CN112831564B - 一种与原发性肺癌辅助诊断相关的遗传变异区域的基因组合及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，公开了一种与原发性肺癌辅助诊断相关的遗传变异区域的基因组合，该基因组合为chr13:32887644‑32893462，chr13:32899213‑32907524，chr13:32910402‑32921033，chr13:32928998‑32937670，chr13:32944539‑32954282和chr13:32968826‑32973805。检测该基因组合区域内的遗传变异情况能够用于原发性肺癌的辅助诊断，具有临床推广价值。
Description
发明领域
本发明属于基因工程及肿瘤医学领域，涉及BRCA2基因的罕见功能性变异遗传标志物的发现及其在原发性肺癌筛查和辅助诊断中的应用。
背景技术
恶性肿瘤是世界范围内的一个重大公共健康问题，已经成为全球第二大死因。肺癌是受累人数最多的恶性肿瘤。据世界卫生组织国际癌症研究中心统计，2018年全球肺癌新发病例达209万，占全部恶性肿瘤病例的11.6％。同时，肺癌也是恶性肿瘤死亡的主要原因，2018年全球肺癌死亡病例176万，占癌症死亡总数的18.4％。我国是全球肺癌发病和死亡人数最多的国家。2018年全国新增肺癌病例77万，发病人数分别位居我国男性恶性肿瘤的第一位和女性恶性肿瘤的第二位；死亡病例69万，位居我国男性和女性恶性肿瘤的第一位。
既往研究报道，肺癌的发生受到遗传和环境因素(主要是烟草暴露)的共同作用。同等环境因素暴露下，具有不同遗传背景的个体对肺癌的易感性不同。胚系遗传变异是导致个体对肺癌发病易感性差异的重要遗传基础。全基因组关联研究(GWAS)作为一项高效的分子流行病学研究策略，已经广泛应用于复杂疾病或性状的遗传学研究中。利用疾病易感的遗传变异谱辅助诊断疾病的发生，可以实现对疾病的前瞻性“基因诊断”。近年来，在肿瘤和心脑血管疾病等常见重大疾病中，遗传变异谱辅助诊断的应用价值已初见端倪。但是，目前GWAS鉴定的常见遗传变异(最小等位基因频率≥0.5％)只能解释一小部分疾病易感性。近期测序研究发现，罕见遗传变异(最小等位基因频率＜0.5％)的数目远超过常见遗传变异，可能是疾病易感性的重要来源。
BRCA2基因位于人类染色体的13q13.1区域(NC_000013.10)，主要参与维持基因组的稳定性，尤其是双链DNA修复的同源重组过程，在维持细胞遗传信息的稳定性方面扮演着重要的角色。BRCA2基因通常作为肿瘤抑制因子发挥功能，然而该基因上的突变会破坏其参与DNA损伤修复的能力，造成DNA损伤的积累，从而触发细胞的过度生长和分裂，最终导致肿瘤的形成。既往研究发现，BRCA2基因胚系变异的携带者发生乳腺癌和卵巢癌的终身风险均显著提高。此外，在前列腺癌和皮肤癌中也有关于BRCA2基因突变增加肿瘤发病风险的报道。上述研究发现并推动了对健康个体进行BRCA2基因检测以评估乳腺癌/卵巢癌的发病风险。然而，BRCA2突变与肺癌发病的关联尚不清晰。此外，既往研究仅关注BRCA2基因编码区变异，对BRCA2基因非编码调控区的功能性变异鲜有研究。
因此，发现位于BRCA2基因特定区域的罕见功能性变异作为原发性肺癌的生物标志物，并研制相应的诊断试剂盒，对我国原发性肺癌的筛查和早期诊断必将是一次有力的推动，也可为其药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟新的途径。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种与原发性肺癌辅助诊断相关的胚系罕见功能性遗传变异基因及其应用。
本发明的第二个目的是提供上述遗传变异基因的特异性引物。
本发明的第三个目的是提供上述遗传变异基因组合及其特异性引物在制备肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明第四个目的是提供肺癌辅助诊断试剂盒。
发明人通过分离和研究肺癌患者及与其年龄性别匹配的健康对照外周血DNA中的罕见变异，寻找与肺癌发生相关的高特异性易感区域，并识别其中的罕见功能性变异，进而研制出可应用于临床或人群的肺癌辅助诊断试剂盒，为肺癌早期筛查和诊断提供支持，为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物提供数据支持。
本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
一种与原发性肺癌辅助诊断相关的遗传变异区域的基因组合，该区域组合为chr13:32887644-32893462，chr13:32899213-32907524，chr13:32910402-32921033，chr13:32928998-32937670，chr13:32944539-32954282和chr13:32968826-32973805。
用于检测所述的遗传变异区域的特异性延伸引物对，这些引物对为：
chr13:32887644-32893462的序列引物对为SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：2、
chr13:32899213-32907524的序列引物对为SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：4、
chr13:32910402-32921033的序列引物对为SEQ ID NO：5与SEQ ID NO：6、
chr13:32928998-32937670的序列引物对为SEQ ID NO：7与SEQ ID NO：8、
chr13:32944539-32954282的序列引物对为SEQ ID NO：9与SEQ ID NO：10和
chr13:32968826-32973805的序列引物对为SEQ ID NO：11与SEQ ID NO：12。
所述的遗传变异区域在制备肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
所述的遗传变异区域的引物在制备肺癌辅助诊断试剂盒中的应用。
一种肺癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒用于检测外周血DNA中BRCA2基因的特定区域：chr13:32887644-32893462，chr13:32899213-32907524，chr13:32910402-32921033，chr13:32928998-32937670，chr13:32944539-32954282和chr13:32968826-32973805。
所述的诊断试剂盒，含有的检测遗传变异区域的特异性引物对为：
chr13:32887644-32893462的序列引物对为SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：2、
chr13:32899213-32907524的序列引物对为SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：4、
chr13:32910402-32921033的序列引物对为SEQ ID NO：5与SEQ ID NO：6、
chr13:32928998-32937670的序列引物对为SEQ ID NO：7与SEQ ID NO：8、
chr13:32944539-32954282的序列引物对为SEQ ID NO：9与SEQ ID NO：10和
chr13:32968826-32973805的序列引物对为SEQ ID NO：11与SEQ ID NO：12。
我们首先在2984例无肿瘤家族史的原发性肺癌患者中发现BRCA2基因的特定区域存在罕见功能性变异，其中58例原发性肺癌患者携带符合条件的变异，包括：13:32889307T>A变异、13:32889360-32889363delAAGG变异、13:32889380:T>C变异、13:32889434:C>A变异、13:32889474:C>T变异、13:32889492:A>G变异、13:32889503:G>C变异、13:32889520:C>A变异、13:32889529:A>T变异、13:32889540:G>A变异、13:32889557:C>T变异、13:32889571:G>T变异、13:32889587:G>A变异、13:32889656:C>A变异、13:32889656:C>T变异、13:32889663-32889664:insCACTGCTGCGC变异、13:32889665-32889666:insCTGCTGCGCCT变异、13:32889676:T>A变异、13:32889734:G>C变异、13:32900727:delC变异、13:32906603:delA变异、13:32911298-32911301:delAAAC变异、13:32911601:C>T变异、13:32912308-32912309:insT变异、13:32912810:delA变异、13:32912810-32912811:delAA变异、13:32913004-32913014:delGACCTTCCAGG变异、13:32913419:delG变异、13:32913453-13:32913454:insT变异、13:32913558-32913559:insA变异、13:32913620-32913623:delTATG变异、13:32913677:delA变异、13:32914085-32914086:delAT变异、13:32914278:delT变异、13:32914936-32914937:delTA变异、13:32914974-32914977:delACAA变异、13:32954050:G>A变异、13:32968825:G>T变异、13:32972297:A>G变异和13:32972800:C>T变异。另外，在3020例无肿瘤家族史，性别年龄匹配的健康对照中，我们发现仅7例样本携带符合条件的变异，包括13:32889451delC变异、13:32889520:C>A变异、13:32889665-32889666:insCTGCTGCGCCT变异、13:32889676:T>A变异、13:32889684:G>A变异、13:32912959-32912963:delAATAC变异和13:32913033:delA变异。为了进一步研究这些变异的综合指征并用于原发性肺癌的筛检，我们构建了目标区域的突变负荷评分。具体来说，我们对目标区域内满足条件的变异进行基因型评分，野生纯合型＝“0”，杂合型＝“1”，变异纯合型＝“2”，进而计算每个研究对象的突变负荷评分S，计算方法如下：
Gk表示目标区域内满足条件的变异k的基因型评分(单个基因型由仪器检测结果确定，只是计算评分的一个中间过程，不需要知道具体基因型。)。S越大提示研究对象的肺癌发病风险越高，S≥1可作为肺癌发病相关的临界指标。联合分析发现肺癌病例中S≥1的样本比例显著高于健康对照(肺癌病例：19.4/1000人，健康对照：2.3/1000人，P＝1.50×10-5，图1)，据此估计，S≥1的个体一生中罹患肺癌的概率为89.2％。
随后在2243例无肿瘤家族史的肺癌患者中进行扩大样本验证，我们发现了39例样本携带目标区域的罕见功能性变异，验证肺癌人群中S≥1的样本比例为17.4/1000人。
所述诊断试剂盒，该试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如Taq酶、dNTP混合液、Mgcl2溶液、去离子水等；还可以含有标准品和/或对照品。
具体地说，本发明解决问题的技术方案包括(1)筛选出人群中位于BRCA2基因特定区域与肺癌发生相关的易感区域的组合(2)建立统一标准的标本库和数据库：以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料。(3)变异筛选和外部验证：我们首先在2984例无肿瘤家族史的原发性肺癌患者中发现BRCA2基因特定区域存在罕见功能性变异，其中58例原发性肺癌患者携带符合条件的变异，包括：13:32889307T>A变异、13:32889360-32889363delAAGG变异、13:32889380:T>C变异、13:32889434:C>A变异、13:32889474:C>T变异、13:32889492:A>G变异、13:32889503:G>C变异、13:32889520:C>A变异、13:32889529:A>T变异、13:32889540:G>A变异、13:32889557:C>T变异、13:32889571:G>T变异、13:32889587:G>A变异、13:32889656:C>A变异、13:32889656:C>T变异、13:32889663-32889664:insCACTGCTGCGC变异、13:32889665-32889666:insCTGCTGCGCCT变异、13:32889676:T>A变异、13:32889734:G>C变异、13:32900727:delC变异、13:32906603:delA变异、13:32911298-32911301:delAAAC变异、13:32911601:C>T变异、13:32912308-32912309:insT变异、13:32912810:delA变异、13:32912810-32912811:delAA变异、13:32913004-32913014:delGACCTTCCAGG变异、13:32913419:delG变异、13:32913453-13:32913454:insT变异、13:32913558-32913559:insA变异、13:32913620-32913623:delTATG变异、13:32913677:delA变异、13:32914085-32914086:delAT变异、13:32914278:delT变异、13:32914936-32914937:delTA变异、13:32914974-32914977:delACAA变异、13:32954050:G>A变异、13:32968825:G>T变异、13:32972297:A>G变异和13:32972800:C>T变异。另外，在3020例无肿瘤家族史，性别年龄匹配的健康对照中，我们发现仅7例样本携带符合条件的变异,包括13:32889451delC变异、13:32889520:C>A变异、13:32889665-32889666:insCTGCTGCGCCT变异、13:32889676:T>A变异、13:32889684:G>A变异、13:32912959-32912963:delAATAC变异和13:32913033:delA变异。(4)对筛选出的遗传变异，进行功能注释，并计算目标区域内的突变负荷评分。(5)肺癌辅助诊断试剂盒的研制：根据肺癌病例和健康对照中BRCA2基因的突变负荷评分S≥1的样本比例存在显著差异的区域开发辅助诊断试剂盒。
本发明人以标准操作程序(SOP)采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料、临床资料等，并采用了Illumina二代测序技术对全基因组区域进行扫描。
具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：
1.研究样本的选择
(1)经病理学明确诊断的散发型肺癌病例；
(2)与病例年龄性别匹配的健康对照；
本研究共采用5227例符合标准的病例样本和3020例健康对照进行研究。
2.酚-氯仿法提取外周血基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到20-50ng/μlDNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
3.Illumina二代测序技术筛选遗传变异
(1)取受试者DNA样本；
(2)采用二代测序对全基因组进行扫描；
(3)检测以区域为单位比较肺癌病例与健康对照中的变异分布差异。
4.遗传变异采用三代测序平台进行检测
(1)取受试者DNA样本；
(2)采用Primer 3软件在线设计引物；
(3)采用三代测序对BRCA2基因特定区域进行扫描；
(4)检测并比较肺癌病例与健康对照中目标区域的罕见功能性变异分布差异。
5.诊断试剂盒制备方法
采用二代测序以区域为单位对全基因组范围进行检测并确定与原发性肺癌发病相关的易感区域，并鉴定区域内的罕见功能性变异，作为肺癌辅助诊断的指标。最后筛选出的BRCA2特定区域的组合组成辅助诊断试剂盒的检测对象(chr13:32887644-32893462，chr13:32899213-32907524，chr13:32910402-32921033，chr13:32928998-32937670，chr13:32944539-32954282和chr13:32968826-32973805)。诊断试剂可以包括该特定区域组合的特异性引物以及Taq酶、dNTP等试剂。
6.统计分析方法
运用χ2检验(用于分类变量)或者student t检验(用于连续性变量)比较人口学特征等在研究对象组间分布的差异；运用Fisher检验比较突变负荷评分S≥1的样本比例在研究对象组间的差异。
以下是本发明进一步的说明：
我们首先在2984例无肿瘤家族史的原发性肺癌患者中发现BRCA2基因的特定区域存在罕见功能性变异，其中58例患者携带符合条件的变异，突变负荷评分S≥1的样本比例为19.4/1000人。另外，在3020例无肿瘤家族史，性别年龄匹配的健康对照中，我们仅发现7例样本携带符合条件的变异，突变负荷评分S≥1的样本比例仅为2.3/1000人。
随后在2243例无肿瘤家族史的肺癌患者中进行扩大样本验证，我们发现了39例样本携带位于目标区域的罕见功能性变异，突变负荷评分S≥1的样本比例为17.4/1000人。
根据上述实验结果，本发明人发现了一组能用于肺癌辅助诊断的罕见功能性变异区域组合。
具体而言，以上区域的组合有助于肺癌的筛查和辅助诊断，为临床医生快速准确掌握患者的疾病状态和病情严重程度，及时采取更具个性化的防治方案提供支持。
本发明有益效果：
本发明提供的遗传变异区域组合作为肺癌辅助判断的标志物的优越性在于：
(1)遗传变异是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、易于检测，该类生物标志物的成功开发将为肺癌的筛查和诊断开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。
(2)采用严密的验证和评价体系，本发明人初期采用二代测序技术对全基因组遗传变异进行扫描，并以区域为单位比较在原发性肺癌病例与健康对照中的罕见功能性变异分布差异，进而识别了与肺癌发生相关的BRCA2基因的特定区域。随后应用三代测序方法在扩大样本散发型肺癌患者中进行了检测和验证；以上方法和策略的应用加速和保证了遗传变异生物标志物和诊断试剂盒在临床上的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
本发明通过匹配的方式控制年龄对疾病发展的影响，研究遗传变异在肺癌筛查和辅助诊断的应用前景，阐述遗传变异对于肺癌发生的影响，揭示其应用价值。因此，本发明获得了肺癌发病相关遗传变异谱和特异性标志物；通过遗传变异序列的改变进行相关诊断试剂盒的研制和应用，可使得肺癌的筛查和诊断更加方便易行，为更快更好的识别早起肺癌患者提供可行性，为临床治疗效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
附图说明
图1是实施例2肺癌初筛组与健康对照组突变负荷评分S≥1的样本比例对比图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1样品的收集和样品资料的整理
发明人于2010年开始至2018年从南京医科大学肿瘤中心及社区正常人群中收集了大量的肺癌患者及正常人群的血标本，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了符合下列标准的实验样品：
1、病理学明确诊断的无家族史散发型肺癌患者初筛样本2984例；
2、病理学明确诊断的无家族史散发型肺癌患者验证样本2243例；
3、无肿瘤家族史，与病例性别年龄匹配的健康对照3020例；
并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。
实施例2外周血DNA中遗传变异的测序扫描
在上述符合条件的肺癌患者和健康对照中，采用二代测序检测获得相关结果。具体步骤为：
1、向储存于2ml冻存管中的白细胞加入溶血试剂(即裂解液，40份量配置方法如下：蔗糖219.72g、氯化镁2.02g和曲拉通X-100(amresco 0694)20ml混合后，用TrisHcl溶液定容至2000ml，下同)，颠倒混匀后完全转入。
2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。
3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液(每300ml中含有122.5ml 0.2M氯化钠，14.4ml0.5M乙二胺四乙酸，15ml 10％十二烷基硫酸钠，148.1ml双蒸水，下同)和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。
4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24：1，v/v，下同)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。
5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl,再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。
6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml,12000rpm离心10min,弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。
7、测量浓度:通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
8、PCR反应体系20微升，包括：模板50ng；上游引物：1微升和下游引物：1微升；2×MIX 10微升；H2O补足至20微升。
9、PCR反应程序：95℃5min；(95℃30s；60℃40s；72℃45s)×35个循环；72℃10min；4℃保存。
10、采用Illumina Nova 6000平台进行二代测序；
11、使用BWA软件将序列比对到人类参考基因组(GRCh37)上，使用GATK软件进行遗传变异的基因分型。在2984例散发性肺癌患者和3020例健康对照中，发现BRCA2基因的特定区域在病例和对照中突变负荷评分S≥1的样本比例存在显著差异(肺癌病例：19.4/1000人，健康对照：2.3/1000人，P＝1.50×10-5，图1)。
实施例3单个区域的三代测序鉴定
将上述发现与肺癌发病有关的易感区域在2243例病理学明确诊断的无家族史散发型肺癌患者进行检测验证，具体步骤为：
1、向储存于2ml冻存管中的白细胞加入溶血试剂，颠倒混匀后完全转入。
2、去除红细胞：用溶血试剂将5ml离心管补至4ml，颠倒混匀，4000rpm离心10分钟，弃上清。向沉淀中加入4ml溶血试剂，再次颠倒混匀清洗一次，4000rpm离心10分钟，弃上清。
3、抽提DNA：向沉淀中加1ml抽提液和8μl蛋白酶K，震荡器上充分震荡混匀，37℃水浴过夜。
4、去除蛋白质：加1ml饱和酚充分混匀(手轻摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清转入新的5ml离心管中。在上清液中加入等体积氯仿与异戊醇混合液(氯仿：异戊醇＝24：1)，充分混匀后(手摇15分钟)，4000rpm离心10分钟，取上清(分入两个1.5ml的离心管)。
5、DNA沉淀：在上清液中加入3M的醋酸钠60μl,再加入与上清液等体积的冰无水乙醇，上下轻摇，可见白色絮状沉淀物，再以12000rpm离心10min。
6、DNA洗涤：在沉淀中加入冰无水乙醇1ml,12000rpm离心10min,弃上清后真空抽干或置于清洁干燥环境中蒸干。
7、测量浓度:通常能得到20-50ng/μl DNA，纯度(紫外260OD与280OD比值)在1.6-2.0。
8、采用三代测序平台对于目标区域进行测序。对与肺癌发病相关的BRCA2特定区域设计特异性引物。
9、PCR反应体系20微升，包括：模板50ng；上游引物：1微升和下游引物：1微升；2×MIX 10微升；H2O补足至20微升。
10、PCR反应程序：95℃5min；(95℃30s；60℃40s；72℃45s)×35个循环；72℃10min；4℃保存。
11、采用PacBio平台进行三代测序。
12、使用Pbmm2软件将测序所得的序列比对到人类参考基因组(GRCh37)上，使用Lofreq软件进行目标区域的变异检测。在2243例散发性肺癌患者中，发现验证患者中在BRCA2基因的目标区域存在罕见功能性变异的富集，突变负荷评分S≥1的样本比例为17.4/1000人。
因此，本发明人证明了采用BRCA2基因特定区域的组合能够较好地筛检肺癌患者。
实施例4用于肺癌筛查和辅助诊断遗传变异试剂盒的制作
遗传变异试剂盒的制作和操作流程是基于三代测序扫描检测分型技术。试剂盒含有一批遗传变异特异性引物(包括下列引物对：SEQ ID NO：1与2、SEQ ID NO：3与4、SEQ IDNO：5与6、SEQ ID NO：7与8、SEQ ID NO：9与10和SEQ ID NO：11与12)，还可以有相应PCR技术所需的常用试剂，如：dNTPs，MgCl2，双蒸水等，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照(如确定基因型的标准品和空白对照等)。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的引物对检测遗传变异，再通过遗传变异谱辅助判断肺癌，不仅稳定，检测方便，且精确。因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导诊断和更有效的个体化治疗。
序列表
<110> 南京医科大学
<120> 一种与原发性肺癌辅助诊断相关的遗传变异区域的基因组合及其应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctctcaccgc acacaaaaga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cctgggaaaa gagcaacatc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cacagcctag tagggggaaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gctcattgca acctccatct 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gatctcagct caccgtagcc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gggaaagcat ctctgtttgc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aatgtctggc acctggtagg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cccttaaaat tgggggaaaa 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccacctggct acttgggata 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcctctgtcc ctggatgtta 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agtcctggtc acctgtttgg 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ggtggcataa ccagctcaat 20
Claims (2)
1.一种与原发性肺癌辅助诊断相关的遗传变异区域的基因组合在制备肺癌辅助诊断试剂盒中的应用，该基因组合为chr13:32887644-32893462，chr13:32899213-32907524，chr13:32910402-32921033，chr13:32928998-32937670，chr13:32944539-32954282和chr13:32968826-32973805。
2.用于检测与原发性肺癌辅助诊断相关的遗传变异区域的基因组合的特异性延伸引物对在制备肺癌辅助诊断试剂盒中的应用，这些引物对为： chr13:32887644-32893462的序列引物对为SEQ ID NO：1与SEQ ID NO：2、 chr13:32899213-32907524的序列引物对为SEQ ID NO：3与SEQ ID NO：4、 chr13:32910402-32921033的序列引物对为SEQ ID NO：5与SEQ ID NO：6、 chr13:32928998-32937670的序列引物对为SEQ ID NO：7与SEQ ID NO：8、chr13:32944539-32954282的序列引物对为SEQ ID NO：9与SEQ ID NO：10和 chr13:32968826-32973805的序列引物对为SEQ ID NO：11与SEQ ID NO：12。
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| GB9624453D0 (en) * | 1995-11-23 | 1997-01-15 | Cancer Res Campaign Tech | Materials and methods relating to the identification and sequencing of the brca2 cancer susceptibility gene and uses thereof |
| CN104962613A (zh) * | 2015-06-02 | 2015-10-07 | 南京医科大学 | 一种用于乳腺癌辅助诊断的突变基因及其应用 |
| EP3447154A1 (en) * | 2017-08-23 | 2019-02-27 | Instytut Genetyki Sadowej Jolanta Powierska - Czarny | Method for detection of mutations, polymorphisms and specific dna sequences on dna matrices with dna imaging techniques for the use in medical diagnostics and forensic genetics |
-
2021
- 2021-02-09 CN CN202110175282.9A patent/CN112831564B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9624453D0 (en) * | 1995-11-23 | 1997-01-15 | Cancer Res Campaign Tech | Materials and methods relating to the identification and sequencing of the brca2 cancer susceptibility gene and uses thereof |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Analyses of rare predisposing variants of lung cancer in 6,004 whole genomes in Chinese;Cheng Wang等;《Cancer Cell》;20221010;第40卷;第1223-1239页 * |
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| Publication number | Publication date |
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