, 1 a 29, de preferência 1 a 11, com maior preferência 1 a 7, ainda com maior preferência 1 a 4 e especialmente de preferência 1, 2, ou 3. Um exemplo específico é como se segue: quando o número de bases na região interna (Z) é 19 a 30 (e.g. 19), o número de bases na região (Xc) é, por exemplo, 1 a 11, de preferência 1 a 7, com maior preferência 1 a 4 e ainda com maior preferência 1, 2 ou 3.

Quando a região (Xc) inclui a sequência de inibição de expressão, a região (Xc) pode ser uma região composta pela sequência de inibição de expressão apenas ou uma região incluindo a sequência de inibição de expressão, por exemplo. O comprimento da sequência de inibição de expressão é tal como descrito anteriormente, por exemplo. Quando a região (Xc) inclui a sequência de inibição de expressão, a sequência de inibição de expressão pode ter adicionalmente uma sequência adicional no seu lado 5' e/ou lado 3' . O número de bases na sequência adicional é, por exemplo, 1 a 11, de preferência 1 é 7 . O número de bases da região (Yc) é, por exemplo, 1 a 29, de preferência 1 a 11, com maior preferência 1 a 7, ainda com maior preferência 1 a 4 e especialmente de preferência 1, 2, ou 3. Um exemplo específico é o seguinte: quando o número de bases na região interna (Z) é 19 a 30 (e.g., 19), o número de bases na região (Yc) é, por exemplo, 1 a 11, de preferência 1 a 7, 20 com maior preferência 1, 2, 3 ou 4 e ainda com maior preferência 1, 2, ou 3.

Quando a região (Yc) inclui a sequência de inibição de expressão, a região (Yc) pode ser uma região composta pela sequência de inibição de expressão apenas ou uma região incluindo a sequência de inibição de expressão, por exemplo. O comprimento da sequência de inibição de expressão é tal como descrito anteriormente, por exemplo. Quando a região (Yc) inclui a sequência de inibição de expressão, a sequência de inibição de expressão pode ter adicionalmente uma sequência adicional no seu lado 5' e/ou lado 3' . O número de bases na sequência adicional é, por exemplo, 1 a 11, de preferência 1 a 7 .

Tal como descrito anteriormente, a relação entre o número de bases na região interna (Z) , o número de bases na região (Xc) e o número de bases na região (Yc) pode ser expressa pela expressão (2) : "Z > Xc + Yc", por exemplo. Especificamente, o número de bases representado por "Xc + Yc" é igual ao número de bases na região interna (Z), ou inferior ao número de bases na região interna (Z), por exemplo. No último caso, "Z-(Xc + Yc)" é, por exemplo, 1 a 10, de preferência 1 a 4 e com maior preferência 1, 2 ou 3. "Z - (Xc + Yc) " corresponde ao número de bases (F) na região de bases desemparelhadas (F) na região interna (Z), por exemplo.

Na segunda molécula ssPN, os comprimentos das regiões ligantes (Lx) e (Ly) não são especialmente limitados. A região ligante (Lx) é tal como descrita anteriormente. Quando os componentes (blocos de montagem) da região ligante (Ly) incluem base(s), o limite inferior do número de bases na região ligante (Ly) é, por exemplo, 1, de preferência 2 e com maior preferência 3, e o limite superior do mesmo é, por exemplo, 100, de preferência 80 e com maior preferência 50. O número de bases em cada uma das regiões ligantes é especif icamente 1 a 50, 1 a 30, 1 a 20, 1 a 10, 1 a 7 ou 1 a 4, por exemplo, mas não se limita a estes exemplos ilustrativos. A região ligante (Lx) pode ser a mesma ou diferente da região ligante (Ly), por exemplo. 0 comprimento total da segunda molécula ssPN não é especialmente limitado. Na segunda molécula ssPN, o limite inferior do número total de bases (o número de bases na molécula ssPN de comprimento total) é, por exemplo, 38, de preferência 42, com maior preferência 50, ainda com maior preferência 51 e especialmente de preferência 52 e o limite superior do mesmo é, por exemplo, 300, de preferência 200, com maior preferência 150, ainda com maior preferência 100 e especialmente de preferência 80. Na segunda molécula ssPN, o limite inferior do número total de bases excluindo as das regiões ligantes (Lx) e (Ly) é, por exemplo, 38, de preferência 42, com maior preferência 50, ainda com maior preferência 51 e especialmente de preferência 52 e o limite superior do mesmo é, por exemplo, 300, de preferência 200, com maior preferência 150, ainda com maior preferência 100 e especialmente de preferência 80.

Na molécula ssPN do presente invento, apenas é necessário que a região ligante (Lx) tenha a estrutura não nucleotidica tal como descrito anteriormente e os outros componentes não são especialmente limitados. No entanto, os resíduos de nucleótido são resíduos de ribonucleótido. O resíduo de nucleótido pode ser um resíduo não modificado (resíduo de nucleótido não modificado) ou pode ser um resíduo que tenha sido modificado (resíduo de nucleótido modificado) , por exemplo. Através da configuração da molécula ssPN do presente invento, de modo a incluir um resíduo de nucleótido modificado, por exemplo, pode melhorar-se a resistência da molécula ssPN a nuclease, permitindo assim melhorar a estabilidade da molécula ssPN. Além disso, a molécula ssPN do presente invento pode incluir adicionalmente, por exemplo, um resíduo não nucleotídico além do resíduo de nucleótido. O resíduo de nucleótido é preferentemente o componente de cada uma das regiões (Xc) , (X) , (Y) e (yc) . Cada uma das regiões é composta por qualquer dos seguintes resíduos (1) a (3), por exemplo. 1. resíduo(s) de nucleótido(s) não modificado(s) 2. resíduo(s) de nucleótido (s) modificado(s) 3. resíduo(s) de nucleótido(s) não modificado(s) e resíduo(s) de nucleótido(s) modificado(s)

Os componentes da região ligante (Ly) não são especialmente limitados e os seus exemplos incluem os resíduos de nucleótido e os resíduos não nucleotídicos, tal como descrito anteriormente. Cada uma das regiões ligantes pode ser composta pelo(s) resíduo(s) de nucleótido (s) apenas, o(s) resíduo(s) de não nucleotídico(s) apenas ou tanto o(s) resíduo(s) de nucleótido(s), como o(s) resíduo(s) nucleotídico (s). Cada uma das regiões ligantes é composta por qualquer dos seguintes resíduos (1) a (7), por exemplo. 1. resíduo(s) de nucleótido(s) não modificado(s) 2. resíduo(s) de nucleótido(s) modificado(s) 3. resíduo(s) de nucleótido(s) não modificado(s) e resíduo(s) de nucleótido(s) modificado(s) 4. resíduo(s) não nucleotídico(s) 5. resíduo(s) não nucleotídico (s) e resíduo(s) de nucleótido(s) não modificado(s) 6. resíduo(s) não nucleotídico(s) e resíduo(s) de nucleótido(s) modificado(s) 7. resíduo (s) não nucleotídico (s), resíduo (s) de nucleótido (s) não modificado (s) e resíduo(s) de nucleótido(s) modificado(s) A molécula ssPN do presente invento pode ser, por exemplo: uma molécula composta por resíduos de nucleótido apenas excepto na sua região ligante (Lx) ; uma molécula incluindo resíduo(s) de nucleotídico(s) além dos resíduos de nucleótido; ou semelhantes. Na molécula ssPN do presente invento, os resíduos de nucleótido podem ser resíduos de nucleótidos não modificados apenas; resíduos de nucleótido modificados apenas; ou tanto resíduo(s) de nucleótido(s) não modificados, como resíduo(s) de nucleótido(s) modificados, tal como descrito anteriormente, por exemplo. Quando a molécula ssPN inclui tanto resíduo (s) de nucleótido(s) não modificados, como resíduo(s) de nucleótido(s) modificados, o número dos resíduo(s) de nucleótido(s) modificados não é especialmente limitado e é, por exemplo, "um ou mais", especificamente, por exemplo, 1 a 5, de preferência 1 a 4, com maior preferência 1 a 3 e com a maior preferência 1 ou 2. Quando a molécula ssPN do presente invento inclui resíduo(s) não nucleotídico (s), o número de resíduo(s) não nucleótídico(s) não é especialmente limitado e é, por exemplo, "um ou mais", especificamente, por exemplo, 1 ou 2.

Na molécula ssPN do presente invento, o resíduo de nucleótido é um resíduo de ribonucleótido. Assim, a molécula ssPN do presente invento também se denomina "molécula de ARN" ou "molécula de ARNss", por exemplo. A molécula de ARNss pode ser, por exemplo: uma molécula composta por resíduos de ribonucleótidos apenas excepto na sua região ligante (Lx); uma molécula incluindo resíduo(s) não nucleótídico(s) além dos resíduos de ribonucleótidos; ou semelhante. Tal como descrito anteriormente, como resíduos de ribonucleótidos, a molécula de ARNss pode incluir: resíduos de ribonucleótidos não modificados apenas; resíduos de ribonucleótidos modificados apenas; ou tanto resíduo(s) de ribonucleótido(s) não modificados, como resíduo(s) de ribonucleótido(s) modificados, por exemplo.

Quando a molécula de ARNss inclui resíduos(s) de ribonucleótido(s) modificados além dos resíduo (s) de ribonucleótido(s) não modificados, por exemplo, o número de resíduo(s) de ribonucleótido(s) modificados não é especialmente limitado e é, por exemplo, "um ou mais", especificamente, por exemplo, 1 a 5, de preferência 1 a 4, com maior preferência 1 a 3 e com a maior preferência 1 ou 2. Os exemplos de resíduos de ribonucleótidos modificados em contraste com os resíduos de ribonucleótidos não modificados incluem resíduos de desoxirribonucleótidos obtidos por substituição de um resíduo de ribose por um resíduo de desoxirribose. Quando a molécula de ARNss inclui resíduo(s) de desoxirribonucleótido(s) além de resíduo(s) de ribonucleótido (s) não modificados, por exemplo, o número dos resíduo(s) de desoxirribonucleótido (s) não é especialmente limitado e é, por exemplo, "um ou mais" especificamente, por exemplo, 1 a 5, de preferência 1 a 4, com maior preferência 1 a 3 e com a maior preferência 1 ou 2. A molécula ssPN do presente invento pode incluir uma substância marcadora (marcador) e pode ser marcada com uma substância marcadora, por exemplo. A substância marcadora não é especialmente limitada e pode ser uma substância fluorescente, um corante, um isótopo ou semelhantes, por exemplo. Os exemplos de substâncias fluorescentes incluem: fluoróforos tais como pireno, TAMRA, fluoresceína, um corante Cy3 e um corante Cy5. Os exemplos do corante incluem corantes Alexa, tal como Alexa 488. Os exemplos de isótopos incluem isótopos estáveis e radioisótopos. Entre estes, são preferíveis os isótopos estáveis. Os isótopos estáveis têm um baixo risco de exposição a radiação e não requerem instalações especiais, por exemplo. Assim, os isótopos estáveis são excelentes em termos de manuseabilidade e pode contribuir para a redução de custos. Além disso, um isótopo estável não muda as propriedades físicas de um composto com ele marcado, por exemplo, e assim tem excelentes características como rastreador. 0 isótopo estável não é especialmente limitado e os seus exemplos incluem 2H, 13C, 15N, 170, 180, 33S, 34S e 36S.

Na molécula ssPN do presente invento, tal como descrito anteriormente, é preferível introduzir a substância marcadora na estrutura não nucleotídica, com maior preferência no (s) resíduo(s) de nucleotídico(s) na região ligante (Lx), por exemplo. A introdução da substância marcadora no(s) resíduo(s) não nucleot ídico (s) pode ser efectuada facilmente e a baixo custo, por exemplo.

Tal como descrito anteriormente, a molécula ssPN do presente invento pode inibir a expressão de um gene alvo. Assim, a molécula ssPN do presente invento pode ser usada como um agente terapêutico para tratar uma doença causada por um gene, por exemplo. De acordo com a molécula ssPN incluindo como sequência de inibição de expressão uma sequência que inibe a expressão de um gene que causa a doença, por exemplo, é possível tratar a doença por inibição da expressão do gene alvo. No presente invento, a expressão "tratamento" abrange: prevenção de doenças; melhoria de doenças; e melhoria do prognóstico, por exemplo, e pode significar qualquer destes. 0 método de usar a molécula ssPN do presente invento não é especialmente limitado. Por exemplo, a molécula ssPN pode ser administrada a um indivíduo com o gene alvo.

Os exemplos do indivíduo a quem se administra a molécula ssPN do presente invento incluem células, tecidos e órgãos. Os exemplos do indivíduo também incluem animais humanos e não humanos, tais como mamíferos não humanos, i.e., mamíferos excluindo humanos. A administração pode ser efectuada in vivo ou in vitro, por exemplo. As células não são especialmente limitadas e os seus exemplos incluem: várias células em cultura tais como células HeLa, células 293, células NIH3T3 e células COS; células estaminais tais como células ES e células estaminais hematopoiéticas; e células isoladas de organismos vivos, tais como células primárias em cultura.

No presente invento, o gene alvo cuja expressão deve ser inibida não é especialmente limitado e pode usar-se qualquer gene pretendido como gene alvo. A sequência de inibição de expressão pode ser concebida tal como adequado dependendo do tipo de gene alvo.

Os exemplos específicos da molécula ssPN do presente invento serão apresentados seguidamente. No entanto, deve salientar-se que o presente invento não é de modo algum limitado a estes exemplos. Os exemplos da sequência de bases da molécula ssPN incluem: sequências de bases de SEQ ID NOs: 3, 11, 14 a 17 e 23; e sequências de bases obtidas, por exemplo, por deleção, substituição e/ou adição de uma ou mais bases nestas sequências de bases. Quando o gene alvo é o gene GAPDH, os exemplos da sequência de bases da molécula ssPN incluem as sequências de bases de SEQ ID NOs: 3 e 11. Quando o gene alvo é TGF-131, os exemplos da sequência de bases da molécula ssPN incluem as sequências de bases de SEQ ID NOs: 14 a 17 e 23.

Relativamente ao uso da molécula ssPN do presente invento, podem referir-se as seguintes descrições relativas à composição, método de inibição, método de tratamento e semelhantes.

Dado que a molécula ssPN do presente invento pode inibir a expressão de um gene alvo tal como descrito anteriormente, é útil como agente farmacêutico, agente de diagnóstico, produto químico para agricultura e ferramenta para efectuar pesquisa em produtos químicos para agricultura, ciência médica, ciências da vida e semelhantes, por exemplo.

No presente invento, a expressão "alquilo" abrange grupos alquilo de cadeia linear e ramificada, por exemplo. 0 número de átomos de carbono no alquilo não é especialmente limitado e é, por exemplo, 1 a 30, de preferência 1 a 6 ou 1 a 4. Os exemplos do grupo alquilo incluem: metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, n-hexilo, iso-hexilo, n-heptilo, n-octilo, n-nonilo e n-decilo. De entre estes, são especialmente preferidos metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, n-pentilo, isopentilo, neopentilo, n-hexilo, iso-hexilo e semelhantes, por exemplo.

No presente invento, a expressão "alcenilo" abrange alcenilos de cadeia linear e ramificada, por exemplo. Os exemplos de alcenilos incluem os alquilos descritos anteriormente com uma ou mais ligações duplas. O número de átomos de carbono no alcenilo não é especialmente limitado e é, por exemplo, igual ao do alquilo, de preferência 2 a 8. Os exemplos de alcenilo incluem vinilo, 1-propenilo, 2-propenilo, 1- butenilo, 2-butenilo, 3-butenilo, 1,3-butadienilo e 3-metil- 2- butenilo.

No presente invento, a expressão "alcinilo" abrange alcinilos de cadeia linear e ramificada, por exemplo. Os exemplos de alcinilos incluem os alquilos descritos anteriormente com uma ou mais ligações triplas. O número de átomos de carbono no alcinilo não é especialmente limitado e é, por exemplo, igual ao do alquilo, de preferência 2 a 8. Os exemplos de alcinilo incluem etinilo, propinilo e butinilo. O alcinilo pode incluir adicionalmente uma ou mais ligações duplas, por exemplo.

No presente invento, a expressão "arilo" abrange grupos hidrocarbonetos aromáticos monociclicos e grupos hidrocarbonetos aromáticos policiclicos, por exemplo. Os exemplos de grupos hidrocarbonetos aromáticos monociclicos incluem fenilo. Os exemplos grupos de hidrocarbonetos aromáticos policiclicos incluem 1-naftilo, 2-naftilo, 1-antrilo, 2- antrilo, 9-antrilo, 1-fenantrilo, 2-fenantrilo, 3-fenantrilo, 4-fenantrilo e 9-fenantrilo. De entre estes são preferidos fenilo e naftilos tais como 1-naftilo e 2-naftilo e semelhantes, por exemplo.

No presente invento, a expressão "heteroarilo" abrange grupos heterociclicos aromáticos monociclicos e grupos heterociclicos aromáticos condensados, por exemplo. Os exemplos de heteroarilo incluem furilos (e.g.: 2-furilo, 3-furilo), tienilos (e.g.: 2-tienilo, 3-tienilo), pirrolilos (e.g.: 1-pirrolilo, 2-pirrolilo, 3-pirrolilo), imidazolilos (e.g.: 1-imidazolilo, 2-imidazolilo, 4-imidazolilo), pirazolilos (e.g.: 1-pirazolilo, 3-pirazolilo, 4-pirazolilo), triazolilos (e.g.: 1,2,4-triazole-l-ilo, 1,2,4-triazole-3-ilo, 1,2,4-triazole-4-ilo), tetrazolilos (e.g.: 1-tetrazolilo, 2- tetrazolilo, 5-tetrazolilo), oxazolilos (e.g.: 2-oxazolilo, 4-oxazolilo, 5-oxazolilo), isoxazolilos (e.g.: 3-isoxazolilo, 4-isoxazolilo, 5-isoxazolilo), tiazolilos (e.g.: 2-tiazolilo, 4- tiazolilo, 5-tiazolilo), tiadiazolilos, isotiazolilos (e.g.: 3- isotiazolilo, 4-isotiazolilo, 5-isotiazolilo) , piridilos (e.g.: 2-piridilo, 3-piridilo, 4-piridilo), piridazinilos (e.g.: 3-piridazinilo, 4- piridazinilo), pirimidinilos (e.g.: 2-pirimidinilo, 4-pirimidinilo, 5-pirimidinilo), furazanilos (e.g.: 3-furazanilo), pirazinilos (e.g.: 2-pirazinilo), oxadiazolilos (e.g.: 1,3,4-oxadiazole-2-ilo), benzofurilos (e.g.: 2-benzo[b]furilo, 3-benzo[b]furilo, 4-benzo[b]furilo, 5- benzo[b]furilo, 6-benzo[b]furilo, 7-benzo[b]furilo), benzotienilos (e.g.: 2-benzo[b]tienilo, 3-benzo[b]tienilo, 4-benzo[b]tienilo, 5-benzo[b]tienilo, 6-benzo[b]tienilo, 7-benzo[b]tienilo), benzimidazolilos (e.g.: 1-benzimidazolilo, 2-benzimidazolilo, 4-benzimidazolilo, 5-benzimidazolilo), dibenzofurilos, benzoxazolilos, benzotiazolilos, quinoxalilos (e.g.: 2-quinoxalinilo, 5-quinoxalinilo, 6-quinoxalinilo), cinolinilos (e.g.: 3-cinolinilo, 4-cinolinilo, 5-cinolinilo, 6- cinolinilo, 7-cinolinilo, 8-cinolinilo), quinazolilos (e.g.: 2-quinazolinilo, 4-quinazolinilo, 5-quinazolinilo, 6-quinazolinilo, 7-quinazolinilo, 8-quinazolinilo), quinolilos (e.g.: 2-quinolilo, 3-quinolilo, 4-quinolilo, 5-quinolilo, 6-quinolilo, 7-quinolilo, 8-quinolilo), ftalazinilos (e.g.: 1-ftalazinilo, 5-ftalazinilo, 6-ftalazinilo), isoquinolilos (e.g.: 1-isoquinolilo, 3-isoquinolilo, 4-isoquinolilo, 5-isoquinolilo, 6-isoquinolilo, 7-isoquinolilo, 8-isoquinolilo), purilos, pteridinilos (e.g.: 2-pteridinilo, 4-pteridinilo, 6-pteridinilo, 7-pteridinilo), carbazolilos, fenantridinilos, acridinilos (e.g.: 1-acridinilo, 2-acridinilo, 3-acridinilo, 4-acridinilo, 9-acridinilo), indolilos (e.g.: 1-indolilo, 2-indolilo, 3-indolilo, 4-indolilo, 5-indolilo, 6-indolilo, 7-indolilo), isoindolilos, fenazinilos (e.g.: 1-fenazinilo, 2-fenazinilo) e fenotiazinilos (e.g.: 1-fenotiazinilo, 2-fenotiazinilo, 3-fenotiazinilo, 4-fenotiazinilo).

No presente invento, a expressão "cicloalquilo" refere-se a grupos hidrocarbonetos saturados cíclicos, por exemplo, e o número de átomos de carbono no cicloalquilo é 3 a 15, por exemplo. Os exemplos de cicloalquilos incluem ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, ciclo-heptilo, ciclo-octilo, grupos de hidrocarbonetos cíclicos em ponte e grupos de hidrocarboneto espiro. De entres são preferidos ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, hidrocarbonetos cíclicos em ponte e semelhantes.

No presente invento, os exemplos de "grupos hidrocarbonetos cíclicos em ponte" incluem biciclo[2.1.0]pentilo, biciclo[2.2.1]heptilo, biciclo[2.2.2]octilo e biciclo[3.2.1]octilo, triciclo[2.2.1.0]heptilo, biciclo[3.3.1]nonano, 1-adamantilo e 2-adamantilo.

No presente invento, os exemplos de "grupos de hidrocarbonetos espiro" incluem espiro[3.4]octilo .

No presente invento, a expressão "cicloalcenilo" abrange grupos de hidrocarbonetos alifáticos cíclicos insaturados, por exemplo, e o número de átomos de carbono no cicloalcenilo é 3 a 7, por exemplo. Os exemplos de grupos cicloalcenilos incluem ciclopropenilo, ciclobutenilo, ciclopentenilo, ciclo-hexenilo, e ciclo-heptenilo. De entre estes são preferidos ciclopropenilo, ciclobutenilo, ciclopentenilo, ciclo-hexenilo e semelhantes. A expressão "cicloalcenilo" também abrange grupos de hidrocarbonetos cíclicos em ponte e grupos de hidrocarbonetos espiro com uma ligação insaturada nos seus anéis, por exemplo.

No presente invento, os exemplos de "arilalquilo" incluem benzilo, 2-fenetilo e naftalenilmetilo. Os exemplos de "cicloalquilalquilo" e "ciclilalquilo" incluem ciclo-hexilmetilo e adamantilmetilo. Os exemplos de "hidroxialquilo" incluem hidroximetilo e 2-hidroxietilo.

No presente invento, o "alcóxi" abrange grupos compostos por qualquer um dos alquilos descritos anteriormente e oxigénio (grupos alquil-O) , por exemplo, e os seus exemplos incluem metóxi, etóxi, n-propóxi, isopropóxi e n-butóxi. Os exemplos de "alcoxialquilo" incluem metoximetilo. Os exemplos de "aminoalquilo" incluem 2-aminoetilo.

No presente invento, os exemplos de "heterociclilo" incluem 1-pirrolinilo, 2-pirrolinilo, 3-pirrolinilo, 1-pirrolidinilo, 2-pirrolidinilo, 3-pirrolidinilo, pirrolidinona, 1-imidazolinilo, 2-imidazolinilo, 4-imidazolinilo, 1-imidazolidinilo, 2-imidazolidinilo, 4-imidazolidinilo, imidazolidinona, 1-pirazolinilo, 3-pirazolinilo, 4-pirazolinilo, 1-pirazolidinilo, 3-pirazolidinilo, 4-pirazolidinilo, piperidinona, piperidino, 2-piperidinilo, 3-piperidinilo, 4-piperidinilo, 1-piperazinilo, 2-piperazinilo, piperazinona, 2-morfolinilo, 3-morfolinilo, morfolino, tetra-hidropiranilo e tetra-hidrofuranilo.

No presente invento, os exemplos de "heterociclilalquilo" incluem piperidinilmetilo e piperazinilmetilo. Os exemplos de "heterociclilalcenilo" incluem 2-piperidiniletenilo. Os exemplos de "heteroarilalquilo" incluem piridilmetilo e quinolina-3-ilmetilo.

No presente invento, a expressão "sililo" abrange grupos representados pela fórmula R3S1-, em que R pode ser seleccionado independentemente dos alquilos, arilos e cicloalquilos descritos anteriormente. Os exemplos de sililos incluem um grupo trimetilsililo e um grupo terc- butildimetilsililo. Os exemplos de "sililóxi" incluem um grupo trimetilsililóxi. Os exemplos de "sililoxialquilo" incluem trimetilsililoximetilo.

No presente invento, os exemplos de "alquileno" incluem metileno, etileno e propileno.

No presente invento, os vários grupos descritos anteriormente podem ser substituídos. Os exemplos de substituintes incluem hidróxi, carboxilo, halogénios, halogenetos de alquilo (e.g.: CF3, CH2CF3, CH2CCI3) , nitro, nitroso, ciano, alquilos (e.g.: metilo, etilo, isopropilo, terc-butilo), alcenilos (e.g.: vinilo), alcinilos (e.g.: etinilo), cicloalquilos (e.g.: ciclopropilo, adamantilo), cicloalquilalquilos (e.g.: ciclo-hexilmetilo, adamantilmetilo), ciclo-alcenilos (e.g.: ciclopropenilo), arilos (e.g.: fenilo, naftilo), arilalquilos (e.g.: benzilo, fenetilo), hetero-arilos (e.g.: piridilo, furilo), hetero- arilalquilos (e.g.: piridilmetilo), heterocíclilos (e.g.: piperidilo), heterociclilalquilos (e.g.: morfolilmetilo), alcóxis (e.g.: metóxi, etóxi, propóxi, butóxi), alcóxis halogenados (e.g.: OCFa), alcenilóxis (e.g.: vinilóxi, alilóxi), arilóxis (e.g.: fenilóxi), alquiloxicarbonilos (e.g.: metoxicarbonilo, etoxicarbonilo, terc-butoxicarbonilo), arilalquilóxis (e.g.: benzilóxi), aminos [alquilaminos (e.g.: metilamino, etilamino, dimetilamino), acilaminos (e.g.: acetilamino, benzoilamino), arilalquilaminos (e.g.: benzilamino, tritilamino), hidroxiaminol, alquilaminoalquilos (e.g.: dietilaminometilo), sulfamoilo e óxo. 2. Resíduo de nucleótido 0 resíduo de nucleótido inclui, como seus componentes, um açúcar, uma base e um fosfato. 0 resíduo de nucleótido é um resíduo de ribonucleótido, tal como descrito anteriormente. 0 resíduo de ribonucleótido tem, por exemplo: um resíduo ribose como açúcar; e adenina (A) , guanina (G) , citosina (C) ou uracilo (U) como base. 0 resíduo de nucleótido pode ser, por exemplo, um resíduo de nucleótido não modificado ou um resíduo de nucleótido modificado. Os componentes do resíduo de nucleótido não modificado são os mesmos ou substancialmente os mesmos componentes de um resíduo de nucleótido de ocorrência natural, por exemplo. Preferentemente, os componentes são os mesmos ou substancialmente os mesmos componentes de um resíduo de nucleótido de ocorrência natural num corpo humano. 0 resíduo de nucleótido modificado é um resíduo de nucleótido obtido por modificação do resíduo de nucleótido não modificado, por exemplo. 0 nucleótido modificado pode ser tal que qualquer dos componentes do resíduo de nucleótido não modificado é modificado, por exemplo. No presente invento, "modificação" significa, por exemplo: substituição, adição, e/ou deleção de qualquer dos componentes; e substituição, adição e/ou deleção de átomo(s) e/ou grupo (s) funcional (is) no (s) componente(s) . Também pode ser denominada "alteração". Os exemplos de resíduos de nucleótidos modificados incluem resíduos de nucleótidos de ocorrência natural e resíduos de nucleótidos modificados artificialmente. Relativamente aos resíduos de nucleótido modificados de origem natural pode referir-se Limbach et ai. (1994, Summary: the modified nucleosides of RNA, Nucleic Acids Res. 22: p. 2183 a 2196), por exemplo. 0 resíduo de nucleótido modificado pode ser um resíduo de um nucleótido alternativo, por exemplo.

Os exemplos de uma modificação do resíduo de nucleótido incluem modificação de um esqueleto de ribose-fosfato (doravante denominado "esqueleto ribofosfato").

No esqueleto ribofosfato, pode modificar-se um resíduo de ribose, por exemplo. No resíduo de ribose, por exemplo, pode modificar-se o carbono da posição 2' . Especificamente, pode substituir-se um grupo hidroxilo ligado ao carbono da posição 2' por hidrogénio, flúor ou semelhantes, por exemplo. Por substituição do grupo hidroxilo ligado ao carbono da posição 2' por hidrogénio, é possível substituir o resíduo ribose por desoxirribose. 0 resíduo de ribose pode ser substituído pelo seu estereoisómero, por exemplo, e pode ser substituído por um resíduo arabinose, por exemplo. 0 esqueleto ribofosfato pode ser substituído por esqueleto não ribofosfato com um resíduo não ribose e/ou um não fosfato, por exemplo. 0 esqueleto não ribofosfato pode ser, por exemplo, o esqueleto ribofosfato modificado de modo a ser não carregado ou semelhante. Os exemplos de uma alternativa obtida por substituição do esqueleto ribofosfato pelo esqueleto não ribofosfato no nucleótido incluem morfolino, ciclobutilo e pirrolidina. Outros exemplos da alternativa incluem resíduos monoméricos de ácido nucleico artificial. Os seus exemplos específicos incluem PNA (ácido nucleico peptídico), LNA (ácido nucleico fechado) e ENA (ácidos nucleicos com ponte de 2' -0,4' -C-etileno). De entre estes, é preferido o PNA.

No esqueleto, pode modificar-se um grupo fosfato, por exemplo. No esqueleto ribofosfato, o grupo fosfato mais próximo do resíduo de açúcar é denominado um grupo "fosfato ". 0 grupo fosfato áesèrregado negativamente e as cargas eléctricas estão distribuídas uniformemente pelos dois átomos de oxigénio que não estão ligados ao resíduo de açúcar. Entre os quatro átomos de oxigénio no grupo fosfato , os dois átomos de oxigénio não ligados ao resíduo de açúcar na ligação fosfodiéster entre os resíduos de nucleótido são doravante denominados "oxigénios não ligantes". Por outro lado, os dois átomos de oxigénio que estão ligados ao resíduo de açúcar na ligação fosfodiéster entre os resíduos de nucleótido são doravante denominados "oxigénios ligantes". De preferência o grupo fosfato é modificado de modo a ficar sem carga ou de modo a tornar a distribuição de carga entre os dois átomos não ligantes assimétrica, por exemplo.

No grupo fosfato, o(s) oxigénio(s)s não ligante(s) podem ser substituído(s) , por exemplo. 0(s) oxigénio(s) pode(m) ser substituído(s) por qualquer átomo seleccionado de S (enxofre),

Se (selénio), B (boro), C (carbono), H (hidrogénio), N (azoto) e OR (R é um grupo alquilo ou um grupo arilo, por exemplo) , por exemplo, e é preferida a substituição por S. É preferível que ambos os oxigénios não ligantes sejam substituídos, por exemplo, e é mais preferível que ambos os oxigénios não ligantes sejam substituídos por S. Os exemplos do grupo fosfato assim modificado incluem fosforotiolatos, fosforoditiolatos, fosforosselenatos, boranofosfatos, ésteres boranofosfato, hidrogenofosfonatos, fosforoamidatos, alquilfosfonatos ou arilfosfonatos e fosfotriésteres. Em particular, é preferível fosforoditiolato no qual ambos os oxigénios não ligantes são substituídos por S.

No grupo fosfato, o(s) oxigénio (s) ligante(s) podem ser substituídos, por exemplo. 0(s) oxigénio(s) podem ser substituídos por qualquer átomo seleccionado de S (enxofre), C (carbono) e N (azoto), por exemplo. Os exemplos de grupos fosfato assim modificados incluem: fosforoamidatos em ponte resultantes da substituição por N; fosforotiolatos em ponte resultantes da substituição por S; e metilenofosfonatos em ponte resultantes da substituição por C. Preferentemente, a substituição do(s) oxigénio(s) em ponte é efectuada em pelo menos um dos resíduos de nucleótidos do terminal 5' e dos resíduos de nucleótidos do terminal 3' da molécula ssPN do presente invento, por exemplo. Quando a substituição é efectuada no lado 5' é preferida a substituição por C. Quando a substituição é efectuada no lado 3' , é preferida a substituição por N. 0 grupo fosfato pode ser substituído por um ligante isento de fosfato, por exemplo. 0 ligante pode conter siloxano, carbonato, carboximetilo, carbamato, amida, tioéter, ligante de óxido de etileno, sulfonato, sulfonamida, tioformacetal, formacetal, óxima, metilenoimino, metilenometilimino, metileno-hidrazo, metilenodimetil-hidrazo, metileno- oximetilimino ou semelhantes. Preferentemente, o ligante pode conter um grupo metilenocarbonilamino e um grupo metilenometilimino.

Na molécula ssPN do presente invento, por exemplo, pode modificar-se pelo menos um dos resíduos de nucleótidos no terminal 3' e um resíduo de nucleótido no terminal 5' . 0 resíduo de nucleótido num dos terminal 3' e terminal 5' pode ser modificado ou os resíduos de nucleótidos em ambos o terminal 3' e terminal 5' podem ser modificados, por exemplo. A modificação pode ser tal como descrito anteriormente, por exemplo, e é preferível modificar grupo (s) fosfato no(s) terminal (ais) . 0 grupo fosfato completo pode ser modificado ou um ou mais átomos no grupo fosfato podem ser modificados, por exemplo. No caso anterior, por exemplo, o grupo fosfato completo pode ser substituído ou deletado. A modificação de resíduo(s) de nucleótido(s) no terminal(ais) pode ser a adição de qualquer outra molécula ou semelhantes, por exemplo. Os exemplos de outras moléculas incluem moléculas funcionais tais como substâncias marcadoras, tal como descrito anteriormente, e grupos protectores. Os exemplos de grupos protectores incluem grupos contendo S (enxofre), Si (silício), B (boro) e éster. Podem usar-se moléculas funcionais, tais como substâncias marcadoras, na detecção e similares da molécula ssPN do presente invento, por exemplo. A outra molécula pode ser adicionada ao grupo fosfato do resíduo de nucleótido ou pode ser adicionada ao grupo fosfato ou ao resíduo açúcar através de um espaçador, por exemplo. 0 átomo terminal do espaçador pode ser adicionado ou substituir qualquer dos oxigénios ligantes do grupo fosfato ou 0, N, S, ou C do resíduo de açúcar, por exemplo. 0 local de ligação do resíduo de açúcar é de preferência, por exemplo, C na posição 3' , C na posição 5' ou qualquer átomo a eles ligados. 0 espaçador também pode ser adicionado ou substituir um átomo terminal do nucleótido alternativo, tal como PNA, por exemplo. 0 espaçador não é especialmente limitado e os seus exemplos incluem -(0¾) n-, -(0¾) nN-, -(0¾) n0-, -(0¾) nS-, 0 (CH2CH2O) nCtbCfhOH, açúcares abásicos, amida, carboxilo, amina, oxiamina, oxi-imina, tioéter, dissulfureto, tiureia, sulfonamida e morfolino e também reagentes biotina e reagentes fluoresceína. Nas fórmulas anteriores, n é um número inteiro positivo e é preferível n = 3 ou 6.

Outros exemplos da molécula a ser adicionada ao terminal incluem corantes, agentes de intercalação (e.g., acridinas), agentes de reticulação (e.g., psoralen, mitomicina C) , porfirinas (TPPC4, texafirina, Safirina), hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (e.g., fenazina, di-hidrofenazina), endonucleases artificiais (e.g. EDTA), transportadores lipofílicos (e.g., colesterol, ácido eólico, adamantano ácido acético, 1-pireno ácido butírico, di-hidrotestosterona, 1,3-bis-0-(hexadecil)glicerol, um grupo geraniloxi-hexilo, hexadecilglicerol, borneol, mentol, 1,3-propanodiol, um grupo heptadecilo, ácido palmítico, ácido mirístico, ácido 03-(oleoil)litocólico, ácido 03-(oleoil)eólico, dimetoxitritilo, ou fenoxazina), complexos peptídicos (e.g., péptido Antennapedia, péptido Tat), agentes alquilantes, fosfato, amino, mercapto, PEG (e.g., PEG-4 OK), MPEG, [MPEG]2, poliamino, alquilo, alquilo substituído, marcadores marcados radioquimicamente, enzimas, haptenos (e.g., biotina), facilitadores de transporte/absorção (e.g., aspirina, vitamina E, ácido fólico) e ribonucleases sintéticas (e.g., imidazole, bisimidazole, histamina, agregados de imidazole, complexos acridina-imidazole, complexos de Eu3+ de tetraazamacrociclos).

Na molécula ssPN do presente invento, o terminal 5' pode ser modificado com um grupo fosfato ou um análogo de grupo fosfato, por exemplo. Os exemplos de grupo fosfato incluem: 5' -monofosfato ( (HOà(0) P-0-5' ); 5' difosfato ( (HOà (O)P-O-P(HO) (0)-0-5' ); 5' -trifosfato (HOà(0)P-0-(HO) (O)P-O-P(HO) (0)-0-5' ); capuz 5' -guanosina (7-metil ou não metilado, 7m-G-0-5' - (HO) (0)P-0-(HO) (O)P-O-P(HO) (0)-0-5' ); capuz 5' -adenosina (Appp); qualquer estrutura em capuz de nucleótido modificado ou não modificado (N-0-5' -(HO) (O)P-O-(HO) (O)P-O-P(HO) (0)-0-5' ); 5' -monotiofosfato (fosforotiolato: (HOà (S)P-0-5' ); 5' -monoditiofosfato (fosforoditiolato: (HO)(HS)(S)P-0-5' ); 5' -fosforotiolato ( (HOà (0)P-S-5' ); monofosfatos, difosfatos e trifosfatos substituídos com enxofre (e.g., 5' - -tiotrifosfato, 5' - -tiotrifosfato semelhantes); 5' -fosforamidatos ( (HOà (0) P-NH-5' , (HO) (NH) (0) P-0-5' ); 5' -alquilfosfonatos (e.g., RP (OH) (0)-0-5' , (0H50)P-5' - CH2, em que R é alquilo (e.g., metilo, etilo, isopropilo, propilo ou semelhantes)); e 5' -alquileterfosfonatos (e.g., RP(OH)(0)-0-5' , em que R é alquiléter (e.g., metoximetilo, etoximetilo ou semelhantes)).

No resíduo de nucledtido, a base não é especialmente limitada. A base pode ser uma base natural ou uma base não natural, por exemplo. A base pode ser uma base derivada naturalmente ou uma base sintética, por exemplo. Pode usar-se como base, uma base comum (universal) , um seu análogo modificado e semelhantes, por exemplo.

Os exemplos de base incluem: bases purina tais como adenina e guanina; e bases pirimidina tais como citosina, uracilo e timina. Outros exemplos de base incluem inosina, timina, xantina, hipoxantina, nubularina, isoguanisina e tubercidina. Os exemplos de base também incluem: derivados alquilo tais como 2-aminoadenina, purina metilada na posição 6 e purina propilada na posição 2; 5-halouracilo e 5-halocitosina; 5-propiniluracilo e 5-propinilcitosina; 6-azouracilo, 6-azocitosina e 6-azotimina; 5-uracilo (pseudouracilo) , 4-tiouracilo, 5-halouracilo, 5- (2-aminopropil)uracilo, 5-aminoaliluracilo; purina halogenada, aminada, tiolada, tioalquilada, hidroxilada na posição 8 e outras purinas substituídas na posição 8; pirimidina trifluorometilada na posição 5 e outras pirimidinas substituídas na posição 5; 7-metilguanina; pirimidinas substituídas na posição 5; 6-azapirimidinas; purinas substituídas em N-2, N-6 e 0-6 (incluindo 2-aminopropiladenina); 5-propiniluracilo e 5-propinilcitosina; di-hidrouracilo; S-desaza-5-azacitosina; 2-aminopurina; 5-alquiluracilo; 7-alquilguanina; 5-alquilcitosina; 7-desaza-adenina; N6,N6-dimetiladenina; 2,6-diaminopurina; 5-amino-alil-uracilo; N3-metiluracilo; 1,2,4-triazolas substituídas; 2-piridinona; 5-nitroindole; 3-nitropirrole; 5-metoxiuracilo; ácido uracilo-5-oxiacético; 5-metoxicarbonilmetiluracilo; 5-metil-2-tiouracilo; 5-metoxicarbonilmetil-2-tiouracilo; 5-metilaminometil-2-tiouracilo; S-(S-amino-3-carboxipropil)uracilo; S-metilcitosina; 5-metilcitosina; N4-acetilcitosina; 2-tiocitosina; N6-metiladenina; N6-isopentiladenina; 2-metiltio-N6-isopenteniladenina; N-metilguanina; e bases alquiladas em 0. Os exemplos de purinas e pirimidinas incluem as divulgadas em patente U.S. No. 3 687 808, "Concise Encyclopedia of Polymer Science and

Engineering", p. 858 a 859, editado por Kroschwitz J. I, John Wiley & Sons, 1990 e Englisch et al, Angewandte Chemie, International Edition, 1991, vol. 30, p. 613.

Outros exemplos de resíduos de nucleótidos modificados incluem os que não têm base, i.e., os que têm um esqueleto ribofosfato abásico. Além disso podem ser usados como resíduo de nucleótido modificado os descritos em pedido internacional No. WO 2004/080406 (data de apresentação: 8 de Março de 2004), por exemplo. 3. Método de síntese da molécula ssPN do presente invento O método para sintetizar a molécula ssPN do presente invento não é especialmente limitado e pode usar-se um método conhecido convencional. Os exemplos do método incluem métodos de síntese de acordo com procedimentos de engenharia genética e métodos de síntese química. Os exemplos de procedimentos de engenharia genética incluem: métodos de síntese que utilizam transcrição in vitro; métodos usando um vector; e métodos efectuados usando uma cassete de PCR. O vector não é especialmente limitado e os seus exemplos incluem vectores não víricos, tais como plasmídeos, e vectores víricos. Os exemplos descritos anteriormente são meramente ilustrativos e o método de síntese não se lhes limita. Os métodos de síntese química não são especialmente limitados e os seus exemplos incluem um método de fosforamidite e um método de H-fosfonato. Os métodos de síntese química podem ser efectuados usando um sintetizador de ácidos nucleicos automatizado disponível comercialmente, por exemplo. Nos métodos de síntese química usa-se geralmente uma amidite. A amidite não é especialmente limitada. Os exemplos de amidites disponíveis comercialmente incluem ARN fosforamidites (2' -O-TBDMSi, nome comercial, Samchully Pharm. Co., Ltd.), ACE amidite, TOM amidite, CEE amidite, CEM amidite e TEM amidite. Na síntese da molécula ssPN do presente invento é preferível usar o monómero do presente invento a ser descrito seguidamente para a síntese da(s) região(ões) ligante(s) representadas pela fórmula (I), por exemplo. 4. Composição A composição de inibição de acordo com o presente invento é, tal como descrito anteriormente, uma composição para inibir a expressão de um gene alvo, contendo a molécula ssPN do presente invento. A composição do presente invento é caracterizada por conter a molécula ssPN do presente invento e outras configurações não são limitadas de modo algum. A composição de inibição do presente invento também se pode denominar reagente de inibição, por exemplo.

Por administração da composição a um indivíduo no qual está presente o gene alvo, é possível inibir a expressão do gene alvo.

Adicionalmente, tal como descrito anteriormente, a composição farmacêutica de acordo com o presente invento contém a molécula ssPN do presente invento. A composição farmacêutica do presente invento é caracterizada por conter a molécula ssPN do presente invento e outras configurações não são limitadas de modo algum. A composição farmacêutica do presente invento também pode ser denominada agente farmacêutico, por exemplo.

Por administração da composição farmacêutica a um doente com uma doença causada por um gene, é possível inibir a expressão do gene, tratando assim a doença. A expressão "tratamento" abrange: prevenção de doenças; melhoria de doenças; e melhoria de prognóstico, por exemplo, e pode significar qualquer um deles.

Uma doença a ser tratada não é especialmente limitada e os seus exemplos incluem doenças causadas pela expressão de genes. Dependendo do tipo de doença, pode ter-se como gene alvo um gene que causa a doença e adicionalmente, dependendo do gene alvo, pode seleccionar-se a sequência de inibição de expressão como adequado.

Um exemplo específico é o seguinte. Assumindo o gene TGF-1 como gene alvo e incorporando uma sequcia de inibição de expressão para este gene na molécula ssPN, a molécula ssPN pode ser usada para o tratamento de doenças inflamatórias, especificamente, lesão pulmonar aguda e semelhantes, por exemplo. 0 método de usar a composição de inibição e a composição farmacêutica (doravante, ambas as composições são simplesmente denominadas "as composições") não são especialmente limitados, e os seus exemplos incluem administrar a molécula ssPN a um indivíduo com o gene alvo.

Os exemplos do indivíduo ao qual se administra a molécula ssPN do presente invento incluem células, tecidos e órgãos. Os exemplos do indivíduo também incluem animais humanos e não humanos tais como mamíferos não humanos, i.e. mamíferos excluindo humanos. A administração pode ser efectuada in vivo ou in vitro, por exemplo. As células não são especialmente limitadas e os seus exemplos incluem: várias células em cultura tais como células HeLa, células 293, células NIH3T3 e células COS; células estaminais tais como células ES e células estaminais hematopoiéticas; e células isoladas de organismos vivos, tais como células primárias em cultura. 0 método de administração não é especialmente limitado e pode ser determinado tal como adequado dependendo do indivíduo, por exemplo. Quando o indivíduo é uma célula em cultura, o método de administração pode ser um método usando um reagente de transfecção, um método de electroporação ou semelhantes, por exemplo. Quando a administração é efectuada in vivo, a administração pode ser administração oral ou administração parentérica, por exemplo. Os exemplos de administração parentérica incluem injecção, administração subcutânea e administração local.

Cada uma das composições do presente invento pode conter apenas a molécula ssPN do presente invento ou adicionalmente pode conter aditivo(s) além da molécula ssPN, por exemplo. 0 aditivo não é especialmente limitado e de preferência é um aditivo farmaceuticamente aceitável, por exemplo. 0 tipo de aditivo não é especialmente limitado e pode ser seleccionado como adequado dependendo do tipo de indivíduo, por exemplo.

Na composição do presente invento, o ssPN pode formar um complexo com o aditivo, por exemplo. 0 aditivo pode também ser denominado agente de complexação, por exemplo. 0 complexo permite que a molécula ssPN seja entregue eficazmente, por exemplo. A ligação entre a molécula ssPN e o agente de complexação não é especialmente limitada; e os seus exemplos incluem ligação não covalente. 0 complexo pode ser um complexo de inclusão ou semelhante, por exemplo. 0 agente de complexação não é especialmente limitado e os seus exemplos incluem polímeros, ciclodextrinas e adamantina. Os exemplos de ciclodextrinas incluem copolimeros de ciclodextrina lineares e copolimeros de ciclodextrina oxidados lineares.

Outros exemplos do aditivo incluem um transportador, uma substância de ligação que se liga a uma célula alvo, um agente de condensação e um agente fusogénico. 0 transportador de preferência é um polímero, com maior preferência um biopolimero, por exemplo. Preferentemente, o transportador é biodegradável, por exemplo. Os exemplos do transportador incluem: proteínas tais como albumina de soro humana (HSA), lipoproteina de baixa densidade (LDL) e globulina; hidratos de carbono tais como, por exemplo, dextrano, pululano, quitina, quitosano, inulina, ciclodextrina e ácido hialurónico; e lipidos. Como transportador também pode ser usado um polímero sintético tal como um poliaminoácido sintético, por exemplo. Os exemplos de poliaminoácidos incluem polilisina (PLL), poliácido-L-aspártico, poliácido-L-glutâmico, copolímero estireno-anidrido maléico, copolimero poli (L-lactídeo-co-glicolídeo) copolimero diviniléter-anidrido maléico, copolimero N-(2-hidroxipropil)metacrilamida (HMPA), polietilenoglicol (PEG), polivinilálcool (PVA), poliuretano, poli (ácido 2-etilacrílico), polímero N-isopropilacrilamida e polifosfazina.

Os exemplos da substância de ligação incluem hormona estimulante da tiróide, hormona estimulante de melanócitos, lectina, glicoproteinas, tensioactivo de proteína A, hidrato de carbono mucina, lactose multivalente, galactose multivalente, N-acetil-galactosamina, N-acetil-glucosamina, manose multivalente, fucose multivalente, poliaminoácido glicosilado, galactose multivalente, transferrina, bisfosfonato, poli-ácido glutâmico, poli-ácido aspártico, lípidos, colesterol, esteróides, ácido biliar, folato, vitamina B12, biotina, Neproxin, péptido RGD e péptido mimético RGD.

Os exemplos do agente fusogénico e o agente de condensação incluem cadeias poliamino tais como polietilenoimina (PEI). PEI pode ser linear ou ramificado e pode também ser sintético ou de ocorrência natural, por exemplo. 0 PEI pode ser substituído com um alquilo ou um lípido, por exemplo. Como agente fusogénico, é também possível usar poli-histidina, poli-imidazole, polipiridina, polipropilenoimina, melitina, uma substância poliacetal (e.g., poliacetal catiónico ou semelhante) ou semelhantes, por exemplo. 0 agente fusogénico pode ter uma estrutura em hélice , por exemplo. 0 agente fusogénico pode ser um agente de ruptura de membrana tal como melitina, por exemplo.

Relativamente às composições de acordo com o presente invento, por exemplo, a formação de complexo e semelhantes são descritas em patente U.S. No. 6 509 323, publicação de patente U.S. No. 200310008818 e WO 2004/080406.

Outros exemplos do aditivo incluem moléculas anfifílicas. A molécula anfifílica é uma molécula com uma região hidrofóbica e uma região hidrofílica, por exemplo. A molécula de preferência é um polímero, por exemplo. O polímero pode ter, por exemplo, uma estrutura secundária, de preferência uma estrutura secundária repetitiva. Especificamente, é preferido um polipéptido e são mais preferidos polipéptidos em hélice e semelhantes, por exemplo. O polímero anfifílico pode ser um polímero com duas ou mais subunidades anfifílicas, por exemplo. Os exemplos de

subunidade incluem subunidades com uma estrutura cíclica com pelo menos um grupo hidrofílico e um grupo hidrofóbico. A subunidade pode conter esteróide tal como um ácido eólico, uma estrutura aromática e semelhantes, por exemplo. O polímero pode conter, por exemplo, tanto uma subunidade com estrutura cíclica, tal como uma subunidade aromática, como um aminoácido. 5. Método de inibição A expressão de um gene alvo pode ser inibida quando se usa a molécula ssPN do presente invento. 0 método de efectuar tal inibição é caracterizado por se usar a molécula ssPN do presente invento e as outras etapas e condições não são de modo algum limitadas. 0 mecanismo pelo qual se inibe a expressão génica não é especialmente limitado e os seus exemplos incluem inibição da expressão por interferência de ARN. 0 método de inibição é, por exemplo, um método para induzir interferência de ARN que inibe a expressão de um gene alvo e também pode ser denominado método de inibição que é caracterizado pelo uso da molécula ssPN do presente invento. 0 método de inibição inclui a etapa de administrar a molécula ssPN a um indivíduo no qual está presente o gene alvo, por exemplo. Através da etapa de administração, a molécula ssPN é posta em contacto com o indivíduo ao qual se administra a molécula ssPN, por exemplo. De acordo com o método in vitro do invento, a molécula ssPN é administrada a células, tecidos e órgãos. Os exemplos do indivíduo também incluem animais humanos e não humanos, tais como mamíferos não humanos, i.e., mamíferos excluindo humanos. A administração pode ser efectuada in vivo ou in vitro, por exemplo.

No método de inibição, a molécula ssPN pode ser administrada sozinha ou pode ser administrada a composição do presente invento contendo a molécula ssPN, por exemplo. 0 método de administração não é especialmente limitado e pode ser seleccionado tal como adequado dependendo do tipo de indivíduo, por exemplo. 6. Método de tratamento

Pode tratar-se uma doença por um método que inclui a etapa de administrar a molécula ssPN do presente invento a um doente e a molécula ssPN inclui, como sequência de inibição de expressão, uma sequência que inibe a expressão de um gene que causa a doença. 0 método de tratamento é caracterizado por se usar a molécula ssPN do presente invento e as outras etapas e condições não são de modo algum limitadas. A descrição relativa ao método de inibição também se aplica ao método de tratamento, por exemplo.

7. Uso da molécula ssPN A molécula ssPN do presente invento é usada para inibir a expressão de um gene alvo. Igualmente, a molécula ssPN do presente invento é usada para induzir interferência de ARN. A molécula de ARN de acordo com o presente invento é uma molécula de ARN para uso no tratamento de uma doença. A molécula de ARN é a molécula ssPN do presente invento e a molécula ssPN inclui, como sequência de inibição de expressão, uma sequência que inibe a expressão de um gene que causa a doença. 8. Monómero

Um monómero para síntese de ácido nucleico tem a estrutura da seguinte fórmula (II). A descrição relativa à molécula ssPN do presente invento também se aplica ao monómero, salvo indicação em contrário.

Através do uso de tal monómero na síntese da molécula ssPN do presente invento, as regiões ligantes (Lx) e (Ly) representadas pela fórmula (I) podem ser sintetizadas facilmente. 0 monómero pode ser usado uma amidite para síntese automatizada de ácido nucleico, por exemplo, e é aplicável geralmente a sintetizadores automáticos de ácido nucleico, por exemplo. Os exemplos do método de síntese incluem um método de fosforamidite e um H-fosfonato.

Na fórmula, X1 e X2 são cada independentemente H2, 0, S ou NH; Y1 e Y2 são cada independentemente uma ligação simples, CH2, NH, 0 ou S; R1 e R2 são cada independentemente H, um grupo protector, ou um grupo protector fosfato; R3 é um átomo de hidrogénio ou substituinte que está ligado a C-3, C-4, C-5 ou C-6 num anel A; L1 é uma cadeia alquileno composta por n átomos e átomo(s) de hidrogénio em átomos de carbono de alquileno podem ou não ser substituídos por OH, 0Ra, NH2, NHRa, NRaRb, SH, ou SRa ou, L1 é uma cadeia poliéter obtida por substituição de pelo menos um átomo de carbono na cadeia alquileno por um átomo de oxigénio, desde que: quando Y1 é NH, 0 ou S, um átomo ligado a Y1 em L1 é carbono, um átomo ligado a OR1 em L1 é carbono e os átomos de oxigénio não estão adjacentes entre si; L1 é uma cadeia alquileno composta por m átomos e átomo(s) de hidrogénio em átomos de carbono de alquileno podem ou não ser substituídos por OR, 0RC, NH2, NHRC, NRcRd, SH, ou SRC ou L2 é uma cadeia poliéter obtida por substituição de pelo menos um átomo de carbono na cadeia alquileno por um átomo de oxigénio, desde que: quando Y2 é NH, 0 ou S, um átomo ligado a Y2 em L2 é carbono, um átomo ligado a OR2 em L2 é carbono e os átomos de oxigénio não estão adjacentes entre si;

Ra, Rb, Rc e Rd são cada qual independentemente um substituinte ou um grupo protector; 1 é 1 ou 2; m é um número inteiro na gama de 0 a 30; e n é um número inteiro na gama de 0 a 30.

Relativamente às partes em comum entre a fórmula (II) e a fórmula (I), as descrições efectuadas anteriormente relativas à fórmula (I) também se aplicam à fórmula (II). Especificamente, na fórmula (II), relativamente a X1, X2, Y1, Y2, R3, L1, L2, 1, m, n e ao anel A, por exemplo, aplicam-se todas as descrições acerca deles feitas anteriormente relativamente à fórmula (I).

Na fórmula (II), R1 e R2 são cada independentemente H, um grupo protector ou um grupo protector fosfato, tal como descrito anteriormente. O grupo protector é tal como descrito anteriormente relativamente à fórmula (I), por exemplo. Especificamente, o grupo protector pode ser seleccionado do grupo I, por exemplo. O grupo I inclui, por exemplo, um grupo dimetoxitritilo (DMTr) , um grupo TBDMS, um grupo ACE, um grupo TOM, um grupo CEE, um grupo CEM, um grupo TEM e grupos contendo sililo representados pela fórmula seguinte. Em particular, é preferível que o grupo protector seja o um grupo DMtr ou qualquer dos grupos contendo sililo.

O grupo protector fosfato pode ser representado pela fórmula seguinte, por exemplo. -P (OR6) (NR7R8)

Na fórmula, R5 é um átomo de hidrogénio ou qualquer substituinte. O substituinte R6 de preferência é um grupo hidrocarboneto e o grupo hidrocarboneto pode ou não ser substituído por um grupo atractor de densidade electrónica, por exemplo. Os exemplos do substituinte R6 incluem halogénios, haloalquilos, heteroarilos, hidroxialquilos, alcoxialquilos, aminoalquilos, sililos, sililoxialquilos, heterociclilalcenilos, heterociclilalquilos, heteroarilalquilos e hidrocarbonetos tais como alquilos, alcenilos, alcinilos, arilos, arilalquilos, cicloalquilos, cicloalcenilos, cicloalquilalquilos e ciclilalquilos. Além disso, o substituinte R6 pode ou não ser substituído com um grupo atractor de densidade electrónica. Os exemplos específicos do substituinte R6 incluem um grupo -cianoetilo, um grupo nitrofeniletilo e um grupo metilo. R7 e R8 são cada um átomo hidrogénio ou qualquer substituinte e podem ser iguais ou diferentes. Os substituintes R7 e R8 de preferência são cada um grupo hidrocarboneto e o grupo hidrocarboneto pode ou não ser substituído com qualquer substituinte. Os exemplos do grupo hidrocarboneto são os mesmos listados na descrição anterior relativa a R6 e o grupo hidrocarboneto de preferência é um grupo metilo, um grupo etilo ou um grupo isopropilo. Neste caso, os exemplos específicos de -NR7R8 incluem um grupo di-isopropilamino, um grupo dietilamino e um grupo etilmetilamino. Alternativamente, os substituintes R7 e R8 conjuntamente (i.e., -NR7R8 como um todo) podem formar um anel contendo azoto (e.g., um grupo piperidilo, um grupo morfolino ou semelhantes) com átomo (s) de azoto aos quais se ligam.

Especificamente, o grupo protector fosfato pode ser seleccionado do grupo II descrito seguidamente. 0 grupo II inclui -P (OCH2CH2CN) (N (i-Pr) 2) e -P (OCH3) (N (i-Pr) 2) , por exemplo. Nas fórmulas anteriores, i-Pr indica isopropilo.

Na fórmula (II), por exemplo, um de R1 e R2 é H ou um grupo protector e o outro é H ou um grupo protector fosfato. Por exemplo, é preferível que, quando R1 é um grupo protector, R2 seja H ou um grupo protector fosfato. Especificamente, é preferível que, quando R1 é seleccionado do grupo I, R2 seja H ou seja seleccionado do grupo II. Igualmente, é preferível, por exemplo, que quando R1 é um grupo protector fosfato, R2 seja H ou um grupo protector. Especificamente, é preferível que quando R1 é seleccionado do grupo II, R2 seja H ou seja seleccionado do grupo I.

Os exemplos da estrutura da formula (II) incluem as seguintes formulas (11 — 1) a (II-9) . Nas formulas seguintes, n e m são iguais aos da formula (II) . Nas formulas seguintes, q é um número inteiro de 0 a 10.

Nas formulas (11 — 1) a (11 — 9) , n, m e q não são especialmente limitados e são tal como descrito anteriormente. Os exemplos específicos são os seguintes: na fórmula (II-I), n = 8; na fórmula (11 — 2), n = 3; na fórmula (11 — 3), n = 4 ou 8; na fórmula (11 — 4), n = 7 ou 8; na fórmula (11 — 5), n = 3 e m = 4; na fórmula 5 (11 — 6) , n = 8 e m = 4; na fórmula (II-7), n = 8 e m = 4; na fórmula (11 — 8), n = 5em=4; ena fórmula (II — 9), q=lem=4. A fórmula seguinte (II-4a) apresenta um exemplo da fórmula (11 — 4) (n = 8) e a fórmula seguinte (II-8a) apresenta um exemplo da fórmula (1-8) (n = 5, m = 4).

0 monómero de preferência inclui a substância marcadora descrita anteriormente, por exemplo. É particularmente preferido que o monómero inclua o isótopo estável descrito anteriormente. A substância marcadora é tal como descrita anteriormente.

Quando o monómero inclui um isótopo tal como o isótopo estável, o isótopo pode ser introduzido na molécula ssPN do presente invento facilmente, por exemplo. 0 monómero incluindo um isótopo pode ser sintetizado a partir, por exemplo, de uma matéria prima com um esqueleto pirrolidina no qual se introduz o isótopo e uma matéria prima com um esqueleto piperidina no qual se introduzir o isótopo. Os exemplos de matéria prima com um esqueleto pirrolidina incluem prolina e prolinol.

Os seguintes esquemas ilustram como se sintetizam os monómeros nos quais se introduziu um isótopo estável usando, como matéria prima, prolina e prolinol cada um dos quais com um isótopo estável incluído. Os esquemas seguintes são meramente ilustrativos.

Pode preparar-se prolinol com um hidrogénio pesado (D) nele introduzido, que é um exemplo de prolinol com um isótopo estável nele introduzido, por tratamento de prolina com LÍAID4, tal como apresentado no seguinte esquema, por exemplo.

Pode preparar-se prolina com um oxigénio pesado (180) nela introduzido, que é um exemplo de prolina com um isótopo estável nela introduzido, por reacção de metiléster de prolina com H2180 em condições básicas, tal como apresentado no seguinte esquema, por exemplo.

Prolina com azoto pesado (15N) introduzido (prolina-15N) e prolinol com azoto pesado (15N) introduzido (prolinol-15N) pode ser sintetizado de acordo com o seguinte esquema, por exemplo. Especificamente, primeiramente faz-se reagir furano ou tetra-hidrofurano com 16NH3 para preparar pirrole com azoto pesado (15N) introduzido. Este é então formilado, obtendo assim 2-formilpirrole com azoto pesado (15N) introduzido. Pode sintetizar-se prolina-15N por oxidação deste a um ácido carboxílico e seguidamente reduzindo a parte pirrole. Igualmente, por redução de 2-formilpirrole com azoto pesado (15N) introduzido, pode sintetizar-se prolinol-15N.

Pode sintetizar-se prolina com carbono pesado (13C) introduzido (prolina-13C) e prolinol com carbono pesado (13C) introduzido (prolinol-13C) de acordo com o seguinte esquema, por exemplo. Ou seja, primeiramente formila-se pirrole com DMF com carbono pesado (13C) introduzido (DMF-13C), obtendo assim 2-formilpirrole com (13C) introduzido. Pode sintetizar-se prolina-13C por oxidação deste a um ácido carboxílico e seguidamente reduzindo a parte a pirrole. Igualmente, por redução de 2-formilpirrole com carbono pesado (13C) introduzido pode sintetizar-se prolinol-13C.

Pode sintetizar-se um monómero com um isótopo estável nele introduzido da forma descrita anteriormente. Utilizando o monómero como amidite para síntese de ácido nucleico, pode sintetizar-se uma molécula de ácido nucleico no qual se introduziu um isótopo estável na região ligante.

Seguidamente, o presente invento será descrito detalhadamente com referência a exemplos e semelhantes. Deve salientar-se, contudo, que o presente invento não está de modo algum limitado a estes.

Exemplos (Exemplo Al) 1. Síntese de prolinol

Sintetizou-se prolinol protegido com um grupo dimetoxitritilo de acordo com o seguinte esquema 1.

(1) Fmoc-L-prolinol (Composto 2)

Dissolveu-se L-prolinol (composto 1) (0,61 g, 6,0 mmol) em 70 ml de água pura, preparando assim uma solução aquosa de L-prolinol. Dissolveu-se N-(9- fluorenilmetoxicarboniloxi)succinimida (Fmoc-OSu) (2,0 g, 6,0 mmol) em 10 ml de THF. Adicionou-se esta solução de THF à solução aquosa de L-prolinol e agitou-se durante 1 hora de modo a fazer reagir L-prolinol com Fmoc-OSu. Separou-se a solução reaccional numa fracção líquida e uma fracção de precipitado. Sujeitaram-se estas fracções respectivamente a extracção com acetato de etilo e recolheram-se delas as respectivas camadas orgânicas. As camadas orgânicas assim obtidas foram misturadas conjuntamente e adicionou-se sulfato de sódio anidro para absorver a humidade (doravante este processo é denominado processo de "secagem"). Filtraram-se as camadas orgânicas e concentrou-se o filtrado obtido por vácuo. A substância residual obtida foi purificada por cromatografia em coluna de silica-gel (eluente: hexano : acetato de etilo = 1 : 1) . Assim, obteve-se o composto 2 (1,4 g, rendimento: 74%). Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. íH-RMN (CDCI3) : 7,77 (2H, d, J = 7,7 Hz, Ar-H) , 7,60 (2H, d, J = 7,3 Hz, Ar-H), 7,40 (2H, t, J = 7,5 Hz, Ar-H), 7,31 (2H, t, J = 7,6 Hz, Ar-H), 4,40-4,50 (2H, m, COOCH2) , 4,22 (1H, t, J = 6,5 Hz, Ar-CH), 3,20-3,80 (5H, m, H-5, H-6), 1,75 (3H, m, H-3, H-4), 1,40 (1H, m, H-3). (2) Fmoc-DMTr-L-prolinol (composto 3)

Dissolveu-se Fmoc-L-prolinol (composto 2) (1,4 g, 4,3 mmol) em 20 ml de piridina e fez-se destilação azeotrópica três vezes. Dissolveu-se a substância residual obtida em 20 ml de piridina. Agitou-se esta solução num banho de gelo sob árgon e adicionou-se cloreto de 4,4' -dimetoxitritilo (DMTr-Cl) (1,8 g, 5,3 mmol). Seguiu-se a reacção nesta solução reaccional por TLC usando clorofórmio/metanol e deixou-se a reacção prosseguir durante 4 horas até deixar de se observar uma mancha de Fmoc-L-prolinol. De modo a parar o excesso de DMTr-Cl, adicionou-se 3 ml de metanol à solução reaccional e agitou-se durante 10 minutos. Adicionou-se adicionalmente clorofórmio à solução reaccional e seguidamente recolheu-se uma camada orgânica. Lavou-se a camada orgânica recolhida com solução salina saturada, seguidamente com solução aquosa de hidrogenocarbonato de sódio a 5% e novamente com solução salina saturada. Secou-se a camada orgânica assim lavada com sulfato de sódio anidro. Seguidamente, filtrou-se a camada orgânica e concentrou-se o filtrado obtido sob vácuo. Purificou-se a substância residual obtida por cromatografia em coluna de silica-gel (eluente: clorofórmio, piridina a 1%).

Obteve-se assim o composto 3 (2,0 g, rendimento: 74%).

Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. 1H-RMN (CDCI3) : 7,77 (2H, d, J = 7,7 Hz, Ar-H), 7,60 (2H, d, J = 7,3 Hz, Ar-H), 7,40-7,18 (13H, m, Ar-H), 6,89 (4H, d, J = 8,6 Hz, Ar-H), 4,20-4,40 (2H, m, COOCH2) , 4,02 (1H, t, J = 6,5 Hz, Ar-CH), 3,80-3,10 (5H, m, H- 5, Η-6) , 3,73 (s, 6Η, OCH3) , 1,84 (3Η, m, Η-3, Η-4), 1,58 (1Η, m, Η-3). (3) DMTr-L-prolinol (Composto 4)

Dissolveu-se Fmoc-DMTr-L-prolinol (composto 3) (2,0 g, 3,2 mmol) em 25 ml de uma solução de DMF contendo piperidina a 20% e agitou-se durante 12 horas. Concentrou-se a solução sob vácuo e purificou-se a substância residual obtida por cromatografia em coluna de sílica-gel (clorofórmio : metanol = 85 : 15, contendo piridina a 1%). Assim, obteve-se o composto 4 (1,0 g, rendimento: 78%). Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. 1H-RMN (CDCls) 7,40-7,14 (9H, m, Ar-H) , 6,82 (4H, d, J = 8,6 Hz, Ar-H) , 3,78 (6H, s, OCH3) , 3,31 (1H, m, H-6), 3,07 (2H, m, H- 2, H-6), 2,90 (2H, m, H-5), 1,84 (3H, m, Η-3, H-4), 1,40 (1H, m, H-3). 2. Síntese de derivados de amidite

Seguidamente, sintetizaram-se derivados de amidite contendo prolinol de acordo com o seguinte esquema 2. Doravante refere-se cloridrato de l-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida como "EDC" e N,N-dimetilaminopiridina (4-dimetilaminopiridina) como "DMAP".

(1) DMTr-amido-L-prolinol (composto 5)

Dissolveu-se DMTr-L-prolinol (composto 4) (0,80 g, 2,0 mmol), EDC (0,46 g, 2,4 mmol) e DMAP (0,29 g, 2,4 mmol) em 20 ml de diclorometano e seguidamente agitou-se. Adicionou-se ácido 10-hidroxidecanóico (0,45 g, 2,4 mmol) a esta solução e seguidamente agitou-se. Seguiu-se a reacção nesta solução reaccional por TLC usando acetato de etilo e deixou-se a reacção prosseguir durante 20 horas até deixar de se observar uma mancha de DMTr-L-prolinol. Seguidamente adicionou-se diclorometano à solução reaccional e recolheu-se uma camada orgânica. A camada orgânica recolhida foi lavada com solução salina saturada e seguidamente seca com sulfato de sódio anidro. Filtrou-se a camada orgânica e concentrou-se o filtrado obtido sob vácuo. Purificou-se a substância residual por cromatografia em coluna de sílica-gel (acetato de etilo, contendo piridina a 1%). Assim obteve-se o composto 5 (0,71 g, rendimento: 62%) . Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. 1H-RMN (CDCI3) 7,40-7,14 (9H, m, Ar-H), 6,82 (4H, d, J = 8,6 Hz, Ar-H), 3,78 (6H, s, OCH3) , 3, 68-2, 93 (7H, m, H-2, H-5, H-6), 2,27-1,72 (6H, m, alquilo, H-3, H-4), 1,58 (4H, s, alquilo), 1,30 (10H, s, alquilo). (2) DMTr-alquil-L-prolinol (composto 6)

Dissolveu-se DMTr-L-prolinol (composto 4) (0,80 g, 2,0 mmol) em 15 ml de metanol. Adicionou-se 5-hidroxipentanal (0,31 g, 3,0 mmol) e seguidamente agitou-se. Adicionou-se cianoboro-hidreto de sódio (0,25 g, 4,0 mmol) a esta solução e seguidamente agitou-se adicionalmente. Seguiu-se a reacção nesta solução reaccional por TLC usando acetato de etilo/hexano e deixou-se a reacção prosseguir durante 24 horas até deixar de se observar uma mancha de DMTr-L-prolinol. Adicionou-se acetato de etilo à solução reaccional e recolheu-se uma camada orgânica. Lavou-se a camada orgânica recolhida com solução salina saturada e seguidamente secou-se com sulfato de sódio anidro. Filtrou-se a camada orgânica e concentrou-se o filtrado obtido sob vácuo. Purificou-se a substância residual por cromatografia em coluna de sílica-gel (hexano: acetato de etilo = 1:1, contendo piridina a 1%) .

Assim, obteve-se o composto 6 (0,62 g, rendimento: 63%).

Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. 1H-RMN(CDCI3) : 7,40-7,14 (9H, m,

Ar-H) , 6,82 (4H, d, J = 8,6 Hz, Ar-H) , 3,78 (6H, s, OCH3) , 3,70-2,86 (4H, m, CH2OH, H-6), 2,06-1,79 (5H, m, alquilo, H-2, H-5), 1,74-1,49 (6H, m, alquilo, H-3, H-4), 1,45-1,27 (4H, m, alquilo). (3) DMTr-uretano-L-prolinol (composto 7)

Dissolveu-se 1,4-butanodiol (0,90 g, 10 mmol) em 30 ml de diclorometano. Adicionou-se adicionalmente carbonildiimidazole (1,4 g, 8,6 mmol) e agitou-se durante 3 horas. Lavou-se uma camada orgânica desta solução reaccional com solução salina saturada e seguidamente secou-se com sulfato de sódio anidro. Filtrou-se a camada orgânica e concentrou-se o filtrado obtido sob vácuo. A substância residual foi purificada por cromatografia em coluna de sílica-gel (clorofórmio : metanol = 9 : 1) . Assim, obteve-se um composto no qual uma extremidade de 1,4-butanodiol foi activada com carbonildiimidazole (0,25 g, 1,5 mmol). Dissolveu-se este composto em 15 ml de diclorometano. Adicionou-se DMTr-L-prolinol (composto 4) (0,6 g, 1,5 mmol) e agitou-se durante 24 horas. Adicionou-se adicionalmente acetato de etilo a esta mistura e recolheu-se uma camada orgânica. Lavou-se a camada orgânica recolhida com solução salina saturada e seguidamente secou-se com sulfato de sódio anidro. Filtrou-se a camada orgânica e secou-se o filtrado obtido sob vácuo. Purificou-se a substância residual por cromatografia em coluna de sílica-gel (hexano : acetato de etilo = 1:1, contendo piridina a 1%) . Assim, obteve-se o composto 7 (0,61 g, rendimento: 77%). Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. íH-RMN (CDCI3) : 7,40-7,14 (9H, m, Ar-H), 6,82 (4H, d, J = 8,6 Hz, Ar-H), 4,24-3, 94 (2H, m, COOCH2) , 3,78 (s, 6H, OCH3), 3,72-2, 96 (7H, m, alquilo, H-2, H-5, H-6), 2,10-1,30 (8H, m, alquilo, H-3, H-4). (4) DMTr-ureido-L-prolinol (composto 8)

Dissolveu-se DMTr-L-prolinol (Composto 4) (0,50 g, 1,2 mmol) e trifosgénio (0,12 g, 0,40 mmol) em 8 ml de diclorometano e agitou-se a mistura resultante em banho de gelo sob árgon. Adicionou-se N,N-diisopropiletilamina (0,31 g, 2,4 mmol) à solução e agitou-se durante 1 hora. Seguidamente adicionou-se adicionalmente 8-amino-l-octanol (0,17 g, 1,2 mmol) e agitou-se durante 30 minutos num banho de gelo da mesma forma anterior. Seguidamente, agitou-se adicionalmente à temperatura ambiente durante 20 horas. Adicionou-se diclorometano à solução e recolheu-se uma camada orgânica. Lavou-se a camada orgânica recolhida com solução salina saturada e seguidamente secou-se com sulfato de sódio anidro. Filtrou-se a camada orgânica e concentrou-se o filtrado obtido sob vácuo. Purificou-se a substância residual por cromatografia em coluna de sílica-gel (hexano: acetato de etilo =4:1, contendo trietilamina a 1%). Assim, obteve-se o composto 8 (0,44 g, rendimento: 62%). Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. íH-RMN (CDC13) : 7,40-7,14 (9H, m, Ar-H) , 6,82 (4H, m, Ar-H), 3,78 (s, 6H, OCH3) , 3, 68-3, 25 (9H, m, CH2NH, CH2OH, H-2, H-5, H-6), 1,74-1,18 (16H, m, alquilo, H-3, H-4). (5) Derivados de amidite com prolinol (compostos 9 a 12)

Sintetizaram-se os compostos 9 a 12 da seguinte forma usando os prolinóis modificados (compostos 5 a 8), respectivamente, como matérias-primas. Dissolveram-se cada um dos prolinóis modificados e 5-benziltio-lH-tetrazole em 3 ml de acetonitrilo. A quantidade do prolinol modificado usada foi a seguinte: composto 5: 0,69 g (1,2 mmol); composto 6: 0,60 g (1,2 mmol); composto 7: 0,60 g (1,2 mmol); e composto 8: 0,25 g (0,43 mmol). A quantidade de 5-benziltio-lH-tetrazole usada foi: 0,15 g (0,78 mmol) para os compostos 5 a 7; e 54 mg (0,15 mmol) para o composto 8. Adicionou-se sob árgon 2-cianoetil-N, Ν,Ν' ,Ν' -tetraisopropilfosforodiamidite à solução e agitou-se durante 2 horas. A quantidade de 2-cianoetil-N,N,Ν' , Ν' -tetraisopropilfosforodiamidite adicionada foi: 0,54 g (1,8 mmol) em sistemas usando os compostos 5 a 7; e 0,19 g (0,64 mmol) num sistema usando o composto 8. Seguidamente,

adicionou-se à solução uma solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio e extraiu-se uma camada orgânica com diclorometano e recolheu-se. Secou-se a camada orgânica recolhida com sulfato de sódio anidro. Filtrou-se a camada orgânica e concentrou-se o filtrado obtido sob vácuo. A substância residual foi purificada por cromatografia em coluna de sílica-gel (hexano : acetato de etilo =1:1, contendo trietilamina a 1%) . Assim obtiveram-se os compostos 9 a 12. Apresentam-se seguidamente os resultados da análise de RMN relativa a estes compostos. DMTr-amido-L-prolinolamidite (composto 9, 0,60 g, rendimento: 55%) íH-RMN (CDC13) : 7,40-7,14 (9H, m, Ar-H), 6.82 (4H, d, J = 8,6 Hz, Ar-H), 3,78 (6H, s, OCH3) , 3,68-2,93 (11H, m, CH20, POCH2, CHCH3, H-2, H-5, H-6), 2,58 (2H, m, CH2CN) , 2,27-1,72 (6H, m, alquilo, H-3, H-4), 1,58 (4H, s, alquilo), 1,30 (22H, s, alquilo, CHCH3) . DMTr-alquil-L-prolinolamidite (composto 10, 0,71 g, rendimento: 60%) 1H-RMN (CDC13) : 7,40-7,14 (9H, m, Ar-H), 6.82 (4H, d, J = 8,6 Hz, Ar-H), 3,78 (6H, s, OCH3) , 3,70-2,86 (8H, m, CH20, POCH2, CHCH3, H-6), 2,58 (2H, m, CH2CN) , 2,06- 1,79 (5H, m, alquilo, H-2, H-5), 1,74-1,49 (6H, m, alquilo, H-3, H-4), 1,37-1,10 (16H, m, alquilo, CHCH3) . DMTr-uretano-L-prolinolamidite (composto 11, 0,67 g, rendimento: 52%) 1H-RMN (CDC13) : 7,40-7,14 (9H, m, Ar-H), 6.82 (4H, d, J = 8,6 Hz, Ar-H), 4,24-3, 94 (2H, m, COOCH2) , 3,78 (s, 6H, OCH3) , 3, 72-2, 96 (11H, m, CH20, POCH2, CHCH3, H-2, H-5, H-6), 2,58 (2H, m, CH2CN) , 2,10-1,46 (8H, m, alquilo, H-3, H-4), 1,34-1,10 (12H, m, CHCH3) . DMTr-ureido-L-prolinolamidite (composto 12, 0,20 g, rendimento: 61%) 1H-RMN, (CDC13) : 7,40-7,14 (9H, m, Ar-H), 6.82 (4H, m, Ar-H), 3,78 (s, 6H, OCH3) , 3, 65-3,25 (13H, m, CH20, POCH2, CHCH3, H-2, CH2NH, CH2OH, H-2, H-5, H-6), 2,73 (2H, m, CH2CN) , 2,10-1,48 (16H, m, alquilo, H-3, H-4), 1,35-1,10 (12H, m, CHCH3) . (Exemplo A2)

Seguidamente, de acordo com o esquema 3 apresentado seguidamente, sintetizaram-se derivados de amidite com L-prolina.

(1) DMTr-hidroxiamido-amino-L-prolina (composto 11)

Adicionou-se um tampão de ácido acético (7 ml) a uma solução de etanol (7 ml) contendo DMTr-amido-L-prolina (composto 6) (1,00 g, 2,05 mmol) e 5-hidroxipentanal (0,33 g, 3,07 mmol) com arrefecimento em gelo. Agitou-se a mistura resultante durante 20 minutos com arrefecimento em gelo. Seguidamente, adicionou-se adicionalmente cianoboro-hidreto de sódio (0,77 g, 12,28 mmol) e agitou-se durante 7 horas à temperatura ambiente. Diluiu-se a mistura com diclorometano, lavou-se com água e seguidamente lavou-se adicionalmente com solução salina saturada. Seguidamente, a camada orgânica foi recolhida e secou-se com sulfato de sódio. Filtrou-se a camada orgânica e removeu-se o solvente no filtrado resultante por evaporação a pressão reduzida. A substância residual obtida foi aplicada a cromatografia em coluna de silica-gel (eluente: CH2CI2: CH3OH = 98 : 2, contendo piridina a 0,05%) .

Seguidamente, aplicou-se o produto obtido a cromatografia em coluna de silica-gel (eluente: CH2CI2 : CH3OH = 98 : 2, contendo piridina a 0,05%) e sujeitou-se adicionalmente o produto obtido a cromatografia em coluna de silica-gel (eluente: diclorometano : acetona =7:3, contendo piridina a 0,05%) . Assim, obteve-se o composto 11 sob a forma de um xarope incolor (0,49 g, rendimento: 41%). Ms (FAB+): m/z 575 (M+) , 303 (DMTr+) (2) DMTr-amido-amino-L-prolina-amidite (Composto 12)

Misturou-se a DMTr-hidroxiamido-amino-L-prolina (Composto 11) (0,50 g, 0,87 mmol) assim obtida com acetonitrilo anidro e secou-se a mistura azeotropicamente à temperatura ambiente. Adicionou-se tetrazolideo de diisopropilamónio (178 mg, 1,04 mmol) à substância residual obtida. Desarejou-se a mistura resultante a pressão reduzida e encheu-se com árgon gasoso. Adicionou-se acetonitrilo anidro (1 ml) à mistura e a esta adicionou-se adicionalmente uma solução de 2-cianoetoxi-Ν,Ν,Ν' ,Ν' -tetraisopropilfosforodiamidite (313 mg, 1,04 mmol) em acetonitrilo anidro (1 ml) . Agitou-se esta mistura durante 4 horas à temperatura ambiente numa atmosfera de árgon. Seguidamente diluiu-se a mistura com diclorometano e lavou-se esta solução com água saturada com bicarbonato de sódio e seguidamente com solução salina saturada. Recolheu-se uma camada orgânica e secou-se com sulfato de sódio. Seguidamente filtrou-se a camada orgânica. Removeu-se o solvente do filtrado obtido por evaporação a pressão reduzida. A substância residual obtida foi aplicada a uma coluna de cromatografia com enchimento de aminossilica (eluente: hexano : acetona = 7:3, contendo piridina a 0,05%) . Assim, obteve-se o Composto 12 na forma de xarope incolor (0,57 g, pureza: 93%, rendimento: 79%). Mediu-se a pureza por HPLC (doravante o mesmo). Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. 1H-RMN (CDCI3) : 7,41-7,43 (m, 2H, Ar-H), 7,28-7,32 (m, 4H, Ar-H), 7,25-7,27 (m, 2H, Ar-H) , 7,18-7,21 (m, 1H, Ar-H), 6, 80-6, 84 (m, 4H, Ar-H), 3,73-3,84 (m, 1H) , 3,79 (s, 6H, OCH3) , 3,47-3, 64 (m, 3H) , 3,12-3,26 (m, 2H) , 3,05 (t, J = 6,4 Hz, 2H, CH2) , 2, 98-2, 02 (m, 2H) , 2,61 (t, J = 5,8 Hz, 2H, CH2) , 2,55-2, 63 (m, 2H) , 2,27-2,42 (m, 1H, CH) , 2,31 (t, 7,8 Hz, 2H, CH2) , 2,03-2,19 (m, 1H, CH) , 1,40-1, 90 (m, 8H) , 1,23-1,33 (m, 5H) , 1,14-1,20 (m, 12H, CH3) ; P-RMN (CDCla) : 146,91; Ms (FAB+) : m/z 774 hH 303 (DMTr+) , 201 (C8Hi9N2OP+) (3) DMTr-hidroxiamidocarbamoil-L-prolina (Composto 13)

Adicionou-se uma solução de acetonitrilo anidro (20 ml) na qual se tinha dissolvido l-imidazolilcarboniloxi-8-hidroxioctano (1,12 g, 4,92 mmol) a uma solução de acetonitrilo anidro (10 ml) na qual se tinha dissolvido a DMTr-amido-L-prolina (Composto 6) (1,00 g, 2,05 mmol), à temperatura ambiente e atmosfera de árgon. Aqueceu-se esta mistura entre 40 °C e 50 °C durante 2 dias e seguidamente deixou-se repousar à temperatura ambiente durante 5 dias. Removeu-se o solvente da mistura por evaporação a pressão reduzida. A substância residual obtida foi aplicada a uma coluna de cromatografia de silica-gel (eluente: diclorometano: acetona =4:1, contendo piridina a 0,05%). Assim, obteve-se o Composto 13 na forma de xarope incolor (0,68 g, rendimento: 50%). Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. iH-RMN (CDCla) : 7,40-7,42 (m, 2H, Ar-H) , 7,27-7,31 (m, 6H, Ar-H), 7,17-7,21 (m, 1H, Ar-H), 6,79-6,82 (m, 4H, Ar-H), 4,23-4,30 (m, 1H) , 4,05-4,10 (m, 2H) , 3,79 (s, 6H, OCH3) , 3,60-3,65 (m, 2H), 3,32-3,55 (m, 2H), 3,16-3,29 (m, 2H), 3,01- 3,07 (m, 2H) , 2,38-2,40 (m, 1H, CH) , 1,83-1, 90 (m, 2H) , 1,57- 1,69 (m, 8H), 1,26-1,36 (m, 2H);Ms (FAB+): m/z 602 (M+), 303 (DMTr+). (4) DMTr-amidocarbamoil-L-prolina-amidite (Composto 14)

Misturou-se a DMTr-hidroxiamidocarbamoil-L-prolina (Composto 13) (0,63 g, 1,00 mmol) assim obtida com piridina anidra e secou-se azeotropicamente a mistura resultante à temperatura ambiente. Adicionou-se tetrazolideo de diisopropilamónio (206 mg, 1,20 mmol) à substância residual obtida e desarejou-se a mistura resultante a pressão reduzida e preencheu-se com árgon gasoso. Adicionou-se acetonitrilo anidro (1 ml) à mistura e adicionou-se adicionalmente uma solução de 2-cianoetoxi-Ν,Ν,Ν' ,Ν' -tetraisopropilfosforodiamidite (282 mg, 1,12 mmol) em acetonitrilo anidro (1 ml) . Agitou-se esta mistura durante 4 horas à temperatura ambiente em atmosfera de árgon. Seguidamente, diluiu-se a mistura com diclorometano e lavou-se com água saturada com bicarbonato de sódio e seguidamente com solução salina saturada. Recolheu-se uma camada orgânica e secou-se com sulfato de sódio. Seguidamente filtrou-se a camada orgânica. Removeu-se o solvente do filtrado obtido por evaporação a pressão reduzida. A substância residual obtida foi aplicada a uma coluna de cromatografia com enchimento de aminossilica (eluente: hexano : acetona =7:3, contendo piridina a 0,5%) . Assim, obteve-se o Composto 14 sob a forma de xarope incolor (0,74 g, pureza: 100%, rendimento: 87%) . Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. P-RMN (CDCls) 147,19; Ms (FAB + ) : m/z 860 (M+) , 303 (DMTr+) , 201 (C8Hi9N2OP + ) . (5) DMTr-t-butildimetilsiloxiamidoureido-L-prolina (Composto 15)

Adicionou-se uma solução de tetra-hidrofurano anidro (10 ml) a trifosgénio (1,22 g, 4,10 mmol) com arrefecimento com gelo em atmosfera de árgon. Introduziu-se nesta mistura uma solução (10 ml) de tetra-hidrofurano anidro na qual tinham sido dissolvidos DMTr-amido-L-prolina (Composto 6) (1,00 g, 2,05 mmol) e DIEA (9,80 g, 75,8 mmol) com arrefecimento com gelo em atmosfera de árgon durante 30 minutos. Seguidamente, tal solução foi agitada durante 1 hora à temperatura ambiente. Introduziu-se nesta mistura uma solução (20 ml) de tetra-hidrofurano anidro na qual tinham sido dissolvidos 10-amino-1-t-butildimetilsiloxidecano (2,66 g, 10,25 mmol) e DIEA (3,20 g, 24,76 mmol) com arrefecimento com gelo em atmosfera de árgon durante 45 minutos. Seguidamente, agitou-se a mistura durante a noite à temperatura ambiente em atmosfera de árgon. Diluiu-se esta mistura com acetato de etilo (200 ml) e recolheu-se a camada orgânica. Lavou-se a camada orgânica com água saturada com bicarbonato de sódio e seguidamente lavou-se adicionalmente com solução salina saturada. Seguidamente, recolheu-se a camada orgânica e secou-se com sulfato de sódio.

Filtrou-se a camada orgânica e removeu-se o solvente do filtrado obtido por evaporação a pressão reduzida. Aplicou-se a substância residual obtida a uma coluna de cromatografia de sílica-gel (eluente: diclorometano : acetona =4:1, contendo piridina a 0,05%) . Assim, obteve-se o Composto 15 sob a forma de um xarope incolor (0,87 g, rendimento: 55%). (6) DMTr-hidroxiamidoureido-L-prolina composto (16)

Adicionou-se uma solução de tetra-hidrofurano diclorometano anidro à DMTr-t-butildimetilsiloxiamidoureido-L-prolina (15) (0,87 g, 1,12 mmol) assim obtida, à temperatura ambiente em atmosfera de árgon. Adicionou-se à mistura, uma solução de tetra-hidrofurano contendo fluoreto de tetrabutilamónio 1 mol/1 (4,69 ml, Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) e agitou-se durante 3 dias à temperatura ambiente em atmosfera de árgon. Diluiu-se a mistura com diclorometano (150 ml) e lavou-se com água e seguidamente lavou-se adicionalmente com solução salina saturada. Recolheu-se uma camada orgânica e secou-se com sulfato de sódio. Seguidamente filtrou-se a camada orgânica. Removeu-se o solvente do filtrado obtido por evaporação a pressão reduzida. Aplicou-se a substância residual obtida a uma coluna de cromatografia em sílica-gel (eluente: diclorometano : acetona =1:1, contendo piridina a 0,05%). Assim, obteve-se o Composto 16 sob a forma de um xarope incolor (0,68 g, rendimento: 92%). Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. íH-RMN (CDC13) : 7,41-7,43 (m, 2H, Ar-H) , 7,27-7,31 (m, 4H,

Ar-H), 7,19-7,26 (m, 2H, Ar-H), 7,19-7,21 (m, 1H, Ar-H), 6,80- 6,83 (m, 4H, Ar-H), 4,34 (t, 2H, CH2) , 3,79 (s, 6H, OCH3) , 3,63 (d, 1H, J = 6,4 Hz, CH2, 3,61 (d, 1H, J = 6,4 Hz, CH2) , 3,34-3,37 (m, 1H, CH), 3,16-3,27 (m, 5H), 3,04 (t, J = 5,9 Hz, 2H, CH2) , 2,38-2,45 (m, 1H, CH) , 1,83-2,05 (m, 3H) , 1,45-1,64 (m, 8H), 1,25-1,38 (m, 7H). (7) DMTr-amidoureido-L-prolinamidite (Composto 17)

Misturou-se a DMTr-hidroxiamidoureido-L-prolina (Composto 16) (0,62 g, 0,94 mmol) assim obtida com acetonitrilo anidro e secou-se azeotropicamente a mistura resultante à temperatura ambiente. Adicionou-se tetrazolídeo de di-isopropilamónio (192 mg, 1,12 mmol) à substância residual obtida e desarejou-se a mistura resultante a pressão reduzida e preencheu-se com árgon gasoso. Adicionou-se acetonitrilo anidro (1 ml) à mistura e adicionou-se adicionalmente uma solução de 2-cianoetoxi-Ν,Ν,Ν' ,N' -tetraisopropilfosforodiamidite (282 mg, 1,12 mmol) em acetonitrilo anidro (1 ml). Agitou-se tal solução durante 4 horas à temperatura ambiente em atmosfera de árgon.

Seguidamente, diluiu-se a mistura com diclorometano e lavou-se esta solução com água saturada com bicarbonato de sódio e seguidamente com solução salina saturada. Recolheu-se uma camada orgânica e secou-se com sulfato de sódio. Seguidamente filtrou-se a camada orgânica. Removeu-se o solvente do filtrado obtido por evaporação a pressão reduzida. A substância residual obtida foi aplicada a uma coluna de cromatografia com enchimento de aminossilica (eluente: hexano : acetona = 1:1, contendo piridina a 0,05%) . Assim, obteve-se o Composto 17 sob a forma de um xarope incolor (0,77 g, pureza: 88%, rendimento: 84%). Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. P-RMN (CDC13) : 147,27; Ms (FAB + ) : m/z 860 W), 303 (DMTr+) , 201 (C8Hi9N2OP + ) . (Exemplo A3) Síntese de prolinadiamidoamidite

De modo a produzir a molécula de ácido nucleico do presente invento incluindo um ligante com um esqueleto de prolina, sintetizaram-se L-prolinadiamidoamidite e D-prolinadiamidoamidite de acordo com o Esquema 3. (A3-1) L-prolinadiamidoamidite (1) Fmoc-hidroxiamido-L-prolina (Composto 4)

Usou-se o Composto 2 (Fmoc-L-prolina) no Esquema 3 como material de partida. Misturaram-se conjuntamente Composto 2 (10,00 g, 29,64 mmol), 4-amino-l-butanol (3,18 g, 35,56 mmol), e 1-hidroxibenzotriazole (10,90 g, 70,72 mmol). Desarejou-se a mistura a pressão reduzida e preencheu-se com árgon gasoso. Adicionou-se acetonitrilo anidro (140 ml) à mistura à temperatura ambiente e adicionou-se adicionalmente à mistura uma solução de diciclo-hexilcarbodiimida (7,34 g, 35,56 mmol) em acetonitrilo anidro (70 ml) . Seguidamente, agitou-se durante 15 horas à temperatura ambiente em atmosfera de árgon. Após finalização da reacção, removeu-se o precipitado gerado por filtração e removeu-se o solvente no filtrado recolhido por evaporação a pressão reduzida. Adicionou-se diclorometano (200 ml) à substância residual obtida e lavou-se a mistura com água saturada com bicarbonato de sódio (200 ml) . Recolheu-se então uma camada orgânica e secou-se com sulfato de magnésio. Seguidamente, filtrou-se a camada orgânica e removeu-se o solvente no filtrado obtido por evaporação a pressão reduzida. Adicionou-se éter dietílico (200 ml) à substância residual, transformando assim em pó a substância residual. Recolheu-se o pó assim obtido por filtração. Assim, obteve-se o Composto 4 sob a forma de um pó incolor (10,34 g, rendimento: 84%) .

Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. íH-RMN (CDC13) : 7,76-7,83 (m, 2H, Ar-H) , 7,50-7, 63 (m, 2H, Ar-H), 7,38-7,43 (m, 2H, Ar-H), 7,28-7,33 (m, 2H, Ar-H), 4,40-4,46 (m, 1H, CH) , 4,15-4,31 (m, 2H, CH2) , 3, 67-3,73 (m, 2H, CH2) , 3,35-3, 52 (m, 2H, CH2) , 3,18-3,30 (m, 2H, CH2), 2,2 0- 2,50 (m, 4H), 1,81-2,03 (m, 3H), 1,47-1,54 (m, 2H); Ms (FAB+): m/z 40 9 (M+H+) . (2) DMTr-amido-L-prolina (Composto 6)

Misturou-se Fmoc-hidroxiamido-L-prolina (Composto 4) (7,80 g, 19,09 mmol) com piridina anidra (5 ml) e secou-se azeotropicamente a mistura resultante duas vezes à temperatura ambiente. Adicionaram-se cloreto de 4,4' -dimetoxitritilo (8,20 g, 24,20 mmol), DMAP (23 mg, 0,19 mmol) e piridina anidra (39 ml) à substância residual obtida. Agitou-se esta mistura durante 1 hora à temperatura ambiente. Seguidamente, adicionou-se metanol (7,8 ml) e agitou-se durante 30 minutos à temperatura ambiente. Diluíu-se esta mistura com diclorometano (100 ml) e lavou-se com água saturada com bicarbonato de sódio (150 ml). Seguidamente, separou-se uma camada orgânica. Secou-se a camada orgânica com sulfato de sódio e seguidamente filtrou-se. Removeu-se o solvente do filtrado obtido por evaporação a pressão reduzida. Adicionou-se dimetilformamida anidra (39 ml) e piperidina (18,7 ml, 189 mmol) à substância residual não purificada assim obtida e agitou-se durante 1 hora à temperatura ambiente. Após a finalização da reacção, removeu-se o solvente da mistura por evaporação a pressão reduzida à temperatura ambiente. Aplicou-se a substância residual obtida a uma coluna de cromatografia de silica-gel (nome comercial: Wakogel C-300, eluente: CH2CI2 : CH3OH = 9 : 1, contendo piridina a 0,05%) . Assim, obteve-se o Composto 6 sob a forma de óleo amarelo claro (9,11 g, rendimento: 98%) .

Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. íH-RMN (CDCI3) : 7,39-7,43 (m, 2H, Ar-H) , 7,30 (d, J = 8,8

Hz, 4H, Ar-H), 7, 21 (tt, 1H, 4,9, 1,3 Hz, Ar-H), 6,81 (d, J = 8,8 Hz, 4H, Ar-H), 3,78 (s, 6H, OCH3) , 3,71 (dd, H, J = 6,3

Hz, 5,4 Hz, CH) , 3,21 (2H, 12,9, 6,3 Hz, 2H, CH2) , 3,05 (t, J = 6,3 Hz, 2H, CH2) , 2,85-2,91 (m, 2H, CH2) , 2,08-2,17 (m, 1H, CH) , 1,85-2,00 (m, 3H) , 1,55-1, 65 (m, 5H) : Ms (FAB+) ; m/z489 (M+H+) , 303 (DMTr+) . (3) DMTr-hidroxidiamido-L-prolina (Composto 8)

Preparou-se uma solução de diclorometano anidro por mistura da DMTr-amido-L-prolina (Composto 6) (6,01 g, 12,28 mmol) assim obtida, com EDC (2,83 g, 14,74 mmol), 1- hidroxibenzotriazole (3,98 g, 29,47 mmol) e trietilamina (4,47 g, 44,21 mmol) em diclorometano anidro (120 ml). Adicionou-se adicionalmente ácido 6-hidroxi-hexanóico (1,95 g, 14,47 mmol) a esta solução à temperatura ambiente em atmosfera de árgon e seguidamente agitou-se durante 1 hora à temperatura ambiente em atmosfera de árgon. Diluiu-se a mistura com diclorometano (600 ml) e lavou-se três vezes com solução salina saturada (800 ml) . Recolheu-se então uma camada orgânica. Secou-se a camada orgânica com sulfato de sódio e seguidamente filtrou-se. Removeu-se o solvente do filtrado obtido por evaporação a pressão reduzida. Assim, obteve-se o Composto 8 sob a forma de uma espuma amarela clara (6,29 g, rendimento: 85%). Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. 1H-RMN (CDCI3) : 7,41-7,43 (m, 2H, Ar-H), 7,27-7,31 (m, 4H, Ar-H), 7,19-7,26 (m, 2H, Ar-H), 7,17-7,21 (m, 1H, Ar-H), 6,79-6, 82 (m, 4H, Ar-H), 4,51-4,53 (m, 1H, CH) , 3,79 (s, 6H, OCH3), 3,61 (t, 2H, J = 6,4 Hz, CH2) , 3,50-3,55 (m, 1H, CH) , 3,36-3,43 (m, 1H, CH) , 3,15-3,24 (m, 2H, CH2) , 3,04 (t, J = 6,3 Hz, 2H, CH2), 2,38-2,45 (m, 1H, CH) , 2,31 (t, 6,8 Hz, 2H, CH2) , 2,05-2,20 (m, 1H, CH) , 1,92-2,00 (m, 1H, CH) , 1,75-1,83 (m, 1H, CH) , 1,48-1,71 (m, 8H) , 1,35-1,44 (m, 2H, CH2) ; Ms (FAB+) : m/z 602 (M+) , 303 (DMTr+) . (4) DMTr-diamido-L-prolina-amidite (Composto 10)

Misturou-se a DMTr-hidroxidiamido-L-prolina (Composto 8) (8,55 g, 14,18 mmol) assim obtida, com acetonitrilo anidro e secou-se azeotropicamente a mistura resultante três vezes à temperatura ambiente. Adicionou-se tetrazolideo de di-isopropilamónio (2,91 g, 17,02 mmol) à substância residual obtida. Desarejou-se a mistura resultante a pressão reduzida e preencheu-se com árgon gasoso. Adicionou-se acetonitrilo anidro (10 ml) à mistura e adicionou-se adicionalmente uma solução de 2-cianoetoxi-N,N,Ν' ,N' - tetraisopropilfosforodiamidite (5,13 g, 17,02 mmol) em acetonitrilo anidro (7 ml) . Agitou-se esta mistura durante 2 horas à temperatura ambiente em atmosfera de árgon. Seguidamente, diluiu-se a mistura com diclorometano e lavou-se com água saturada com bicarbonato de sódio (200 ml) três vezes e seguidamente com solução salina saturada (200 ml). Recolheu-se uma camada orgânica e secou-se com sulfato de sódio.

Seguidamente filtrou-se a camada orgânica. Removeu-se o solvente do filtrado obtido por evaporação a pressão reduzida. Aplicou-se a substância residual obtida a uma coluna de cromatografia com enchimento de aminossílica-gel (eluente: hexano : acetato de etilo = 1:3, contendo piridina a 0,05%) . Assim, obteve-se o Composto 10 sob a forma de um xarope incolor (10,25 g, pureza: 92%, rendimento: 83%). Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. iH-RMN (CDCla) : 7,40-7,42 (m, 2H, Ar-H) , 7,29-7,31 (m, 4H, Ar-H), 7,25-7,27 (m, 2H, Ar-H), 7,17-7,21 (m, 1H, Ar-H), 6,80-6,82 (m, 4H, Ar-H), 4,51-4,53 (m, 1H, CH), 3,75-3,93 (m, 4H) , 3,79 (s, 6H, OCH3) , 3, 45-3, 60 (m, 4H) , 3,35-3,45 (m, 1H, CH) , 3,20-3,29 (m, 1H) , 3,04 (t, J = 6,4 Hz, 2H, CH2) , 2,62 (t, J = 5,8 Hz, 2H, CH2) , 2,40-2,44 (m, 1H, CH) , 2,31 (t, 7,8 Hz, 2H, CH2) , 2,03-2,19 (m, 1H, CH) , 1, 92-2,02 (m, 1H, CH) , 1,70-1,83 (m, 1H, CH) , 1,51-1,71 (m, 8H) , 1,35-1,44 (m, 2H, CH2), 1,18 (d, J = 6,8 Hz, 6H, CH3) , 1,16 (d, J = 6,8 Hz, 6H, CH3) ; P-RMN (CDC13) : Ms 147,17; Ms (FAB+) : m/z 802 IK 303 (DMTr+) , 201 (C8Hi9N2OP+) . (A3-2) D-prolina-diamido-amidite (1) Fmoc-hidroxiamido-D-prolina (Composto 3)

Usou-se o Composto 1 (Fmoc-D-prolina) no Esquema 3 como material de partida. Desarejou-se a mistura do Composto 1 (1,5 g, 4,45 mmol), diciclo-hexilcarbodiimida (1,1 g, 5,34 mmol) e 1-hidroxibenzotriazole (1,5 g, 10,69 mmol) a pressão reduzida e preencheu-se com árgon gasoso. Adicionou-se acetonitrilo anidro (24 ml) à mistura à temperatura ambiente e adicionou-se adicionalmente uma solução de 4-amino-l-butanol (0,48 g, 5,34 mmol) em acetonitrilo anidro (6 ml) . Seguidamente, agitou-se durante 15 horas à temperatura ambiente em atmosfera de árgon. Após a finalização da reacção, removeu-se o precipitado gerado por filtração e removeu-se o solvente no filtrado recolhido por evaporação a pressão reduzida. Adicionou-se diclorometano à substância residual obtida e lavou-se a mistura com tampão de ácido acético (pH 4,0) três vezes e lavou-se adicionalmente três vezes com água saturada com bicarbonato de sódio. Seguidamente, recolheu-se uma camada orgânica e secou-se com sulfato de magnésio. Seguidamente, filtrou-se a camada orgânica e removeu-se o solvente no filtrado obtido por evaporação a pressão reduzida. Adicionou-se éter dietilico (50 ml) à substância residual, transformando assim em pó a substância residual. O pó assim obtido foi recolhido por filtração. Assim, obteve-se o Composto 3 sob a forma de um pó branco. Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. 1H-RMN (400 MHz, CDC13) : 7,77 (d, J = 7,3 Hz, 2H) ; 7,58 (br, 2H) ; 7,41 (t, J = 7,3 Hz, 2H) ; 7,32 (t, J = 7,3 Hz, 2H) ; 4,25-4,43 (m, 4H); 3,25-3,61 (m, 6H); 1,57-1,92 (m, 8H). MS (FAB+) : m/z 409 (M+H+) . (2) DMTr-amido-D-prolina (Composto 5)

Misturou-se Fmoc-hidroxiamido-D-prolina (Composto 3) (1,0 g, 2,45 mmol) com piridina anidra (5 ml) e secou-se azeotropicamente duas vezes a mistura resultante à temperatura ambiente. Adicionaram-se cloreto de 4,4' -dimetoxitritilo (1,05 g, 3,10 mmol) , DMAP (3 mg, 0,024 mmol) e piridina anidra (5 ml) à substância residual obtida. Agitou-se esta mistura durante 1 hora à temperatura ambiente. Seguidamente, adicionou-se metanol (1 ml) e agitou-se durante 30 minutos à temperatura ambiente. Diluiu-se esta mistura com diclorometano e lavou-se com água saturada com bicarbonato de sódio. Seguidamente, separou-se uma camada orgânica. Secou-se a camada orgânica com sulfato de sódio e seguidamente filtrou-se. Removeu-se o solvente do filtrado obtido por evaporação a pressão reduzida. Adicionaram-se dimetilformamida anidra (5 ml) e piperidina (2,4 ml, 24 mmol) à substância residual impura assim obtida e agitou-se durante 1 hora à temperatura ambiente. Após finalização da reacção, removeu-se o solvente da mistura por evaporação a pressão reduzida à temperatura ambiente. Aplicou-se a substância residual obtida a uma coluna de cromatografia em sílica-gel (nome comercial Wakogel C-300, eluente: CH2CI2: CH3OH = 9:1, contendo piridina a 0,05%) .

Assim, obteve-se Composto 5 sob a forma de um óleo amarelo claro (1,26 g, rendimento: 96%) . Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. 1H-RMN (400 MHz, CDCI3) : 7,62 (br, 1H) ; 7,41-7,44 (m, 2H); 7,26-7,33 (m, 6H); 7,17-7,22 (m, 1H); 6,80-6,84 (m, 4H); 3,78 (s, 6H); 3,71 (dd, J = 8,8, 5,4 Hz, 1H); 3,22 (q, 6,5 Hz, 2H) ; 3,07 (t, J = 6,1 Hz, 2H) ; 2, 97-3, 03 (m, 1H) ; 2,85-2,91 (m, 1H); 1,86-2,15 (m, 3H); 1,55-1,73 (m, 6H). MS (FAB+): m/z 489 (M+H+) , 303 (DMTr+) . (3) DMTr-hidroxidiamido-D-prolina (Composto 7)

Preparou-se uma solução de diclorometano anidro por mistura da DMTr-amido-D-prolina (Composto 5) (1,2 g, 2,45 mmol) assim obtida com EDC (566 mg, 2,95 mmol), 1- hidroxibenzotriazole (796 mg, 5,89 mmol) e trietilamina (1,2 ml, 8,84 mmol) em diclorometano anidro (24 ml). Adicionou-se adicionalmente ácido 6-hidroxi-hexanóico (390 mg, 2,95 mmol) a esta solução à temperatura ambiente em atmosfera de árgon e seguidamente agitou-se durante 1 hora à temperatura ambiente em atmosfera de árgon. Diluiu-se a mistura com diclorometano e lavou-se três vezes com água saturada com bicarbonato de sódio. Seguidamente filtrou-se a camada orgânica. Removeu-se o solvente do filtrado obtido por evaporação a pressão reduzida. Assim, obteve-se o Composto 7 sob a forma de um óleo amarelo claro (1,4 g, rendimento: 95%) . Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. 1H-RMN (400 MHz, CDC13) : 7,40-7,43 (m, 2H); 7,25-7,32 (m, 6H); 7,17-7,22 (m, 1H); 6,79-6,83 (m, 4H); 3,79 (s, 6H); 3,58- 3,63 (m, 2H) ; 3,49-3,55 (m, 1H) ; 3,15-3,26 (m, 2H); 3,02-3,07 (m, 2H); 2,30-2,33 (m, 2H); 2,11-2,20 (m, 1H); 1,50-1,99 (m, 13H) ; 1,36-1,43 (m, 2H) ; MS (FAB+) : m/z 602 (M+) , 303 (DMTr+) . (4) DMTr-diamido-D-prolina-amidite (Composto 9)

Misturou-se a DMTr-hidroxidiamido-D-prolina (Composto 7) (1,2 g, 1,99 mmol) assim obtida com acetonitrilo anidro e secou-se azeotropicamente a mistura resultante três vezes à temperatura ambiente. Adicionou-se tetrazolídeo de di-isopropilamónio (410 mg, 2,40 mmol) à substância residual obtida. Desarejou-se a mistura resultante a pressão reduzida e preencheu-se com árgon gasoso. Adicionou-se adicionalmente acetonitrilo (2,4 ml) e 2-cianoetoxi-N,N,Ν' ,N' - tetraisopropilfosforodiamidite (722 mg, 2,40 mmol) à mistura. Agitou-se esta mistura durante 2 horas à temperatura ambiente em atmosfera de árgon. Seguidamente, diluíu-se a mistura com diclorometano e lavou-se três vezes com água saturada com bicarbonato de sódio e seguidamente lavou-se com solução salina saturada. Recolheu-se uma camada orgânica e secou-se com sulfato de sódio. Seguidamente filtrou-se a camada orgânica. Removeu-se o solvente do filtrado obtido por evaporação a pressão reduzida. Aplicou-se a substância residual obtida a uma coluna de cromatografia com enchimento de aminossílica-gel (eluente: hexano : acetato de etilo = 1 : 3). Assim, obteve-se o Composto 9 sob a forma de óleo incolor (1,4 g, pureza: 95%, rendimento: 83%). Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. iH-RMN (400 MHz, CDC13) : 7,40-7,43 (m, 2H) ; 7,25-7,32 (m, 6H); 7,14-7,21 (m, 1H); 6,80-6,83 (m, 4H); 3,80-3,85 (m, 2H); 3,79 (s, 6H); 3,49-3,65 (m, 5H); 3,02-3,06 (m, 2H); 2,60-2,63 (m, 2H); 2,29-2,33 (m, 2H) ; 1,77-1,82 (m, 2H); 1,56-1, 68 (m, 8H); 1,38-1,3 (m, 2H); 1,15-1,29 (m, 18H); 31P-RMN (162 MHz, CDCI3) 146, 94; MS (FAB+) : m/z 802 tM, 303 (DMTr+) , 201 (C8Hi9N2OP + ) . (Exemplo A4)

De modo a produzir a molécula de ácido nucleico do presente invento incluindo um ligante com um esqueleto de prolina, sintetizou-se L-prolina-diamido-amidite (tipo B) de acordo com o Esquema 4 apresentado seguidamente.

(1) Fmoc-t-butildimetilsiloxiamido-L-prolina (Composto 18)

Misturaram-se conjuntamente Fmoc-hidroxiamido-L-prolina (Composto 4) (2,00 g, 30 mmol), cloreto de t- butildimetilsililo (1,11 g, 35 mmol) e imidazole (10,90 g, 71 mmol). Desarejou-se a mistura a pressão reduzida e preencheu-se com árgon gasoso. Adicionou-se acetonitrilo anidro (20 ml) à mistura à temperatura ambiente e agitou-se durante a noite à temperatura ambiente em atmosfera de árgon. Após finalização da reacção adicionou-se diclorometano (150 ml) à mistura. Lavou-se a mistura resultante três vezes com água e seguidamente com solução salina saturada. Recolheu-se uma camada orgânica e secou-se com sulfato de magnésio. Seguidamente filtrou-se a camada orgânica. Removeu-se o solvente do filtrado obtido por evaporação a pressão reduzida e aplicou-se a substância residual a uma coluna de cromatografia em sílica-gel (eluente: CH2CI2 : CH3OH =95 : 5). Assim, obteve-se o Composto 18 sob a forma de xarope incolor (2,35 g, rendimento: 92%) . Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. 1H-RMN (CDCI3) : 7,76-7,78 (m, 2H, Ar-H) , 7,50-7, 63 (m, 2H, Ar-H), 7,38-7,42 (m, 2H, Ar-H), 7,29-7,34 (m, 2H, Ar-H), 4,10-4,46 (m, 4H, CH2) , 3,47-3,59 (m, 4H, CH2) , 3,20-3,26 (m, 2H, CH), 1,85-1,95 (m, 2H), 1,42-1,55 (m, 6H), 0,96 (s, 9H, t-Bu) , 0,02 (s, 6H, SiCH3) ; Ms (FAB+) : m/z 523 (M+H+) . (2) t-butil-dimetilsiloxiamido-L-prolina (Composto 19)

Adicionaram-se acetonitrilo anidro (5 ml) e piperidina (2,4 ml) ao Fmoc-t-butil-dimetilsiloxiamido-L-prolina (Composto 18) (1,18 g, 2,5 mmol) assim obtido e agitou-se durante 1 hora à temperatura ambiente. Após finalização da reacção adicionou-se acetonitrilo (50 ml) à mistura e removeu-se a matéria insolúvel por filtração. Removeu-se o solvente do filtrado obtido por evaporação a pressão reduzida. Aplicou-se a substância residual obtida a uma coluna de cromatografia em sílica-gel (eluente: CH2CI2 : CH3OH =9 : 1). Assim, obteve-se o Composto 19 sob a forma de um xarope incolor (0,61 g, rendimento: 90%). Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. ^-RMN (CDCI3) : 3,71 (dd, 1H, J = 9,0 Hz, 5,2 Hz, CH) , 3,61-3,64 (m, 2H, CH2) , 3,22-3,28 (m, 2H, CH2) , 2, 98-3, 04 (m, 1H, CH), 2,86-2,91 (m, 1H, CH), 2,08-2,17 (m, 1H, CH), 1,86-1,93 (m, 1H, CH) , 1, 66-1,75 (m, 2H, CH2) , 1,52-1,57 (m, 4H) , 0,89 (s, 9H, t-Bu) , 0,05 (s, 6H, SiCH3) ; Ms (FAB+) ; m/z 301 (M+H+) . (3) t-butil-dimetilsiloxiamido-hidroxiamido-L-prolina (Composto 20)

Preparou-se uma solução em diclorometano anidro por mistura da t-butil-dimetilsiloxiamido-L-prolina (Composto 19) (550 mg, 1,8 mmol) assim obtida com ácido 6-hidroxi-hexanóico (300 mg, 2,3 mmol), EDC (434 mg, 2,3 mmol) e 1-hidroxibenzotriazole (695 mg, 4,5 mmol) em diclorometano anidro (20 ml). Adicionou-se trietilamina (689 mg, 6,8 mmol) a esta solução à temperatura ambiente em atmosfera de árgon e seguidamente agitou-se durante a noite à temperatura ambiente em atmosfera de árgon. Lavou-se a mistura com solução salina saturada. Recolheu-se uma camada orgânica e secou-se a camada orgânica recolhida com sulfato de sódio. Seguidamente filtrou-se a camada orgânica. Removeu-se o solvente do filtrado obtido por evaporação a pressão reduzida. Aplicou-se a substância residual obtida a uma coluna de cromatografia em silica-gel (eluente: CH2CI2 : CH3OH =9 : 1). Assim, obteve-se o Composto 20 sob a forma de um xarope incolor (696 mg, rendimento: 92%). Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. iH-RMN (CDCI3) : 4,54 (d, 1H, CH) , 3,58-3, 67 (m, 5H) , 3,52-3,56 (m, 1H, CH), 3,32-3,39 (m, 1H), 3,20-3,25 (m, 2H), 2,40-2,43 (m, 1H, CH) , 2,33 (t, J = 7,3 Hz, 2H, CH2) , 2,05- 2,25 (m, 2H) , 1, 93-2,03 (m, 1H, CH) , 1,76-1,85 (m, 1H, CH) , 1,50-1,73 (m, 8H) , 1,37-1,46 (m, 2H, CH2) , 0,87 (s, 9H, t-Bu) , 0,04 (s, 6H, S1CH3) ; Ms (FAB+) : m/z 415 (M++1). (4) DMTr-hidroxidiamido-L-prolina (tipo B) (Composto 21)

Misturou-se t-butildimetilsiloxiamido-hidroxiamido-L- prolina (Composto 20) (640 mg, 1,54 mmol) assim obtida com piridina anidra (1 ml) e secou-se azeotropicamente à temperatura ambiente. Adicionou-se cloreto de 4,4' -dimetoxitrit ilo (657 mg, 1,85 mmol), DMAP (2 mg) e piridina anidra (5 ml) à substância residual obtida e agitou-se durante 4 horas à temperatura ambiente. Seguidamente, adicionou-se metanol (1 ml) a esta mistura e agitou-se durante 30 minutos à temperatura ambiente. Diluíu-se a mistura com diclorometano e lavou-se com água saturada com bicarbonato de sódio. Recolheu-se uma camada orgânica e secou-se com sulfato de sódio. Seguidamente filtrou-se a camada orgânica. Removeu-se o solvente do filtrado obtido por evaporação a pressão reduzida. Adicionou-se acetonitrilo anidro (5 ml) e uma solução de tetra-hidrofurano contendo fluoreto de tetrabutilamónio a 1 mol/1 (1,42 ml, fluoreto de tetrabutilamónio 1,42 mmol) à substância residual obtida e agitou-se durante a noite à temperatura ambiente. Após finalização da reacção, adicionou-se acetato de etilo (100 ml) à mistura. Lavou-se a mistura resultante com água e seguidamente com solução salina saturada. Recolheu-se uma camada orgânica e secou-se com sulfato de sódio. Seguidamente filtrou-se a camada orgânica. Removeu-se o solvente do filtrado obtido por evaporação a pressão reduzida. Aplicou-se a substância residual obtida a uma coluna de cromatografia em sílica-gel (eluente: CH2CI2: CH3OH = 95 : 5, contendo piridina a 0,05%) . Assim, obteve-se o Composto 21 sob a forma de um xarope incolor (680 mg, rendimento: 73%) . Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. íH-RMN (CDCI3) : 7,41-7,44 (m, 2H, Ar-H) , 7,26-7,33 (m, 4H, Ar-H), 7,18-7,21 (m, 2H, Ar-H), 7,17-7,21 (m, 1H, Ar-H), 6,80-6,84 (m, 4H, Ar-H), 4,51-4,53 (d, 6,8 Hz, 1H, CH), 3,79 (s, 6H, OCH3) , 3,61 (dd, 2H, J = 11 Hz, 5,4 Hz, CH2) , 3,50-3,54 (m, 1H, CH) , 3,36-3,43 (m, 1H, CH) , 3,20-3,26 (m, 2H, CH2) , 3,05 (t, J = 6,4 Hz, 2H, CH2) , 2,38-2,45 (m, 1H, CH) , 2,30 (t, J = 7,8 Hz, 2H, CH2) , 2,05-2,25 (m, 1H, CH) , 1,92-2,00 (m, 1H, CH) , 1,75-1,83 (m, 1H, CH) , 1,52-1, 67 (m, 8H) , 1,35-1,45 (m, 2H, CH2) ; Ms (FAB+) : m/z 602 (M+) , 303 (DMTr+) . (5) DMTr-diamido-L-prolina-amidite (tipo B) (Composto 22)

Misturou-se a DMTr-hidroxidiamido-L-prolina (tipo B) (Composto 21) (637 mg, 1,06 mmol) assim obtida com acetonitrilo anidro e secou-se azeotropicamente a mistura resultante à temperatura ambiente. Adicionou-se tetrazolídeo de di-isopropilamónio (201 mg, 1,16 mmol) à substância residual obtida e desarejou-se a mistura resultante a pressão reduzida e preencheu-se com árgon gasoso. Adicionou-se acetonitrilo anidro (1 ml) à mistura e adicionou-se adicionalmente uma solução de 2-cianoetoxi-N,N,Ν' ,Ν' -tetraisopropilfosforodiamidite (350 mg, 1,16 mmol) em acetonitrilo anidro (1 ml) . Agitou-se esta mistura durante 4 horas à temperatura ambiente em atmosfera de árgon. Diluiu-se a mistura com diclorometano e lavou-se com água saturada com bicarbonato de sódio e solução salina saturada. Recolheu-se uma camada orgânica e secou-se com sulfato de sódio. Seguidamente filtrou-se a camada orgânica. Removeu-se o solvente do filtrado obtido por evaporação a pressão reduzida. Aplicou-se a substância residual obtida a uma coluna de cromatografia com enchimento de sílica-gel (eluente: hexano : acetona =7: 3). Assim, obteve-se o Composto 22 sob a forma de xarope incolor (680 mg, pureza: 95%, rendimento: 76%).

Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. íH-RMN (CDCls) : 7,41-7,43 (m, 2H, Ar-H), 7,25-7,32 (m, 4H, Ar-H), 7,17-7,22 (m, 2H, Ar-H), 6,80-6,83 (m, 4H, Ar-H), 4,53 (d, J = 7,8 Hz, 1H, CH), 3,75-3,93 (m, 3H), 3,79 (s, 6H, OCH3), 3,46-3, 68 (m, 5H) , 3,34-3,41 (m, 1H, CH) , 3,10-3,31 (m, 1H, CH) , 3,05 (t, J = 6,3 Hz, 2H, CH2) , 2,62 (t, J = 6,3 Hz, 2H, CH2) , 2,39-2,46 (m, 1H, CH) , 2,29 (t, 7,3 Hz, 2H, CH2) , 2,03-2,19 (m, 1H, CH) , 1, 90-2,00 (m, 1H, CH) , 1,70-1,83 (m,

1H, CH) , 1,51-1,71 (m, 8H) , 1,35-1,45 (m, 2H, CH2) , 1,18 (d, J = 6,4 Hz, 6H, CH3) , 1,16 (d, J = 6,4 Hz, 6H, CH3) ; P-RMN (CH3CN) : 146, 90; Ms (FAB+) : m/z 803 1M), 303 (DMTr+) . (Exemplo A5)

De modo a produzir uma molécula de ácido nucleico do presente invento incluindo um ligante com um esqueleto de prolina, sintetizou-se DMTr-amidoetilenoxietilamino-L-prolina-amidite (doravante referida como "tipo espaçador de PEG") de acordo com o Esquema 5 seguidamente apresentado.

(1) DMTr-amido-hidroxietoxietilamino-L-prolina (Composto 23)

Misturaram-se conjuntamente DMTr-amido-L-prolina (Composto 6) (1,00 g, 2,05 mmol), éster 2-(2-hidroxietoxi)etílico de ácido 4-toluenossulfónico (3,10 g, 12,30 mmol) e solução de carbonato de potássio (0,85 g, 6,15 mmol) em dimetilformamida anidra (10 ml) e agitou-se a mistura resultante durante 4 dias à temperatura ambiente em atmosfera de árgon. Removeu-se o solvente na mistura por evaporação à temperatura ambiente a pressão reduzida. Seguidamente, adicionou-se diclorometano (20 ml) e filtrou-se a mistura resultante. Concentrou-se o filtrado e aplicou-se a substância residual obtida a uma coluna de cromatografia em sílica-gel. Usaram-se como eluentes da coluna de cromatografia em sílica-gel, primeiramente, acetato de etilo contendo piridina a 0,05% e seguidamente usou-se uma mistura de CH2CI2 e CH3OH (CH2CI2: CH3OH =9:1) contendo piridina a 0,05%. Como resultado, obteve-se o Composto 23 sob a forma de xarope incolor (1,15 g, rendimento: 97%). Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. 1H-RMN (CDCI3) : 7,41-7,45 (m, 2H, Ar-H) , 7,27-7,31 (m, 6H, Ar-H), 7,17-7,21 (m, 1H, Ar-H), 6,79-6,82 (m, 4H, Ar-H), 3,79 (s, 6H, OCH3) , 3, 60-3,70 (m, 2H) , 3,39-3,57 (m, 4H) , 3,13-3,27 (m, 3H), 3,07-3,08 (m, 2H), 2,71-2,84 (m, 1H), 2,38- 2,46 (m, 1H), 2,14-2,19 (m, 1H), 1,84-1,87 (m, 1H), 1,57-1,76 (m, 8H) . (2) DMTr-amidoetilenoxietilamino-L-prolina-amidite (Composto 24)

Misturou-se a DMTr-amido-hidroxietoxietilamino-L-prolina (Composto 23) (0,63 g, 1,00 mmol) assim obtida com piridina anidra e secou-se azeotropicamente a mistura resultante à temperatura ambiente. Adicionou-se tetrazolideo de di- isopropilamónio (206 mg, 1,20 mmol) à substância residual obtida. Desarejou-se a mistura resultante a pressão reduzida e preencheu-se com árgon gasoso. Adicionou-se acetonitrilo anidro (1 ml) à mistura e adicionou-se adicionalmente uma solução de 2-cianoetoxi-N,N,Ν' ,N' - tetraisopropilfosforodiamidite (282 mg, 1,12 mmol) em acetonitrilo anidro (1 ml) . Agitou-se esta mistura durante 4 horas à temperatura ambiente em atmosfera de árgon.

Seguidamente diluiu-se a mistura com diclorometano e lavou-se com água saturada com bicarbonato de sódio e solução salina saturada. Recolheu-se uma camada orgânica e secou-se com sulfato de sódio. Seguidamente filtrou-se a camada orgânica. Removeu-se o solvente do filtrado obtido por evaporação a pressão reduzida. Aplicou-se a substância residual obtida a uma coluna de cromatografia com enchimento de aminossílica-gel (eluente: hexano : acetona =7:3, contendo piridina a 0,05%). Assim, obteve-se o Composto 24 sob a forma de xarope incolor (0,74 g, pureza: 100%, rendimento: 87%) . Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. 1H-RMN (CD3CN): 7,41-7,43 (m, 2H, Ar-H), 7,28-7,31 (m, 6H, Ar-H), 7,18-7,22 (m, 1H, Ar-H), 6,84-6,86 (m, 4H, Ar-H), 3,73-3, 84 (m, 2H, CH2) , 3,79 (s, 6H, OCH3) , 3,47-3, 64 (m, 7H) , 3,15-3,23 (m, 1H) , 3,11 (t, J = 6,4 Hz, 2H, CH2) , 3,01 (t, J = 5,9 Hz, 2H, CH2) , 2, 95-2, 99 (m, 1H) , 2,58-2, 63 (m, 2H) , 2,31-2,35 (m, 1H, CH) , 2,03-2,19 (m, 1H, CH) , 1,48-1, 78 (m, 10H), 1,12-1,57 (m, 12H, CH3) ; P-RMN (CD3CN) : 148, 00; Ms (FAB+) : m/z 776 (M+) , 303 (DMTr+) 201 (C8Hi9N2OP+) . (Exemplo A6) 1. Síntese de prolinol protegido

De acordo com o esquema 6 seguinte, sintetizou-se prolinol protegido com um grupo dimetoxitritilo (Composto 3).

(1) Trifluoroacetil-L-prolinol (Composto 1)

Dissolveu-se L-prolinol (2,0 g, 20 mmol) em 20 ml de THF. Por outro lado, dissolveu-se trifluoroacetato de etilo (3,0 g, 21 mmol) em 20 ml de THF. Seguidamente, introduziu-se a última solução de THF na solução de THF anterior contendo o L-prolinol e agitou-se durante 12 horas. Esta solução reaccional foi concentrada sob vácuo. Assim, obteve-se o Composto 1 (3,7 g, rendimento: 97%). Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. íH-RMN (CDC13) : 4,28-4,23 (1.0H, m, OH), 3,90-3,41 (5H, H-2, H-5, H-6, m), 2,27-1,77 (4H, H-3, H-4, m). (2) Trifluoroacetil-DMTr-L-prolinol (Composto 2)

Dissolveu-se em piridina o trifluoroacetil-L-prolinol (Composto 1) (3,7 g, 19 mmol) assim obtido e secou-se azeotropicamente três vezes a mistura resultante à temperatura ambiente. Dissolveu-se a substância residual obtida em 15 ml de piridina e adicionou-se cloreto de 4,4' -dimetoxitritilo (DMTr-Cl) (8,1 g, 24 mmol) a esta mistura com agitação da mistura sob árgon e num banho de gelo. Deixou-se reagir adicionalmente durante 4 horas à temperatura ambiente. Seguidamente, de modo a eliminar o excesso de DMTr-Cl, adicionou-se adicionalmente 10 ml de metanol à solução reaccional e agitou-se durante 10 minutos. Seguidamente, adicionou-se diclorometano à solução reaccional e lavou-se a mistura resultante com uma solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio e solução salina saturada. Secou-se uma camada orgânica recolhida após a lavagem com sulfato de sódio. Filtrou-se a camada orgânica e concentrou-se sob vácuo o filtrado obtido. Aplicou-se a substância residual obtida a uma coluna de cromatografia em sílica-gel (eluente CH2CI2: CH3OH = 95 : 5, contendo piridina a 0,1%). Assim, obteve-se o Composto 2 purificado (8,5 g, rendimento: 89%) . Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto.

íH-RMN, (CDCI3) : 7,39-7,18 (9H, m, Ar-H) , 6,82 (4H, d, J = 8,6 Hz, Ar-H), 3,78 (6H, s, OCH3) , 3,70-3,41 (5H, H-2, H-5, H-6, m), 2,19-1,85 (4H, H-3, H-4, m). (3) DMTr-L-prolinol (Composto 3)

Dissolveu-se o trifluoroacetil-DMTr-L-prolinol (Composto 2) (5 g, 10 mmol) assim obtido em 100 ml de THF. Adicionaram- se 100 ml de uma solução aquosa de hidróxido de sódio a 5% a esta solução de THF e submeteu-se a agitação. Adicionaram-se 5 ml de solução de fluoreto de tetra-n-butilamónio (TBAF) 1 M a esta solução e agitou-se durante 12 horas à temperatura ambiente. Lavou-se esta solução reaccional com uma solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio e solução salina saturada. Secou-se uma camada orgânica recolhida após a lavagem com sulfato de sódio. Filtrou-se a camada orgânica e concentrou-se sob vácuo o filtrado obtido. Assim, obteve-se o Composto 3 (3,6 g, rendimento: 90%). Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. íH-RMN (CDCI3) : 7,40-7,14 (9H, m, Ar-H), 6,82 (4H, d, J = 8,6 Hz, Ar-H), 3,78 (6H, s, OCH3) , 3,31 (1H, m, H-6), 3,07 (2H, m, H-2, H-6), 2,90 (2H, m, H-5), 1,84 (3H, m, H-3, H-4), 1,40 (1H, m, H-3) . 2. Síntese do derivado de amidite

Utilizando o prolinol protegido (Composto 3) sintetizado no ponto "1" anteriormente, sintetizaram-se derivados amidite com prolinol ligado em várias formas de ligação de acordo com o Esquema 7 apresentado seguidamente.

(1) DMTr-uretano-L-prolinol (Composto 4)

Dissolveu-se 1, 8-octanodiol (9,0 g, 62 mmol) em 90 ml de THF e colocou-se esta solução sob árgon. Por outro lado, dissolveu-se carbonildiimidazole (2,0 g, 12 mmol) em 10 ml de THF. Adicionou-se esta última solução de THF à solução de THF anterior e agitou-se durante 1 hora à temperatura ambiente. Lavou-se esta solução reaccional com água até deixar de se observar a mancha do 1,8-octanodiol no TLC. Além disso, lavou-se uma camada orgânica recolhida após a lavagem com solução salina saturada e secou-se com sulfato de sódio anidro. Filtrou-se a camada orgânica e concentrou-se o filtrado obtido sob vácuo. Aplicou-se a substância residual obtida a uma coluna de cromatografia de silica-gel (eluente: CH2CI2: CH3OH = 95 : 5) . Obteve-se assim o composto purificado em epígrafe.

Neste composto, activou-se um terminal do 1, 8-octanodiol com carbonildiimidazole (2,3 g, rendimento: 77%).

Dissolveram-se 0,9 g do composto em 10 ml de acetonitrilo e colocou-se esta solução sob árgon. Por outro lado, dissolveu-se DMTr-L-prolinol (Composto 3) (1,9 g, 4,8 mmol) em 20 ml de acetonitrilo. Adicionou-se a última solução de acetonitrilo à primeira solução de acetonitrilo e agitou-se durante 24 horas à temperatura ambiente. Seguidamente lavou-se esta solução reaccional com uma solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio e solução salina saturada. Recolheu-se uma camada orgânica e secou-se com sulfato de sódio anidro. Filtrou-se a camada orgânica e concentrou-se o filtrado obtido sob vácuo. Aplicou-se a substância residual obtida a uma coluna de cromatografia de silica-gel (eluente: diclorometano : acetona = 9:1, contendo piridina a 0,1%) .

Assim, obteve-se o Composto 4 (prolinol-uretano-amidite) purificado (1,5 g, rendimento: 65%). Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto.

!H-RMN, (CDC13) : 7,40-7,14 (9H, m, Ar-H) , 6,82 (4H, d, J = 8,6 Hz, Ar-H), 4,24-3, 94 (2H, m, COOCH2) , 3,78 (s, 6H, OCH3), 3,72-2,96 (7H, m, alquil, H-2, H-5, H-6), 2,10-1,30 (16H, m, alquil, H-3, H-4); FAB-MS: 576 [M+H]+. (2) DMTr-ureido-L-prolinol (Composto 5)

Dissolveu-se sob árgon, trifosgénio (2,0 g, 6,7 mmol) em 10 ml de THF e agitou-se a 0 °C. Por outro lado, dissolveram-se DMTr-L-prolinol (Composto 3) (1,3 g, 3,2 mmol) e N,N- diisopropilet ilamina (16 g, 124 mmol) em 10 ml de THF e introduziu-se esta solução na solução de trifosgénio em THF. Agitou-se esta solução reaccional durante 1 hora a 0 °C e seguidamente durante 2 horas à temperatura ambiente.

Seguidamente, dissolveram-se 8-amino-l-octanol (2,3 g, 16 mmol) e N, N-diisopropiletilamina (5,0 g, 38 mmol) em 30 ml de THF. Introduziu-se a solução reaccional que esteve em agitação nesta solução de THF e agitou-se durante 1 hora a 0 °C e seguidamente durante 48 horas à temperatura ambiente.

Concentrou-se esta solução reaccional sob vácuo e dissolveu-se a substância residual obtida em diclorometano. Lavou-se esta solução com uma solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio e solução salina saturada. Recolheu-se uma camada orgânica e secou-se com sulfato de sódio anidro. Filtrou-se a camada orgânica e concentrou-se o filtrado obtido sob vácuo. Purificou-se a substância residual obtida por aplicação numa coluna de cromatografia de silica-gel de fase reversa. Neste momento o eluente usado foi um solvente misto de acetona e água contendo piridina a 0,1% e a razão de mistura entre acetona e água foi alterada passo-a-passo. Especificamente, alterou-se gradualmente a razão molar entre acetona e água (acetona : água) de modo a ser 2:8, 3:7, 4:6e5:5 nesta ordem. Extraíu-se com diclorometano uma fracção contendo Composto 5 como composto alvo e secou-se a camada orgânica assim obtida com sulfato de sódio anidro. Filtrou-se a camada orgânica e concentrou-se o filtrado obtido sob vácuo. Assim, obteve-se o Composto 5 (prolinol-ureido-amidite) (0,9 g, rendimento: 49%) . Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. 1H-RMN (CDCls) : 7,40-7,14 (9H, m, Ar-H), 6,82 (4H, m, Ar- H) , 3,78 (s, 6H, OCH3) , 3, 68-3,25 (9H, m, CH2NH, CH2OH, H-2, H- 5, H-6) , 1,74-1,18 (16H, m, alquil, H-3, H-4) ; FAB-MS: 575 [M+H]+. (3) Derivados de amidite contendo prolinol (Compostos 6 e 7)

Dissolveu-se em acetonitrilo o Composto 4 assim obtido (0,80 g, 1,4 mmol) como um prolinol modificado e a mistura resultante foi seca azeotropicamente três vezes à temperatura ambiente. Dissolveu-se a substância residual obtida em 1 ml de acetonitrilo e colocou-se a solução sob árgon. Adicionou-se tetrazolídeo de diisopropilamónio (0,24 g, 1,4 mmol) a esta solução de acetonitrilo, obtendo-se assim uma solução reaccional. Por outro lado, dissolveu-se 2-cianoetil-Ν,Ν,Ν' ,N' -tetraisopropilfosforodiamidite (0,50 g, 1,7 mmol) em 1 ml de acetonitrilo. Adicionou-se esta solução à solução reaccional e agitou-se a mistura resultante durante 4 horas à temperatura ambiente. Adicionou-se diclorometano à solução reaccional e lavou-se a mistura resultante com uma solução aquosa saturada de hidrogenocarbonato de sódio e solução salina saturada. Secou-se uma camada orgânica recolhida após a lavagem com sulfato de sódio anidro. Filtrou-se a camada orgânica e concentrou-se o filtrado obtido sob vácuo. Aplicou-se a substância residual obtida a uma coluna de cromatografia de aminossílica-gel (eluente: hexano : acetona = 10 : 1, contendo piridina a 0,1%) . Assim, obteve-se o Composto 6 (DMTr-uretano-L-prolinolamidite) purificado (0,90 g, rendimento: 83%) . Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto. 1H-RMN (CDCI3) : 7,40-7,14 (9H, m, Ar-H), 6,82 (4H, d, J = 8,6 Hz, Ar-H), 4,24-3, 94 (2Η, m, COOCH2) , 3,78 (s, 6Η, OCH3) , 3,72-2, 96 (11Η, m, CH20, POCH2, CHCH3, H-2, H-5, H-6) , 2,58 (2H, m, CH2CN) , 2,10-1,46 (16H, m, alquil, H-3, H-4), 1,34-1,10 (12H, m, CHCH3) ; 31P-RMN: (CD3CN) 146, 82; FAB-MS: 776 [M+fi.]

Obteve-se Composto 7 purificado (DMTr-ureido-L-prolinolamidite) (0,80 g, rendimento: 74%) da mesma forma como anteriormente com a excepção de, como prolinol modificado, se usar Composto 5 em vez de Composto 4. Apresenta-se seguidamente o resultado da análise de RMN respeitante a este composto . 3H-RMN (CDCI3) : 7,40-7,14 (9H, m, Ar-H) , 6,82 (4H, m, Ar- H) , 3,78 (s, 6H, OCH3) , 3, 65-3,25 (13H, m, CH20, POCH2, CHCH3,

H-2, CH2NH, CH2OH, H-2, H-5, H-6), 2,73 (2H, m, CH2CN) , 2, ΙΟΙ,48 (16H, m, alquil, H-3, H-4), 1,35-1,10 (12H, m, CHCH3) ; 31P-RMN (CD3CN) 146, 83; FAB-MS: 775 [M+HJ (Exemplo Bl) Síntese de ARN em fase sólida

Sintetizou-se ARN com um ligante. Sintetizou-se o ARN a partir da sua extremidade 3' e no sentido da sua extremidade 5' com base no método de fosforamidite recorrendo a um sintetizador de ácidos nucleicos (nome comercial: ABI Expedite (marca registada) 8909 Nucleic Acid Synthesis System, Applied Biosystems). Na síntese, usaram-se RNAPhosphoramidites (2' -0-TBDMSi, nome comercial, Samchully Pharm. Co., Ltd.) como amidites de ARN (o mesmo aplica-se doravante aqui). Desprotegeram-se as amidites por um método convencional e purificaram-se os ARN sintetizados por HPLC. Nos exemplos seguintes, efectuou-se a síntese de ARN da mesma forma que no presente exemplo, salvo indicação em contrário.

Especificamente, como o ARN (Ex) do presente exemplo sintetizou-se ARNss (PH-0001) tendo como ligante o Composto 12 apresentado no esquema 2. Primeiramente, sintetizou-se ARN com uma sequência apresentada em SEQ ID NO: 1 seguidamente.

Seguidamente, ligou-se o Composto 12 à extremidade 5' do ARN. Além disso, na extremidade 5' do ARN apresentado em SEQ ID NO: 1, sintetizou-se ARN com a sequência apresentada em SEQ ID NO: 2 seguidamente, através do Composto 12. 5' -GGCUGUUGUCAUACUUCUCAUGGUU-3' (SEQ ID NO: 1) 5' -CCAUGAGAAGUAUGACAACAGCC-3' (SEQ ID NO: 2) O ARNss assim sintetizado é referido como ARNss (PH-0001) do presente exemplo. Tal como apresentado em SEQ ID NO: 3 seguidamente, a estrutura de PH-0001 é de modo a que: a sequência de ARN de SEQ ID NO: 2 está na sua extremidade 5' ; a sequência de ARN de SEQ ID NO: 1 está na sua extremidade 3' ; e estas sequências de ARN estão ligadas entre si através do ligante Lx (i.e., Composto 12) . Além disso, tal como apresentado na sequência seguinte, a sequência de ARN de SEQ ID NO: 2 é complementar à sequência de ARN de SEQ ID NO: 1.

Assim, tal como apresentado na fórmula seguidamente apresentada, PH-0001 tem uma estrutura em haste em resultado de auto-hibridação. Na sequência seguinte, a parte sublinhada "GUUGUCAUACUUCUCAUGG" (SEQ ID NO: 4) é uma região envolvida na inibição da expressão do gene GAPDH.

Ex: PH-0001 (SEQ ID NO: 3) 51 -CG A U G AG A A Gl IAL ] Π A CA A CA GCC-Lx-fífí CI IfíUIJGl JCAl IACÍ] IJCt JCAUGGUU-t CCAUGAG2iAGUAUGAGAACAGCC\ UU GGUACU CUU GAUACU OUU GU C GG ^ ^

Por outro lado, como ARN de um exemplo comparativo sem ligante, sintetizou-se o ARNsh (NH-0001) seguinte como um controlo positivo de ARNi de (Pc) . Tal como seguidamente apresentado, neste NH-0001, a sequência da região 5' indicada com maiúsculas é a mesma que a de PH-0001, i.e., a sequência de ARN de SEQ ID NO: 2 e a sequência da região 3' indicada com maiúsculas é a mesma que a de PH-0001, i.e., a sequência de ARN de SEQ ID NO: 1. Entre a sequência de ARN de SEQ ID NO: 2 e a sequência de ARN de SEQ ID NO: 1, NH-0001 tem a sequência de ARN indicada com letras minúsculas como um ligante, em vez do Composto 12. De forma semelhante a PH-0001, NH-0001 forma uma haste por auto-hibridação, apresentando assim uma estrutura ARNsh, tal como apresentado na fórmula apresentada seguidamente. Na sequência seguinte, a parte sublinhada "GUUGUCAUACUUCUCAUGG" (SEQ ID NO: 4) é uma região envolvida na inibição de expressão.

Pc: NH'0001(SEQ ID NO: 5) 5; - CCATJ GAGA AGUAU GACA AC AGCOcacaccGGCU GUUGU CAUACUUCU CAU GGIJU- 3'

GCIAIJGAGAAGÍIIAUGACAACAGCC c A UUGGUACUCUUCAUAGX'GUUGUCGG ., _C

CCA (Exemplo B2) Efeito de inibição na expressão do gene GAPDH em células HCT116

Usando o ARN do presente invento, analisou-se a expressão do gene GAPDH in vitro. (1) Materiais e método

Como ARN (Ex) do presente exemplo, usou-se ARNss (PH-0001) do Exemplo Bi. Prepararam-se soluções de ARN por dissolução do ARN em água destilada para injecção (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd., doravante a mesma) de modo a atingir as concentrações pretendidas (1 pmol/l, 5 pmol/l e 25 pmol/l).

Usaram-se como células, células HCT116 (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.) . Usou-se como meio um meio 5A de McCoy (Invitrogen) contendo FBS a 10%. As condições de cultura foram estabelecidas a 37 °C e CO2 a 5%.

Primeiramente, cultivaram-se as células HCT116 no meio e adicionaram-se numa placa de 24 poços de modo a gue cada poço contivesse 400 μΐ do meio para se obter uma densidade de 2 x 104 células/poço. Cultivaram-se as células nos poços durante 24 horas adicionais. Seguidamente, transfectaram-se as células com o ARN usando o reagente de transfecção Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com o protocolo fornecido com este. Especificamente, efectuou-se a transfecção estabelecendo uma composição por poço como se segue. A concentração final do ARN no poço foi estabelecida a 1 nmol/1, 5 nmol/1 ou 25 nmol/1.

Após a transfecção, cultivaram-se as células nos poços durante 24 horas e seguidamente recolheu-se o ARN usando um mini kit RNeasy (Qiagen, Países Baixos) de acordo com o protocolo fornecido com este. Subsequentemente, sintetizou-se o ADNc a partir do ARN usando uma transcriptase reversa (nome comercial: Superscript III, Invitrogen) de acordo com o protocolo fornecido com esta. Assim, tal como seguidamente descrito, efectuou-se PCR usando o ADNc assim sintetizado como um molde e mediram-se os níveis de expressão do gene GAPDH e do gene de -actina como padrão interno. Corrigiu-se o nível de expressão do gene GAPDH relativamente ao do gene da actina.

Efectuou-se o PCR usando LightCycler FastStart ADN Master SYBR Green I (nome comercial, Roche) como reagente e Light Cycler DX400 (nome comercial, Roche) como instrumento (doravante o mesmo). Amplificaram-se o gene GAPDH e o gene da -actina usando os seguintes conjuntos de iniciadores, respectivamente.

Conjunto de iniciadores de PCR para o gene GAPDH 5' -GGAGAAGGCTGGGGCTCATTTGC-3' (SEQ ID NO: 7) 5' -TGGCCAGGGGTGCTAAGCAGTTG-3' (SEQ ID NO: 8)

Conjunto de iniciadores para o gene da -actina 5' -GCCACGGCTGCTTCCAGCTCCTC-3' (SEQ ID NO: 9) 5' -AGGTCTTTGCGGATGTCCACGTCAC-3' (SEQ ID NO: 10)

Como controlo 1, relativamente às células às quais se tinha apenas adicionado 100 μΐ da solução (B) , mediram-se também as quantidades dos genes expressos (-) . Além disso, como controlo 2, relativamente às células submetidas aos mesmos processos de transfecção tal como anteriormente com excepção de que a solução de ARN não foi adicionada e que se adicionaram (B) e 1,5 μΐ de (A) de modo a que a quantidade total de (A) e (B) seria de 100 μΐ, mediu-se igualmente o nivel de expressão do gene (simulado).

Seguidamente, estabeleceu-se como 1 o nivel de expressão corrigido do gene GAPDH no controlo (-) e que nas células transfectadas com o ARN a cada concentração foi apresentado como o valor relativo ao do controlo (-). (2) Resultados

Apresentam-se estes resultados na figura 4. A figura 4 é um gráfico que apresenta o nivel de expressão relativa do gene GAPDH e o eixo vertical indica o nivel relativo de expressão génica. Tal como se pode observar a partir da figura 4, a actividade de inibição de PH-0001 do Exemplo BI não foi prejudicada. Igualmente, considera-se que PH-0001 é estabilizado pelo Composto 12 como um ligante do presente invento. (Exemplo B3) Estabilidade em soro humano

Relativamente ao ARN do presente invento, analisou-se a estabilidade em soro humano. (1) Materiais e método

Como ARN (Ex) do presente exemplo, usou-se ARNss (PH-0001) do Exemplo BI. Como ARN de um exemplo comparativo, usou-se ARNsh (NH—0001) como ARNi de controlo positivo (Pc) usado no Exemplo BI.

Primeiramente, misturaram-se cada um dos ARN e soro humano normal (MP Biomedicals) em 1 χ PBS e incubou-se 30 μΐ desta mistura a 37 °C. Em 30 μΐ da mistura, a quantidade de ARN adicionado foi estabelecida a 60 pmol e a quantidade de soro humano normal adicionado foi estabelecida de modo a que a sua concentração final fosse de 10%. Seguidamente, 0 horas, 0,5 horas, 1 hora e 2 horas após o início da incubação, terminou-se a reacção por extracção com fenol e clorofórmio. Submeteu-se o extracto líquido obtido a electroforese usando um gel de poliacrilamida a 15%. Seguidamente, corou-se o gel com SYBR Green II (nome comercial, Lonza) e seguidamente analisou-se usando uma E-B0X-VX2 (M & S Instruments Inc., Tóquio). (2) Resultados

Apresentam-se estes resultados na figura 5. A figura 5 é um electroforetograma mostrando a estabilidade. Na figura 5, a pista "M" indica um marcador de peso molecular e " (h)" indica 0 tempo de incubação.

Tal como se pode observar na figura 5, relativamente a NH- 0001 do exemplo comparativo composto por um nucleótido natural, verificou-se que se iniciou uma reacção de degradação rápida logo às 0,5 horas após o início da incubação e em seu resultado, os tamanhos do ARN a todos os pontos temporais entre 0,5 e 2 horas após o início da incubação foram menores do que o tamanho do ARN às 0 horas após o início da incubação. Contrariamente, relativamente a PH-0001 do exemplo incluindo o ligante, não se observou substancialmente qualquer alteração na mobilidade com o tempo de incubação, i.e., não se observou substancialmente qualquer diminuição de peso molecular devido à degradação. Estes resultados demonstram que o ARN com o ligante pode conseguir estabilidade melhorada em soro humano. (Exemplo B4) Efeito de inibição da expressão do gene GAPDH em células HCT 116

Sintetizou-se ARNss incluindo um ligante contendo prolina representado pela fórmula seguinte e analisou-se o efeito de inibição do ARNss no gene GAPDH.

(1) Materiais e método (1.1) Síntese em fase sólida de ARNss

Sintetizou-se o ARN com base num método de fosforamidite do mesmo modo que no Exemplo BI.

Como ARN (Ex) do presente exemplo, usou-se ARNss (PK-0004) apresentado seguidamente. Na sequência seguinte, "Lx" e "Ly" são cada o ligante contendo prolina representado pela fórmula anterior (apresentada no parágrafo [0275]). Na síntese do ARNss, sintetizou-se o ARNss a partir do seu lado 3' usando amidites de ARN (nome comercial "RNA Phosphoramidites", Samchully Pharm. Co. , Ltd.) de acordo com SEQ ID NO: 11. Nos locais "Lx" e "Ly", ligaram-se DMTr-diamido-L-prolina-amidites (Compostos 10 no esquema 3) sintetizadas no Exemplo A3-1. Na sequência, "GUUGUCAUACUUCUCAUGG" (SEQ ID NO: 4) é uma região envolvida na inibição de expressão.

Como ARN de um exemplo comparativo, usou-se ARNss (PK-0003) como um ARNi de controlo negativo (Nc) . Na sequência seguinte, "Lx" e "Ly" são cada um o ligante contendo prolina representado pela fórmula anterior (apresentado no parágrafo [0275]). Na síntese do ARNss, sintetizou-se o ARNss a partir do seu lado 3' usando amidites de ARN (nome comercial "RNA Phosphoramidites", Samchully Pharm. Co., Ltd.) de acordo com a SEQ ID NO: 12. Nos locais de "Lx" e "Ly", ligaram-se as DMTr-diamido-L-prolina-amidites sintetizadas no Exemplo A3 (Compostos 10 no esquema 3). Concebeu-se este ARNss de modo a incorporar uma sequência permutada em vez da sequência de inibição de expressão.

(1.2) Inibição da expressão génica

Preparou-se uma solução de ARN por dissolução de cada um dos ARN que tinha sido crio-preservado em água destilada para injecção (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) de modo a obter uma concentração de 20 pmol/l.

Usando a solução de ARN, mediu-se o nivel de expressão do gene GAPDH em células HCT116 do mesmo modo que no Exemplo B2. Na transfecção, a composição por poço foi estabelecida como se segue. Na composição seguinte, (B) é Opti-MEM (Invitrogen), (C) é a solução de ARN de 20 pmol/l e foram adicionados de modo que a sua quantidade total seria de 98,5 μΐ. A concentração final de ARN no poço foi estabelecida a 1 nmol/1, 3 nmol/1 ou 10 nmol/1.

(2) Resultados

Apresentam-se estes resultados na figura 6. A figura 6 é um gráfico apresentado a nivel de expressão relativa do gene GAPDH. Tal como se pode observar pela figura 6, PK-0004 do exemplo com o ligante do presente invento apresentou uma actividade de inibição potente e a actividade foi dependente da dose. Por outro lado, não se observou qualquer efeito de inibição quando se usou PK-0003 como controlo negativo. (Exemplo B5) Reactividade da proteína Dicer

Analisou-se a reactividade de uma proteína Dicer humana recombinante com ARNss previamente substituído com um ligante contendo prolina. (1) Materiais e método

Como ARN (Ex) do presente exemplo, usou-se ARNss (PK-0004) do Exemplo B4. Como ARN de um exemplo comparativo, usou-se ARNss (PK-0003) como um controlo negativo de ARNi (Nc) apresentado no Exemplo B4 e usou-se ARNss (NK-0016) apresentado seguidamente como um ARNi de controlo positivo (Pc). A estrutura de NK-0016 é tal que as sequências da região do lado 5' (Xc) , da região interna do lado 5' (X) , da região do lado 3' (Yc) e da região interna do lado 3' (Y) são as mesmas das presentes em PK-0004 e entre Xc e X e entre Yc e Y, proporcionaram-se polinucleótidos como ligantes em vez dos ligantes (Lx, Ly) representados na fórmula anterior (apresentada no parágrafo [0275]) usados em PK-0004.

Preparou-se uma solução reaccional contendo a proteína Dicer e cada um dos ARN usando Coldshock-DICER (nome comercial, Takara Bio Inc.) como reagente de acordo com o protocolo fornecido. Incubou-se esta solução reaccional a 37 °C. Estabeleceu-se o tempo de incubação em 0, 3, 6 ou 9 horas. À solução reaccional previamente submetida ao tempo de pré-incubação determinado, adicionou-se uma solução de terminação de reacção a acompanhar o reagente. Seguidamente, submeteu-se a solução a electroforese usando gel de poliacrilamida a 15%.

Em seguida, corou-se o gel com SYBR Green II (nome comercial, Lonza) e seguidamente analisou-se usando E-BOX-VX2 (nome comercial, M & S Instruments Inc.). (2) Resultados e análise

Apresentam-se estes resultados na figura 7. A figura 7 apresenta os resultados da electroforese, que indicam a reactividade da proteína Dicer com ARNss. Na figura 7, a pista "M" indica um marcador de peso molecular (20 pb, 30 pb, 40 pb, 50 pb) e "(h)" indica o tempo de incubação. O NK-0016 do exemplo comparativo composto por um nucleótido natural, reagiu rapidamente com a proteína Dicer e desapareceu antes de decorridas 9 horas a partir do início da incubação. Contrariamente, os ARN com um ligante contendo prolina, i.e., PK-0004 do exemplo e PK-0003 como controlo negativo, reagiram gradualmente com a proteína Dicer, de modo que não desaparecerem completamente mesmo 9 horas após o início da incubação. A partir destes resultados, verificou-se que a estabilidade em células é melhorada por incorporação de um ligante contendo prolina. Ou seja, considerando estes resultados conjuntamente com os resultados obtidos relativamente ao efeito de inibição do gene, concluiu-se que o ARN do presente invento com um ligante contendo prolina tem um efeito de melhorar a durabilidade do efeito da interferência de ARN em células. (Exemplo B6) Efeito de inibição sobre a expressão do gene GAPDH em células A549 e células 293

Analisou-se a inibição da expressão do gene GAPDH in vitro usando ARNss previamente submetido a substituição com um ligante com prolina. (1) Materiais e método

Como ARN (Ex) do presente exemplo, usou-se ARNss (PK-0004) do Exemplo B4. Como ARN de um exemplo comparativo, usou-se ARNss (PK-0003) como um ARNi de controlo negativo (Nc) apresentado no Exemplo B4. Preparou-se a solução de ARN por dissolução de cada um dos ARN em água destilada para injecção (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) de modo a obter uma concentração de 20 pmol/l.

Usaram-se como células, células A549 e células 293 (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.). Como meio para as primeiras células, usou-se DMEM contendo FBS a 10% (Invitrogen). Como meio para as últimas células, usou-se MEM contendo FBS a 10% (Invitrogen). As condições de cultura foram estabelecidas a 37 °C e C02 a 5%.

Primeiramente, cultivaram-se as células de cada tipo no meio e adicionaram-se numa placa de 24 poços de modo que cada poço contivesse 400 μΐ do meio para atingir uma densidade de 5 x 104 células/poço. Cultivaram-se as células nos poços durante mais 24 horas. Seguidamente, transfectaram-se as células com o ARN usando um reagente de transfecção Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com o protocolo fornecido.

Especificamente, efectuou-se a transfecção estabelecendo a composição por poço como se segue para células A549 e células 293. Na composição seguinte, (B) é Opti-MEM (Invitrogen) e (C) é uma solução de ARN a 20 pmol/l e foram adicionadas de modo a que a quantidade total de (B) e (C) fosse de 98,5 μΐ ou 99 μΐ. A concentração final do ARN no poço foi estabelecida a 1 nmol/1, 3 nmol/1 ou 10 nmol/1.

Após transfecção, cultura das células, recolha do ARN, síntese do ADNc e PCR efectuados do mesmo modo descrito no Exemplo B4, determinou-se o nível de expressão relativa do gene GAPDH. (2) Resultados

Apresentam-se estes resultados nas figuras 8 e 9. A figura 8 apresenta os resultados obtidos respeitantes às células A549 e a figura 9 apresenta os resultados obtidos respeitantes às células 293. As figuras 8 e 9 são cada uma gráficos apresentando o nível de expressão relativa do gene GAPDH. Tal como se pode constatar das figuras 8 e 9, verificou-se que PK-0004 de acordo com o exemplo apresenta uma actividade de inibição potente e apresenta um efeito de inibição génica de uma forma dependente da concentração. Por outro lado, não se observou qualquer efeito de inibição quando se usou PK-0003 como controlo negativo. (Exemplo B7) Efeito de inibição sobre a expressão do gene GAPDH em células HCT116

Usando ARNss previamente submetido a substituição com um ligante contendo prolina ou prolinol, analisou-se o efeito de inibição sobre a expressão de GAPDH em células HCT116. (1) Materiais e método (1.1) Síntese em fase sólida de ARNss

Como ARN do presente exemplo (Ex ARNss), sintetizou-se o mesmo Ex ARNss tal como usado no Exemplo B4. Sintetizou-se o ARN do mesmo modo que no Exemplo B4, salvo indicação em contrário.

Como amidites para síntese de ligante usaram-se L-prolina-diamido-amidite (Composto 10 no esquema 3) sintetizada no Exemplo A3-1 e prolinol-uretanoamidite (Composto 6 no esquema 7), prolinol-ureídoamidite (Composto 7 no esquema 7), prolina-amidoamino-amidite (Composto 12 no esquema 3) e prolina-amidureidoamidite (Composto 17 no esquema 3) sintetizadas no Exemplo A6. Relativamente aos respectivos ARN assim sintetizados, apresentam-se na tabela seguinte as amidites usadas para síntese das suas partes de ligante.

(1.2) Inibição da expressão génica

Efectuou-se transfecção para células HCT116, cultura, recolha do ARN, síntese do ADNc e PCR do mesmo modo descrito no Exemplo B4, com a excepção de se usarem cada um dos ARN acima e determinou-se o nível de expressão relativa do gene GAPDH. (2) Resultados

Apresentam-se estes resultados na figura 10. A figura 10 é um gráfico que apresenta o nível de expressão relativa do gene GAPDH nas células HCT116. Tal como se pode concluir a partir da figura 10, verificou-se que os ARNss incluindo prolina ou prolinol (PK-0004, PK-0006, PK-0010, PK-0012, e PK-0016) apresentam cada um actividade de inibição potente e apresentam cada um efeito de inibição de uma forma dependente da concentração. (Exemplo B8) Efeito de inibição sobre a expressão do gene GAPDH em células HCT116

Analisou-se o efeito de inibição sobre o gene GAPDH em células HCT116 in vitro usando ARNss previamente submetido a substituição com um ligante com prolina. (1) Materiais e método (1.1) Síntese em fase sólida de ARNss

Como ARN do presente exemplo (Ex ARNss), sintetizou-se o mesmo Ex ARNss que se usou no Exemplo B4. Sintetizou-se o ARN de mesmo modo que no Exemplo B4, salvo indicação em contrário.

Como amidites para síntese de ligante, usaram-se D-prolina-diamido-amidite (Composto 9 no esquema 3) sintetizada no Exemplo A3-1 e prolina-diamido-amidite (tipo B) (Composto 22 no esquema 4) sintetizada no Exemplo A4. Relativamente aos respectivos ARN assim sintetizados, apresentam-se na tabela seguinte as amidites usadas para síntese das suas partes de ligante.

(1.2) Inibição da expressão génica

Apresentam-se estes resultados na figura 11. A figura 11 é um gráfico que apresenta o nível de expressão relativa do gene GAPDH nas células HCT116. Tal como se pode concluir a partir da figura 11, verificou-se que os ARNss incluindo prolina (PK-0004, PK-0034 e PK-0036) apresentam cada um actividade de inibição potente e apresentam cada um efeito de inibição de forma dependente da concentração. (Exemplo B9) Efeito de inibição sobre a expressão do gene TGF- 1 in vitro

Usando ARNss previamente submetidos a substituição com um ligante contendo prolina, analisou-se o efeito de inibição sobre a expressão do gene TGF- 1 em células Hepal-6. (1) Materiais e método (1.1) Síntese em fase sólida de ARNss

Como ARN do presente exemplo, sintetizaram-se PK-0007, PK-0026, PK-0027 e PK-0028 seguidamente apresentados.

Sintetizaram-se os ARN do mesmo modo que no Exemplo B4, salvo indicação em contrário. Como amidites para síntese de ligando, usou-se L-prolina-diamido-amidite (Composto 10 no esquema 3) sintetizada no Exemplo A3-1. Cada um dos ARN inclui a seguinte sequência de 21 meros que inibe a expressão do gene TGF- 1. Concebeu-se esta sequência com base no ARNsi usado por Cheng et ai. (Mol. Pharm., 2009, 6, p. 772-779) . Nas sequências seguintes, indica uma base desemparelhada.

Sequência de inibição de expressão do gene TGF- 1 (SEQ ID NO: 18) 5' -AAAGUCAAUGUACAGCUGCUU-3'

(1.2) Inibição da expressão génica

Preparou-se uma solução de ARN por dissolução de cada um dos ARN que tinha sido crio-preservado em água destilada para injecção (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) de modo a atingir uma concentração de 20 pmol/l.

Usaram-se como células, células Hepal-6 (The RIKEN BioResource Center) e usou-se como meio DMEM contendo FBS a 10% (Invitrogen). As condições de cultura foram estabelecidas a 37 °C e CO2 a 5%.

Primeiramente, cultivaram-se as células Hepal-6 no meio e adicionaram-se a uma placa de 24 poços de modo a cada poço conter 400 μΐ de meio para atingir uma densidade de 3 x 104 células/poço. Seguidamente, efectuou-se transfecção dos ARNss para as células Hepal-6, recolha do ARN e síntese de ADNc, do mesmo modo que no Exemplo B4, excepto que se utilizou a solução de ARN anterior. Na transfecção, a concentração final de ARN no poço foi estabelecida a 1 nmol/1. Seguidamente, efectuou-se PCR do mesmo modo que no Exemplo B4, com excepção de se usarem como iniciadores o seguinte conjunto de iniciadores de PCR para o gene TGF- 1 e o seguinte conjunto de iniciadores para o gene de -actina e mediu-se o nível de expressão do gene TGF- 1 e do gene de -actina como padrão interno. O nível de expressão do gene TGF- 1 foi corrigido tomando como referência o nível de expressão do gene da actina.

Conjunto de iniciadores de PCR para o gene TGF- 1 5' -CCATTGCTGTCCCGTGCAGAGCTG-3' (SEQ ID NO: 19) 5' -ATGGTAGCCCTTGGGCTCGTGGATC-3' (SEQ ID NO: 20)

Conjunto de iniciadores para o gene da -actina 5' -GTCGTACCACAGGCATTGTGATGG-3' (SEQ ID NO: 21) 5' -GCAATGCCTGGGTACATGGTGG-3' (SEQ ID NO: 22)

Mediu-se o nível de expressão génica de cada um de controlo (-) e controlo (simulado) , do mesmo modo que no Exemplo B4. Seguidamente, estabeleceu-se o nível de expressão corrigido para o gene TGF- 1 no controlo (-) como sendo 1 e apresentou-se o das células transfectadas com cada ARN como um valor relativo ao do controlo. (2) Resultados

Apresentam-se estes resultados na figura 12. A figura 12 é um gráfico que apresenta o nível de expressão relativa do gene TGF- 1. Tal como se pode verificar na figura 12, os ARNss contendo prolina apresentam todos potentes actividades de inibição.

Entre eles, PK-0027 e PK-0028 nos quais a 2a base e a 3a base da extremidade 3' da região interna (Z) são as bases desemparelhadas, respectivamente, apresentaram actividades de inibição mais elevadas do que PK-0007 e PK-0026 nas quais a 4a base e a 5a base a partir da extremidade 3' da região interna (Z) são as bases desemparelhadas, respectivamente. Com base nestes resultados, verificou-se que, fixando a posição da base desemparelhada na região interna (Z) de modo a estar mais próxima da extremidade 3' relativamente ao meio da região interna, é possível melhorar a actividade de inibição. De igual modo, já foi confirmado que a actividade de inibição pode ser melhorada fixando a posição da base desemparelhada na região interna (Z) de modo a estar mais próxima da extremidade 5' relativamente ao meio da região interna. Tal relação entre a posição da base desemparelhada e a actividade de inibição apresentada, revelou um comportamento semelhante ao apresentado em exemplos de referência descritos seguidamente. (Exemplo B10) Efeito de inibição da expressão do gene TGF-1 e lesão aguda do pulmão in vivo

Usando ARNss previamente substituído com um ligando contendo prolina, analisaram-se os efeitos de inibição da expressão génica e lesão aguda do pulmão in vivo. Analisaram-se estes efeitos de acordo com o método descrito em Takagi et al. (J. Thromb Hemost 2009; 7: p. 2053-2063) . (B10-1) Efeito de inibição da expressão do gene TGF- 1 in vivo

Usando ARNss previamente substituído com um ligando contendo prolina, analisaram-se os efeitos de inibição sobre a expressão do gene TGF- 1 in vivo. (1) Materiais e método (1.1) Administração de ARN a ratinhos com lesão aguda do pulmão

Como ARN (Ex) do presente exemplo, usou-se ARNss (PK-0007) do Exemplo B9. Usaram-se como ARN de um exemplo comparativo: ARNss (PK-0008) como controlo negativo (Nc); ARNss (NK-0033) como controlo positivo (Pc) e ARNss (NK-0035) como um seu controlo negativo (Nc); e ARNds (NI-0030) como controlo positivo (Pc) e ARNds (NI-0031) como um seu controlo negativo (Nc), que se apresentam todos seguidamente.

Preparou-se a solução de ARN por dissolução de 100 pg de cada um dos ARN em 75 μΐ de soro fisiológico estéril. Por outro lado, preparou-se uma solução de LPS por dissolução de 100 pg de lipopolissacárido (LPS) em 50 pl de soro fisiológico estéril.

Primeiramente, instilou-se 80 pl da solução do ARN em traqueias de ratinhos. Seguidamente, 1 hora após a instilação, instilou-se 50 μΐ da solução de LPS na traqueia de ratinhos para induzir lesão pulmonar.

Como controlo negativo para o LPS, usou-se 50 μΐ de soro fisiológico estéril isento de LPS em vez da solução de LPS. De igual modo, como controlo negativo para a solução de ARN, usou-se 80 μΐ de soro fisiológico estéril.

Apresentam-se seguidamente os grupos de administração. Em cada grupo de administração usaram-se quatro a seis ratinhos.

Grupo de administração 1: 5 minutos após a administração de 75 μΐ de soro fisiológico estéril, administraram-se 50 μΐ de soro fisiológico estéril.

Grupo de administração 2: 5 minutos após a administração de 75 μΐ de soro fisiológico estéril, administraram-se 50 μΐ da solução de LPS.

Grupo de administração 3: 5 minutos após a administração de 75 μΐ de uma solução de ARN (PK-0007), administraram-se 50 μΐ da solução de LPS.

Grupo de administração 4: 5 minutos após a administração de 75 μΐ da solução de ARN (PK-0008), administraram-se 50 μΐ da solução de LPS.

Grupo de administração 5: 5 minutos após a administração de 75 μΐ da solução de ARN (NK-0033), administraram-se 50 μΐ da solução de LPS.

Grupo de administração 6: 5 minutos após a administração de 75 μΐ da solução de ARN (NK-0035), administraram-se 50 μΐ da solução de LPS.

Grupo de administração 7: 5 minutos após a administração de 75 μΐ da solução de ARN (NI-0030), administraram-se 50 μΐ da solução de LPS.

Grupo de administração 8: 5 minutos após a administração de 50 μΐ da solução de ARN (NI-0031), administraram-se 50 μΐ da solução de LPS. (1.2) Amostragem de fluido de lavagem bronquioalveolar (BALF) 24 horas após a instilação da solução de LPS ou soro fisiológico estéril (controlo negativo para LPS), submeteram-se os ratinhos a eutanásia por administração de um excesso de pentobarbital nas suas cavidades abdominais. Recolheram-se os pulmões e usaram-se como amostras.

Relativamente a cada amostra de pulmão dos ratinhos, mediu-se o nivel de expressão do gene TGF- 1 por unidade de peso de pulmão usando TGF- 1 Quantikine Colorimetric Sandwich ELISA (nome comercial, R&D Systems). (2) Resultados

Apresentam-se estes resultados na figura 13. A figura 13 é um gráfico que apresenta o nivel de expressão do gene TGF- 1 por unidade de peso de pulmão em cada grupo de administração e o eixo horizontal indica a quantidade da proteína TGF- 1 expressa. No grupo de administração 3 (LPS (+)/PK-0007 (+)), o nível de expressão do gene TGF- 1 foi fortemente inibido comparativamente com o grupo de administração 2 (LPS (+)/ARNss (-)). Verificou-se que este efeito de inibição era mais forte do que os do grupo de administração 5 (LPS ( + )/controlo positivo de NK-0033 ( + ) ) e do grupo de administração 7 (LPS (+)/controlo positivo de NI-0030). No grupo de administração 4 (controlo negativo de PK-0008 (+)), no grupo de administração 6 (controlo negativo de NK-0035 (+)) e no grupo de administração 8 (controlo negativo de NI-0031 (+)), não se observou qualquer efeito de inibição. (A10-2) Efeito fora do alvo in vivo

Usando ARNss previamente submetido a substituição com um ligante contendo prolina, analisou-se o efeito fora do alvo in vivo e avaliou-se o efeito secundário.

Como ARN do presente exemplo, usou-se ARNss (PK-0007) do Exemplo B9. Como ARN de um exemplo comparativo, usou-se ARNss (PK-0008) como um ARNi de controlo negativo (Nc) apresentado no Exemplo A10-1. Preparou-se a solução de ARN por dissolução de 100 pg de cada um dos ARN em 75 μΐ de soro fisiológico estéril.

Apresentam-se seguidamente os grupos de administração. Em cada grupo de administração usaram-se dois a quatro ratinhos.

Grupo de administração 1:

Administraram-se 75 μΐ de soro fisiológico estéril.

Grupo de administração 2:

Administraram-se 75 μΐ da solução de ARN (PK-0007).

Grupo de administração 3:

Administraram-se 75 μΐ da solução de ARN (PK-0008).

Então, 24 horas após a administração, submeteram-se os ratinhos a eutanásia do mesmo modo que no Exemplo B10-1. Recolheram-se amostras de sangue perfurando os pulmões dos ratinhos. Adicionou-se cada amostra de sangue a um tubo de ensaio contendo uma solução aquosa de citrato de sódio a 3,8%. A quantidade (volume) de solução aquosa de citrato de sódio foi estabelecida a 1/10 da amostra de sangue. Recolheu-se a amostra de BALF (fluido de lavagem bronqueoalveolar) a partir desta mistura da forma descrita em Yasui et al. (Am J Respir Crit Care Med 2001: 163: 1660-8). Mediram-se as quantidades de TNF- e IFN— no sobrenadante da amostra de BALF.

Mediu-se a quantidade de TNF- e a quantidade de IFN- em cada sobrenadante. Quantificou-se a quantidade de TNF- usando Mouse TNF set II (nome comercial, Beckton Dickinson and Company) de acordo com as suas instruções de utilização. Quantificou-se a quantidade de IFN- usando uma placa de ELISA produzida utilizando Rabbit Anti-Mouse Interferin (nome comercial, PBL Interferon Source) e Biotin Labeling Kit-NH2 (nome comercial, Dojindo Laboratories) de acordo com as suas instruções de utilização.

Apresentam-se estes resultados na figura 14. A figura 14A é um gráfico que apresenta a quantidade de TNF- na amostra BALF em cada grupo de administração e a figura 14B é um gráfico que apresenta a quantidade de IFN- na amostra BALF em cada grupo de administração. Nas figuras 14A e 14B, o eixo horizontal indica as quantidades respectivas. No grupo de administração 2 (PK-0007 (+)) de acordo com o presente exemplo, não se induziu a expressão de TNF- e IFN- comparativamente com o grupo de administração 1 (ARNss (-)). (Exemplo Bll) Resistência a ribonuclease

Relativamente ao ARNss do presente invento, analisou-se a resistência à ribonuclease. (1) Materiais e método

Como ARN (Ex) do presente exemplo, usou-se ARNss (PK-0007) do Exemplo B9. Além disso, usou-se um ARN de um exemplo comparativo, ARNds (NI-0030) como controlo positivo (Pc) apresentado no Exemplo B10-1.

Primeiramente, misturaram-se 60 pmol de cada um dos ARN anteriores, 5 χ 10-5 unidades de ARNase A (Roche) e 5 χ 10_ 5 unidades de ARNase Ti (nome comercial, Roche) com Tris-HCl (pH 8) 20 mmol/1 e incubou-se a mistura resultante a 37 °C. 10 minutos, 20 minutos e 30 minutos após o início da incubação, terminou-se a reacção de ARNase de acordo com um método convencional. Seguidamente, submeteu-se a solução reaccional a electroforese usando um gel de poliacrilamida a 15%. Em seguida, corou-se o gel com SYBR Green II (nome comercial, Lonza) e seguidamente analisou-se usando E-BOX-VX2 (nome comercial, M & S Instruments Inc., Tóquio). (2) Resultados

Apresentam-se estes resultados na figura 15. A figura 15 é um electroferograma que apresenta resistência à ribonuclease.

Na figura 15, a pista "M" indica um marcador de peso molecular e "(min)" indica o tempo de incubação.

Tal como se pode observar pela figura 15, NI-0030 do exemplo comparativo composto por um nucleótido natural, foi degradado quase completamente após 10 minutos de incubação. Contrariamente, PK-0007 do exemplo permaneceu ainda após 10 minutos de incubação. Estes resultados demonstram que o ARNss do presente invento é melhor que o ARNds em termos de resistência a ribonuclease. (Exemplo B12) Resistência a nuclease

Relativamente ao ARNss do presente invento, analisou-se a resistência à nuclease. (1) Materiais e método

Como ARN (Ex) do presente exemplo, usou-se ARNss (PK-0007) do Exemplo B9. Como ARN de um exemplo comparativo, usou-se ARNds (NI-0030) como uma ARNi de controlo positivo (Pc) apresentado no Exemplo B10-1.

Primeiramente, misturaram-se 60 pmol de cada ARNss com 0,5 unidades de nuclease S7 (Roche) em Tris-HCl (pH 8) 50 mmol/1 contendo CaCl2 5 mmol/1 e incubou-se a mistura resultante a 37 °C. 0,5 horas após o início da incubação (0 h), terminou-se a reacção de nuclease S7 de acordo com um método convencional. Seguidamente, submeteu-se a solução reaccional a electroforese usando um gel de poliacrilamida a 15% com ureia 7 M, de acordo com um método convencional. Em seguida, corou-se o gel com SYBR Green II (nome comercial, Lonza) e seguidamente analisou-se usando E-BOX-VX2 (nome comercial, M & S Instruments Inc. , Tóquio). (2) Resultados

Apresentam-se estes resultados na figura 16. A figura 16 é um electroferograma que apresenta resistência a nuclease S7. Na figura 16, a pista "M" indica um marcador de peso molecular e "(h)" indica o tempo de incubação.

Tal como se pode observar pela figura 16, NI-0030 do exemplo comparativo composto por um nucleótido natural, foi degradado quase completamente após 0,5 horas de incubação.

Contrariamente, PK-0007 do exemplo permaneceu mesmo após 0,5 horas de incubação. Estes resultados demonstram que o ARNss do presente invento é melhor que o ARNds em termos de resistência a nuclease S7. A partir dos respectivos resultados obtidos nos Exemplos B, verificou-se que os ssPN do presente invento podem ser construídos independentemente do tipo de gene alvo, por exemplo. Assim, pode dizer-se que a molécula ssPN do presente invento constitui uma nova ferramenta versátil que pode ser usada para inibir a expressão de um gene alvo sem depender do tipo de gene alvo. (Exemplo de referência 1)

Usando os ARNss com uma base desemparelhada em posições diferentes, analisou-se a inibição da expressão do gene GAPDH in vitro. (1) Materiais e método

Como ARN, usaram-se os ARNss apresentados na figura 17. Na figura 17, os números à direita indicam números de identificação de sequências. Na figura 17, a partir da extremidade 5' , uma região indicada com letras minúsculas sublinhadas é a região (Xc); uma região indicada com letras maiúsculas sublinhadas é a região interna (Z) ; e uma região indicada com letras minúsculas sublinhadas é a região (Yc) . Uma região entre Xc e Z é uma região ligante (Lx) e uma região entre Z e Yc é uma região ligante (Ly) . Igualmente, "Xc/Yc" indica a razão entre o comprimento em bases (Xc) da região (Xc) e o comprimento em bases (Yc) da região (Yc). Na figura 17, indica uma base desemparelhada.

Em cada ARNss, o comprimento em bases da região interna (Z) foi estabelecido a 26, o comprimento em bases da região ligante (Lx) foi estabelecido a 7 e o comprimento em bases da região ligante (Ly) foi estabelecido a 4. Em NK-0036 e NK-0040, o número total de bases (Xc + Yc) nas regiões (Xc) e (Yc) foi estabelecido a 26. Nos ARNss diferentes de NK-0036 e NK-0040, o número total das bases (Xc + Yc) nas regiões (Xc) e (Yc) foi estabelecido a 25. Seguidamente, nestas condições, alterou-se o comprimento em bases das regiões (Xc) e (Yc) . Consequentemente, NK-0036 e NK-0040 tornaram-se as moléculas sem bases desemparelhadas. Além disso, cada um dos ARNss diferente de NK-0036 e NK-0040 tornaram-se na molécula na qual a região interna (Z) inclui apenas uma base desemparelhada que não forma uma cadeia dupla e a posição da base desemparelhada na região interna (Z) foi deslocada do lado 3' para o lado 5' .

Efectuaram-se transfecção para células HCT116, cultura de células, recolha de ARN, síntese de ADNc e PCR, de modo semelhante ao Exemplo B2, com excepção de se ter usado cada um dos ARN anteriores e determinou-se o nível de expressão relativa do gene GAPDH. A concentração de ARN na altura da transfecção foi estabelecida a 10 nmol/1. (2) Resultados e análise

Apresentam-se estes resultados na figura 18. A figura 18 é um gráfico que apresenta o nível de expressão relativa do gene GAPDH quando se usou cada um dos ARN a uma concentração final de 10 nmol/1. Tal como se pode observar na figura 18, verificou-se que todos os ARNss com os comprimentos variáveis da região do lado 5' (Xc) e da região do lado 3' (Yc) inibiram a expressão do gene GAPDH.

Nomeadamente, verificou-se que, à medida que a diferença entre o comprimento em bases da região (Xc) e o comprimento em bases da região (Yc) se tornava maior, o nível de expressão do gene diminuía relativamente, i.e., aumentava o efeito de inibição. Ou seja, verificou-se que, estabelecendo a posição da base desemparelhada na região interna (Z) de modo a estar mais próxima do lado 5' ou do lado 3' relativamente ao meio da região interna, é possível melhorar a actividade de inibição. (Exemplo de referência 2)

Usando os ARNss com uma base desemparelhada em posições diferentes, analisou-se a inibição da expressão do gene TGF- 1 in vitro. (1) Materiais e método

Como ARN, usaram-se os ARNss apresentados seguidamente. Nas sequências seguintes, indica uma base desemparelhada. NK-0 0 3 3 (SEQ ID NO: 49)

(1.2) Inibição da expressão génica

Preparou-se a solução de ARN por dissolução de cada um dos ARN que tinha sido crio-preservado em água destilada para injecção de modo a obter uma concentração de 20 pmol/l. Seguidamente, efectuou-se transfecção dos ARNss para as células Hepal-6, recolha de ARN, síntese de ADNc, PCR e determinação do nível de expressão relativa do gene TGF- 1 tal como no Exemplo B9, com excepção de se usar a solução de ARN anterior. A concentração de ARN na altura da transfecção foi estabelecida a 1 nmol/1. (2) Resultados

Apresentam-se estes resultados na figura 19. A figura 19 é um gráfico que apresenta o nível de expressão relativa do gene TGF- 1. Tal como se pode observar a partir da figura 19, todos estes ARNss apresentaram actividades de inibição. Além disso, NK-0055 e NK-0062 nos quais a 2a base e a 3a base a contar da extremidade 3' da região interna (Z) são as bases desemparelhadas, respectivamente, apresentaram actividades de inibição mais elevadas do que NK-0033 e NK-0061 nas quais a 4a base e a 5a base a contar da extremidade 3' da região interna (Z) são as bases desemparelhadas, respectivamente. Estes resultados estão de acordo com o comportamento apresentado no exemplo de referência 1 dirigido ao gene alvo diferente. (Exemplo de referência 3)

Usando os ARNss com uma base desemparelhada em posições diferentes, analisou-se a inibição da expressão do gene LAMA1 in vitro. (1) Materiais e método

Como ARN, usaram-se os ARNss apresentados seguidamente. Nas sequências seguintes, indica uma base desemparelhada.

Efectuou-se a transfecção de células 293 tal como no Exemplo B6, com excepção de se ter usado cada um dos ARN acima e cultivaram-se as células durante 48 horas. A concentração de ARN na altura da transfecção foi estabelecida a 10 nmol/1. Seguidamente, efectuou-se recolha de ARN, síntese de ADNc e PCR tal como no Exemplo B2, com excepção de se usar o conjunto de iniciadores do gene LAMA1 apresentado seguidamente e mediram-se o nível de expressão do gene LAMA1 e o nível de expressão do gene de -actina como padrão interno. Corrigiu-se o nível de expressão do gene LAMA1 relativamente à do gene de -actina como padrão interno.

Conjunto de iniciadores para o gene LAMA1 5' -AAAGCTGCCAATGCCCCTCGACC-3' (SEQ ID NO: 55) 5' -TAGGTGGGTGGCCCTCGTCTTG-3' (SEQ ID NO: 56)

Relativamente ao controlo 1 (-) e ao controlo 2 (simulado), também se mediram as quantidades de expressão do mesmo modo que no Exemplo B2. Seguidamente, estabeleceu-se o nível de expressão corrigido do gene LAMA1 no controlo (-) como 1 e apresentou-se o nível de expressão nas células t ransf ect adas com cada ARN como um valor relativo ao do controlo. (2) Resultados

Apresentam-se estes resultados na figura 20. A figura 20 é um gráfico que apresenta o nível de expressão relativa do gene LAMA1 em células 293. Tal como se pode observar a partir da figura 20, todos estes ARNss apresentaram actividades de inibição. Além disso, NK-0064 na qual a 2a base a contar da extremidade 3' da região interna (Z) é a base desemparelhada, apresentou uma actividade de inibição mais elevada do que NK-0043 na qual a 4a base a contar da extremidade 3' da região interna (Z) é a base desemparelhada. Estes resultados estão de acordo com o comportamento apresentado nos exemplos de referência 1 e 2 dirigidos a diferentes genes alvo. (Exemplo de referência 4)

Usando os ARNss com uma base desemparelhada em posições diferentes, analisou-se a inibição da expressão do gene LMNA in vitro. (1) Materiais e método

Efectuou-se a transfecção de células A549 tal como no Exemplo B6, com excepção de se ter usado cada um dos ARN acima e cultivaram-se as células durante 48 horas. A concentração de ARN na altura da transfecção foi estabelecida a 3 nmol/1. Seguidamente, efectuou-se recolha de ARN, síntese de ADNc e PCR tal como no Exemplo B2, com excepção de se usar como iniciadores o conjunto de iniciadores do gene LMNA apresentado seguidamente e mediram-se o nível de expressão do gene LMNA e 0 nível de expressão do gene de -actina como padrão interno. Corrigiu-se o nível de expressão do gene LMNA relativamente à do gene de -actina como padrão interno.

Conjunto de iniciadores para o gene LMNA 5' -CTGGACATCAAGCTGGCCCTGGAC-3' (SEQ ID NO: 59) 5' -CACCAGCTTGCGCATGGCCACTTC-3' (SEQ ID NO: 60)

Relativamente ao controlo 1 (-) e ao controlo 2 (simulado), também se mediram as quantidades de expressão do mesmo modo que no Exemplo B2. Seguidamente, estabeleceu-se o nível de expressão corrigido do gene LMNA no controlo (-) como 1 e apresentou-se o nível de expressão nas células transf ectadas com cada ARN como um valor relativo ao do controlo. (2) Resultados

Apresentam-se estes resultados na figura 21. A figura 21 é um gráfico que apresenta o nível de expressão relativa do gene LMNA em células A549. Tal como se pode observar a partir da figura 21, todos estes ARNss apresentaram actividades de inibição. Além disso, NK-0066 na qual a 2a base a contar da extremidade 3' da região interna (Z) é a base desemparelhada, apresentou uma actividade de inibição mais elevada do que NK-0063 na qual a 4a base a contar da extremidade 3' da região interna (Z) é a base desemparelhada. Estes resultados estão de acordo com o comportamento apresentado nos exemplos de referência 1 a 3 dirigidos a diferentes genes alvo. A partir dos resultados obtidos nos exemplos de referência 1 a 4, torna-se evidente que, por exemplo, relativamente à posição da base desemparelhada, verificam-se comportamentos semelhantes independentemente do tipo de gene alvo e uma sequência de inibição de expressão para o gene alvo. Além disso, já se descreveu anteriormente que o Exemplo B9 apresentava um comportamento semelhante aos dos exemplos de referência. (Exemplo de referência 5)

Usando ARNss com variação do comprimento da região interna do lado 5' (X) , da região do lado 5' (Xc), da região interna do lado 3' (Y) e da região do lado 3' (Yc) , analisou-se a inibição da expressão do gene GAPDH in vitro. (1) Materiais e método

Como ARN, usaram-se os ARNss apresentados na figura 22. Na figura 22, os números do lado direito indicam os números de identificação da sequência. Na figura 22, a partir do lado 5' , uma região indicada com letras minúsculas sublinhadas é a região (Xc); uma região indicada com letras maiúsculas sublinhadas é a região interna (Z) ; e uma região indicada com letras minúsculas sublinhadas é a região (Yc) . De igual modo, "Xc+Yc/X+Y" indica a razão entre o comprimento total em bases das regiões (Xc) e (Yc) e o comprimento total em bases das regiões (X) e (Y). Na figura 22, indica uma base desemparelhada.

Em cada um dos ARNss, o comprimento em bases da região ligante (Lx) foi estabelecida como 7, o comprimento em bases da região ligante (Ly) foi estabelecida como 4, o comprimento em bases da região (Yc) foi estabelecida como 1 e a 2a base a contar do lado 3' da região interna (Z) foi estabelecida como uma base desemparelhada. Assim, alteraram-se o comprimento em bases da região interna (Z) e o comprimento em bases da região (Xc) .

Salvo indicação em contrário, efectuaram-se transfecção de cada um dos ARN para células HCT116, cultura, recolha do ARN, síntese do ADNc e PCR, do mesmo modo que no Exemplo B2 e calculou-se o nível de expressão relativa do gene GAPDH. Efectuou-se a transfecção estabelecendo a composição por poço como a mesma apresentada na tabela 2 do Exemplo B4. (2) Resultados e análise

Apresentam-se estes resultados na figura 23. A figura 23 é um gráfico que apresenta o nível de expressão relativa do gene GAPDH quando se usou cada um dos ARN a uma concentração final de 1 nmol/1. Tal como se pode observar na figura 23, verificou-se que todos os ARNss com comprimentos variados das regiões (X) , (Xc) , (Y) e (Yc) , inibiram a expressão do gene GAPDH.

Enquanto o presente invento foi anteriormente descrito com referência a concretizações e exemplos ilustrativos, o presente invento não se lhes limita de qualquer modo.

Aplicabilidade industrial

De acordo com a molécula ssPN do presente invento, é possível inibir a expressão de um gene. Além disso, dado que a molécula de ssPN não é circular, esta pode ser facilmente sintetizada. Igualmente, dado que a molécula ssPN é em cadeia simples, não é necessária uma etapa de hibridação tal como para a produção de uma cadeia dupla, de modo que pode ser produzida eficazmente. Além disso, dado que a região ligante inclui o(s) resíduo(s) não nucleotídico(s) , tornam-se possíveis alterações não apenas convencionais aos resíduos de nucleótido, por exemplo, mas também são possíveis alterações tais como modificação da região ligante, por exemplo. Tal como anteriormente descrito, dado que a molécula ssPN do presente invento pode inibir a expressão de um gene alvo, é útil como, por exemplo, um fármaco, um agente de diagnóstico, um produto químico para a agricultura e uma ferramenta para investigação em produtos químicos para a agricultura, ciências médicas, ciências da vida e semelhantes.

[Listagem de sequências] TF11004WO.ST25.txt

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> BONAC CORPORATION <120> Molécula de ARN em cadeia simples com esqueleto alicíclico contendo azoto <130> N116853C EP <140> <141> 2011-07-28 <150> JP2010-174915 <151> 2010-08-03 <150> JP2010-230806 <151> 2010-10-13 <150> JP2010-269823 <151> 2010-12-02 <150> JP2011-152381 <151> 2011-07-08 <16 0 > 6 9 <170> Patentln versão 3.1 <210> 1 <211> 25

<212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <4 0 0> 1 ggcuguuguc auacuucuca ugguu 25 <210> 2 <211> 23 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 2 ccaugagaag uaugacaaca gcc 23 <210> 3 <211> 48

<212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 3 ccaugagaag uaugacaaca gccggcuguu gucauacuuc ucaugguu 48 <210> 4 <211> 19 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 4 guugucauac uucucaugg 19 <210> 5 <211> 55

<212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <4 0 0>5 ccaugagaag uaugacaaca gccccacacc ggcuguuguc auacuucuca ugguu 55 <210> 6 <211> 19 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 6 auuguaacga gacaaacac 19 <210> 7 <211> 23

<212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <400> 7 ggagaaggct ggggctcatt tgc 23 <210> 8 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <400> 8 tggccagggg tgctaagcag ttg 23 <210> 9 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <400> 9 gccacggctg cttccagctc etc 23 <210> 10 <211> 25 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <4 0 0> 10 aggtctttgc ggatgtccac gtcac 25 <210> 11 <211> 51

<212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <4 0 0> 11 caugagaagu augacaacag ccggcuguug ucauacuucu caugguucga a 51 <210> 12 <211> 51

<212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <4 0 0> 12 ccaucaacga uaagugaaag ccggcuuuca cuuaucguug auggcuucga a 51 <210> 13 <211> 62

<212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <4 0 0> 13 caugagaagu augacaacag ccccacaccg gcuguuguca uacuucucau gguucuucgg 60 aa 62 <210> 14 <211> 51 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <4 0 0> 14 cagcuguaca uugacuuuag ccggcuaaag ucaauguaca gcugcuucga a 51 <210> 15 <211> 50

<212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <4 0 0> 15 agcuguacau ugacuuuagc cggcuaaagu caauguacag cugcuucgaa 50 <210> 16 <211> 51

<212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <4 0 0> 16 agcagcugua cauugacuuu agccggcuaa agucaaugua cagcugcuuc g 51 <210> 17 <211> 50

<212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <4 0 0> 17 gcagcuguac auugacuuua gccggcuaaa gucaauguac agcugcuucg 50 <210> 18 <211> 21 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <4 0 0> 18 aaagucaaug uacagcugcu u 21 <210> 19 <211> 24

<212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <4 0 0> 19 ccattgctgt cccgtgcaga gctg 24 <210> 20 <211> 25

<212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <400> 20 atggtagccc ttgggctcgt ggatc 25 <210> 21 <211> 24

<212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <400> 21 gtcgtaccac aggcattgtg atgg 24 <210> 22 <211> 22 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <400> 22 gcaatgcctg ggtacatggt gg 22 <210> 23 <211> 51

<212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 23 ugucagugcu cauuuacaag ccggcuugua aaugagcacu gacacuucga a 51 <210> 24 <211> 62

<212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <4Ο0> 24 cagcuguaca migacuuuag ccccacaccg gcuaaaguca auguacagcu gcuucmiegg 60 <210> 25 <211> 62 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 25 ugucagugcu cauuuacaag ccccacaccg gcuuguaaau gagcacugac acuucuucgg 60 aa 62 <210> 26 <211> 21 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> em sentido <400> 26 gcagcuguac auugacuuua g 21 <210> 27 <211> 21

<212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> em anti-sentido <400> 27 aaagucaaug uacagcugcu u 21 <210> 28 <211> 21

<212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> em sentido <400> 28 gugucagugc ucauuuacaa g 21 <210> 29 <211> 21

<212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> em anti-sentido <4Ο0> 29 uguaaaugag cacugacacu u 21 <210> 30 <211> 19

<212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 30 uugcgcuuuu uggugacgc 19 <210> 31 <211> 62

<212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 31 aaccaugaga aguaugacaa cagceceaea ecggcuguug ucauacuucu caugguucuu 60 eg 62 <210> 32 <211> 62 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 32 accaugagaa guaugacaac agccceacac eggcuguugu cauacuucuc augguucuuc 60 gg 62 <210> 33 <211> 62 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 33 ccaugagaag uaugacaaca gccccacacc ggcvuguuguc auacuucuca ugguucuucg 60 ga 62

<210> 34 <211> 62 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 34 caugagaagu augacaacag ccccacaccg gcuguuguca uacuucucau gguucuucgg £0 aa 62 <210> 35 <211> 62 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 35 augagaagua ugacaacagc cccacaccgg cugmigucau acuucucaug guucmiagga 60 ac 62 <210> 36 <211> 62 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 36 ugagaaguau gacaacagcc ccacaccgga uguugucaua cuucucaugg uucuueggaa 60 cc 62 <210> 37 <211> 62 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 37 agaaguauga caacagcccc acaccggcug uugucauacu ucucaugguu cuucggaacc 60 au 62 <210> 38 <211> 62 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 38 aaguaugaca acagccccac accggcuguu gucauacuuc ucaugguucu ucggaaccau 60 ga 62 <210> 39 <211> 62 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 39 guaugacaac agccccacac cggcuguugu cauacuucuc augguucuuc ggaaccauga 60 ga 62 <210> 40 <211> 62 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 40 augacaacag ccccacaccg gcuguuguca uacuucucau gguucuucgg aaccaugaga 60 ag 62 <210> 41 <211> 62 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 41 acaacagacc cacaccggcu guugucauac uuaucauggu ucuucggaac caugagaagu 60 au 62 <210> 42 <211> 62 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 42 aacagcccca caccggcugu ugucauacuu cucaugguuc uucggaacca ugagaaguau 60 ga 62 <210> 43 <211> 62 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 43 cagccccaca ccggcuguug ucauacuucu caugguucuu cggaaccaug agaaguauga £0 ca 62 <210> 44 <211> 62 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 44 agccccacac cggcuguugu cauacuucuc augguucuuc ggaacaauga gaaguaugac 60 38. 62 <210> 45 <211> 62 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 45 gccccacacc ggcuguuguc auacuucuca ugguucuucg gaaccaugag aaguaugaca 60 ac 62 <210> 46 <211> 62 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 46 ccccaeaccg gcuguuguca uacuucucau gguuauucgg aaccaugaga aguaugaaaa 60 ca 62 <210> 47 <211> 62 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 47 cccacaccgg cuguugucau acuucucaug guucuucgga accaugagaa guaugacaac 60 ag 62 <210> 48 <211> 62 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 48 ccacaccggc uguugucaua cuucucaugg uucuucggaa ccaugagaag uaugacaaca 60 gc 62 <210> 49 <211> 62 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 49 cagcuguaca uugacuuuag ccccacaccg gcuaaaguca auguacagcu gcLmcuucgg 60 aa 62 <210> 50 <211> 61 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 50 agcuguacau ugacuuuagc cocacaccgg cuaaagucaa uguacagcug cuucuucgga 6Õ

a 6L <210> 51 <211> 62 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 51 agcagcug\ia cauugacvmu agccccacac cggcuaaagu caauguacag cugcuucuuc 60 gg 62 <210> 52 <211> 61 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <4Ο0> 52 gcagcuguac auugaauuua gccccacacc ggcuaaaguc aauguacagc ugcuucuucg 60 g 61 <210> 53 <211> 62 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 53 uguuugucuc guuacaauau ccocacaccg gauauuguaa cgagaaaaac acuccuucgg 60 ga 62 <210> 54 <211> 62 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 54 aguguuuguc ucguuacaau auccocacac cggauauugu aacgagacaa aeacuceuuc 60 gg 62 <210> 55 <211> 23 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <400> 55 aaagctgcca atgcccctcg acc 23 <210> 56 <211> 22

<212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <400> 56 taggtgggtg gccctcgtct tg 22 <210> 57 <211> 62

<212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 57 cgucaccaaa aagcgcaauu ccccacaccg gaaimgcgcu uuuuggugac gcuucuucgg 60 aa 62 <210> 58 <211> 62 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 58 agcgucacca aaaagcgeaa uuccccacac cggaauugcg cuuuuuggug acgcuucuuc 60 gg 62 <210> 59 <211> 24 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <400> 59 ctggacatca agctggccct ggac 24 <210> 60 <211> 24

<212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> iniciador <400> 60 caccagcttg cgcatggcca cttc 24 <210> 61 <211> 64

<212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 61 aaccaugaga aguaugacaa cagccccaca ccggcuguug ucauacuucu caugguucgu 60 ucge 64 <210> 62 <211> 62 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 62 accaugagaa guaugacaac agccccacac cggcuguugu cauacuucuc augguucuuc 60 gg 62 <210> 63 <211> 60 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 63 accaugagaa guaugacaac agcccacacc gcuguuguca uacuucucau gguucuucgg 60 <210> 64 <211> 58

<212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 64 ccaugagaag uaugacaaca gcccacaccg cuguugucau acuucucaug guuuucga 58 <210> 65 <211> 58

<212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 65 accaugagaa guaugacaac agccacaccc uguugucaua cuucucaugg uucuucgg 58 <210> 66 <211> 56 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <4Ο0> 6 6 ccaugagaag uaugacaaca gccacacccu guugucauac uucucauggu uuucga 56 <210> 67 <211> 54 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 67 caugagaagu augacaacag ccacacccug uugucauacu ucucaugguu ucga 54 <210> 68 <211> 54 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 68 ccaugagaag uaugacaaca ccacaccugu ugucauacuu cucaugguuu ucga 54 <210> 69 <211> 52 <212> ARN <213> Artificial <22 0> <223> molécula de ácido nucleico <400> 9 caugagaagu augacaacac cacaccuguu gucauacuuc ucaugguuuc ga 52

Lisboa, 2015-02-20

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Molécula de ARN em cadeia simples compreendendo uma sequência de inibição de expressão que inibe a expressão de um gene alvo, em que: a molécula compreende: uma região (Xc) , uma região ligante (Lx) e uma região (X); a região (X) compreende a sequência de inibição de expressão; - a região (Xc) é complementar à região (X); e - a região ligante (Lx) é representada pela fórmula seguinte (I):

em que: X1 e X2 são cada um independentemente H2, 0, S ou NH; Y1 e Y2 são cada um independentemente uma ligação simples, CH2, NH, 0 ou S; R3 é um átomo de hidrogénio ou substituinte que está ligado a C-3, C-4, C-5 ou C-6 num anel A; L1 é uma cadeia de alquileno composta por n átomos e um átomo de hidrogénio num átomo de carbono de alquileno pode ser ou não substituído por OH, 0Ra, NH2, NHRa, NRaRb, SH ou SRa, ou L1 é uma cadeia poliéter obtida por substituição de pelo menos um átomo de carbono na cadeia de alquileno por um átomo de oxigénio, desde que: quando Y1 é NH, 0 ou S, um átomo ligado a Y1 em L1 é carbono, um átomo ligado a OR1 em L1 é carbono e os átomos de oxigénio não são adjacentes entre si; L2 é uma cadeia de alquileno composta por m átomos e um átomo de hidrogénio num átomo de carbono de alquileno pode ser ou não substituído por OH, 0RC, NH2, NHRC, NRcRd, SH ou SRC, ou L2 é uma cadeia poliéter obtida por substituição de pelo menos um átomo de carbono numa cadeia de alquileno por um átomo de oxigénio, desde que: quando Y2 é NH, 0 ou S, um átomo ligado a Y2 em L2 é carbono, um átomo ligado a OR2 em L2 é carbono e os átomos de oxigénio não são adjacentes entre si; Ra, Rb, Rc e Rd são cada um independentemente um substituinte ou um grupo protector; 1 é 1 ou 2; m é um número inteiro na gama entre 0 e 30; n é um número inteiro na gama entre 0 e 30; as regiões (Xc) e (X) estão cada uma ligadas à região ligante (Lx) através de -OR1- ou -OR2-; e R1 e R2 podem estar ou não presentes e quando estão presentes, R1 e R2 são cada um independentemente um resíduo de nucleótido ou a estrutura da fórmula (I).
2. Molécula em cadeia simples de acordo com a reivindicação 1, em que L1 é a cadeia de poliéter e a cadeia de poliéter é polietilenoglicol.
3. Molécula em cadeia simples de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o total (m + n) do número de átomos (n) em L1 e o número de átomos (m) em L2 está na gama entre 0 e 30.
4. Molécula em cadeia simples de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a estrutura de fórmula (I) é qualquer uma das seguintes fórmulas (I — 1) a (1-9) em que n é um número inteiro entre 0 e 30, m é um número inteiro entre 0 e 30 e q é um número inteiro entre 0 e 10:
5. Molécula em cadeia simples de acordo com a reivindicação 4, em que: na fórmula (I — 1), n = 8; na fórmula (1-2), n = 3; na fórmula (1-3), n = 4 ou 8; na fórmula (1-4), n = 7 ou 8; na fórmula (1-5), n = 3 e m = 4; na fórmula (1-6), n = 8 e m = 4; na fórmula (1-7), n = 8 e m = 4; na fórmula (1-8), n=5em=4; e na fórmula (1-9), q = 1 e m = 4.
6. Molécula em cadeia simples de acordo com a reivindicação 4, em que a fórmula (1-4) é a fórmula seguinte (I-4a) e a fórmula (1-8) é a fórmula seguinte (I-8a):
7. Molécula em cadeia simples de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o número de bases (X) na região (X) e o número de bases (Xc) na região (Xc) satisfazem uma condição da expressão (3) ou (5): X > Xc ...(3) X = Xc ... (5)
8. Molécula em cadeia simples de acordo com a reivindicação 7, em que o número de bases (X) na região (X) e o número de bases (Xc) na região (Xc) satisfaz uma condição da expressão (11): X - Xc = 1, 2 ou 3 ...(11)
9. Molécula em cadeia simples de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o número de bases (X) na região (X) é 19 a 30.
10. Molécula em cadeia simples de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que - o número de bases total na molécula é 38 ou mais; e/ou - a molécula em cadeia simples compreende pelo menos um resíduo modificado e/ou uma substância de marcação e/ou um isótopo estável.
11. Composição para inibir a expressão de um gene alvo, compreendendo a composição a molécula em cadeia simples de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores.
12. Composição farmacêutica compreendendo a molécula em cadeia simples de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10.
13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12, para uso no tratamento de inflamação.
14. Método in vitro para inibir expressão de um gene alvo, compreendendo o método o uso da molécula em cadeia simples de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que opcionalmente - o método compreende administrar a molécula em cadeia simples a uma célula, um tecido ou um órgão in vitro; ou expressão do gene alvo é inibida por indução de interferência por ARN.
15. Molécula em cadeia simples de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10 para uso num método de tratamento de uma doença, em que a molécula compreende, como sequência de inibição de expressão, uma sequência que inibe expressão de um gene que causa a doença. Lisboa, 2015-02-20