CN114540480A - miR-501-3p作为精神分裂症诊断标志物的应用 - Google Patents

miR-501-3p作为精神分裂症诊断标志物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了miR‑501‑3p作为精神分裂症诊断标志物的应用，本发明首次发现了miR‑501‑3p在精神分裂症患者外周血中表达下降，通过检测外周血miR‑501‑3p的表达水平可以作为精神分裂症前期诊断的分子标志物，其ROC曲线下面积为0.9172，灵敏度为83.09％，特异度为86.84％，具有较高的诊断价值。通过检测外周血miR‑501‑3p的表达量，可作为检测或治疗指标应用于临床，为精神分裂症的机理研究以及临床应用提供理论基础。

Description

miR-501-3p作为精神分裂症诊断标志物的应用
技术领域
本发明属于医学免疫学诊断技术领域，具体涉及miR-501-3p作为精神分裂症诊断标志物的应用。
背景技术
精神分裂症(schizophrenia，SCZ)是最为严重的精神障碍之一，以幻觉、妄想、精神运动性兴奋等阳性症状和(或)以情感迟钝、情感淡漠、社交退缩、意志减退等阴性症状为主要临床特征。
精神分裂症是遗传与环境相互作用所致的复杂性遗传病，表观遗传修饰作为介导遗传与环境因素相互作用的重要机制，主要包括非编码RNA、DNA甲基化修饰等。表观遗传学说的提出，完善了经典遗传学无法解释诸如同卵双生子遗传背景一致但共病率只有50％左右的现象，同时研究介导遗传和环境因素相互作用的表观遗传修饰在精神分裂症发生发展过程中的作用机制，发现潜在的病因和干预靶点，建立监测疾病发生发展的生物标记物将有组于实现精神分裂症的早期诊断和干预。已有研究表明，精神分裂症病人若能早期诊断并及时得到有效治疗可以显著改善患者的预后，并大大减少医疗开支，降低致残率。因此有必要研发一种具有敏感性和特异性的生物标志物来提高精神分裂症诊断的可靠性，以便于有针对性进行药物干预及开展临床科学研究。
MicroRNA(miRNA)作为重要的表观遗传修饰之一，是一类长约22nt的单链非编码RNA。多项研究报道精神分裂症患者大脑皮层或外周循环系统中存在众多表达失调miRNAs，并通过介导神经系统发育和递质传递、免疫防御、代谢等通路的功能紊乱诱发疾病的易感性。通过高通量测序或芯片等技术手段已发现了精神分裂症外周血循环系统和中枢脑组织中存在众多miRNA失调现象，其中miR-137、miR-34a、miR-30e、miR-7、miR-181b、miR-132、miR-212、miR-432和miR-107等已被多项研究发现失调表达与精神分裂症显著相关。通过对miRNA靶基因的预测及其功能通路富集分析发现，miRNA多参与神经系统发育和功能相关的递质传递、轴突导向、长时程增强等通路。外周血等循环系统中发现的失调miRNA为研发用于精神分裂症早期诊断和预测的生物标记提供了科学依据。
血液是临床诊断中常用的生物检材，血液具有取材简单，处理方便等优点。近年来血液学miRNA相关的研究已取得一定的成果，因此基于miRNA的定量检测技术寻找精神分裂症特异性的血液miRNA作为生物指标用于精神分裂症的早期筛查、诊断和预后疗效评价具有重要的科研和临床应用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供miR-501-3p作为精神分裂症诊断标志物的应用。
本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一方面，提供检测miR-501-3p的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下a1)至a3)中的至少一种：
a1)诊断精神分裂症；a2)诊断待测者是否为精神分裂症；a3)防控精神分裂症。
在本发明的一些实施方式中，所述检测miR-501-3p的物质为通过反转录PCR、实时定量PCR、原位杂交、芯片技术检测所述miR-501-3p表达水平的试剂或仪器。
在本发明的一些实施方式中，所述检测miR-501-3p的物质为miR-501-3p的特异性引物。
在本发明的一些实施方式中，所述miR-501-3p的特异性引物的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
本发明的第二方面，提供一种用于检测miR-501-3p的引物，所述检测miR-501-3p的引物的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
本发明的第三方面，提供一种产品，包括本发明第一方面所述检测miR-501-3p的物质或本发明第二方面所述的引物；所述产品的功能为如下a1)至a3)中的至少一种：
a1)诊断精神分裂症；a2)诊断待测者是否为精神分裂症；a3)防控精神分裂症。
在本发明的一些实施方式中，所述产品为试剂盒、芯片、试纸或高通量测序平台。
在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包含miR-501-3p的逆转录引物；所述miR-501-3p的逆转录引物优选如SEQ ID NO:2所示。
在本发明的一些实施方式中，还包含内参基因的逆转录引物和内参基因的特异性引物；优选地，所述内参基因为U6 miRNA。
在本发明的一些实施方式中，所述内参基因的逆转录引物的序列如SEQ ID NO:5所示；所述内参基因的特异性引物序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。
本发明的第四方面，提供一种数据处理装置，所述装置包括：
所述数据输入模块：用于输入miR-501-3p的表达量数值；
所述数据记录模块：用于存储miR-501-3p的表达量数值；
所述数据比较模块：数据比较模块用于将待测者外周血中miR-501-3p表达量和对照外周血中miR-501-3p的表达量进行比；
所述结论输出模块即如果待测者外周血中miR-501-3p的表达量低于对照外周血中miR-501-3p的表达量，则结论输出模块显示待测者为精神分裂症；如果待测者外周血中miR-501-3p的表达量等于或高于对照外周血中miR-501-3p的表达量，则结论输出模块显示待测者为非精神分裂症。
在本发明的一些实施方式中，所述对照外周血为健康人的外周血。
本发明的第五方面，提供本发明第一方面所述检测miR-501-3p的物质、本发明第二方面所述引物、本发明第三方面所述试剂盒和/或本发明第四方面所述的装置在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下a1)至a3)中的至少一种：
a1)诊断精神分裂症；a2)诊断待测者是否为精神分裂症；a3)防控精神分裂症。
本发明的第五方面，提供miR-501-3p作为标志物在b1)～b3)任一项中的应用：
b1)开发诊断精神分裂症的试剂；
b2)构建精神分裂症模型；
b3)筛选预防和/或治疗精神分裂症的药物。
本发明的第六方面，提供一种精神分裂症模型的构建方法通过降低或抑制miR-501-3p的表达量。
在本发明的一些实施方式中，所述降低或抑制miR-501-3p的表达量为特异性敲除miR-501-3p。
在本发明的一些实施方式中，所述精神分裂症模型优选为动物模型。
在本发明的一些实施方式中，所述动物为小鼠。
本发明的第七方面，提供本发明第五方面所述构建方法得到的动物模型在研究精神分裂症发生发展的分子机制，或制备和/或筛选治疗精神分裂症药物中的应用。
本发明的第八方面，提供一种筛选预防和/或治疗精神分裂症的药物的方法，通过检测给药前后miR-501-3p的表达量来判断药物的有效性。
本发明的有益效果是：
本发明首次发现了miR-501-3p在精神分裂症患者外周血中表达下降，通过检测外周血miR-501-3p的表达水平可以作为精神分裂症前期诊断的分子标志物，其ROC曲线下面积为0.9172，灵敏度为83.09％，特异度为86.84％，具有较高的诊断价值。通过检测外周血miR-501-3p的表达量，可作为检测或治疗指标应用于临床，为精神分裂症的机理研究以及临床应用提供理论基础。
本发明还通过在小鼠体细胞中特异性敲除miR-501-3p构建成功小鼠精神分裂症模型，可用于后续的精神分裂症发生发展的分子机制，或制备和/或筛选治疗精神分裂症药物中。
附图说明
图1为miR-501-3p GO富集通路。
图2为在精神分裂症散发样本和正常人样本中利用实时荧光定量PCR检测miR-501-3p的表达情况。
图3为ROC曲线。
图4为利用CRISPR/Cas9技术在动物水平验证miR-501-3p的致病机制。图4a为Mir501 KO小鼠构建示意图；图4b为人源与鼠源Mir501同源性；图4c为Mir501 KO小鼠交配流程图；图4d为Mir501 KO小鼠基因型鉴定；图4e为Mir501表达量测量；图4f为原位杂交荧光鉴定miR-501-3p敲除效率；图4g三箱社交实验社交新颖性阶段箱体中时间统计；图4h为三箱社交实验社交新颖性阶段社交识别系数统计；图4i为三箱社交实验社交识别阶段箱体中时间统计；图4j为三箱社交实验社交识别阶段社交识别系数统计；图4k为新事物识别实验；图4l为前脉冲冲动抑制抑制效率。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1 Small-RNA Seq和生物信息学方法发现单患精神分裂症同卵双生子差异表达miRNAs
临床病例入组：入组个体年龄介于18-60岁之间；性别不限；患者本人及其生物学父母均为中国汉族；患者符合《精神障碍诊断与统计手册第4版》修订版(DSM-IV-TR)的诊断标准；由两名中级以上精神科医生采用结构式访谈MINI诊断为精神分裂症。
采用国际标准化诊断和评估工具结构化临床访谈表(SCID-I/P)和阳性和阴性症状量表(Positive and Negative Syndrome Scale,PANSS)进行诊断和症状严重程度评估，要求PANSS基线分≥60分；生命体征(体温、呼吸、血压、脉搏)和常规检查(血常规、肝、肾功能)处在正常范围内。排除标准：排除DSM-IV轴I诊断精神分裂症之外的其它精神障碍，排除患有重大躯体疾病(如严重心、肝、肾疾病等)、糖尿病、高血压、肿瘤、免疫系统和内分泌系统疾病，妊娠期及哺乳期妇女；患者或法定监护人签署知情同意书。同时采用高危人群评估量表SIPS对双生子中的健康个体进行筛查且每半年随访一次。
同卵双生子鉴定：采用酚氯仿法从血样中提取DNA，经DNA浓度测定及凝胶电泳后，符合标准的DNA-20℃保存。利用Sinofiler 16位点STR荧光检测试剂盒(美国ABI公司)，根据说明书进行PCR扩增，将PCR扩增产物与DNA分子量标准550及去离子甲酰胺混匀，95℃变性3min，立即冷却到4℃，在Applied Biosystems 3130遗传分析仪上进行毛细管电泳，用基因扫描软件检测扩增片段的荧光标记，以DNA分子量标准550为内标，根据扩增的STR片段大小确定STR基因座，以Ladder为标准，用Genemapper ID v3.1基因分析软件确定16个常染色体STR基因座的等位基因型。
质控和转录组检测：采用EDTA抗凝剂采血管和PAXgene血液RNA采集管进行外周血采集，用PAXgene Blood mRNA Kit提取总RNA；RNA样本需经琼脂糖凝胶电泳检测无明显降解和污染，OD260/280值大于1.8，Bioanalyzer 2100检测无明显降解且RIN大于8.0和Qubit定量后进行转录组检测(sRNA-seq:Illumina HiSeqTM2500/SE50/12million reads；RNA-seq:Illumina2000/PE125/100million reads。由商业化生物技术公司完成)。
DE-miRNA分析：用bowtie2将sRNA-seq下机质控后的reads比对到人类参考基因组(hg19)上；用miRDeep2统计miRBase(version 21)上人类miRNAs的表达量(reads counts)，并用TPM做归一化处理；采用edgeR并以家系为协变量的配对检验对发现队列的SDC twins进行病例-对照差异miRNA的筛选；验证队列1的分析是以家系为协变量将表型一致的twin作为生物学重复进行病例-对照差异miRNA的筛选；以|Log2(fold change)|>0.585且p<0.05作为DE-miRNA筛选标准。
本申请人团队前期通过对同卵双生子对外周血转录组测序(sRNA-seq和RNA-seq)和差异分析发现队列(SDC twins)，再经公共数据库验证差异显著和差异方向一致后，有1个miRNAs保留下来且均为疾病组下调表达(表1)。
表1 miR-501-3p在双生子样本中的差异
Figure BDA0003463484510000051
接下来，申请人利用Pearson相关性分析筛选与这1个miRNAs表达呈负相关的mRNAs(r<-0.7,p<0.05，来自临床twin样本的RNA-seq)并经miRWalk2.0软件(8个参数中有3个参数预测为靶基因)预测为miRNA调控靶基因的进行功能富集分析。结果显示其中miR-501-3p调控靶基因网络显著富集于神经元生成，神经发生，调控细胞代谢过程、细胞分化和自噬等功能通路(图1)。
实施例2精神分裂症散发样本(n>100例)中利用实时荧光定量PCR检测miR-501-3p的表达情况
本例纳入76例健康正常志愿者和136例精神分裂症患者，全血经红细胞裂解液裂解两遍后，收集白细胞，按1ml全血加入1ml TRIzol，按说明书提取总RNA，测浓度后电泳，上样量总RNA 100ng左右，用新配制的TBE电泳及液琼脂糖胶电泳：1％琼脂糖胶，电压140V，电泳15分钟，检测其完整性。
TRizol提取的完整的RNA琼脂糖电泳会有三条带，从大到小分别代表28S、18S和5S(此条带包含小RNA)，上面两条最亮，且28S条带的亮度约是18S条带的2倍，下面5S的条带最浅，如果上面两条28S、18S的条带没有或者有拖尾现象，说明RNA可能发生了降解；本实验目的包括miRNA，故要求样本RNA电泳三条带清晰、完整。由于成熟的miRNA较短，逆转录引物及qPCR引物的设计与常规引物有很大的区别。一般要针对每个miRNA设计3条引物，一条特异的反转录引物，第二条是miRNA特异的上游引物--通常由miRNA序列除去3’端6个碱基的剩余部分，同时在5’端添加GC使Tm值接近60℃，反向引物都在茎环结构上，是通用的。每个miRNA特异的逆转录引物有两部分组成，一段是可以形成茎环结构的通用序列(如SEQ INNO:1所示)和可与目标miRNA3’端反向互补的6个碱基。茎环引物不仅可以有效延长miRNA的长度，减少非特异扩增的几率。hsa-miR-501-3p逆转录引物如SEQ ID NO:2所示；hsa-miR-501-3p正向引物如SEQ ID NO:3所示；反向引物如SEQ ID NO:4所示；U6逆转录引物如SEQID NO:5所示；U6正向引物如SEQ ID NO:6所示；U6反向引物如SEQ ID NO:7所示；
SEQ ID NO:1：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-3’；
SEQ ID NO:2：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGAATC-3’；
SEQ ID NO:3：5’-GCGGCGGAATGCACCCGGGCAAG-3’；
SEQ ID NO:4：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’；
SEQ ID NO:5：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；
SEQ ID NO:6：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；
SEQ ID NO:7：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。
①miRNA逆转录反应：
a.取逆转录引物(20μM)，加入适量RNase-free H2O，配置成逆转录引物(5μM)；
b.以10μl反应体系进行逆转录反应，体系如表2；RT反应结束后请立即将cDNA产物取出，快速置于冰上冷却；内参引物(U6)的使用与miRNA的检测方法一致。
②miRNA qPCR反应，颈环法反向引物为通用引物，与颈环引物的颈环序列相匹配，与miRNA无关。U6内参需选用其特异的U6逆转录引物，体系如表3。
表2 miRNA的逆转录反应体系
试剂 10μl体系 终浓度
RNA模板(1μg) Xμl
逆转录引物(5μM) 1μl 500nM
逆转录缓冲液 2μl 1×
逆转录酶 2μl
去RNA酶水 至10μl
以上体系混匀后，瞬时离心，RT反应程序为：42℃60min，85℃5sec。
表3 miRNA的qPCR反应
试剂 20μl体系 终浓度
逆转录产物 2μl
SYBR Green Mix 10μl
正向引物(5μM) 0.8μl 200nM
反向引物(5μM) 0.8μl 200nM
去RNA酶水 至20μl
使用ABI 7500Real-Time PCR System，使用2步法反应程序：预变性95℃3min，95℃20sec，60℃30sec，共45个循环。溶解曲线分析：70-95℃，升温速度为0.5℃/次，恒温时间5sec/次。
结果如表4所示，精神分裂症患者组2-ΔCTΔCT(36.10±22.95)，而正常人检测结果2-ΔCTΔCT(100±56.58(图2))。
表4精神分裂症和正常人中的miR-501-3p表达量
诊断 正常人 精神分裂症
年龄(年龄，均值±标准差) 41.2±7.1 47.9±9.1
性别(男/女) 39/37 89/47
表达(均值±标准差) 100±56.58 36.10±22.95
如图3所示，根据临床受试者曲线(ROC)分析，miR-501-3p的曲线下面积为0.9172，说明miR-501-3p具有较高的诊断价值。进一步通过ROC曲线分析灵敏度为83.09％，特异性为86.84％，cut-off值为51.02，可以理解为在临床检验中外周血miR-501-3p有较大把握诊断该样本罹患精神分裂症，可以诊断或辅助诊断精神分裂症，显示了潜在的诊断价值。
实施例3 Mir501 KO小鼠展现精神分裂症样行为
利用同源重组原理，采用受精卵同源重组的方式，对Mir基因进行flox修饰(插入倒置Mir基因片段)形成体细胞KO小鼠(Mirfx/fx)。简要过程如下：通过体外转录的方式，获得Cas9 mRNA和gRNA；通过In-Fusion cloning的方法构建同源重组载体(donor vector)，该载体包含3.0kb 5’同源臂、0.7kb的flox区域和3.0kb 3’同源臂。将Cas9 mRNA、gRNA和donor vector显微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠。经长片段PCR鉴定，获得正确同源重组的F0代小鼠；F0代小鼠与C57BL/6J小鼠交配获得阳性F1代小鼠(图4a-图4d)。经qRT-PCR和原位杂交免疫荧光显示，Mir501 KO小鼠在脑组织中miR-501-3p表达缺失(图4e和图4f)
小鼠行为学评估：评估小鼠体重、身长以及HE染色(肾脏、脑、心脏、脾、肝)等基本指标有无异常。行为学检测包括三箱社交实验、新事物识别实验、以及前脉冲冲动抑制实验等，评估小鼠是否存在记忆、社交以及感觉门控等功能存在异常。行为学实验结果显示，Mir501 KO小鼠出现社交障碍，相较于野生型小鼠Mir501 KO小鼠在社交识别阶段出现明显的社交趋避现象(图4i和图4j)，在社交新颖阶段Mir501 KO小鼠出现明显的社交障碍(图4g和图4h)；在新事物识别实验中，Mir501 KO小鼠出现明显的短期记忆和学习功能障碍，Mir501KO小鼠在测试阶段无法识别新旧事物(图4k)；在前脉冲抑制实验中，Mir501 KO小鼠前脉冲抑制效率明显低于野生型小鼠，表明Mir501 KO小鼠听觉门控通路异常(图4l)。上述结果表明Mir501 KO小鼠出现社交障碍、学习、记忆功能受损，感觉门控失调等精神分裂症样表型异常行为(图4)。
上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 南方医科大学
<120> miR-501-3p作为精神分裂症诊断标志物的应用
<130>
<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgac 44
<210> 2
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgacagaatc 50
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gcggcggaat gcacccgggc aag 23
<210> 4
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gtgcagggtc cgaggt 16
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aacgcttcac gaatttgcgt 20
<210> 6
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aacgcttcac gaatttgcgt 20

Claims (10)

1.检测miR-501-3p的物质在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下a1)至a3)中的至少一种：
a1)诊断精神分裂症；a2)诊断待测者是否为精神分裂症；a3)防控精神分裂症。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测miR-501-3p的物质为miR-501-3p的特异性引物；优选地，所述miR-501-3p的特异性引物的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
3.一种用于检测miR-501-3p的引物，其特征在于，所述引物的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
4.一种产品，包括权利要求1～2任一项所述检测miR-501-3p的物质或权利要求3所述的引物；所述产品的功能为如下a1)至a3)中的至少一种：
a1)诊断精神分裂症；a2)诊断待测者是否为精神分裂症；a3)防控精神分裂症；
优选地，所述产品为试剂盒、芯片、试纸或高通量测序平台。
5.一种数据处理装置，其特征在于，所述装置包括：
数据输入模块：用于输入miR-501-3p的表达量数值；
数据记录模块：用于存储miR-501-3p的表达量数值；
数据比较模块：数据比较模块用于将待测者外周血中miR-501-3p表达量和对照外周血中miR-501-3p的表达量进行比；
结论输出模块即如果待测者外周血中miR-501-3p的表达量低于对照外周血中miR-501-3p的表达量，则结论输出模块显示待测者为精神分裂症；如果待测者外周血中miR-501-3p的表达量等于或高于对照外周血中miR-501-3p的表达量，则结论输出模块显示待测者为非精神分裂症；优选地，所述对照外周血为健康人的外周血。
6.权利要求1～2任一项所述检测miR-501-3p的物质、权利要求3所述的引物、权利要求4所述的产品和/或权利要求5所述的装置在制备产品中的应用；所述产品的功能为如下a1)至a3)中的至少一种：
a1)诊断精神分裂症；a2)诊断待测者是否为精神分裂症；a3)防控精神分裂症。
7.miR-501-3p作为标志物在b1)～b3)任一项中的应用：
b1)开发诊断精神分裂症的试剂；
b2)构建精神分裂症模型；
b3)筛选预防和/或治疗精神分裂症的药物。
8.一种精神分裂症模型的构建方法，其特征在于，通过降低或抑制miR-501-3p的表达量；优选地，所述降低或抑制miR-501-3p的表达量为特异性敲除miR-501-3p。
9.权利要求8所述构建方法得到的动物模型在研究精神分裂症发生发展的分子机制，或制备和/或筛选治疗精神分裂症药物中的应用。
10.一种筛选预防和/或治疗精神分裂症的药物的方法，其特征在于，通过检测给药前后miR-501-3p的表达量。
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