CN110846310B - Snp位点集及胚胎核酸样本进行亲缘鉴定的方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因测序领域，具体涉及SNP位点集及胚胎核酸样本进行亲缘鉴定的方法和用途。所述SNP位点集包括SNP001～SNP200中的至少之一。本发明还提供了捕获探针、捕获芯片、引物组，以及基于胚胎核酸样本进行亲缘鉴定的方法和装置。本发明通过对胚胎进行亲权鉴定，可以减少病人移植错误带来的损害，而且具有高度准确性。
Description
技术领域
本发明涉及基因测序领域，具体涉及一种SNP位点集及胚胎核酸样本进行亲缘鉴定的方法和用途。
背景技术
国内不孕不育患者超过4000万，而IVF-ET(In vitro fertilization-Embryotransfer)技术能有效解决这一问题。经国家批准的国内辅助生殖机构超过400家，估计年出生10万名试管婴儿。
对于胚胎，如何进行亲缘鉴定，还需要进一步改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种SNP位点集及胚胎核酸样本进行亲缘鉴定的方法和用途。
本发明的发明人通过研究发现：在将胚胎植入人体之前，对胚胎进行亲权鉴定，一方面能够尽早实现对于胚胎的亲权鉴定，另一方面可以减少错误移植所带来的痛苦。应用于本发明所提供的技术，若在试管婴儿医疗流程中加入胚胎植入前亲权鉴定并出具相关报告，则能有效规范市场和避免移植错误，对患方和医疗机构均具有重要意义。
为此，根据本发明的第一方面，本发明提供了一种SNP位点集，包括：SNP001-SNP200中至少一种。优选包括SNP001-SNP200中的至少50个SNP位点。在本文中“所述SNP位点集”指的是一组包含有不同SNP位点的集合。根据本发明的实施例，所述SNP位点集是包含有SNP001～SNP200这200个SNP位点的任意50个SNP位点以上的SNP位点的集合，如表1所示。本发明所提供的“一种SNP位点集”也可以根据需要，表述为“一组SNP位点”。
表1SNP位点
表1中示出的这些SNP位点覆盖了整个基因组，而且通过对这些SNP位点进行测序能够得到尽可能多的准确分型位点。利用这些SNP位点，对于处在胚胎时期的胚胎的核酸样本进行SNP分型，可以获得准确的分型结果。根据每个SNP位点对应的rs号，可以利用人类参考基因组hg，获得相应的SNP位点的详细信息。
根据本发明的实施例，本发明所提供的SNP位点集，可以包括表1中的任意50种SNP位点；或者可以包括表1中的任意80种SNP位点；或者可以包括表1中的任意100种SNP位点；或者可以包括表1中的任意120种SNP位点；或者可以包括表1中的任意150种SNP位点；或者可以包括表1中的任意180种SNP位点；优选可以包括表1中的全部SNP位点。当所提供的SNP位点集中的所包含的SNP位点越多时，所获得的SNP分型的结果也就越精确。根据本发明的实施例，当所提供的SNP位点集包含表1中的至少50种SNP位点时，可以获得准确的SNP分型结果，用于胚胎植入前的亲权鉴定。
根据本发明的第二方面，本发明提供了一种捕获探针，所述捕获探针特异性识别预定核酸序列，所述预定核酸序列含有根据本发明第一方面所述SNP位点集的至少之一。
根据本发明的实施例，所述捕获探针固为单链寡核苷酸。通过制备包含所述位点基因芯片，并且反转录合成单链寡核苷酸探针，通过液相杂交捕获系统建库和测序，从而可以利用芯片方便快捷捕获SNP001～SNP200中的任意SNP位点。
根据本发明的第三方面，本发明提供了一种捕获芯片，所述捕获芯片携带多个捕获探针，所述捕获探针为根据本发明第二方面所述的捕获探针，并且根据本发明第一方面所述的SNP位点集的每一个SNP位点均有至少一个对应的捕获探针。
根据本发明的第四方面，本发明提供了一种试剂盒，包括选自下列的至少之一：根据本发明第二方面所述的捕获探针；根据本发明第三方面所述的捕获芯片。
根据本发明的第五方面，本发明提供了一种基于胚胎核酸样本进行亲缘鉴定的方法，包括：(1)基于胚胎核酸样本和待测亲本核酸样本，针对本发明第一方面所述SNP位点集，确定所述胚胎的胚胎SNP分型结果以及所述待测亲本的待测亲本SNP分型结果；(2)基于所述胚胎SNP分型结果与所述待测亲本SNP分型结果，以便确定所述胚胎与所述待测亲本之间的亲缘关系。本发明通过对胚胎核酸样本进行SNP分型，对待测亲本核酸样本进行SNP分型，将胚胎SNP分型结果与待测亲本SNP分型结果比对，从而来确定胚胎和待测亲本之间的亲缘关系。
根据本发明的实施例，以上基于胚胎核酸样本进行亲缘鉴定的方法，可以进一步附加如下技术特征：
根据本发明的实施例，所述胚胎来自于体外受精卵形成后不超过14天。根据本发明的实施例，所述胚胎来自于体外受精卵形成后不超过7天。在7天以内即可取形成囊胚滋养层细胞，或者利用胚胎培养液中的游离循环DNA，实现胚胎的SNP分型。
根据本发明的实施例，所述胚胎来自于体外受精卵形成后处于3～6天。
根据本发明的实施例，所述胚胎核酸样本来自于胚胎培养液或者囊胚期滋养外胚层单细胞。在胚胎植入前进行亲权鉴定，通过显微微切割技术取囊胚滋养外胚层1个细胞，或者是利用受精卵培养到第三天卵裂期或第五天囊胚期的培养液中游离循环DNA(cfDNA)，经全基因组扩增后，可以利用用于个体识别的SNP位点集合成的基因芯片进行捕获建库测序，通过生物信息分析得到父母及胚胎的遗传信息从而确认亲子关系。
根据本发明的实施例，所述核酸样本是全基因组。通过对核酸样本的全基因组进行测序，可以解决微量样本不满足建库起始量的问题，可以将pg级别的DNA扩增至μg级别。
根据本发明的实施例，所述胚胎核酸样本预先通过下列至少之一进行全基因组扩增：多重退火环状扩增、多重置换扩增、简并寡核苷酸引物PCR。对全基因组进行扩增，可以实现对单一细胞基因组(5-7pg DNA)甚至单条染色体的扩增，其中应用多重退火环状扩增(MALBAC，multiple annealing and looping-based amplification cycles)、多重置换扩增(MDA)以及简并寡核苷酸引物PCR(DOP-PCR)等技术更是可以方便快捷实现微量DNA的全基因组扩增。其中MALBAC技术采用随机引物与模板DNA杂交，在65℃左右条件下利用链置换聚合酶扩增模板，产生“半扩增子”。随后的扩增循环产生完全的扩增子，完全扩增子形成发夹结构，防止自身成为模板。以此方式来避免扩增子成为模板而只使用原始模板，从而降低扩增错误率。MDA利用随机六碱基引物在多个位点与模板DNA退火，接下来在高扩增效率和保真性的Phi29DNA聚合酶在DNA的多个位点同时起始复制，Phi 29DNA聚合酶，对于模板有很强的模板结合能力，能连续扩增100kb的DNA模板而不从模板上解离。同时这种酶具有3’-5’外切酶活性，以此保证扩增的高保真性。DOP-PCR引物设计3`端为在基因组中频率很高的结合位点，中间为连续简并碱基，5`端为约10碱基固定序列，基因组被随机打断制备OminiPlex文库，形成一系列短且重叠的模板，产物为400bp左右质量为μg级。
根据本发明的实施例，步骤(1)进一步包括：(1-1)基于所述胚胎核酸样本和待测亲本核酸样本，构建测序文库；(1-2)对所述测序文库进行测序，以便获得测序结果；以及(1-3)基于所述测序结果，确定所述胚胎的胚胎SNP分型结果以及所述待测亲本的待测亲本SNP分型结果。
根据本发明的实施例，步骤(1-1)进一步包括：对所述胚胎核酸样本的全基因组序列进行片段化处理；对所述片段化处理产物进行捕获，所述捕获采用本发明第二方面所述的捕获探针，或者本发明第三方面所述的捕获芯片；利用所述捕获产物作为插入片段，构建测序文库。
根据本发明的实施例，所述测序利用下列至少之一的测序平台：Hiseq4000、BGISEQ500、Ion Proton。测序文库的制备方法根据所选择的测序方法的要求进行，测序方法依据所选的测序平台的不同，可选择但不限于Illumina公司的Hisq2000/2500测序平台、Life Technologies公司的Ion Torrent平台、BGI的BGISEQ平台和单分子测序平台，测序方式可以选择单端测序，也可以选择双末端测序，获得的下机数据是测读出来的片段，称为读段(reads)。
根据本发明的实施例，步骤(1-2)进一步包括：对所述测序文库进行测序，获得测序读段；将所述测序读段比对到参考基因组上，确定所述测序读段在所述参考基因组上的位置以及所述SNP位点的基因型；选择测序深度大于50的SNP位点，碱基占位点总深度比例小于0.1或大于0.9的所述SNP位点则判定为纯合位点，碱基占位点总深度比例大于0.3且小于0.7的所述SNP位点则判定为杂合子。对于胚胎分出的单细胞或培养液中cfDNA经全基因组扩增后存在等位基因脱扣和扩增偏好性扩增错误等分型不准确的情况，故本发明在进行SNP分型时，在判断SNP位点纯合或者杂合时，对于纯合杂合的分型标准进行了修改，表现为：针对测序深度大于50的SNP位点，认为碱基占比小于0.1或大于0.9的位点为纯合位点，碱基占比大于0.3且小于0.7的位点为杂合子。以SNP0001，即rs1005533位点为例，若测序总深度为1000×(即测序的reads包含此位点的条数为1000条)，其中测得的G碱基为600×，A碱基为400×，那么G碱基则占测序总深度比例为0.6，由于所得到的碱基占比大于0.3小于0.7，则判断该SNP位点为杂合子。由此，一方面可以通过对多个SNP位点进行测定，获得SNP分型结果，另一方面在判断SNP位点纯合或者杂合时，严格按照如上标准，获得精确的SNP分型结果。
根据本发明的第六方面，本发明提供了一种基于胚胎核酸样本进行亲缘鉴定的装置，包括：SNP分型系统，所述SNP分型系统基于胚胎核酸样本和待测亲本核酸样本，针对权本发明第一方面所述SNP位点集，确定所述胚胎的胚胎SNP分型结果以及所述待测亲本的待测亲本SNP分型结果；SNP分型比对系统，所述SNP分型比对系统与所述SNP分型系统相连，所述SNP分型比对系统基于所述胚胎SNP分型结果与所述待测亲本SNP分型结果，以便确定所述胚胎与所述待测亲本之间的亲缘关系。
根据本发明的实施例，以上基于胚胎核酸样本进行亲缘鉴定的装置可以进一步附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述胚胎来自于体外受精卵形成后不超过14天。
根据本发明的实施例，所述胚胎来自于体外受精卵形成后不超过7天。
根据本发明的实施例，所述胚胎来自于体外受精卵形成后处于3～6天。
根据本发明的实施例，所述胚胎核酸样本来自于胚胎培养液或者囊胚期滋养外胚层单细胞。
根据本发明的实施例，所述核酸样本是全基因组。
根据本发明的实施例，所述胚胎核酸样本预先通过下列至少之一进行全基因组扩增：多重退火环状扩增、多重置换扩增、简并寡核苷酸引物PCR。
根据本发明的实施例，所述SNP分型系统进一步包括：文库构建单元，所述文库构建单元基于所述胚胎核酸样本和待测亲本核酸样本，构建测序文库；测序单元，所述测序单元与所述文库构建单元相连，所述测序单元用于对所述测序文库进行测序，以便获得测序结果；以及SNP分型确定单元，所述SNP分型确定单元与所述测序单元相连，所述SNP分型确定单元基于所述测序结果，确定所述胚胎的胚胎SNP分型结果以及所述待测亲本的待测亲本SNP分型结果。
根据本发明的实施例，所述测序利用下列至少之一的测序平台：Hiseq4000、BGISEQ500、Ion Proton。
本发明所取得的有益效果为：(1)首次提出对胚胎进行亲权鉴定的检测方案，解决了病人移植错误所带来的精神和经济的巨大损害，且在胚胎植入前出具与相应父母的亲权鉴定报告对规范试管婴儿流程很有意义。
(2)高准确性。本发明基于千人基因组计划中汉族人多态性位点数据库，选取大量SNP位点，数量多均匀覆盖全基因组，准确性高，非父排除率可达99.99999999％。胚胎早期体外培养过程中由于细胞凋亡会向培养基中释放微量cfDNA，总体来讲囊胚期培养液中cfDNA含量高于卵裂期，约几十pg。大量SNP位点高深度测序能提高准确分型的多态性位点数，从而判定亲子关系。
(3)使目前对高通量测序数据的SNP分型方法对单细胞测序数据的分型结果存在的5％假阳性降到1％。
附图说明
图1是根据本发明的一个实施例提供的一种基于胚胎核酸样本进行亲缘鉴定的装置示意图。
图2是根据本发明的一个实施例提供的SNP分型系统的示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
在对胎儿进行亲权归属鉴定时，通常需要在将胚胎植入母体6-8周之内，才能对胎儿亲权归属进行检验，如何能够在更早期，在胚胎还未植入母体体内之前，例如对于受精卵或者对于还处于卵裂时期的胚胎进行鉴定，可以减少胚胎植入错误对于当事人身心所带来的巨大伤害。
而且，正如上文中提到的，根据2004年国务院科技部和卫生部发布的《人胚胎干细胞研究伦理指导原则》，对于人胚胎干细胞的研究给出了指导原则，其中之一就是需要遵守“利用体外受精、体细胞核移植、单性复制技术或遗传修饰获得的囊胚，其体外培养期限自受精或核移植开始不得超过14天”。本发明在对胚胎进行亲权鉴定时，可以利用培养14天以内的处于卵裂期或者囊胚的胚胎，取培养液或者单细胞进行SNP分型，即可获得SNP分型结果，符合规定。
本发明的发明人创造性的想到利用单个细胞或者对正处于培养液中的胚胎的核酸样本进行亲缘鉴定，减少错误移植带来的痛苦。然而，传统亲子鉴定技术以及无创产前亲子鉴定通常采用个体的血斑、毛发、口腔拭子等，对检材需求量较高在100pg以上，而单个细胞或胚胎培养液中cfDNA含量通常仅在10pg左右。如何通过少量或者说微量的cfDNA获得胚胎的核酸信息，同时降低由于测序所带来的假阳性率，来获得准确率高的分型结果，来用于亲权鉴定，至关重要。
为此，本发明通过利用汉族人群的SNP数据进行统计分析，筛选获得含有200个SNP位点的SNP位点集，包括SNP001～SNP200中的至少50个位点，如表1所示。这些位点覆盖了整个基因组，而且通过这些SNP位点进行高深度测序能够得到尽可能多的准确分型位点。利用这些SNP位点，对于处在不同时期的胚胎培养液中的cfDNA或者对处于囊胚期的单细胞进行扩增，精确度高。
在本文中，表述方式“胚胎培养液”或者“胚胎培养基”指的是：用于体外培养所述胚胎的基质或者液体。
在本文中，表述方式“cfDNA”指的是在对胚胎进行体外培养的过程中，由胚胎释放到胚胎培养液或者称胚胎培养基中的游离DNA。
根据本发明的实施例，通过体外受精-胚胎移植(IVF-ET)或者卵泡胞浆内单精子显微注射技术(ICSI)方法获得的受精卵，培养到囊胚期，按植入前遗传学筛查(preimplantation genetic screening，PGS)流程取得单细胞，-20°冻存。例如在授精后的第5～6天，囊胚充分扩张，在远离内细胞团的部位取囊胚期细胞。
根据本发明的实施例，所述胚胎培养液为将所述胚胎培养至囊胚期或者卵裂期的培养液滴。收集培养液，将颗粒细胞彻底去除干净是关键，确保培养液中无外源DNA干扰。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种基于胚胎核酸样本进行亲缘鉴定的装置，如图1所示，包括SNP分型系统和SNP分型比对系统，所述SNP分型比对系统和所述SNP分型系统相连；所述SNP分型系统基于胚胎核酸样本和待测亲本核酸样本，针对本发明所述的SNP位点集，确定所述胚胎的胚胎SNP分型结果以及所述待测亲本的待测亲本SNP分型结果；所述SNP分型比对系统基于所述胚胎SNP分型结果与所述待测亲本SNP分型结果，以便确定所述胚胎与所述待测亲本之间的亲缘关系。
根据本发明的实施例，所述SNP分型系统如图2所示，进一步包括：文库构建单元，测序单元以及SNP分型确定单元；所述测序单元与所述文库构建单元相连，所述SNP分型确定单元与所述测序单元相连；所述文库构建单元基于所述胚胎核酸样本和待测亲本核酸样本，构建测序文库；所述测序单元用于对所述测序文库进行测序，以便获得测序结果；所述SNP分型确定单元基于所述测序结果，确定所述胚胎的胚胎SNP分型结果以及所述待测亲本的待测亲本SNP分型结果。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
通过如下方法筛选获得了一组用于STR分型鉴定的SNP位点集，包括：
第一，对千人基因组计划中汉族人群的SNP数据做统计分析后，按照杂合度>0.4，次等位基因频率>0.4的条件筛选大量SNP位点；其中次等位基因即两个等位基因中频率较小的那个等位基因。
第二，将通过第一步得到的所有SNP位点按照次等位基因频率进行排序，取前200个位点，如表1所示。
通过本发明获得的这200个SNP位点覆盖了整个基因组，针对无论是单细胞还是胚胎培养液中cfDNA含量过低，cfDNA扩增效率低的问题，利用这些SNP位点进行测序能得到尽可能多的准确的分型结果。通过对这些SNP位点的特定组合，能够实现SNP分型，从而用来判断亲子关系。
然后以表2中给出的50个SNP位点为例，测定了这些SNP位点的随机匹配概率以及非父排除率，测定结果表明这些SNP位点的随机匹配概率在1.30*10-21以上，非父排除率在1～4.18*10-5以上。
表2 50个SNP位点
| 位点 | 位点 | 位点 | 位点 | 位点 |
| rs1005533 | rs1357617 | rs1886510 | rs2831700 | rs8037429 |
| rs1015250 | rs1360288 | rs1979255 | rs354439 | rs826472 |
| rs1024116 | rs1382387 | rs2016276 | rs717302 | rs873196 |
| rs1029047 | rs1413212 | rs2040411 | rs719366 | rs876724 |
| rs1031825 | rs1427585 | rs2046361 | rs722098 | rs891700 |
| rs10495407 | rs9416589 | rs2056277 | rs727811 | rs901398 |
| rs11985445 | rs1454361 | rs2076848 | rs729172 | rs907100 |
| rs12543529 | rs1463729 | rs2107612 | rs733164 | rs914165 |
| rs9478708 | rs1493232 | rs2111980 | rs735155 | rs917118 |
| rs1355366 | rs1528460 | rs251934 | rs737681 | rs964681 |
由此可见，利用本发明提供的SNP位点，根据碱基之间的特异性配对的规律，可以设计捕获探针，从而特异性识别预定的核酸序列，而这些核酸序列就包括表1中的SNP位点。
实施例2
按照如下方法得到分型数据。
步骤一、囊胚期外胚滋养层单细胞或者胚胎培养液的采集
按PGS流程取得的单个细胞转移至装有裂解液的PCR小管中，按照如下步骤进行全基因组扩增、建库、测序、SNP分型分析等。
如果以胚胎培养液作为分型的样本，由于胚胎培养液中cfDNA的含量少，且自然降解，因此可以至少采集10μL以上的胚胎培养液。在按照如下步骤进行全基因组扩增、建库、测序、SNP分型分析的过程中，所用到的试剂的体积可以根据实际情况进行调整。
步骤二、全基因组扩增(以亿康MALBAC试剂盒为例，货号为KT110700110/YK001A)
裂解
| 反应成分 | 体积 |
| 单细胞 | ﹤1μL |
| 细胞裂解缓冲液(Cell lysis buffer) | 5μL |
| 细胞裂解酶(Cell lysis enzyme) | 0.1μL |
反应程序：
| 50℃ | 90min |
| 80℃ | 10min |
| 4℃ | hold |
通过裂解，离心后得到上层清液，上层清液中仅含有来自于胚胎中的核酸，即裂解产物，然后进行Malbac预扩增以及指数扩增。通过预扩增，得到首尾互补的环状单链DNA，从而可以减少扩增的偏倚性，然后通过指数扩增获得大量扩增产物。
Malbac预扩增
| 反应成分 | 体积 |
| 上一步裂解产物 | 5μL |
| Pre-Amp buffer | 30μL |
| Pre-Amp enzyme | 1μL |
反应程序：
指数式扩增
| 反应成分 | 体积 |
| 上一步扩增产物 | 35μL |
| Amplification buffer | 30μL |
| Amplification enzyme | 0.8μL |
反应程序：
将以上扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，从电泳结果可以看出，经过Malbac试剂盒扩增的产物，大小在200-2000bp左右，电泳结果显示为弥散带。
步骤三、扩增产物纯化及物理打断
对步骤二得到的扩增产物，利用1.8倍体积Ampure XP beads纯化，并用3.0荧光定量仪检测浓度。具体包括：取扩增产物1μg用TE补齐至80μL，用covaris打断仪按说明书超声破碎片段至250bp左右，用1.8倍体积Ampure XP beads纯化，并用3.0荧光定量仪检测浓度。同时将破碎后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示破碎后的条带大小在250bp左右。
步骤四、胚胎父母gDNA提取
基因组DNA提取：父母全血用QIAGEN试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)提取基因组DNA，得到父母基因组DNA，用3.0荧光定量仪检测。用2％琼脂糖凝胶，120V电压，跑胶35min，检测DNA质量，确保基因组DNA完整未降解。从所得到的琼脂糖凝胶结果图来看，父本和母本的基因组DNA大小均在23kb左右，说明所提取得到的基因组DNA完整未发生降解。然后将父本和母本的基因组DNA按照步骤三的方法进行物理打断，将物理打断后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示破碎后的条带大小在250左右。
然后按照如下步骤，分别对来自于囊胚期外胚滋养层单细胞的破碎后的DNA片段(即步骤三得到的DNA片段)以及来自于父本和母本的破碎的DNA片段(即步骤四得到的DNA片段)进行测序文库的构建、测序以及数据分析。
步骤五、Hiseq文库建立、上机测序
文库建立
①末端修复：
| 反应成分 | 体积 |
| 打断后DNA(50ng) | 30μL |
| Nuclease Free Water | 12.5μL |
| 10×PNK Buffer | 5μL |
| dNTP Mix(10mM) | 1μL |
| T4 DNA Polymerase | 0.5μL |
| T4 PNK | 0.5μL |
| Klenow Fragment | 0.5μL |
反应程序：
| 20℃ | 30min |
反应完后，将反应产物用1.8倍体积Ampure XP beads纯化。
②末端修复后加dATP：
| 反应成分 | 体积 |
| 修复后产物 | 34μL |
| Nuclease Free Water | 8μL |
| 10×Blue Buffer | 5μL |
| dATP(5mM) | 2μL |
| Klenow 3’-5’exo- | 1μL |
反应程序：
| 37℃ | 30min |
③接头连接：
| 反应成分 | 体积 |
| 加“A”后的DNA样品 | 22.5μL |
| 2x Rapid Ligation buffer | 25μL |
| PE Adapter oligo mix(40uM) | 0.5μL |
| T4DNA Ligase(Rapid) | 2μL |
反应程序：
| 20℃ | 15min |
反应完后，将反应产物用1.5倍体积Ampure XP beads纯化，并用Nanodrop检测浓度。
④预扩增：
| 反应成分 | 体积 |
| 连接后产物 | 32.2μL |
| index primer(10uM) | 4μL |
| 10×Pfx Amplification Buffer | 5μL |
| dNTP Solution Set(10mM) | 2μL |
| MgSO4(50mM) | 2μL |
| Index P1(10μM公用引物) | 4μL |
| Platinum Pfx DNA polymerase(2.5U) | 0.8μL |
反应程序:
反应完用1.5倍体积Ampure XP beads纯化。用3.0荧光定量仪检测浓度。
⑤杂交洗脱
参照《SureSelectXT Target Enrichment System for Illumina Paired-EndMultiplexed Sequencing Library》流程进行杂交洗脱。
⑥用Agilent2100和qPCR检测片段大小和文库浓度，然后利用BGISEQ 500测序平台进行测序。
⑦下机数据分析
通过SOAPnuke fliter过滤掉测序数据中残留的接头，低质量reads；通过bwa将Clean reads比对到参考序列上；通过samtools将比对之后的sam文件转化为bam格式，并排序；通过picard里的MarkDuplicates标出完全相同的read，去掉PCR偏向性扩增产物，最后通过GATK里的UnifiedGenotyper进行SNP分型分析。
即常规的SNP分型方法主要是以比对+分型模式(bwa/bowtie+samtools/gatk)，先通过将测序序列(Reads)比对到参考基因组上，确定序列的相对位置，再依次读取各位点的碱基类型，最终确认基因型。本发明所提供的SNP分型方法在常规的SNP分型方法的基础上，进一步基于如下规则来判断SNP位点的纯合和杂合属性：即选取测序深度大于50X的位点，碱基与位点总深度比例大于0.3，且小于0.7的，则认为是杂合子；碱基与位点总深度比例小于0.1或者大于0.9，则认为是纯合子。而对于碱基与位点总深度比例在0.1～0.3以及0.7～0.9之间的位点，由于并不确定是否是由于扩增不平衡等原因所导致的，所以直接将这些位点舍弃。
实施例3
利用炎黄单细胞，应用实施例2给出的方法，结合表1中示出的200个SNP位点，进行SNP分型检测。
A、炎黄单细胞测试SNP分型准确性：对比新旧SNP分型方法
用炎黄细胞(基因库细胞中心培养)作为阳性对照(其SNP分型结果已公开)，平行测试4个炎黄单细胞，按照实施例2的实验流程，将测序结果按常规SNP分型方法和本发明研发的SNP分型方法进行对比，其中表3为测序数据。
表3测序数据统计表
| 样本编号 | RawReads | CleanReads | 靶序列比例 | 平均深度(x) |
| malbac-1 | 5.35E+07 | 2.14E+07 | 4.68％ | 166 |
| malbac-2 | 3.79E+07 | 1.51E+07 | 4.76％ | 120 |
| malbac-3 | 5.07E+07 | 1.92E+07 | 3.68％ | 116 |
| malbac-4 | 7.23E+07 | 2.81E+07 | 4.73％ | 221 |
其中，表3中，靶序列比例代表的含义为经过目标SNP位点的序列占总下机序列的百分比。
选取深度大于50的位点，分别将两种分型结果与炎黄基因组进行比较，并统计分型错误率，见表4。其中，表4中共有位点数代表的是每种分型方法得到的位点与基因组上SNP位点的交集数，共有杂合位点数代表的是每种分型方法得到的杂合位点与基因组上SNP位点的交集数。不一致比率代表的是共有位点中每种分型方法得到的分型结果与基因组不一致的位点个数所占的比例，即利用各分型方法得到的分型结果与基因组不一致的位点个数占共有位点数的比值。不一致比率的大小可以用来表征各分型方法的错误率。
表4不同分型方法下深度大于50的位点统计表
从表4可以看出，通过比较深度50的位点在两种分型方法下的分型结果，可以发现它们的错误率的平均值分别为5.37％(将9.68％，3.24％，4.58％以及3.97％加和，求平均值)和1.97％(将5.54％，0.47％，1.03％以及0.84％加和，求平均值)，说明通过本发明所提供的SNP分型方法能明显降低错误率。通过选取测序深度大于50的SNP位点，基于如下标准判断纯合和杂合属性：即碱基占位点总深度比例小于0.1或大于0.9的所述SNP位点判定为纯合位点，碱基占位点总深度比例大于0.3且小于0.7的所述SNP位点判定为杂合子，从而使目前对高通量测序数据的SNP分型方法对单细胞测序数据的分型结果存在的5％假阳性降到1％。
实施例4新SNP分型方法在家系中验证
选择一个胚胎家系，验证新分型方法在胚胎亲权鉴定中的准确性，在进行测试之前已经签订了知情同意书。
对测试父母提取基因组DNA建库测序，按常规流程得到SNP分型；
按照实施例2给出的方法，对测试胚胎通过单细胞全基因组扩增后建库测序，用新SNP分型方法(即本发明所提供的SNP分型方法)得到分型结果，其位点数目及杂合度见表5。其中杂合度即为所检测出的杂合位点的数目与所检测得到的总位点数的比值。
表5位点信息统计表
| 总位点数 | 杂合位点 | 杂合度 | |
| 父亲 | 195 | 93 | 47.69％ |
| 母亲 | 186 | 87 | 46.77％ |
| 胚胎 | 160 | 57 | 35.63％ |
根据SNP位点分型结果进行三联体判定，从得到的鉴定结果可知MALBAC扩增存在约25％的假阴性(即等位基因脱扣)，故选取胚胎的杂合位点进行亲子鉴定。父母双方和胚胎共有51个杂合位点被检出，根据千人基因组数据库等位基因频率进行计算法医学参数，其CPI(累计亲权指数)为3.29E+07，CPE(累计非父排除率)为1-2.25E-5，见表6。其中累计亲权指数通过公式(1)和公式(2)计算得到，累计非父排除率通过公式(3)和公式(4)计算得到。
CPI＝ΠPIk (2)
CPE＝1-Π(1-PEk) (4)
注：Pi，Pj指位点的等位基因，k指所用位点数目。
表6家系中CPI和CPE计算
| 共有杂合 | 冲突杂合 | CPI | CPE |
| 51 | 0 | 3.29E+07 | 1-2.25E-5 |
因此，本发明通过炎黄单细胞测试新SNP分型方法准确性，并在家系中验证，计算法医学参数CPI和CPE得到亲权鉴定结果。本发明在位点选择、实验流程搭建和信息分析方法上建立一套适用于胚胎亲子鉴定的流程，可实现胚胎移植前亲权鉴定，防止由于错植而带来患者精神和经济上的巨大损失，对规范试管婴儿市场很有意义。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“中心”、“纵向”、“横向”、“长度”、“宽度”、“厚度”、“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”“内”、“外”、“顺时针”、“逆时针”、“轴向”、“径向”、“周向”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接或彼此可通讯；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以是第一和第二特征直接接触，或第一和第二特征通过中间媒介间接接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”可是第一特征在第二特征正上方或斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”可以是第一特征在第二特征正下方或斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (11)
1.一种基于胚胎核酸样本进行亲缘鉴定的方法，其特征在于，包括：
(1)基于胚胎核酸样本和待测亲本核酸样本，针对SNP位点集确定所述胚胎的胚胎SNP分型结果以及所述待测亲本的待测亲本SNP分型结果，所述SNP位点集为下表SNP位点：
(2)基于所述胚胎SNP分型结果与所述待测亲本SNP分型结果，以便确定所述胚胎与所述待测亲本之间的亲缘关系；
所述胚胎来自于体外受精卵形成后不超过14天；
步骤(1)进一步包括：
(1-1)基于所述胚胎核酸样本和待测亲本核酸样本，构建测序文库；
(1-2)对所述测序文库进行测序，以便获得测序结果；
(1-3)基于所述测序结果，确定所述胚胎的胚胎SNP分型结果以及所述待测亲本的待测亲本SNP分型结果；
步骤(1-2)进一步包括：
对所述测序文库进行测序，获得测序读段；
将所述测序读段比对到参考基因组上，确定所述测序读段在所述参考基因组上的位置以及所述SNP位点的基因型；
选择测序深度大于50的SNP位点，碱基占位点总深度比例小于0.1或大于0.9的所述SNP位点则判定为纯合位点，碱基占位点总深度比例大于0.3且小于0.7的所述SNP位点则判定为杂合子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，利用捕获探针特异性识别预定核酸序列，所述预定核酸序列含有所述SNP位点集。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述捕获探针为单链寡核苷酸。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，利用捕获芯片携带多个所述的捕获探针，并且所述的SNP位点集的每一个SNP位点均有至少一个对应的捕获探针。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胚胎来自于体外受精卵形成后不超过7天。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胚胎来自于体外受精卵形成后处于3～6天。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胚胎核酸样本来自于胚胎培养液或者囊胚期外胚滋养层单细胞。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胚胎核酸样本和所述待测亲本核酸样本是全基因组。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胚胎核酸样本预先通过下列至少之一进行全基因组扩增：
多重退火环状扩增、多重置换扩增、简并寡核苷酸引物PCR。
10.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤(1-1)进一步包括：
对所述胚胎核酸样本的全基因组序列进行片段化处理；
对所述片段化处理产物进行捕获，所述捕获采用所述的捕获探针，或者所述的捕获芯片；
利用所述捕获产物作为插入片段，构建测序文库。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述测序利用下列至少之一的测序平台：Hiseq4000、BGISEQ500、Ion Proton。
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