CN114752552A - 冷冻胚胎的复苏、培养、优选和单囊胚移植方法以及用于复苏冷冻胚胎的无创检测方法 - Google Patents

冷冻胚胎的复苏、培养、优选和单囊胚移植方法以及用于复苏冷冻胚胎的无创检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于复苏冷冻胚胎的无创检测方法，以及用于获取检测样本的冷冻胚胎的复苏、培养方法，本发明还提供了利用检测结果评估胚胎移植优先等级的胚胎优选方法，用于单囊胚移植当中，从而本发明还提供了相应的单囊胚移植方法和系统。

Description

冷冻胚胎的复苏、培养、优选和单囊胚移植方法以及用于复苏 冷冻胚胎的无创检测方法
技术领域
本发明属于辅助生殖技术领域。具体地，本发明涉及一种在体外受精-胚胎移植技术中应用于胚胎冷冻/复苏的一系列方法，包括用于复苏冷冻胚胎的无创检测方法，以及用于获取检测样本的冷冻胚胎的复苏、培养方法，还包括利用检测结果评估胚胎移植优先等级的胚胎优选方法，以及相应的单囊胚移植方法和系统。
背景技术
体外受精-胚胎转移技术(IVF-ET)是怀孕困难夫妻孕育后代的最终解决方案之一。迄今为止，全球已有超过800万的婴儿是借助IVF-ET技术出生。在此过程中，由于胚胎移植时，一般会尝试多胚胎移植，使得多胎妊娠率居高不下，目前已达到20％。多胎妊娠会增加不良妊娠结局并危及母婴健康，选择性单囊胚移植(eSET)是降低多胎妊娠率的最有效方法，在国际上得到越来越多的应用。在这样的趋势下，提高单胚胎移植的成功率至关重要，但目前仍然欠缺科学的胚胎发育潜能的评价方法。
染色体非整倍体会导致胚胎发育停滞或胚胎着床失败，是导致IVF妊娠率低下、流产率较高的一个重要因素。在流产胎儿中，非整倍体占比达50％以上。现阶段最常用的胚胎选择方法是传统的形态学评估，但其无法单独识别胚胎的染色体情况。因此，可以对于染色体非整倍体的高风险人群实施胚胎植入前遗传学非整倍体检测技术(preimplantationgenetic testing for aneuploidy，PGT-A)，在植入前对胚胎染色体进行拷贝数分析。但如果待孕者未能在首个周期选择PGT-A，若发生种植失败或流产，只能继续通过形态学评级对剩余的冻存胚胎进行选择，无法确认染色体情况。
如果这部分人群在移植失败或流产后，计划选择PGT-A检测，则需要在经历胚胎复苏后，再实施有创的胚胎活检和二次冷冻等一系列操作，可能使胚胎受损。因此，针对此类人群，若能通过无创染色体筛查，检测胚胎的染色体倍性，可在复苏后避免胚胎的活检操作，极大的减少胚胎受损的可能。
胚胎在培养过程中会释放cfDNA到培养液中，近些年，通过cfDNA进行无创PGT-A检测成为辅助生殖领域的研究热点。特别是对冷冻后复苏胚胎的培养液进行的相关研究表明，与新鲜胚胎培养液相比，冻胚培养液被证明更适合实施无创胚胎植入前遗传学非整倍体检测(niPGT)。研究通常在冻胚复苏后，培养14-24h，收集培养液或者囊胚腔液和培养液混合液，样本扩增成功率为92.3-100％，以整胚的结果为金标准，对比培养液结果与整胚结果的一致性，准确性可达 87-100％。Kuznyetsov等人的研究结果显示，NICS结果与整胚结果的一致性甚至超过TE结果与整胚结果的一致性(96.4％vs 87.5％)。但是，通常在冷冻复苏周期中，以上研究的冻胚复苏培养时间均较长(14-24h)，这对于已经达到冷冻标准的冻存囊胚来说，体外培养时间过长，则错过胚胎种植的最佳时机，并不适合在实际临床工作中应用。
目前，临床上常规地会在胚胎发育的第5至第7天(囊胚阶段)，对胚胎进行形态学评级，选择级别为3BC以上的囊胚进行冷冻，并在冷冻前进行激光皱缩。胚胎冷冻多采用玻璃化冷冻技术，临床使用较多的载体是cryoleaf、cryotop、冷冻环cryoloop。冷冻液和解冻液均购买商业化产品，如日本加藤公司。囊胚冷冻的过程是：平衡和洗涤囊胚，然后装管并装载，投入液氮冷冻。在复苏时，把囊胚进行平衡、洗涤和培养。囊胚在复苏2小时后囊胚腔扩张，则表明复苏成功。大部分中心培养2-3小时后直接移植囊胚。个别中心会过夜培养(18-20h)，再把胚胎移植到患者体内。个别中心会对胚胎活检，再次冷冻胚胎，待活检结果出来后，复苏整倍体的胚胎进行移植。
本发明提供了一种改进的胚胎复苏培养方式，对冷冻囊胚进行检测、培养和评估。
发明简述
本发明的发明人通过长期经验积累和研究验证，探索出了一系列应用于胚胎冷冻/复苏的操作条件和/或检测评估方法，以最大限度增加冷冻胚胎移植的成功率，以保证接受冷冻胚胎移植的待孕者获得最佳结局。
在一个方面，本发明提供了一种冷冻胚胎的复苏方法，所述方法包括：(1)获取准备复苏的来自待孕者的冷冻胚胎；(2)复苏所述冷冻胚胎，并转入微滴培养体系进行培养，培养时间为T1。
在一个更具体的实施方案中，所述T1为4-10小时，优选6-8小时，更优选6小时。
在另一个优选的实施方案中，所述微滴培养体系的体积为10-20μL，优选15μL，更优选10 μL。
在第二个方面，本发明提供了一种冷冻胚胎复苏后的检测样本制备方法，其中所述的检测样本是用于胚胎的基因/染色体检测，例如整倍性检测，所述方法的特征在于，采用本发明第一方面的复苏方法对胚胎进行复苏和培养，并在培养结束后，获取所述培养体系中的培养液作为检测样本。
在一个具体的实施方案中，培养时间为4-10小时，优选6-8小时，更优选6小时。在另一个优选的实施方案中，所述微滴培养体系的体积为10-20μL，优选15μL，更优选10μL。
在第三个方面，本发明提供了一种冷冻胚胎复苏后的基因/染色体检测方法，以检测胚胎在基因/染色体方面是否具有异常状况，例如，染色体的整倍性/非整倍性。所述方法的特征在于，采用本发明第一方面的复苏方法对胚胎进行复苏和培养，并采用本发明第二方面的检测样本制备方法获得检测样本。
在一个优选的实施方案中，所述胚胎基因/染色体检测方法是无创胚胎染色体筛查(non- invasive chromosome screening,NICS)。
在一个具体的实施方案中，培养时间为4-10小时，优选6-8小时，更优选6小时。在另一个优选的实施方案中，所述微滴培养体系的体积为10-20μL，优选15μL，更优选10μL。
在一些实施方案中，所述基因/染色体检测方法的检测结果是，样本中来自胚胎的游离DNA 经检测为具有整倍性，因而所述胚胎的染色体是整倍体。在另一些实施方案中，所述检测的结果是，样本中来自胚胎的游离DNA经检测为具有非整倍性，因而所述胚胎的染色体是非整倍体，例如，21-三体，18-三体，等等。在另一些实施方案中，所述检测的结果是，样本中来自胚胎的游离DNA经检测为具有非整倍性，因而所述胚胎的染色体是非整倍体，例如，21-三体， 18-三体，等等。在另一些实施方案中，所述检测的结果是“NA”(NotAvailable)，即出现扩增失败、扩增失败导致测序数据不足分析、扩增后产物的测序数据未达到分析标准的情况，因而未获得关于胚胎的倍性检测结果。
在第四个方面，本发明提供了一种冷冻胚胎移植的方法，所述方法能够以候选胚胎中最大概率获得最佳临床结局，即持续妊娠并活产。所述方法包括以下步骤：
a)获取准备复苏的来自待孕者的冷冻胚胎；
b)复苏所述冷冻胚胎，并转入微滴培养体系进行培养，培养时间为T1；
c)收集培养液，对其中的cfDNA进行扩增后进行胚胎染色体遗传学检测；
d)根据染色体遗传学检测和胚胎冷冻之前进行的形态学评估的结果对胚胎进行优先等级评定；
e)向待孕者移植优先等级较高的胚胎。
在一个具体的实施方案中，培养时间为4-10小时，优选6-8小时，更优选6小时。在另一个优选的实施方案中，所述微滴培养体系的体积为10-20μL。
在一些实施方案中，胚胎染色体遗传学检测的结果为以下三种之一：整倍体、NA和非整倍体。
在一些实施方案中，胚胎形态学评估的结果为以下三种之一：优、中和差。
在优选的实施方案中，胚胎优先等级评定的标准为：综合染色体遗传学检测结果与形态学评估结果，按照整倍体+优>NA+优>整倍体+中>NA+中作出评定。
在优选的实施方案中，按照优先等级高低向待孕者移植所需数目的胚胎，其中对于遗传学检测为非整倍体的和/或形态学评估为差的胚胎，需要在患者充分知情风险的情况下，由临床医生与患者共同决定是否移植。
因而相应地，在另一个方面，本发明提供了一种胚胎的移植优先等级的评定方法，所述方法的特征在于，采用本发明第三方面的检测方法获得的胚胎染色体遗传学检测结果，结合胚胎冷冻之前进行的形态学评估的结果，对胚胎进行优先等级评定。在一些实施方案中，胚胎染色体遗传学检测的结果为以下三种之一：整倍体、NA和非整倍体。在一些实施方案中，胚胎形态学评估的结果为以下三种之一：优、中和差。在优选的实施方案中，胚胎优先等级评定的标准为：综合染色体遗传学检测结果与形态学评估结果，按照整倍体+优>NA+优>整倍体+中>NA+ 中作出评定。
在另一个方面，本发明提供了一种优选冷冻胚胎的方法，所述方法的特征在于，采用上述移植优先等级的评定方法对候选胚胎的移植优先等级进行评定。在一些实施方案中，胚胎的评定结果为整倍体+优，因而是最优选用于移植的胚胎。在一些实施方案中，胚胎的评定结果为 NA+优，因而是次优用于移植的胚胎。在一些实施方案中，胚胎的评定结果为整倍体+中，因而是再次优用于移植的胚胎。在一些实施方案中，胚胎的评定结果为NA+中，因而是尚可用于移植的胚胎。在一些实施方案中，胚胎的评定结果为遗传学检测为非整倍体和/或形态学评估为差，在患者充分知情风险的情况下，由临床医生与患者共同决定是否移植。
在另一个方面，本发明提供了一种用于冷冻胚胎移植的系统，其包括以下模块：
1)胚胎复苏培养模块：所述模块用于对获取的来自待孕者的冷冻胚胎进行复苏和培养；
2)胚胎检测模块：所述模块用于收集模块1)中的胚胎培养液，并对其中的cfDNA进行扩增后进行胚胎染色体遗传学检测，所述模块还用于追溯、获取和/或接收胚胎冷冻之前进行形态学评估的结果；
3)结果分析模块：根据模块2)所输出的胚胎染色体遗传学检测结果和形态学评估结果，分析相应胚胎用于移植的优先等级。
在一些优选的实施方案中，所述系统的所述胚胎复苏培养模块采用微滴培养体系，培养体积为10-20μL，优选10μL。
在一些优选的实施方案中，所述系统的所述胚胎复苏培养模块采用的培养时间为4-10小时，优选6-8小时，更优选6小时。
在一些优选的实施方案中，所述系统的所述胚胎检测模块输出的染色体遗传学检测分为三种结果：整倍体、NA和非整倍体；形态学评估分为三种结果：优、中和差。在一些进一步的实施方案中，所述结果分析模块由上述结果评定胚胎移植的优先等级从高到低为：整倍体+ 优>NA+优>整倍体+中>NA+中，而遗传学检测为非整倍体的和/或形态学评估为差的胚胎在患者充分知情风险的情况下，由临床医生与患者共同决定是否移植。
附图说明
图1所示为本发明的方法的验证研究的全流程图。
图2示意了利用本发明的方法所评定的胚胎移植优先级来决定的胚胎优先移植顺序。
发明详述
体外受精-胚胎移植(转移)技术(In Vitro Fertilization-Embryo Transfer,IVF-ET)，即公众所谓的“试管婴儿”技术，是一种科学的、能够快速帮助待孕者的获得妊娠状态的辅助生殖技术 (Assisted Reproductive Technology,ART)。其过程是从人体取出配子(精子和卵子)，在体外条件下受精形成胚胎，再挑选优质胚胎转移入子宫腔着床发育成胎儿。如同从该技术的名称可以看出的那样，该技术分两个阶段：即人的配子(精子和卵子)在体外受精，形成胚胎，并发育至囊胚阶段；将囊胚转移入待孕者子宫腔内，使得囊胚在子宫内膜上完成着床。此后，胚胎继续发育的过程即与自然受孕机会无差别。
IVF(In Vitro Fertilization，体外受精)即第一阶段中最常用的手段，因此往往用其名称指代第一阶段。IVF的操作方式是，将精子通过筛选处理后，直接加入卵子周围，两种配子即可直接完成受精结合形成胚胎。在男性方精子正常或基本正常的情况下，采用IVF手段。
ICSI(Intracytoplasmic sperm injection，卵胞浆内单精子注射)是IVF的替代手段，在男性方精子数量过少和/或行动力过弱以至于不能依靠自身进入卵细胞内的情况下，利用显微授精技术将单个精子注射入卵子内，从而使得卵子受精形成胚胎。如无特别说明，本文的方法适用于 IVF、ICSI或其他体外受精方式形成的胚胎。
如无特别说明，“待孕者”、“受试者”和“患者”在本文中可互换地使用，意指意图接受体外受精-胚胎移植技术使得其受孕(获得妊娠状态)的女性。尽管在很多情况下，此类女性是经过长期、多次尝试而未能自然受孕的，但这并不意味着此类女性患有疾病，因为未能自然受孕的原因多样且复杂(疾病只是其中的一部分)，同时也不意味着体外受精-胚胎移植技术能够治疗该女性可能患有的任何疾病，而该待孕者在临床机构接受服务从而仅仅是被习惯性地称作“患者”。非妊娠/妊娠状态的转换是一种生理过程的转换(尽管是复杂且精密的)，体外受精-胚胎移植技术的唯一目的即是快速地、可靠地建立妊娠状态。在绝大多数情况下，待孕者在接受体外受精- 胚胎移植技术时，无需本人和/或其配偶实际被诊断为患有任何疾病。即使待孕者因为患有疾病导致很难/无法自然受孕，体外受精-胚胎移植技术往往也不能确定地治疗该疾病，而仅仅是提供了一种自然受孕的替代受孕方式。
囊胚是胚胎发育过程中的一个阶段，在这个阶段中的胚胎内部含有囊胚腔、致密的内细胞团和滋养层细胞。在自然受孕过程中和在胚胎移植时，当胚胎发育至囊胚阶段，可以在子宫内膜上着床。因此，如无特别说明，“囊胚”和“胚胎”在本文中可互换地使用。
如无特别说明，本文中以“D”+数字表示胚胎形成(例如，在体外形成)之后发育的天数。例如，但非限制性地，D5表示胚胎形成后第5天，D6表示胚胎形成后第6天。
囊胚冷冻又称为囊胚玻璃化冷冻，是指将发育至囊胚阶段的胚胎存置于零下196℃的液氮环境中，从而长时间保存的手段。当通过体外受精获得多个高质量胚胎、不在单次移植中全部使用时，或由于母体原因无法移植新鲜胚胎时，可以将一个或多个囊胚进行冷冻操作，并在需要或适合胚胎移植时，将囊胚复苏并用于移植。适合于本发明的囊胚冷冻/复苏方法例如是采用日本加藤冷冻和解冻试剂盒(Kitazato BiophamaCo.Ltd.Shizuoka.Japan)，根据说明书的操作指示进行。冷冻试剂包括平衡液(ES)、冷冻液(VS)；解冻试剂含有解冻液(TS)、稀释液(DS)、洗液1(WS1)和洗液2(WS2)；冷冻载体为Cryotop(日本加藤公司生产)。囊胚冷冻前利用激光辅助孵化系统在远离内细胞团一侧透明带进行人工皱缩囊腔，将囊胚液释放，待完全皱缩后进行玻璃化冷冻。冷冻过程在37℃下，ES液中2min，VS中45-60s，然后将胚胎置于冷冻载体Cryotop顶端，并立刻投入液氮中。囊胚复苏过程将装载有囊胚的冷冻载体从液氮中取出，迅速放入已平衡至37℃的TS中1min，后依次转入室温平衡的DS、WS1和WS2中，每步 3min。复苏后采用G2.5PLUS(Vitrolife公司)进行微滴培养(例如，15-20微升)至移植前。在本发明的优选的实施方案中，囊胚是在天数D5或D6时进行冷冻的。在本发明的更优选的实施方案中，囊胚是在天数D5时进行冷冻的。
本发明优选采用的冻胚复苏培养方案如下：使用15-20μL培养液体系微滴培养复苏的囊胚 6h，收集囊胚培养液(SCM，spent culture medium)进行胚胎染色体遗传学检测。Kuznyetsov等人使用25μL体系复苏冻存胚胎，培养24h，收集囊胚腔液和培养液混合液，扩增成功率达100％， NICS结果与整胚结果一致性达96.4％。Huang等人使用15μL培养液复苏冻胚，培养24h，收集培养液，扩增效率为92.3％，与整胚结果一致性为93.8％。Jiao等人发表的文献中，使用12μL 培养液复苏培养冻胚15h，收集囊胚腔液和培养液的混合液，扩增效率可达100％，与整胚结果一致性为90.48％。基于上述现有技术，本领域技术人员常规地知晓，但临床实践中，冻存胚胎复苏培养的时间一般是2-3h,培养时间过长可能导致已发育至囊胚阶段的胚胎错过最佳种植时间，影响着床率。我们在研究中对冷冻胚胎复苏培养6h，这是多家生殖中心胚胎实验室冷冻胚胎的常规复苏操作，可以使复苏胚胎的发育潜能充分激活，有利于胚胎着床，同时也满足NICS 检测的样本起始量要求。
在发育上，不是所有的胚胎都是均等地产生出来。高质量胚胎与低质量胚胎在多种因素上体现出区别。虽然尚有争议，但本领域大多数学者认为，遗传物质更完美、增殖更加旺盛和迅速的胚胎将更有利于着床以及之后的继续发育为完整个体。
术语“形态学评估”指依据胚胎的形态对胚胎的生命力和发育潜能进行推断的手段，依据为：遗传物质正常、营养供应充足、代谢旺盛的增殖状态胚胎会在形态上有所反映。是在PGT出现之前是胚胎评估最重要的手段之一。现有技术中已有多种提出的形态学评估标准。在本发明的优选实施方案中，采用Gardner和Schoolcraft开发的基于囊胚扩张、内细胞团和滋养外胚层发育三部分的评分系统。该评分系统的评价标准是：根据囊胚腔的大小分为：1级(早期囊胚)，囊胚腔小于胚胎体积的1/2；2级(囊胚)，囊胚腔大于胚胎体积的1/2；3级(完全囊胚)，囊胚腔几乎占满了整个胚胎；4级(扩张囊胚)，囊胚体积扩大，囊胚腔扩张，透明带变薄；5级(孵化囊胚)，透明带出现破口，部分滋养层细胞开始从透明带破口孵出；6级(孵出囊胚)，囊胚完全从透明带中孵出，脱离透明带。对≥3级的囊胚才会考虑移植。内细胞团按3个等级评分：A级，细胞数多，紧密成团，突起明显；B级，细胞数较少，疏散或成群；C级，细胞数很少，难以辨别明显的内细胞团结构。滋养层按3个等级评分：A级，细胞数多，形成一层连续的上皮样结构；B 级，细胞数较少，上皮样结构不连续，较疏松；C级，细胞数很少。在本发明优选的实施方案中，将AA、AB或BA的囊胚评估为形态学优；将BB/AC评估为形态学中；将CA/BC/CB评估为形态学差。
术语“PGT”指胚胎植入前遗传学检测(Preimplantation Genetic Testing)，在本文中，“PGT”与“PGT-A”(Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy，胚胎植入前非整倍体遗传学检测) 可互换地使用。最早的PGT技术是有创性的，通过对胚胎进行活检、获取卵裂球细胞或滋养层细胞进行遗传学检测。随着胚胎细胞向培养体系中释放出的无细胞DNA(cell-free DNA)的发现，收集这部分DNA进行PGT检测的无创性PGT(Non-invasivepreimplantation genetic testing， niPGT)手段也开始被越来越多地采用。在本文中，术语“niPGT”术语“NICS”(无创性染色体筛查，Non-invasive chromosome screening)可互换地使用。
术语“无创胚胎染色体筛查(non-invasive chromosome screening,NICS)”是指利用胚胎游离DNA通过全基因组扩增(WGA)和二代测序(NGS)，来反映整个胚胎的染色体情况的无创 PGT技术。培养液中的游离无细胞DNA的含量是较少、甚至极少的，此前并没有发现它的存在 (即使发现了也没有有效的检测手段)。但全基因组扩增和二代测序技术的高通量、高灵敏度和高度自动化改变了这一情形。使用WGA和NGS技术有效扩增了胚胎中的游离DNA，并对其进行有效的测序，实质上也形成了一种“低覆盖度的全基因组测序”。利用现代计算机的超强运算能力和适当的算法，有限的测序数据也能够充分地被比对到参考基因组上，从而在有足够的样本量用于分析的情况下获得分析结果。目前有两个主要的测序平台被用于PGT或niPGT，它们是Illumina的MiSeq和Thermo-Fisher Scientific的PersonalGenome Machine(PGM)。两者在测序分析之后的数据输出和分析之间存在差异。在CNV分析的情况下，除了NGS之外，microarray、SNP microarray、Realtime PCR和CGH microarray等检测方式也可用于NICS的目的。本领域技术人员在根据本发明的方法获取所述的样本之后，可以容易地根据现有技术当中已有的方案来实施本发明的遗传学检测，例如Xu J,etal.(2016)Noninvasive chromosome screening of human embryos by genomesequencing of embryo culture medium for in vitro fertilization.Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America 113(42):11907-11912和Huang J,et al.(2021)Chromosome Screening of HumanPreimplantation Embryos by Using Spent Culture Medium:Sample Collection andChromosomal Ploidy Analysis. Journal of visualized experiments:JoVE(175)等文献中所描述的，或如本申请人此前申请的中国发明专利公开号CN 109536581 A中所描述的，上述文献通过引用的方式以其整体并入本文。
拷贝数变异(CNV)是指一种亚微观水平的结构变异，与参考序列相比，基因组中的缺失和(或)重复及其组合衍生出的复杂染色体结构变异形式。若CNV异常，则说明染色体不是整倍体。
如无特别说明，术语“NA”在本文中意指对于所获取的胚胎检测样本进行检测(例如，扩增、建库和测序)之后，未得到有意义的结果。此类结果的产生，可能是由于胚胎细胞比较致密，导致被释放至培养液中的DNA更少，即此类样本有更高的概率来自形态学更加优质的胚胎。所以，在没有整倍体胚胎时，在向待孕者充分说明风险和待孕者充分知情同意的情况下，形态学评估为优但遗传学检测结果为NA的胚胎也是优选的选择。在本发明的一些实施方案中，向待孕者移植形态学评估为优但遗传学检测结果为NA的复苏冷冻囊胚。
以下实施例提供了本发明的示例性实施例。虽然出于本发明的目的已经描述了各种实施例，但是这些实施例不应当被认为是将本发明的教导局限于此。基于实施例而进行的各种改变和修改，以获得相同或相似的结果的技术方案，同样在本发明的保护范围之内。
实施例
实施例1.试验设计与受试者
本发明进行了一项回顾性的队列研究：收集2019年1月至2019年7月期间在某中心按照形态学优选的冷冻胚胎进行复苏的单囊胚移植待孕者的212例囊胚培养液。纳入标准：待孕者有冷冻胚胎，且同意按照形态学优选进行单囊胚移植。排除标准：待孕者有输卵管积水且未行输卵管近端结扎；待孕者有内分泌因素、感染因素、免疫功能异常等疾病；待孕者有内膜息肉，且在解冻移植前未做处理。
212例待孕者按照形态学优选冷冻的单囊胚进行移植，形态学评分标准为Gardner和 Schoolcraft开发的基于囊胚扩张、内细胞团和滋养外胚层发育三部分的评分系统，冷冻的胚胎复苏6h后进行单囊胚移植，同步收集微滴培养液冻存待NICS检测，随访待孕者至活产结局，分析NICS结果与临床结局的关系。
观察指标如下：
(1)妊娠的诊断与随访
随访终点是活产情况。临床妊娠定义为在移植后28-30天经超声确定宫腔内有妊娠囊及胎心搏动，持续妊娠定义为妊娠≥12周且胎儿心脏活动为阳性，早期流产定义为在妊娠12周前超声监查后临床妊娠(至少一个妊娠囊)丢失，活产定义为分娩1个胎龄超过28周的活产婴儿。
(2)数据计算公式
临床妊娠率＝临床妊娠周期数/解冻移植周期数，持续妊娠率＝持续妊娠周期数/解冻移植周期数，流产率＝流产的周期数/临床妊娠周期数，活产率＝活产的周期数/解冻移植周期数。
实施例2.材料与方法
I.NICS样本收集
胚胎冻存与复苏
采用日本加藤冷冻和解冻试剂盒(Kitazato Biophama Co.Ltd.Shizuoka.Japan)对囊胚进行冷冻和复苏。冷冻试剂包括平衡液(ES)、冷冻液(VS)；解冻试剂含有解冻液(TS)、稀释液(DS)、洗液1(WS1)和洗液2(WS2)；冷冻载体为Cryotop(日本加藤公司生产)。囊胚冷冻前利用激光辅助孵化系统在远离内细胞团一侧透明带进行人工皱缩囊腔，将囊胚液释放，待完全皱缩后进行玻璃化冷冻。冷冻过程在37℃下，ES液中2min，VS中45-60s，然后将胚胎置于冷冻载体Cryotop顶端，并立刻投入液氮中。囊胚复苏过程将装载有囊胚的冷冻载体从液氮中取出，迅速放入已平衡至37℃的TS中1min，后依次转入室温平衡的DS、WS1和WS2中，每步 3min。复苏后采用G2.5PLUS(Vitrolife公司)进行微滴培养(15-20微升)至移植前。
培养液收集
在胚胎移植前，将微滴培养的复苏囊胚转移至移植皿。微滴培养液进行收集，同时收集空白培养液作为对照。为保证样本检出率，微滴培养时间为6小时。微滴培养液用移液枪转到无核酸酶的PCR管中-20℃冷冻保存。
II.样本检测
扩增、建库和测序
按照操作说明，使用ChromInstTM(YikonGenomics)文库试剂盒进行WGA和NGS文库制备。简而言之，DNA先与随机引物库退火，预扩增后，再指数扩增至2μg。使用文库构建试剂盒对扩增产物进行文库制备，使用Qubit3.0和1.5％琼脂糖凝胶电泳对NGS文库进行质量控制。使用Illumina平台进行测序，每个库获得约200万个测序读数。
CNV分析
使用R、Python等对数据进行分析和可视化。沿着整个基因组按照bin大小为1Mb对高质量reads进行计数，并通过GC和参考数据集对reads进行归一化,二值分割算法(CBS)用于CNV 片段的检测。30％嵌合率被设置为区分非整倍体和整倍体的阈值。当嵌合程度低于30％时，胚胎被归类为“整倍体”，当嵌合程度高于70％时，胚胎被归类为“非整倍体”。扩增失败、扩增失败导致测序数据不足分析、扩增后产物的测序数据未达到分析标准被归类为“NA”组。所有胚胎根据上述检测结果被分为整倍体、非整倍体和NA组。
III.数据分析
使用IBM SPSS19进行数据分析。在基线特征中，连续变量若符合正态分布，以均数±标准差(x-±s)表示,使用单因素方差分析检验；若是非正态分布，以中位数和四分位距表示，使用 Kruskal-Wallis检验。基线特征和分层分析中的计数变量以频数和百分比表示，采用卡方检验或 Fisher精确检验进行分析。将p<0.1且与临床结局有影响的协变量，纳入多因素Logistic回归分析，比较整倍体组、非整倍体组和NA组的临床结局。
实施例3.胚胎复苏培养时间对比
实验步骤：
收集某中心捐赠的58枚冷冻的废弃囊胚，按照解冻试剂盒说明进行复苏(Kitazato Biophama Co.Ltd.Shizuoka.Japan)，复苏后采用G2.5PLUS(Vitrolife公司)进行微滴培养(20微升)，置于三气培养箱中培养，培养2小时后，囊胚腔扩张视为存活，适合用于移植。
把囊胚分成4组，每组培养的时间分别为2、4、8和10小时，分配的囊胚数如表1，复苏后2h先观察囊胚腔扩张情况，判断囊胚是否复苏成功。组1(2h)可以直接收集培养液至5μl的样本保存液中，其余胚胎按照分组时间收集培养液。按照本发明中阐述的裂解、扩增建库和测序步骤进行检测，根据建库情况和测序结果分析扩增成功率。
6小时组采用临床常规操作的32枚胚胎的回顾性数据。冷冻的囊胚在复苏后，培养6小时，进行移植，同步收集胚胎培养液进行检测，培养液的收集和检测过程同上。
实验结果：
1.2小时后观察囊胚腔扩张情况，共计90枚囊胚中，有84枚胚胎复苏成功。如表1所示。
表1.囊胚分组和复苏情况
组1(2h) 组2(4h) 组3(6h) 组4(8h) 组5(10h)
纳入的胚胎数(个) 10 15 32 20 13
成功复苏囊胚数(个) 9 14 30 19 12
2.在6小时培养时间，20μl的培养体系下，扩增成功率为90％。6h、8h和10h的扩增成功率相差不大，如表2。(临床上大部分中心无法培养8h/10h，时间过长)
表2.不同培养时间对比，扩增成功率结果
Figure BDA0003632555670000091
该对比实验结果可以指导本发明的方法采用6小时作为复苏后培养和取样培养液的最优时间，4-10小时或6-8小时也是较理想的选择。
实施例4.胚胎复苏培养体系体积对比
实验步骤：
收集某中心捐赠的30枚冷冻的废弃囊胚，按照解冻试剂盒说明进行复苏(Kitazato Biophama Co.Ltd.Shizuoka.Japan)，复苏后采用G2.5PLUS(Vitrolife公司)进行微滴培养，把囊胚分成2 组，培养液体系分别为10μl和15μl。然后置于三气培养箱中培养，培养2小时后，囊胚腔扩张视为存活，适合用于移植。然后继续培养4小时。
收集所有胚胎的培养液至5μl的样本保存液中。按照本发明中的裂解、扩增建库和测序步骤进行检测，根据建库情况和测序结果分析扩增成功率。
20μl组的数据同样采用如实施例3所述的来自32枚胚胎的回顾性数据。
实验结果：
1. 2小时后观察囊胚腔扩张情况，共计67枚胚胎中64枚胚胎复苏成功。如表3。
表3.囊胚分组和复苏情况
组1(10μl) 组2(15μl) 组3(20μl)
纳入的胚胎数 20 15 32
成功复苏囊胚数 19 15 30
2.在6小时培养时间，体积为20μl的培养体系下，扩增成功率为90％，而更小的培养体积获得更高的扩增成功率。(如表4所示)
表4. 10-20μl培养体系对比：
Figure BDA0003632555670000101
该对比实验结果可以指导本发明的方法采用10μl-20μl、最优选10μl培养液体积用于复苏后培养体系。
实施例5.研究结果
受试者基线数据
按照形态学优选复苏冷冻囊胚212个，根据胚胎实验室常规操作，采用单微滴培养6h后，将囊胚转移至移植皿在超声引导下进行单囊胚移植，随访待孕者的临床结局。同步收集胚胎微滴培养液进行NICS检测。2例胚胎未收集到SCM，故最终纳入210例待孕者。NICS检测结果为：53例SCM扩增失败、扩增失败导致测序数据不足分析或扩增后产物的测序数据未达到分析标准，89例为整倍体，68例为非整倍体(参见图1)。
表5是210例所有待孕者的临床基线特征，按照胚胎的NICS结果，待孕者被分为整倍体、非整倍体和NA组。纳入的基线特征有：男女双方的年龄、BMI、不孕年限、受精类型、不孕类型、不孕原因，囊胚的天数、囊胚形态学评级。其中形态学评级按照Munne文章中的分类标准，把胚胎分成优中差，优：AA/BA/AB；中：BB/AC；差：CA/BC/CB。大部分指标在三组中差异不具有统计学意义，仅男女方年龄、受精方式、原发或继发不孕、胚胎天数和形态学评级存在显著差异。(表5)
表5待孕者的临床基线特征
Figure BDA0003632555670000111
染色体筛查结果和临床结局
共210例待孕者，其中异位妊娠1例，晚期流产1例。临床妊娠率为48.6％(102/210),持续妊娠率为39.5％(83/210)，早期流产率为17.6％(18/102)，活产率为39.0％(82/210)(图1)。
男女方年龄、形态学评级、胚胎天数、受精方式和不孕类型作为自变量纳入到二分类Logistic 回归分析中。分析结果显示，整倍体组的临床妊娠率、持续妊娠率和活产率高于非整倍体组56.2％ vs 29.4％,adjusted OR 0.33,95％CI 0.15-0.72；47.2％vs22.1％,adjusted OR 0.34,95％CI 0.15-0.77； 46.1％vs 22.1％,adjusted OR 0.39,95％CI 0.18-0.86)，并存在统计学意义(参见表6)。
整倍体组的临床妊娠率、流产率、持续妊娠率和活产率与NA组没有显著性差异(56.2％vs 60.4％,adjusted OR 0.85,95％CI 0.39-1.85；47.2％vs 49.1％,adjustedOR 0.76,95％CI 0.36-1.63； 46.1％vs 49.1％,adjusted OR 0.78,95％CI 0.37-1.67)(参见表6)，即两组具有相似的结局。
表6 Logistic回归分析比较整倍体组、非整倍体组和NA组的临床结局
Figure BDA0003632555670000121
a logistic回归分析校正了男女方年龄、形态学评级、胚胎天数、受精方式和原发或继发不孕。＊代表p<0.05,＊＊代表p<0.01。
按照形态学评级分成优中差三组。不同评级中的整倍体占比为41.8％、42％和44.0％，基本没有差异,非整倍体占比为21.5％，34.6％和46.0％，即可见非整倍体随着评级越差而比例增加，总体临床妊娠率、持续妊娠率和活产率随着胚胎评级的提高而提高(59.5％vs 44.4％vs 38.0％, p＝0.038；49.4％vs 39.5％vs 24.0％,p＝0.016；49.4％vs 39.5％vs 22.0％,p＝0.008)。评级为“差”的胚胎，流产率高于另外两组(17.0％vs11.1％vs 31.6％)，但未发现显著性差异(p＝0.172)。仅胚胎评级为中的人群中，三组的临床妊娠率有显著差异(p＝0.037)，且整倍体组高于非整倍体组 (p＝0.014)。同时也发现，NA组的优胚占比最高(54.7％，29/53，参见表7)。该分层分析同样表明，虽然胚胎的形态学评估结果是非常重要的因素，但不足以单独用于预测冻胚结局。
表7按照胚胎形态学评级分层，比较临床结局
Figure BDA0003632555670000122
如上所述，发明人在本研究中回顾性地分析了210例冷冻囊胚复苏的培养液NICS检测结果与按照形态学优选胚胎进行单囊胚移植待孕者的临床结局。
整倍体组的临床妊娠率、持续妊娠率和活产率显著高于非整倍体组(56.2％vs29.4％, adjusted OR 0.33,95％CI 0.15-0.72；47.2％vs 22.1％,adjusted OR 0.34,95％CI 0.15-0.77；46.1％vs 22.1％,adjusted OR 0.39,95％CI 0.18-0.86)，但与NA组的临床妊娠率、持续妊娠率和活产率差别不大(56.2％vs 60.4％,adjusted OR 0.85,95％CI 0.39-1.85；47.2％vs 49.1％,adjusted OR 0.76, 95％CI 0.36-1.63；46.1％vs49.1％,adjusted OR 0.78,95％CI 0.37-1.67)。如果待孕者移植整倍体胚胎，相较于非整倍体胚胎，临床结局将得到改善，这与前期研究相符。非整倍体组也有活产 (22.1％)，说明检测结果存在一定的假阳性或者胚胎具有自身修复能力。但作为指导意见而言，非整倍体的检测结果表明此类胚胎的移植将伴随很大的风险、成功的预期相对不高，因此需要在待孕者被充分告知风险的基础上，由待孕者和医生综合多方面因素共同讨论决定是否进行移植。
从表6及表7中可以得出，NA组与整倍体组的临床妊娠率、持续妊娠率和活产率相差不大(56.2％vs 60.4％,adjusted OR 0.85,95％CI 0.39-1.85；47.2％vs 49.1％,adjusted OR 0.76,95％ CI 0.36-1.63；46.1％vs 49.1％,adjusted OR 0.78,95％CI0.37-1.67)，推测该组胚胎形态学“好”胚占比高(54.7％vs 37.1％vs 25.0％)，胚胎细胞比较致密，导致被释放至培养液中的DNA更少，从而产生“NA”的结果。Magli等人在研究中也发现，囊胚腔液扩增成功的胚胎移植后，仅37％的待孕者获得临床妊娠，18％的待孕者获得持续妊娠；而囊胚腔液扩增失败的胚胎移植后，临床妊娠率为77％，持续妊娠率为70％。所以，在没有整倍体胚胎时，在与待孕者充分说明风险和待孕者充分知情同意后，可以考虑移植形态学评级高但NA的胚胎。整个
因此在整倍体胚胎中，形态学为优的胚胎应最优先被移植。根据活产率的结果，我们推荐的胚胎优先移植顺序为：整倍体+优→NA+优→整倍体+中→NA+中(参见表7及图2)。
整个说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请，包括如下文所列参考文献，在此以相同的程度全文引入作为参考，就如同明确和单独地说明以其整体引入每一单个出版物、专利或专利申请作为参考一样。本发明的所述产品、方法、或用途的多种修改和变形对本领域技术人员而言显而易见而不背离本发明的范围和精神。虽然已结合具体实施方案描述了本发明，但应理解它能够进一步修改，所要求的发明不应不适当地限于这类具体实施方案。实际上，对本领域技术人员而言显而易见的是，所述用于实施本发明的方式的多种修改旨在处于本发明的范围之内。本申请旨在涵盖本发明的任何变形、用途或改编，其通常遵循本发明的原理，且包括处于本发明所属领域内的已知惯例内，且可应用于前文所示基本特征的这类对本公开的偏离。
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Claims (27)

1.一种评定冷冻胚胎移植优先等级的方法，包括以下步骤：
(1)获取来自待孕者的冷冻胚胎；
(2)复苏所述冷冻胚胎，并转入微滴培养体系进行培养，其中所述培养时间为T1；
(3)收集培养液，对其中的cfDNA进行扩增后进行胚胎染色体遗传学检测；
(4)根据染色体遗传学检测和胚胎冷冻之前进行的形态学评估的结果对胚胎进行移植优先等级评定。
2.如权利要求1所述的方法，其中微滴培养体系的体积为10μL-20μL。
3.如权利要求1所述的方法，其中培养时间T1为4-10小时。
4.如权利要求1所述的方法，其中培养时间T1为6-8小时。
5.如权利要求1-4任一项所述的方法，其中染色体遗传学检测分为三种结果：整倍体、NA和非整倍体；形态学评估分为三种结果：优、中和差；根据上述结果评定胚胎移植的优先等级为：整倍体+优>NA+优>整倍体+中>NA+中，而染色体遗传学检测为非整倍体的和/或形态学评估为差的胚胎在患者充分知情风险的情况下，由临床医生与患者共同决定是否移植。
6.一种优选冷冻胚胎的方法，包括步骤：采用权利要求1-5任一项的方法对候选胚胎进行移植优先等级评定；其特征在于，选择优先等级最高的胚胎，将以在候选胚胎中最大概率获得最佳临床结局，即持续妊娠并活产。
7.一种冷冻胚胎移植的方法，包括以下步骤：
(1)获取准备复苏的来自待孕者的冷冻胚胎；
(2)复苏所述冷冻胚胎，并转入微滴培养体系进行培养，其中所述培养时间为T1；
(3)收集培养液，对其中的cfDNA进行扩增后进行胚胎染色体遗传学检测；
(4)根据染色体遗传学检测和胚胎冷冻之前进行的形态学评估的结果对胚胎进行优先等级评定；
(5)向待孕者移植优先等级更高的胚胎。
8.如权利要求7所述的方法，其中微滴培养体系的体积为10-20μL。
9.如权利要求7所述的方法，其中培养时间T1为4-10小时。
10.如权利要求7所述的方法，其中培养时间T1为6-8小时。
11.如权利要求7-10任一项所述的方法，其中染色体遗传学检测分为三种结果：整倍体、NA和非整倍体；形态学评估分为三种结果：优、中和差；由上述结果评定胚胎移植的优先等级为：整倍体+优>NA+优>整倍体+中>NA+中，而染色体遗传学检测为非整倍体的和/或形态学评估为差的胚胎在患者充分知情风险的情况下，由临床医生与患者共同决定是否移植。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述方法将以在候选胚胎中最大概率获得最佳临床结局，即持续妊娠并活产。
13.一种冷冻胚胎复苏方法，包括以下步骤：
a)获取准备复苏的来自待孕者的冷冻胚胎；
b)复苏所述冷冻胚胎，并转入微滴培养体系进行培养，培养时间为T1；
其特征在于，培养时间T1为4-10小时。
14.如权利要求13所述的方法，其中培养时间T1为6-8小时。
15.如权利要求13所述的方法，其中微滴培养体系的体积为10-20μL。
16.一种复苏冷冻胚胎的基因或染色体遗传学检测样本的制备方法，包括以下步骤：
a)获取准备复苏的来自待孕者的冷冻胚胎；
b)复苏所述冷冻胚胎，并转入微滴培养体系进行培养，培养时间为T1；
c)收集培养液，作为所述基因或染色体遗传学检测样本；
其特征在于，培养时间T1为4-10小时。
17.如权利要求16所述的方法，其中培养时间T1为6-8小时。
18.如权利要求16所述的方法，其中微滴培养体系的体积为10-20μL。
19.一种冷冻胚胎复苏后的基因/染色体遗传学检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)采用权利要求13-15中任一项的复苏方法对来自待孕者的冷冻胚胎进行复苏和培养；
2)采用权利要求16-18中任一项的检测样本制备方法获得检测样本；并且
3)检测所述样本。
20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，步骤3)中的检测使用核酸测序方法。
21.如权利要求19或20所述的方法，其特征在于，步骤3)中的检测目标是拷贝数变异。
22.一种用于冷冻胚胎移植的系统，其包括以下模块：
1)胚胎复苏培养模块：所述模块用于对获取的来自待孕者的冷冻胚胎进行复苏和培养；
2)胚胎检测模块：所述模块用于收集模块1)中的胚胎培养液，并对其中的cfDNA进行扩增后进行胚胎染色体遗传学检测，并用于获取胚胎冷冻之前进行的形态学评估的结果；
3)结果分析模块：根据模块2)所输出的胚胎染色体遗传学检测结果和形态学评估结果，分析相应胚胎用于移植的优先等级。
23.如权利要求22所述的系统，其中所述胚胎复苏培养模块采用微滴培养体系，培养体积为10-20μL。
24.如权利要求22所述的系统，其中所述胚胎复苏培养模块采用的培养时间为4-10小时。
25.如权利要求22所述的系统，其中所述胚胎复苏培养模块采用的培养时间为6-8小时。
26.如权利要求22所述的系统，其中所述胚胎复苏培养模块采用的培养时间为6小时。
27.如权利要求22-26任一项所述的系统，其中染色体遗传学检测分为三种结果：整倍体、NA和非整倍体；形态学评估分为三种结果：优、中和差；由上述结果评定胚胎移植的优先等级为：整倍体+优>NA+优>整倍体+中>NA+中，而遗传学检测为非整倍体的和/或形态学评估为差的胚胎在患者充分知情风险的情况下，由临床医生与患者共同决定是否移植。
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