JP2022516543A - 胚盤胞培養液を使用して胚の健康状態を検出するための方法および製品 - Google Patents

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Abstract

胚盤胞培養液を使用して胚の健康状態を検出するための方法および製品が提供される。具体的には、胚盤胞培養液を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚の健康状態を検出する方法であって、以下の工程：（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏでＤ５～Ｄ６まで培養される胚盤胞を含有する第１の胚盤胞培養系を提供すること；（ｂ）液交換培養のために新鮮胚盤胞培養液を含有する第２の胚盤胞培養系に前記胚盤胞を移して（前記液交換培養の期間はＴ１である）、培養胚盤胞培養液を得ること；（ｃ）前記培養胚盤胞培養液を取り出して、無細胞の培養胚盤胞培養液、すなわち、検出サンプルを得ること；および（ｄ）前記検出サンプルに対する遺伝子検出を行って、前記胚盤胞の健康状態を決定すること、を含むことを特徴とする方法が提供される。前記方法は、ＩＶＦおよびＩＣＳＩ技術における過剰な精子および母体由来顆粒細胞の汚染による干渉のリスクを除去することができ、かつ胚の健康状態を正確に決定することができる。【選択図】なし

Description

本発明は、生物医学および分子細胞生物学の分野、特に、胚盤胞培養液を使用して胚の健康状態を検出するための方法および製品に関する。
背景
着床前遺伝子スクリーニング（ＰＧＳ）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された胚の染色体状態を検出して、母体の子宮に着床される正常染色体を有する胚をスクリーニングし、それにより、妊娠成功率を約６０％に増加させている。様々な検査に必要な生体サンプルは、一般に生検として知られるｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された胚から採取された１～数個の細胞であり、これらの少数の細胞の検出は、胚全体の染色体が正常であるかどうかを反映するものである。理論上、吸引された細胞の染色体状態は、胚における他の細胞のものと同じである。これらの細胞を検査することにより、胚の染色体状態が正常であるかどうかを決定することができる。この時点における数個のトロホブラスト細胞の生検は、胚発生に対する有害作用をもたらさないと、一般に考えられている。現在、新生児の健康から判断して、この操作は何らかの健康影響をもたらすことは示されていない。しかしながら、細胞サンプリングのための胚操作は、比較的高い技術が必要とされる。操作が不適切な場合、胚に重大な損傷を引き起こすことになる。損傷が非常に重度である場合、胚発生が停止される可能性があり、たとえ細胞サンプリングが十分に行われた場合でも、細胞喪失および胚に対するわずかな損傷を引き起こすことは避けられないであろう。さらに、この技術は登場から短期間しか経過しておらず（わずか数年）、細胞喪失および軽度の損傷が胚発生および出生後の健康に対する有害作用をもたらすという証拠はないが、ヒトの生涯にわたる健康に長期的な影響を及ぼすかどうかは、現時点では不明である。さらに、いくつかの例において、サンプリングにより得られた数個の細胞の染色体状態は、胚における他の細胞の染色体状態と異なり、誤った検査結果をもたらす。
最近、胚細胞を採取せず、除去された胚盤胞培養液のみを使用して、胚の健康を反映する非生検技術が検討されてきた。除去された胚盤胞培養液は、処理され、検査および分析される。検査分析結果は、高い正確度で胚盤胞胚の健康状態を間接的に反映する。この技術は、胚自体のいかなる成分も採取せず、倫理的問題を有しない。この技術は、胚に対する損失を全く引き起こさず、健康影響に対する隠れた危険性を排除する。さらに、この技術は、操作が簡便かつ安全であり、比較的高い正確度で胚の状態を反映することができる。
この技術を実施するための従来のプロセスは、以下を含む：新鮮なｉｎ ｖｉｔｒｏ受精卵母細胞を培養液中で３日目（Ｄ３）まで培養し、次いで、胚を３日目（Ｄ３）に胚盤胞培養液に移し、５日目（Ｄ５）または６日目（Ｄ６）まで培養し、胚のグレーディングのために胚盤胞をＤ５またはＤ６に取り出す。胚が凍結のためのグレードに達した場合、凍結操作を直ちに行う。残りの胚盤胞培養液は、採取する必要がある検査サンプルである。臨床上、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精は、ＩＶＦおよびＩＣＳＩのプロセスのうちの１つにより通常行われる。ＩＶＦのプロセスでは、２個以上の精子とのコインキュベーションにより、卵母細胞を受精させ、ＩＣＳＩのプロセスでは、単一精子の注入により、卵母細胞を受精させる。ＩＶＦでは、胚の透明帯の周りをさまよう過剰な精子が通常存在する。精子の父方ＤＮＡの干渉を避けるために、ＩＣＳＩ受精が一般に使用される。
Galluzzi L, et al. (2015, Extracellular embryo genomic DNA and its potential for genotyping applications, Future Science OA 1(4): FSO62)は、培養液を３日目（Ｄ３）に胚盤胞培養液に交換し、Ｄ３からＤ５／Ｄ６まで胚を胚盤胞培養液中で培養し、次いで、使用済みの胚盤胞培養液を検査サンプルとして採取する方法を記載している。Vera-Rodriguez M. et al. (Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development, Hum Reprod. 2018 Apr 1;33(4):745-756)は、これもまた培地交換をＤ３に行い、胚を胚盤胞培養液に移し、Ｄ３～Ｄ５／Ｄ６に培養し、次いで、使用済み胚盤胞培養液を検査サンプルとして採取する、ＩＣＳＩ受精のみに関する方法を記載している。ＣＮ２０１５１０７４６０９８．Ｘは、これもＩＣＳＩ受精のみに対して使用される方法を報告しており、この方法は、Ｄ３における培養液交換の後、Ｄ５／Ｄ６まで胚を培養することを含む。栄養外胚葉生検の検出法と比較して、非生検検出に関するこれらの従来のプロセスは、胚の検出結果の正確度を大幅に改善したが、依然として約１５％の偽陰性率を有しており、その主な理由は、検査サンプルが、外部物質、特に母体起源の妨害物質による干渉が避けられないことによる。いくつかの文献において、これらの従来のプロセスとわずかに異なる方法が記載されている。例えば、Medium-Based Noninvasive Preimplantation Genetic Diagnosis for Human -Thalassemias-SEA, Medicine (Baltimore). 2015 Mar;94(12):e669は、Ｄ３に第１の培地交換、４日目（Ｄ４）に第２の培地交換を行い、次いで、Ｄ４～Ｄ５／Ｄ６に培養し、使用済み胚盤胞培養液を検査サンプルとして採取することを含む方法を報告している。Kuznyetsov V. (Evaluation of a novel non-invasive preimplantation genetic screening approach, PLoS One. 2018 May 10;13(5):e0197262)は、Ｄ４に培地交換を行って、新鮮胚をＤ５まで培養し、レーザーパルスを使用して胞胚腔を収縮させた後、胞胚腔液を採取する、ＩＶＦではなくＩＣＳＩのみに関するサンプリング法を報告している。これらの文書において、サンプリングのためのｉｎ ｖｉｔｒｏインキュベーション時間はＤ４までシフトされており、サンプルはＤ５／Ｄ６に採取される。一方、検査サンプルの１２～３６時間のｉｎ ｖｉｔｒｏインキュベーション時間は依然として長く、このため、外部物質により干渉されることは依然として避けられず、それにより、胚由来ＤＮＡの比が減少しており、胚の検出結果の正確度は有意に改善しておらず、約１５％の偽陰性率が依然として存在し、ＩＣＳＩサンプリングおよびＩＶＦサンプリングの両方に適用することは不可能である。他方、胚はＤ４に評価または操作され、追加の工程は、胚発生に対して予測不可能な影響を及ぼし得る。Ｄ４の胚は通常、桑実期胚に発達し、これは、胚盤胞に発達するために胚にとって重要な期間である。桑実期の直後に、胚盤胞期が続く。胚盤胞形成率は、胚発生の重要な指標である。胚盤胞の形成後、移植または凍結などのｉｎ ｖｉｔｒｏ操作を検討することができる。したがって、胚盤胞形成率に影響を及ぼさないように、Ｄ４桑実期における胚の培養液の交換などのｉｎ ｖｉｔｒｏ操作は、通常臨床では行われない。
しかしながら、現在の検出法では、検査サンプルは、外部物質、特に母体物質による干渉が避けられず、高い偽陰性率をもたらし、ＩＣＳＩサンプリングおよびＩＶＦサンプリングの両方に適用することができない。
したがって、胚の健康を検出するために胚盤胞培養液を検査サンプルとして使用して、正確度を改善でき、かつ偽陰性率を減少させることができるＩＣＳＩおよびＩＶＦの両方にとって適切な方法および製品を開発するという、当技術分野における差し迫ったニーズが存在する。
本発明の目的は、胚の健康を検出するために胚盤胞培養液を検査サンプルとして使用して、正確度を改善でき、かつ偽陰性率を減少させることができるＩＣＳＩおよびＩＶＦにとって好適な方法および製品を提供することである。
本発明の第１の態様は、胚盤胞培養液を使用して、胚盤胞の健康状態を検出するｉｎ ｖｉｔｒｏ法であって、以下の工程：
（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のＤ５～Ｄ６の胚盤胞を含む、第１の胚盤胞培養系を提供すること；
（ｂ）新鮮胚盤胞培養液を含有する第２の胚盤胞培養系に前記胚盤胞を移し、Ｔ１の期間交換培地中で培養して、使用済みの胚盤胞培養液を得ること；
（ｃ）前記使用済みの胚盤胞培養液を採取して、無細胞使用済み胚盤胞培養液、すなわち、検査サンプルを得ること；および
（ｄ）前記胚盤胞の健康状態を同定するための遺伝学的アッセイを行うこと
を含む方法を提供する。
好ましい実施形態において、前記第１の胚盤胞培養系は、ｄｅ ｎｏｖｏ胚盤胞培養のための系（すなわち、培養をＤ１から開始し、培地の交換を行わない）を含む。
別の好ましい実施形態において、前記第１の胚盤胞培養系は、１回以上の培地交換の後の胚盤胞培養のための最後の系（ここで、例えば、培養液交換は、Ｄ２～Ｄ３またはＤ３～Ｄ４、例えばＤ３に行ってもよい）を含む。
別の好ましい実施形態において、「培養日数のＤ５～Ｄ６」は、Ｄ５±１２時間またはＤ６±１２時間、好ましくは、Ｄ５±６時間、より好ましくは、Ｄ５～Ｄ５＋６時間を包含する。
別の好ましい実施形態において、前記培養日数Ｄ５は、培養開始後５日目であり、ここで、培養の初日がＤ１に設定される。
別の好ましい実施形態において、工程（ａ）において、前記胚盤胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養は、ｄｅ ｎｏｖｏ培養（すなわち、培養をＤ１から開始し、培地の交換を行わない培養）である。
別の好ましい実施形態において、工程（ａ）において、前記胚盤胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養は、段階的培養である。
別の好ましい実施形態において、工程（ａ）において、前記胚盤胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養は、第１段階胚盤胞培養および第２段階胚盤胞培養を含む。
別の好ましい実施形態において、前記第１段階胚盤胞培養は、卵割期培養液中で、Ｄ１～Ｄ３、好ましくは、Ｄ１～Ｄ３±１２時間、より好ましくは、Ｄ１～Ｄ３±８時間、より好ましくは、Ｄ１～Ｄ３±６時間培養することを含む。
別の好ましい実施形態において、前記第２段階胚盤胞培養は、胚盤胞培養液中でＤ３～Ｄ５に培養することを含む。
別の好ましい実施形態において、前記Ｔ１の期間は、２～８時間、例えば、３～６時間、好ましくは、３～５時間である。
別の好ましい実施形態において、前記胚盤胞の透明帯は、前記第２の胚盤胞培養系において穿孔される。
別の好ましい実施形態において、透明帯穿孔により形成される孔径は、１０～４０μｍ、好ましくは、１０～３０μｍ、より好ましくは、１０～２０μｍである。
別の好ましい実施形態において、前記方法は、以下の特徴：
（ｉ）高いシグナル・ノイズ比、ここで、前記シグナル・ノイズ比Ｓ１／Ｓ０は、２超、好ましくは、５超、より好ましくは、１０超であり、ここで、Ｓ１は胚からのシグナルであり、Ｓ０はバックグラウンドからのシグナルである；
（ｉｉ）低い偽陰性率、ここで、前記偽陰性率は、８％未満、好ましくは、５％未満、より好ましくは、３％未満である；
（ｉｉｉ）高い正確度、ここで、前記正確度は、８０％以上、好ましくは、８５％以上、より好ましくは、９０％以上である
のうち１つ以上を有する。
別の好ましい実施形態において、前記第１の胚盤胞培養系は、単精子受精のための培養系（またはＩＣＳＩ培養系）である。
別の好ましい実施形態において、前記第１の胚盤胞培養系は、多精子受精のための培養系（またはＩＶＦ培養系）である。
別の好ましい実施形態において、工程（ａ）において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された前記胚盤胞は、単精子受精胚盤胞（またはＩＣＳＩ胚盤胞）である。
別の好ましい実施形態において、工程（ａ）において、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養された前記胚盤胞は、多精子受精胚盤胞（またはＩＶＦ胚盤胞）である。
別の好ましい実施形態において、前記第２の胚盤胞培養系は、１個の胚盤胞（胚）のみを含有する。
別の好ましい実施形態において、前記第２の胚盤胞培養系は、１０～６０マイクロリットル、好ましくは、１０～５０マイクロリットル、または１０～３０マイクロリットル、より好ましくは、１０～１５マイクロリットルの培養液を含む単一胚培養系である。
別の好ましい実施形態において、工程（ｃ）において、前記採取された培養液の容量は、前記単一胚培養系における培養液の容量の５０～１００％、好ましくは、７０～１００％、より好ましくは、８０～１００％、最適には、９０～１００％である。
別の好ましい実施形態において、工程（ｄ）は、以下の工程（ｅ）：
（ｉ）前記培養液を溶解液と混合し、前記培養液および前記溶解液を含有する第１の混合物を得ること；
（ｉｉ）前記第１の混合物を溶解酵素と混合し、インキュベートし、次いで、前記溶解酵素を不活性化して、溶解産物を得ること；ならびに
（ｉｉｉ）前記溶解産物に対するゲノム解析を行い、前記胚盤胞（胚）の健康状態を同定すること
をさらに含む。
別の好ましい実施形態において、前記胚の健康状態は、染色体異数性、ミトコンドリアのコピー数、ＤＮＡ含量が正常であるかどうか、および病原遺伝子の検出を含む。
別の好ましい実施形態において、前記ゲノム解析法は、ＮＩＣＳ－ＩＮＳＴ増幅法および分析法を含む。前記ＮＩＣＳ－ＩＮＳＴの増幅法は、序康医療科技有限公司（蘇州市）製のＵｎｉｖｅｒｓａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品名ＮＩＣＳ－Ｉｎｓｔ（商標））の説明書を参照することができる。増幅法および分析法を含む当技術分野で公知の他のゲノム解析法も、本発明に適用可能である。例えば、ＣＮ１０３８９０１９１Ｂは、ＭＡＬＢＡＣゲノム増幅法などの使用を開示している。
別の好ましい実施形態において、前記ゲノム解析法は、第二世代シークエンシング、核酸チップ、免疫蛍光検出、蛍光ＰＣＲ検出、第一世代シークエンシング、第三世代シークエンシング、質量分析、またはその組合せからなる群から選択される。
別の好ましい実施形態において、前記溶解液は、Ｔｒｉｓ緩衝液、キレート剤、塩酸塩、非イオン性界面活性剤、またはその組合せからなる群から選択される成分を含有する。
別の好ましい実施形態において、前記Ｔｒｉｓ緩衝液は、Ｔｒｉｓ－Ｃｌを含む。
別の好ましい実施形態において、前記Ｔｒｉｓ緩衝液の濃度は、１０～６０ｍＭ、好ましくは、１５～５０ｍＭ、より好ましくは、２０～４５ｍＭ、例えば、３０ｍＭである。
別の好ましい実施形態において、前記Ｔｒｉｓ緩衝液のｐＨは、５～１０、好ましくは、６～９、より好ましくは、７～８である。
別の好ましい実施形態において、前記キレート剤は、ＥＤＴＡを含む。
別の好ましい実施形態において、前記キレート剤の濃度は、０．２～８ｍＭ、好ましくは、０．３～６ｍＭ、より好ましくは、０．５～４ｍＭ、例えば、２ｍＭである。
別の好ましい実施形態において、前記塩酸塩は、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、またはその組合せからなる群から選択される。
別の好ましい実施形態において、前記塩酸塩の濃度は、５～６０ｍＭ、好ましくは、８～４０ｍＭ、より好ましくは、１０～４０ｍＭ、例えば、２０ｍＭである。
別の好ましい実施形態において、前記非イオン性界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、Ｔｗｅｅｎ２０、ＮＰ４０、ＳＤＳ、またはその組合せからなる群から選択される。
別の好ましい実施形態において、前記非イオン性界面活性剤の濃度は、前記溶解液の総重量に対して０．０２～１０％、好ましくは、０．０５～５％、より好ましくは、０．１～３％、例えば、０．２％である。
別の好ましい例において、工程（ｅ）の工程（ｉ）において、前記溶解液と培養液の容量比は、１：１０～１０：１、好ましくは、１：５～５：１、より好ましくは、１：２～２：１である。
別の好ましい実施形態において、前記溶解酵素は、プロテイナーゼＫ、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｒｏｔｅａｓｅ、ペプシン、パパイン、トリプシン、リゾチーム、またはその組合せからなる群から選択される。
別の好ましい実施形態において、前記溶解酵素の濃度は、１～２５μｇ／ｍｌ、好ましくは、５～２０μｇ／ｍｌ、より好ましくは、１０～１５μｇ／ｍｌである。
別の好ましい実施形態において、添加された溶解酵素の量は、０．１～１０μｌ、好ましくは、０．５～６μｌ、より好ましくは、０．８～３μｌである。
別の好ましい実施形態において、工程（ｅ）（ｉｉ）は、
（ｉ）インキュベーション温度が、２０～７０℃、好ましくは、３０～６０℃である；
（ｉｉ）インキュベーション時間が、１分～１２時間、好ましくは、１０分～６時間、より好ましくは、３０分～２時間である；
（ｉｉｉ）不活性化温度が、６０～１００℃、好ましくは、７５～９５℃である；
（ｉｖ）不活性化時間が、０．５～２０分、好ましくは、０．８～１５分である、
からなる群から選択される１以上の特徴を含む。
別の好ましい実施形態において、工程（ｅ）（ｉｉｉ）において、ＰＣＲがゲノム解析に使用される。好ましくは、ＰＣＲ反応チューブは、増幅混合物、０．５％～２０％のＰＣＲ阻害剤に対する剤、５～２０ｍＭ ｄＮＴＰ、５～１００μＭ ＮＧおよびＮＴプライマー、５０～２００μＭ増幅プライマー、０．５～１０単位の核酸ポリメラーゼを含有し、好ましくは、前記ＰＣＲ阻害剤に対する剤は、ＤＭＳＯ、ベタイン、ホルムアミド、グリセロールおよびアルブミンのうち１つ以上から選択され；前記核酸ポリメラーゼは、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔポリメラーゼ、Ｋｌｅｎｏｗ Ｆｒａｇｍｅｎｔ ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＡＭＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素、ｕｌｔｒａ－ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、ＬｏｎｇＡｍｐ Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼおよびＯｎｅＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのうち１つ以上から選択される。
別の好ましい実施形態において、前記増幅混合物は、１０～２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、５～２５ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、５～３０ｍＭ ＫＣｌ、０．５～５ｍＭ ＭｇＳＯ４、０．１％～２０％ＤＭＳＯおよび０．０５～５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む。
別の好ましい実施形態において、前記増幅混合物は、好ましくは、１５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５ｍＭ （ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ４、５％ ＤＭＳＯおよび２％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００を含む。
別の好ましい実施形態において、前記ＮＧおよびＮＴプライマーは、５’末端から３’末端にかけてユニバーサル配列および可変配列を含み、ここで、前記ユニバーサル配列は、Ｇ、Ａ、ＣおよびＴの４個の塩基のうち２または３個から構成され、ただし、前記ユニバーサル配列は、ＧおよびＣを同時に含まない；前記増幅プライマーは、前記ユニバーサル配列を含み、前記可変配列を含まない。
別の好ましい実施形態において、前記可変配列は、（Ｎ）ｎＧＧＧ、（Ｎ）ｎＴＴＴ、（Ｎ）ｍＴＮＴＮＧ、（Ｎ）ｘＧＴＧＧ（Ｎ）ｙからなる群から選択され、ここで、Ｎは、天然核酸と塩基対形成することができる任意のヌクレオチドであり、ｎは、３～１７から選択される正の整数であり、ｍは、３～１５から選択される正の整数であり、ｘおよびｙはそれぞれ、３～１３から選択される正の整数である。
別の好ましい実施形態において、工程（ｅ）（ｉｉｉ）において、ＰＣＲによるゲノム解析における、全ゲノム増幅のためのサーマルサイクリング手順は、以下の通りである：
（１）９０～９８℃の第１の変性温度で５～２０秒；
（２）５～１５℃の第１のアニーリング温度で５～６０秒、１５～２５℃の第２のアニーリング温度で５～６０秒、２５～３５℃の第３のアニーリング温度で３０～８０秒、３５～４５℃の第４のアニーリング温度で５～６０秒、および４５～５５℃の第５のアニーリング温度で５～６０秒；
（３）５５～８０℃の第１の伸長温度で１０～１５０分；
（４）９０～９８℃の第２の変性温度で５～３０秒；
（５）４５～７０℃の第６のアニーリング温度で１０～３０秒；
（６）６０～８０℃の第２の伸長温度で１～１０分；
（７）工程（４）～（６）を５～５０サイクル繰り返す；
（８）６０～８０℃の温度で伸長反応を１～１０分続ける；
（９）０～５℃の冷蔵庫で増幅産物を保存する。
別の好ましい実施形態において、工程（ｅ）（ｉｉｉ）において、ＰＣＲによるゲノム解析における全ゲノム増幅のためのサーマルサイクリング手順は、以下の通りである：
（１）第１の変性温度９５℃で１０秒；
（２）１０℃の第１のアニーリング温度で４５秒、２０℃の第２のアニーリング温度で４５秒、３０℃の第３のアニーリング温度で６０秒、および４０℃の第４のアニーリング温度で４５秒、および５０℃の第５のアニーリング温度で４５秒；
（３）６２℃の第１の伸長温度で９０分；
（４）９５℃の第２の変性温度で２０秒；
（５）５９℃の第６のアニーリング温度で２０秒；
（６）７２℃の第２の伸長温度で３分；
（７）工程（４）～（６）を１０～３０サイクル繰り返す；
（８）７２℃で伸長反応を５分続ける；
（９）４℃の冷蔵庫で増幅産物を保存する。
別の好ましい実施形態において、前記方法は、非治療的および非診断的である。
本発明の第２の態様は、遺伝子検査サンプルまたは染色体検査サンプルを調製する方法であって、以下の工程：
（ａ）Ｄ５～Ｄ６のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養胚盤胞を含む、第１の胚盤胞培養系を提供すること；
（ｂ）新鮮胚盤胞培養液を含有する第２の胚盤胞培養系に前記胚盤胞を移し、Ｔ１の期間交換培地中で培養して、使用済みの胚盤胞培養液を得ること；
（ｃ）前記使用済みの胚盤胞培養液を採取して、無細胞使用済みの胚盤胞培養液、すなわち、検査サンプルを得ること
を含む方法を提供する。
別の好ましい実施形態において、前記第２の胚盤胞培養系は、１個の胚盤胞（胚）のみを含有する。
別の好ましい実施形態において、前記第２の胚盤胞培養系は、１０～６０マイクロリットル、好ましくは、１０～５０マイクロリットル、より好ましくは、１０～１５マイクロリットルの培養液を含む単一胚培養系である。
別の好ましい実施形態において、工程（ｃ）において、前記検査サンプルの容量は、前記第２の胚盤胞培養系における培養液の容量の５０～１００％、好ましくは、７０～１００％、より好ましくは、８０～１００％、最適には、９０～１００％である。
本発明の第３の態様は、胚盤胞培養液を使用して、胚盤胞の健康状態を検出するためのキットであって、
（ｉ）第１の容器、および前記第１の容器に含まれる卵割期培養液；
（ｉｉ）第２の容器、および前記第２の容器に含まれる第１の胚盤胞培養液；
（ｉｉｉ）第３の容器、および前記第３の容器に含まれる第２の胚盤胞培養液；ならびに
（ｉｖ）ラベルまたは説明書
を含むキットを提供する。
別の好ましい実施形態において、前記第１の容器、前記第２の容器、および前記第３の容器は異なるものである。
別の好ましい実施形態において、前記第１の容器中の卵割期培養液は、Ｄ１～Ｄ３の、好ましくは、Ｄ３±１２時間までの、より好ましくは、Ｄ３±８時間までの、より好ましくは、Ｄ３±６時間までの卵割期胚培養に使用される。
別の好ましい実施形態において、前記第２の容器中の第１の胚盤胞培養液は、Ｄ３～Ｄ５における胚盤胞培養に使用される。
別の好ましい実施形態において、前記第３の容器中の第２の胚盤胞培養液は、Ｄ５～Ｄ６の後の時点における胚盤胞培養に使用される。
別の好ましい実施形態において、前記第１の胚盤胞培養液および前記第２の胚盤胞培養液は、同じ組成物を有し、両者は、Ｇ－２ ＰＬＵＳ培地（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ社）またはＱｕｉｎｎ’ｓ Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｌｕｓ胚盤胞培地（ＳＡＧＥ）である。
別の好ましい実施形態において、前記卵割期培養液は、Ｇ－１ ＰＬＵＳ培地（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ社）またはＱｕｉｎｎ’ｓ Ｅｍｂｒｙｏ維持培地（ＳＡＧＥ）である。
本発明の第４の態様は、胚盤胞の健康状態の診断を支援するためのデバイスであって、
（ａ）Ｄ５～Ｄ６に培養胚盤胞の培養液を交換し、かつ前記胚盤胞の後期培養をある期間（Ｔ１）行うように機能する、後期胚盤胞のための培養モジュールを包含する、培養モジュールと；
（ｂ）前記後期胚盤胞の培養モジュールから、検査サンプルとしての前記胚盤胞の使用済みの培養液を採取するように機能する、サンプリングモジュールと；
（ｃ）前記サンプリングモジュールから採取された検査サンプルに対する遺伝子検出を行って、検出結果を得るように機能する、検出モジュールと；
（ｄ）前記検出結果に基づき前記胚盤胞の健康状態を決定して、前記胚盤胞の健康状態の評価結果を提供するように機能する、評価モジュールと；
（ｅ）前記胚盤胞の健康状態の評価結果を出力するように機能する、出力モジュールと
を含むデバイスを提供する。
別の好ましい実施形態において、前記Ｔ１の期間は、２～８時間、例えば、３～６時間、好ましくは、３～５時間である。
本発明の範囲内において、本発明の上記の技術的特徴および以下（例えば、実施形態）に具体的に記載された技術的特徴は、互いに組み合わせて、新規のまたは好ましい技術的解決法を形成することができると理解されるべきであるが、その技術的解決法は、本文の長さの制限のために個別に説明しない。
図面の説明
図１は、検査サンプルの曝露時間における従来のサンプリング法と本発明のサンプリング法との間の差の概略図を示す。 図２は、従来のＤ３～Ｄ５サンプリング法を使用して採取した培養液のＣＮＶ分析結果を示す。 図３は、本発明のＤ５サンプリング法を使用して採取した培養液のＣＮＶ分析結果を示す。
発明の詳細な説明
長期の広範な徹底的な研究の後、多数のスクリーニングおよび検査を通じて、本発明者らは、本発明の１０～２０マイクロリットルの胚盤胞培養系を使用して、Ｄ５～Ｄ６日目まで胚盤胞培養液において胚（胚盤胞）を培養し、次いで、培養のために胚を新鮮胚盤胞培養液に移し、検査のために新鮮胚盤胞培養液から少量の培養液を採取することにより、胚の健康状態（例えば、染色体異数性、ミトコンドリアのコピー数、ＤＮＡ含量が正常であること、および病原遺伝子検出）を、非常に低い偽陰性率（８％未満、好ましくは、５％未満）で正確に検出できることを初めて意外にも発見した。この方法は、過剰な精子および母体由来顆粒細胞からの汚染物質による干渉のリスクを大幅に排除することができる。これに基づき、本発明者は本発明を完成した。
本明細書で使用する場合、用語「胚盤胞」および「胚」は、互換的に使用され、卵子の受精後５～７日目に通常形成されるｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の最終段階の胚を指す。
本明細書で使用する場合、枯渇培養液（ｄｅｐｌｅｔｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）は、使用済みの培養液、例えば、胚を培養するために使用されている培養系から分離された培養液を指す。
本明細書で使用する場合、ｄｅ ｎｏｖｏ培養は、培養プロセスの最初から培養プロセスの最後まで培養液を交換しない胚培養プロセスを指す。例えば、Ｄ１～Ｄ５におけるｄｅ ｎｏｖｏ培養は、胚培養プロセスをＤ１から開始してＤ５まで継続し、その間培養液を交換しないことを意味する。
本明細書で使用する場合、段階的培養は、胚が１回以上の培地交換を受ける胚培養プロセスを指す。例えば、Ｄ１～Ｄ５における段階的培養は、胚培養プロセスをＤ１から開始してＤ５まで継続し、その間胚は１回以上の培地交換を受け、例えば、Ｄ１～Ｄ３に、胚を卵割期培養液中で培養し、Ｄ３～Ｄ５に、胚をさらに交換した胚盤胞培養液中で培養することを意味する。
本明細書で使用する場合、「Ｄｘ」（ここで、ｘ＝１、２、３…の正の整数）は、受精卵母細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の開始を１日目（Ｄ１）に設定して、Ｄｘは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のＸ日目であることを意味する。
本明細書で使用する場合、「Ｄ３～Ｄ５サンプリング」は、Ｄ３～Ｄ５に培養液を使用して胚を培養し、Ｄ５にサンプルを使用済みの培養液（すなわち、枯渇培養液）から採取することを意味する。したがって、このサンプリング法により得た培養液サンプルは、少なくとも約４８時間以上のある期間（すなわち、検査サンプルの曝露時間）、培養胚と接触することになる。
本明細書で使用する場合、「当日サンプリング」は、培養液交換の日に、胚を交換した培養液中で短期間培養した後に、使用済みの培養液（すなわち、枯渇培養液）からサンプルを採取することを指す。したがって、このサンプリング法により得た培養液サンプルが培養胚と接触する時間（すなわち、検査サンプルの曝露時間）は、短くなる。本発明において、曝露時間は、８時間、例えば、３～６時間、より好ましくは、３～５時間を超えないことが好ましい。
本明細書で使用する場合、「溶解液」は、培養液サンプル中のタンパク質および細胞を分解するために使用される溶解緩衝液を指す。いくつかの実施形態において、溶解液は、溶解酵素を含んでもよいし、含まなくてもよい。いくつかの実施形態において、溶解液および溶解酵素は、培養液サンプルに同時に加えることができる。他の複数の実施形態において、溶解酵素は、溶解液を培養液サンプルと混合した後に添加される。
本明細書で使用する場合、「検査サンプルのｉｎ ｖｉｔｒｏインキュベーション時間」、「検査サンプルの培養時間」および「検査サンプルの曝露時間」は、互換的に使用され、サンプリングに使用される培養液が、ｉｎ ｖｉｔｒｏで胚と接触している、または胚とともにインキュベートされている時間の長さを意味する。
本明細書で使用する場合、「ＣＮＶ」は、染色体コピー数変異を指す。ＣＮＶ命名法は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ（ＩＳＣＮ）で編集されている。Shaffer LG, Slovak ML, Campbell LJ (2009): ISCN 2009 an international system for human cytogenetic nomenclature, Human Genetics volume 126, Article number: 603 (2009)を参照のこと。
ＩＶＦおよびＩＶＦ胚
ＩＶＦは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ受精を指し、具体的には、卵母細胞および精子を採取し、試験管に入れて受精させ、次いで、受精卵母細胞（すなわち、胚の前駆体）を母体の子宮に戻す移植をし、胎児に発達させる、試験管ベビーとしても知られる、胚移植技術と組み合わせたｉｎ ｖｉｔｒｏ受精を指す。
「多精子受精胚盤胞」または「ＩＶＦ胚盤胞」は、複数の精子を卵母細胞とｉｎ ｖｉｔｒｏ共培養し、ＩＶＦ技術を使用して受精させることにより得た胚盤胞を指す。
ＩＣＳＩおよびＩＣＳＩ胚
ＩＣＳＩ（Ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ ｓｐｅｒｍ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）は、単一精子を卵子の細胞質内にマイクロインジェクトする技術であり、第二世代の「試験管ベビー」である。この技術は、単一精子を卵子に注入して、それを受精させるための顕微鏡操作システムを使用する。「単精子受精胚盤胞」または「ＩＣＳＩ胚盤胞」は、卵子細胞質内精子マイクロインジェクションの技術であるＩＣＳＩを使用して得た胚盤胞を指す。
検出法
本発明は、胚盤胞培養に使用された枯渇培養液（ｄｅｐｌｅｔｅｄ ｍｅｄｉｕｍ）（すなわち、ある期間胚盤胞を培養するために使用されている培養系から分離された培養液）について遺伝子検出を行って、胚の健康状態を同定する検出法を提供する。
本発明において、胚盤胞培養に使用された枯渇培養液の遺伝子検出のための方法は、特に限定されず、例えば、第二世代シークエンシング、核酸チップ、免疫蛍光検出、蛍光ＰＣＲ検出、第一世代シークエンシング、第三世代シークエンシング、質量分析検出、またはその組合せなど、従来の方法を検出に使用することができる。
一つの実施形態において、前記検出法は、以下の工程：
（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のＤ５～Ｄ６の胚盤胞を含む、第１の胚盤胞培養系を提供すること；
（ｂ）新鮮胚盤胞培養液を含有する第２の胚盤胞培養系に前記胚盤胞を移し、Ｔ１の期間交換培地中で培養して、使用済みの胚盤胞培養液を得ること；
（ｃ）前記使用済みの胚盤胞培養液を採取して、検査サンプルである無細胞使用済みの胚盤胞培養液を得ること；および
（ｄ）前記胚盤胞の健康状態を同定するための遺伝学的アッセイを行うこと
を含む。
好ましい実施形態において、工程（ｄ）は、以下の工程（ｅ）：
（ｉ）前記培養液を溶解液と混合し、前記培養液および前記溶解液を含有する第１の混合物を得ること；
（ｉｉ）前記第１の混合物を溶解酵素と混合し、インキュベートし、次いで、前記溶解酵素を不活性化して、溶解産物を得ること；ならびに
（ｉｉｉ）前記溶解産物に対するゲノム解析を行い、前記胚盤胞（胚）の健康状態を同定すること
をさらに含む。
特定の実施形態において、胚盤胞培養液を検査サンプルとして使用して、胚の健康状態を反映する本発明に係る方法は、以下の主工程：
（ａ）卵母細胞をＩＶＦまたはＩＣＳＩにより受精させ、受精後、受精卵母細胞を培養液に移し、Ｄ３卵割期まで培養し、次いで、胚をＤ３に胚盤胞培養液に移し、Ｄ５～Ｄ６まで培養する；
（ｂ）胚盤胞のグレーディングを行い、十分に発達した胚盤胞をＤ５±０．５日に別の新鮮胚盤胞培養液に移し、レーザー穿刺機器を使用して、高倍率顕微鏡下で透明帯を穿孔し、胚を収縮させ、３～５時間後に胚盤胞を取り出してガラス化した後の、残りの使用済みの胚盤胞培養液が、採取すべき検査サンプルである；
（ｃ）工程（ｂ）において得た使用済みの胚盤胞培養液を溶解液に移し、遠心分離後、サンプルを、限定されるものではないが、ＮＩＣＳ－ＩＮＳＴの増幅を含む全ゲノム増幅、および分析に供して、胚の健康状態を反映する検査結果が得られる
を含む。
本発明は、Ｄ５±０．５日に培養液交換を行い、３～５時間の短時間培養を行った後、胚盤胞培養液を検査サンプルとして採取する。これにより、検査結果の正確度が有意に改善し、偽陰性率が５％以下に減少し、外部物質による干渉、特に母体由来干渉が大幅に避けられる。さらに、これにより、本発明に係る方法は、ＩＣＳＩおよびＩＶＦ受精の両方に適用可能である。
本発明において、以下のことが、検出結果の正確度の改善に寄与すると考えられている：第１に、従来の操作法における２～３日の曝露時間（図１に示すように）と比較して、本発明に係る検査サンプルの曝露時間は、非常に短期間に短縮されており、それにより、外部物質による干渉、特に母体由来干渉が可能な限り最大限に避けられ、また、受精プロセスに関係なく、検出結果の正確度が大幅に改善する。第２に、胚は自身を修復する能力を有し、異常断片が培地に放出され、従来の培養法における培養期間では、その断片が正確度に影響を及ぼし得る。本発明において、サンプリングは、Ｄ５に培養液が交換された後の３～５時間のインキュベーションの時点で行われ、このため、交換された培養液中の胚の培養時間は短い。胚の自己修復は、Ｄ３～Ｄ５培養期間中およびＤ５培養液交換前に生じ、異常断片の大部分は、Ｄ３～Ｄ５培養期間中に放出される。これは、本発明に従って採取された検査サンプル中の異常断片の放出率の低減につながり、結果的に、検出結果の正確度が改善される。本発明が出願される前は、一般に、ＩＣＳＩ受精胚の培養液が採取されているが、ＩＶＦ胚の培養液を採取する試みはされていない。外部干渉にとって最も重要な因子は、検査サンプルの過度に長いｉｎ ｖｉｔｒｏインキュベーション時間である。本発明は、培養液サンプルを採取するために短時間インキュベーション法を採用している。この方法は、過度に長いインキュベーション時間に起因する精子および顆粒細胞などによる外部干渉を回避し、それにより、検査サンプル中の胚由来ＤＮＡの比が減少し、結果の正確度が影響を受け得る。
工程（ｃ）における検査サンプルの量は、８～１５μＬ、好ましくは、１０μＬである。新鮮胚盤胞培養液（すなわち、第２の胚盤胞培養液）の量は、好ましくは、１０～１５μＬである。
好ましくは、胚盤胞グレーディングは、ステージ４以上にまで発達している十分に発達した胚を選択することを包含する。
工程（ｂ）における穿孔は、胞胚腔液の放出、すなわち、遊離核酸の放出を増加させ、このため、核酸物質の初期量は、３～５時間の短期インキュベーションという前提の下に、検査サンプル中で、その後の増幅および検出に十分なレベルまで増加し、それにより、検出成功率が９７％以上に達し得ることが確実となる。胚は通常、胚盤胞期において観察され、グレーディングされ、凍結保存される。胚盤胞期での操作は、胚に対する損傷を引き起こさないと考えられている。本発明はまた、Ｄ５胚盤胞期を選択してレーザー穿孔およびｉｎ ｖｉｔｒｏインキュベーションを行うため、これらの操作は胚発生に影響を及ぼさずに行われる。
本発明において、工程（ｂ）は、Ｄ５に培養液を交換する前に、胚を洗浄する工程も含んでもよく、これは、検出結果の正確度をさらに改善するのに有用である。
本発明において、工程（ａ）において、Ｄ３に胚盤胞培養液の交換を行った後、複数の胚を混合培養することができ、または単一胚培養を行うことができる。
サンプル調製および検査
本発明はまた、遺伝子検査サンプルまたは染色体検査サンプルを調製する方法であって、以下の工程：
（ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のＤ５～Ｄ６の胚盤胞を含む、第１の胚盤胞培養系を提供すること；
（ｂ）新鮮胚盤胞培養液を含有する第２の胚盤胞培養系に前記胚盤胞を移し、Ｔ１の期間交換培地中で培養して、使用済みの胚盤胞培養液を得ること；
（ｃ）前記使用済みの胚盤胞培養液を採取して、無細胞の使用済みの胚盤胞培養液、すなわち、検査サンプルを得ること
を含む方法を提供する。
別の好ましい実施形態において、前記方法により得られた検査サンプルは、胚の健康状態を同定するための遺伝子検査に使用することができる。
透明帯穿孔
胚を胚盤胞期まで成長させ、胚盤胞を操作台に置く。内部細胞塊から離れており、かつ薄い栄養外胚葉を有する部位を選択し、レーザー光を使用して胚盤胞腔を穿孔し、透明帯に小孔を作り、胞胚腔液を胚盤胞培養液に放出できるようにする。透明帯の孔径は特に限定されない。透明帯の好ましい孔径は、１０～４０μｍ、好ましくは、１０～３０μｍ、より好ましくは、１０～２０μｍである。
本発明において、透明帯の穿孔は、胞胚腔液の放出、すなわち、遊離核酸の放出を増大させ、それにより、３～５時間の短いインキュベーションという前提の下に、検査サンプル中の核酸物質の初期量の増加がもたらされる。結果として、検査サンプルは、その後の増幅および検出にとって十分な核酸物質を有し、それにより、検出成功率が９７％以上に達し得ることが確実となる。
レーザー穿孔操作が行われない場合も、検出成功率は最大約７０％と高くなる。
検出キット
本発明において、胚盤胞培養液を使用して、胚の健康状態を検出するためのキットであって、
（ｉ）第１の容器、および前記第１の容器に含まれる卵割期培養液；
（ｉｉ）第２の容器、および前記第２の容器に含まれる第１の胚盤胞培養液；
（ｉｉｉ）第３の容器、および前記第３の容器に含まれる第２の胚盤胞培養液；ならびに
（ｉｖ）ラベルまたは説明書
を含むキットが提供される。
胚の健康の診断を支援するためのデバイス
本発明において、胚の健康状態の診断を支援するためのデバイスであって、
（ａ）Ｄ５～Ｄ６に培養胚盤胞の培養液を交換し、かつ前記胚盤胞の後期培養をある期間（Ｔ１）行うように機能する、後期胚盤胞のための培養モジュールを含む、培養モジュールと；
（ｂ）前記後期胚盤胞培養モジュールから、検査サンプルとしての前記胚盤胞の使用済みの培養液を採取するように機能する、サンプリングモジュールと；
（ｃ）前記サンプリングモジュールから採取された検査サンプルに対する遺伝子検出を行って、検出結果を得るように機能する、検出モジュールと；
（ｄ）前記検出結果に基づき前記胚盤胞の健康状態を決定して、前記胚盤胞の健康状態の評価結果を提供するように機能する、評価モジュールと；
（ｅ）前記胚盤胞の健康状態の評価結果を出力するように機能する、出力モジュールと
を含むデバイスが提供される。
本発明はまた、本発明に係る胚盤胞の健康状態を評価する方法において使用されるデバイスの調製における、場合によりモジュール（ｂ）～（ｅ）と組み合わせた、前記モジュール（ａ）の使用に関する。
本発明の主な利点としては、以下のものが挙げられる：
（１）本発明において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のＤ５～Ｄ６に胚盤胞を短期培養のために新鮮胚盤胞培養液に移し、次いで、使用済みの培養液をそこから分離し、遺伝子検査のために少量の培養液を採取することにより、胚の健康状態（例えば、染色体が異常であるかどうか、染色体異数性、ミトコンドリアのコピー数、ＤＮＡ含量が正常であるかどうか、病原遺伝子検査など）を非常に高い正確度および非常に低い偽陰性率（８％未満、好ましくは、５％未満）で検出することができ、過剰な精子および母体由来顆粒細胞からの汚染物質による干渉のリスクを大幅に低減できることが初めて発見された。
（２）本発明は、単一胚培養系、すなわち、１個の胚のみを１個の培養液中で培養する培養系に適用可能であり、この系により得られた胚の健康状態の検出結果は、より正確である。
（３）本発明に係る方法は、単精子受精胚に使用することができ、かつ多精子受精胚にも使用することができるユニバーサルな方法であり、多精子受精胚が好ましい。
（４）本発明の方法は、透明帯穿孔の工程を含んでもよく、それにより、検出結果がさらに改善され得る。
（５）本発明の方法は、非常に高いシグナル・ノイズ比を有する。
（６）本発明の方法において、胚培養液の採取操作は、胚がＤ５まで培養された後に行われる。操作時間は非常に短く、検査サンプルのインキュベーション時間は調節可能であり、外部干渉のリスクは低い。さらに、サンプル採取法は、受精プロセスにより限定されず、ＩＶＦ胚およびＩＣＳＩ胚の両方に適用可能な培養液サンプリング法である。
（７）Ｄ５培地交換および短期培養を使用した本発明に係るプロセスは、検査サンプルのｉｎ ｖｉｔｒｏインキュベーション時間を調節することで、母体由来干渉および精子由来干渉などの外部干渉が最大限に制御されるという利点を有する。これにより、本発明の適用は、ＩＣＳＩ胚に限定されず、ＩＶＦ胚にも適用することができる。
以下、具体例により本発明をさらに説明する。これらの例示は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないと理解されるべきである。これらの例示において特定の条件を示していない実験方法は、通常、従来の条件または製造業者により推奨される条件に従う。特に断りのない限り、パーセントおよび部は、重量パーセントおよび重量部である。
特に断りのない限り、本発明において使用される材料は、総て市販の製品である。
一般的方法
以下のように胚盤胞培養液を得る：
（１）受精卵母細胞（志願者のカップルから得たものであり、ここで、卵母細胞は女性志願者から得たものであり、精子は男性志願者から得たものであり、ＩＶＦまたはＩＣＳＩをｉｎ ｖｉｔｒｏ受精に使用して、受精卵母細胞を得る）を３日目（Ｄ３）までｉｎ ｖｉｔｒｏ培養し、培養液交換ありまたはなしで５日目（Ｄ５）／６日目（Ｄ６）までさらに培養する；
（２）胚がステージ４以上の胚盤胞に発達したら、胚を３０μＬの胚盤胞培養液の少なくとも３個の液滴に移し（１個の液滴中に１個の胚のみであったことを確認する）、各液滴を緩やかに吹き込みながら、液滴を２～３回すすぎ、次いで、３７℃ならびに５％ＣＯ２および５％Ｏ２で一晩平衡化した１０～１５μＬの微小液滴に胚を移し、レーザー穿孔機器を使用して高倍率顕微鏡下で透明帯を穿孔し、胚を収縮させ、培養を３～５時間または３～６時間続ける。
（３）工程（２）において得た短期培養胚盤胞（約１０～１５マイクロリットル）の培養液を５マイクロリットルの溶解液（３０ｍＭ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．８、２ｍＭ ＥＤＴＡ、２０ｍＭ ＫＣｌ、０．２％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）に移し、採取チューブにサンプル名を記し、微量遠心機において３０秒間遠心分離する。サンプルは、全ゲノム増幅に直ちに使用することができるか、または－２０℃もしくは－８０℃で冷凍保存することができる。
本発明の検出法は、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（商品名ＮＩＣＳ－Ｉｎｓｔ（商標）、序康医療科技有限公司（蘇州市））の説明書を参照して行う。
実施例１
本実施形態は、本発明のＤ５当日サンプリング法と従来のＤ３～Ｄ５サンプリング法との比較に関する。
簡単に述べれば、受精卵母細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＤ３まで培養し、次いで、得られた胚を胚盤胞培養液に移し、Ｄ５まで培養を続けた。従来のＤ３～Ｄ５サンプリング法に従って、Ｄ５における胚盤胞培養液を「Ｄ３～Ｄ５サンプリング」法のサンプルとして採取した。その後、本発明の方法に従って、Ｄ５胚盤胞を新鮮胚盤胞培養液に移し、「当日サンプリング」を上記の一般的方法に従ってＤ５の日に行った。「Ｄ５当日サンプリング」のＣＶ検査結果を、同じ胚からの「Ｄ３～Ｄ５サンプリング」の検査結果と比較し、全胚の検査結果と比較した。全胚からの結果をゴールドスタンダードとして使用した。全胚からの検査結果が異常な染色体コピー数を示し、培養液からの検査結果が正常な染色体コピー数を示す場合、培養液の検査結果を偽陰性と判断する。偽陰性率は、全検査結果における偽陰性の検査結果の割合である。
大量の実験データにより示されるように、本発明の検出結果の正確度は有意に改善し、偽陰性率は５％以下に減少する。従来のＤ３～Ｄ５サンプリング（１３０組のサンプル）の偽陰性率および本発明の「Ｄ５当日サンプリング」の偽陰性率（６２組のサンプル）を以下に示す：
Figure 2022516543000001
上記の表に示されるように、サンプリング前の短期培養とともにＤ５における胚盤胞培養液交換により、偽陰性率を１．６％に制御することができる。対照的に、Ｄ３～Ｄ５サンプリング法では、母体由来干渉を効果的に制御することができず、偽陰性率は１２．３％であり、臨床的誤診を引き起こしやすい。
Ｄ３～Ｄ５により引き起こされたいくつかの偽陰性例は、以下の通りである：（表は、異なる培養液を使用したＣＮＶ染色体核型分析の結果を示す）
Figure 2022516543000002
本発明において、Ｄ５における胚盤胞培養液の交換とサンプリング前の短期培養により、図２および図３に示すように、母体由来干渉を最大限に低減することができる。図２および３は、それぞれ本発明の方法および従来のＤ３～Ｄ５サンプリング法により得た雄性胚の染色体コピー数（ＣＮ）プロファイルを示す。ＣＮプロファイルの横軸は、常染色体１～２２ならびに性染色体ＸおよびＹの順序で配置される染色体であり、縦軸はコピー数である。正常ヒト胚（二倍体）に関しては、常染色体コピー数は２であるはずである。性染色体は、Ｘの２個のコピー（女性）、またはＸおよびＹのそれぞれ１個のコピー（男性）である。
Ｄ３～Ｄ５サンプリング法において、ＣＮＶ（染色体コピー数変異、Ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒ ｖａｒｉａｎｔｓ）の不正確な決定を引き起こし得る、培養液採取時の母体由来干渉の現象を回避することは困難である。例えば、図２に示されるように、４６ＸＹ（男性）の結果は、４６ＸＹ／ＸＸ（男女モザイク）として解釈される。本発明のＤ５当日サンプリング法において、培養液はＤ５の日に採取され、これは、ＣＮＶが４６ＸＹ（男性）として解釈される図３に示されるように、母体干渉を最小限にし、真のＣＮＶ結果を復元させることができる。
比較実験により、本発明により採取された胚盤胞培養液を性別検出に使用する場合、それがＩＣＳＩ胚またはＩＶＦ胚であるかどうかは、全胚を使用した検出と比較して、性別判定の正確度に影響を及ぼさず、偽陰性を引き起こす父方干渉または母体干渉がないことも見出された。いくつかの例は以下の通りである：
Figure 2022516543000003
したがって、本発明の方法は、非常に良好な正確度および非常に低い偽陰性率を有する。
比較例１
方法は実施例１と同じであり、違いは、培養を３日目（Ｄ３）～４日目（Ｄ４）まで続け、培養液をＤ４に交換し、連続的培養の２４または４８時間後に使用済みの胚盤胞培養液を検出のために採取する、という点である。１９組のサンプルに対して実施した検査結果は、胚の健康（例えば、胚染色体異常）の検査結果の正確度は８４．２％（１６／１９）であり、偽陰性率は１０．５％（２／１９）であったことを示した。サンプルサイズを増やして比較例１の方法を使用したところ、その結果は、この方法の正確度が小さくなり、偽陰性率は高くなったことを示した。
考察
Ｄ４胚は通常、胚が胚盤胞に発達するための臨界期である桑実期の胚に発達する。桑実期の次の段階は、胚盤胞期である。胚盤胞形成率は、胚発生の重要な指標である。胚盤胞の形成後、凍結および移植などのｉｎ ｖｉｔｒｏ操作を検討することができる。このため、臨床上、Ｄ４の桑実期の胚は通常、胚盤胞形成率に影響を及ぼさないように、培養液交換などのｉｎ ｖｉｔｒｏ操作に供さない。
胚は、胚盤胞期において観察され、グレーディングされ、凍結される。胚盤胞期での操作は、胚に対する損傷を引き起こさない。本発明において、レーザー穿孔およびｉｎ ｖｉｔｒｏインキュベーションのためにＤ５の胚盤胞期が選択され、したがって、これらの操作は、胚発生に影響を及ぼさないという前提の下に行われる。
本発明において言及される総ての文書は、各文書が参照として個別に引用されるかのように、本出願に参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に対して様々な変更または改変を行うことができ、これらの均等な形態も本出願の添付の特許請求の範囲により定義される範囲内に収まると理解されるべきである。

Claims (12)

  1. 胚盤胞培養液を使用して胚盤胞の健康状態をｉｎ ｖｉｔｒｏで検出する方法であって、以下の工程：
    （ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養の５日目（Ｄ５）～６日目（Ｄ６）の胚盤胞を含む、第１の胚盤胞培養系を提供すること；
    （ｂ）新鮮胚盤胞培養液を含有する第２の胚盤胞培養系に前記胚盤胞を移し、Ｔ１の期間交換した培養液中で培養して、使用済みの胚盤胞培養液を得ること；
    （ｃ）前記使用済みの胚盤胞培養液を採取して、無細胞の使用済みの胚盤胞培養液、すなわち、検査サンプルを得ること；および
    （ｄ）前記胚盤胞の健康状態を同定するための遺伝学的アッセイを行うこと
    を含むことを特徴とする、方法。
  2. 工程（ａ）において、前記胚盤胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養が、ｄｅ ｎｏｖｏ培養または段階的培養である、請求項１に記載の方法。
  3. 工程（ａ）において、前記胚盤胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養が、第１段階胚盤胞培養および第２段階胚盤胞培養を含む、請求項１に記載の方法。
  4. 前記第１段階胚盤胞培養が、卵割期培養液中で１日目（Ｄ１）～３日目（Ｄ３）に培養することを含む、請求項３に記載の方法。
  5. 前記第２段階胚盤胞培養が、胚盤胞培養液中でＤ３～Ｄ５に培養することを含む、請求項３に記載の方法。
  6. 前記Ｔ１期間が２～８時間、例えば、３～６時間、好ましくは、３～５時間である、請求項１に記載の方法。
  7. 前記方法が、以下の特徴：
    （ｉ）高いシグナル・ノイズ比、ここで、前記シグナル・ノイズ比Ｓ１／Ｓ０は、２超、好ましくは、５超、より好ましくは、１０超であり、ここで、Ｓ１は胚からのシグナルであり、Ｓ０はバックグラウンドからのシグナルである；
    （ｉｉ）低い偽陰性率、ここで、前記偽陰性率は、８％未満、好ましくは、５％未満、より好ましくは、３％未満である；
    （ｉｉｉ）高い正確度、ここで、前記正確度は、８０％以上、好ましくは、８５％以上、より好ましくは、９０％以上である
    のうち１つ以上を有する、請求項１に記載の方法。
  8. 遺伝子検出または染色体検出のためのサンプルを調製する方法であって、以下の工程：
    （ａ）ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養のＤ５～Ｄ６の胚盤胞を含む、第１の胚盤胞培養系を提供すること；
    （ｂ）新鮮胚盤胞培養液を含有する第２の胚盤胞培養系に前記胚盤胞を移し、Ｔ１の期間交換した培養液中で培養して、使用済みの胚盤胞培養液を得ること；
    （ｃ）前記使用済みの胚盤胞培養液を採取して、無細胞の使用済みの胚盤胞培養液、すなわち、検査サンプルを得ること
    を含むことを特徴とする、方法。
  9. 請求項１に記載の方法に使用される生成物の調製における培養モジュールの使用であって、前記培養モジュールは、Ｄ５～Ｄ６に培養胚盤胞の培養液を交換し、かつ前記胚盤胞の後期培養をある期間（Ｔ１）行うように機能する、後期胚盤胞のための培養モジュールを含む、使用。
  10. 胚盤胞の健康状態の診断を支援するためのデバイスであって、
    （ａ）Ｄ５～Ｄ６に培養胚盤胞の培養液を交換し、かつ前記胚盤胞の後期培養をある期間（Ｔ１）行うように機能する、後期胚盤胞のための培養モジュールを包含する、培養モジュールと；
    （ｂ）前記後期胚盤胞培養モジュールから、検査サンプルとしての前記胚盤胞の使用済みの培養液を採取するように機能する、サンプリングモジュールと；
    （ｃ）前記サンプリングモジュールから採取された検査サンプルに対する遺伝子検出を行って、検出結果を得るように機能する、検出モジュールと；
    （ｄ）前記検出結果に基づき前記胚盤胞の健康状態を決定して、前記胚盤胞の健康状態の評価結果を提供するように機能する、評価モジュールと；
    （ｅ）前記胚盤胞の健康状態の評価結果を出力するように機能する、出力モジュールと
    を含むことを特徴とする、デバイス。
  11. 前記方法が、培地交換後および検査サンプル採取前に、前記胚盤胞の透明帯を穿孔することをさらに含む、請求項１～８に記載の方法。
  12. 前記培養モジュールが、培地交換後に前記胚盤胞の透明帯を穿孔するためのデバイスをさらに含む、請求項９に記載の使用および請求項１０に記載のデバイス。
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