CN108265051A - 用于从母体捕获和分离胎儿细胞的无创方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于从母体捕获和分离胎儿细胞的无创方法和试剂盒。具体来说，本发明涉及胎儿滋养层细胞特异性表达基因的启动子和胎儿有核红细胞特异性表达基因的启动子，以及重组I型单纯疱疹病毒，所述重组I型单纯疱疹病毒剔除了与致病性相关的基因片段，并且将病毒基因组ICP野生型启动子替换为胎儿滋养层细胞特异性表达基因或有核红细胞特异性表达基因的启动子，并且其中插入了用于示踪重组I型单纯疱疹病毒的标记物。

Description

用于从母体捕获和分离胎儿细胞的无创方法和试剂盒
技术领域
本发明提供了一种新型的产前筛查和检测方法和试剂盒，特别是涉及一种可以在妊娠早期实现胎儿细胞的捕获和分离的无创方法和试剂盒，从而降低生育染色体疾病或者基因异常患儿的风险。
背景技术
妊娠早期进行产前诊断以检测胎儿的基因或者染色体异常等遗传缺陷非常重要。目前，广泛使用的三种产前筛查检测方法主要为：羊水穿刺术、绒毛膜绒毛取样术以及胎儿游离DNA(cfDNA)检测。但是，目前的这三种技术都存在着一定的局限性。羊水穿刺术和绒毛膜绒毛取样术都是侵入性技术，有一定的致胎儿流产率和/或导致胎儿损伤。此外，羊水穿刺术和绒毛膜绒毛取样术都只能在孕期较晚的时间(8-20周或以上)才能进行筛查和检测。
利用母体血液样品来实施胎儿的产前筛查将是非常有利的选择。只有非常有限数量的胎儿细胞存在于母体血液中阻碍了将母体循环中的胎儿细胞用于产前筛查目的的可行性。胎儿cfDNA检测是最近建立起来的利用母体外周血的非侵入性产前检测诊断技术，然而这项技术无法可靠地检测到胎儿基因组中的微小变化，尤其是一些导致严重疾病或发育障碍的基因缺失。母体外周血中胎儿cfDNA含量极少，也给筛查检测结果带来了一定的不稳定性。
现有的产前筛查检测方法具有检测窗口期较晚、存在一定的检测危险性、检出率低以及检测灵敏度差的缺点。因此，急需一种能在妊娠早期准确、灵敏、快速并且特异性地从母体体液捕获和分离胎儿细胞从而能对胎儿的染色体和基因进行检测实现早期产前筛查的方法和试剂盒。尤其是需 要从母体血液样品中分离胎儿细胞的改进方法以帮助产前筛查。
发明内容
本发明就是基于重组I型单纯疱疹病毒在胎儿滋养层细胞或有核红细胞细胞中的特异性生长增殖，所述重组I型单纯疱疹病毒剔除了ICP34.5的基因，并将病毒基因组ICP4野生型启动子替换为胎儿滋养层细胞或有核红细胞特异性表达基因的启动子，并且在剔除所述基因的位置插入了荧光蛋白表达盒以便于示踪。因此，本发明首次提出构建重组I型单纯疱疹病毒用于从母体体液捕获和分离胎儿细胞，用于妊娠期，尤其是妊娠早期无创的产前筛查和检测。
本发明的发明人通过对胎儿细胞及母体细胞基因表达谱的分析，筛选出20个胎儿滋养层细胞特异性表达而母体细胞不表达的基因，以及3个胎儿有核红细胞特异性表达而母体细胞不表达的基因。用上述基因的启动子活性调控重组病毒的表达复制可以实现重组I型单纯疱疹病毒在胎儿滋养层细胞或胎儿有核红细胞中特异性地复制增殖，而在母体任何细胞内都不复制增殖。
第一方面，本发明提供了胎儿滋养层细胞特异性表达基因的启动子。优选地，所述启动子为选自SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:20的任一项的启动子，或与选自SEQ ID NO:1-SEQID NO:20的任一项的启动子有至少80％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少98％，优选至少99％同一性的启动子序列。
第二方面，本发明提供了胎儿有核红细胞特异性表达基因的启动子。优选地，所述启动子为选自SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:23的任一项的启动子，或与选自SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:23的任一项的启动子有至少80％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少98％，优选至少99％同一性的启动子序列。
第三方面，本发明提供了一种重组I型单纯疱疹病毒，所述病毒剔除了与致病性相关的基因片段，并且将病毒基因组ICP野生型启动子替换为胎儿滋养层细胞特异性表达基因或有核红细胞特异性表达基因的启动子，并且其中插入了用于示踪重组I型单纯疱疹病毒的标记物。优选地，所述重组I型单纯疱疹病毒剔除了与致病性相关的ICP34.5基因。
优选地，将病毒基因组ICP4野生型启动子替换为胎儿滋养层细胞特异性表达基因或有核红细胞特异性表达基因的启动子。优选地，所述胎儿滋养层细胞特异性表达基因的启动子为选自SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:20的任一项的启动子，或与选自SEQ ID NO:1-SEQID NO:20的任一项的启动子有至少80％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少98％，优选至少99％同一性的启动子序列。优选地，胎儿有核红细胞特异性表达基因的启动子为选自SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:23的任一项的启动子，或与选自SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:23的任一项的启动子有至少80％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少98％，优选至少99％同一性的启动子序列。
优选地，所述重组I型单纯疱疹病毒中在剔除ICP34.5基因的位置处插入了荧光蛋白表达盒。由此，病毒在复制增殖过程中可以特异性的表达荧光蛋白，从而可以简单快速的区分母体细胞与胎儿细胞，进而实现特异性地捕获、分离胎儿细胞。所述荧光蛋白表达盒优选自绿色荧光蛋白表达盒、青色荧光蛋白表达盒、红色荧光蛋白表达盒和黄色荧光蛋白表达盒。
第四方面，本发明提供了一种用于制备本发明的重组I型单纯疱疹病毒的制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)将野生型I型单纯疱疹病毒株的基因组ICP4野生型启动子替换为胎儿滋养层细胞的启动子或有核红细胞特异性表达基因的启动子；(2)从野生型I型单纯疱疹病毒株中剔除致病基因；以及(3)在基因组中插入荧光蛋白表达盒。
优选地，所述野生型I型单纯疱疹病毒株为野生型I型单纯疱疹病毒17+株。
优选地，所述胎儿滋养层细胞特异性表达基因的启动子为选自SEQ ID NO:1-SEQID NO:20的任一项的启动子，或与选自SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:20的任一项的启动子有至少80％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少98％，优选至少99％同一性的启动子序列。
优选地，所述胎儿有核红细胞特异性表达基因的启动子为选自SEQ ID NO:21-SEQID NO:23的任一项的启动子，或与选自SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:23的任一项的启动子有至少80％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少98％，优选至少99％同一性的启动子序列。
优选地，从野生型I型单纯疱疹病毒株中剔除致病基因ICP34.5基因。
更具体地，本发明提供了一种用于制备本发明的重组I型单纯疱疹病毒的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)提取野生型单纯疱疹病毒I型株的全长病毒DNA；
(2)构建胎儿滋养层细胞或胎儿有核红细胞特异性表达基因的启动子连接ICP4基因的质粒；
(3)构建ICP4稳定表达的BHK-ICP4细胞株；
(4)构建插入了荧光蛋白表达盒eGFP，并且含有ICP4基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的质粒；
(5)构建剔除ICP4基因的重组I型单纯疱疹病毒；
(6)构建替换ICP4基因野生型启动子的重组I型单纯疱疹病毒；
(7)提取步骤(6)获得的重组I型单纯疱疹病毒的全长病毒DNA；
(8)构建含有ICP34.5基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的质粒；以及
(9)构建剔除ICP34.5基因的重组I型单纯疱疹病毒。
更具体地，本发明提供了一种用于制备本发明的重组I型单纯疱疹病 毒的制备方法，所述方法包括如下步骤：
(1)提取野生型单纯疱疹病毒I型17+株的全长病毒DNA；
(2)构建pcDNA3-NHN-Np-ICP4质粒：
(2.1)构建pcDNA3-NHN质粒，将合成的核苷酸序列NheI-HpaI-NheI插入pcDNA3的EcoRV位点即获得pcDNA3-NHN质粒；和
(2.2)将基因合成的胎儿滋养层细胞(20个特异基因)或有核红细胞(3个特异基因)特异性表达基因的启动子的单链DNA退火形成双链DNA，并分别插入(2.1)获得的pcDNA3-NHN的NruI/HindIII的位点，形成一系列的质粒，统称为pcDNA3-NHN-Np；
(2.3)使用下表1所示的引物，以步骤A得到的全长病毒DNA为模板，分三段PCR扩增ICP4基因：
表1
(2.4)将步骤(2.3)获得的ICP4-1st序列用EcoRI/BsrGI处理，ICP4-2nd序列用BsrGI/PvuI处理，ICP4-3rd序列用PvuI/XhoI处理；和
(2.5)将步骤(2.4)获得的基因序列插入步骤(2.2)获得的pcDNA3-NHN-Np质粒的EcoRI/XhoI位点，得到胎儿滋养层细胞(20个特异基因)或有核红细胞(3个特异基因)特异性表达基因的启动子连接ICP4基因的pcDNA3-NHN-Np-ICP4质粒；
(3)构建ICP4稳定表达的BHK-ICP4细胞株：
(3.1)构建pcDNA3-CMV-ICP4质粒，将(2.5)获得的pcDNA3-NHN-Np-ICP4质粒，用EcoRI/XhoI处理，获得ICP4基因表达盒，插入pcDNA3质粒的EcoRI/XhoI位点，获得pcDNA3-CMV-ICP4质粒；和
(3.2)将(3.1)获得的pcDNA3-CMV-ICP4质粒，转染BHK细胞，筛选 获得稳定细胞株BHK-ICP4；
(4)将荧光蛋白表达盒eGFP插入含有ICP4基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的pICP4del质粒的EcoRV位点，得到pICP4delGFP质粒；
(5)构建剔除ICP4基因的重组I型单纯疱疹病毒oHSV1-d4GFP：
(5.1)将步骤(1)得到的野生型单纯疱疹病毒I型17+株的全长病毒DNA与步骤(4)得到的pICP4delGFP质粒共转染(3.2)获得的BHK-ICP4细胞，全长病毒DNA上的ICP4基因与pICP4delGFP质粒上的荧光蛋白表达盒发生同源重组，发生重组病毒的毒斑发荧光；和
(5.2)挑选荧光毒斑，纯化出重组I型单纯疱疹病毒oHSV1-d4GFP；
(6)构建替换ICP4基因野生型启动子的重组I型单纯疱疹病毒17+NpICP4：
(6.1)将(2.5)获得的pcDNA3-NHN-Np-ICP4质粒用PmeI/HpaI处理，获得Np-ICP4基因表达盒，插入pICP4del质粒的SaII/BE位点，获得pICP4del-Np-ICP4质粒；
(6.2)将步骤(5.2)得到的重组I型单纯疱疹病毒oHSV1-d4GFP病毒DNA与步骤(6.1)得到的pICP4del-Np-ICP4质粒共转染BHK-ICP4细胞，oHSV1-d4GFP荧光蛋白质表达盒与pcDNA3-NHN-Np-ICP4质粒上的胎儿滋养层细胞(20个特异基因)或有核红细胞(3个特异基因)特异性表达基因的启动子连接ICP4基因表达盒发生同源重组，发生重组的病毒的毒斑无荧光产生；和
(6.3)挑选无荧光毒斑，纯化出重组I型单纯疱疹病毒17+NpICP4；
(7)提取步骤(6.3)获得的重组I型单纯疱疹病毒17+NpICP4的全长病毒DNA；
(8)构建含有ICP34.5基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的质粒pH2dI34.5：
(8.1)使用下表2所示的引物，以步骤(1)得到的全长病毒DNA为模板，PCR扩增ICP34.5基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列；
表2
(8.2)将步骤(8.1)扩增所得PCR产物上游侧翼区序列插入到pSP72质粒的PvuII/XbaI位点，得到pSP72H2d34.5US质粒；
(8.3)将步骤(8.1)扩增所得PCR产物下游侧翼区序列插入到步骤(8.2)获得的pSP72H2d34.5US质粒的EcoRV/BglII位点，得到含ICP34.5基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的pH2d34.5质粒；和
(8.4)将荧光蛋白表达盒插入到步骤(8.3)获得的pH2d34.5质粒的EcoRV位点，得到pH2d34.5GFP质粒；
(9)构建剔除ICP34.5基因的重组I型单纯疱疹病毒17+NpICP4d34.5GFP：
(9.1)将步骤(7)得到的重组I型单纯疱疹病毒17+NpICP4的全长病毒DNA与步骤(8.4)得到的pH2d34.5GFP质粒共转染BHK-ICP4细胞，全长病毒DNA上的ICP34.5基因与pH2d34.5荧光蛋白质粒上的荧光蛋白表达盒发生同源重组，发生重组的病毒的毒斑发荧光；和
(9.2)挑选荧光毒斑，纯化出系列重组I型单纯疱疹病毒17+NpICP4d34.5GFP。
第五方面，本发明提供了一种由第四方面的制备方法制备的重组I型单纯疱疹病毒。
第六方面，本发明提供了一种用于妊娠期，优选用于妊娠早期的产前筛查诊断试剂盒，其中，所述试剂盒中包括本发明的重组I型单纯疱疹病毒。优选地，本发明的试剂盒中包括上述第三方面中所述的重组I型单纯疱疹病毒。优选地，本发明的试剂盒中包括由第四方面的制备方法制备的重组I型单纯疱疹病毒。
本发明的试剂盒中，除了满足滴度的本发明的重组I型单纯疱疹病毒，还可以具有红细胞裂解液和磷酸缓冲液，或者聚蔗糖-泛影葡胺和磷酸缓冲液。优选地，病毒滴度为1×107cfu。优选地，红细胞裂解液为pH7，由0.15M氯化铵、10nM碳酸氢钾和1nM乙二胺四乙酸组成，磷酸缓冲液pH为7.3。优选地，聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Urografin)的比重为1.077±0.001千克/立方米，磷酸缓冲液的pH为7.3。优选地，本发明的试剂盒中，也可以只由满足一定滴度的本发明的重组I型单纯疱疹病毒构成。
第七方面，本发明提供了一种用于从妊娠期，优选妊娠早期母体血液样品中分离胎儿细胞方法，所述方法包括如下步骤：(1)采集一定孕周的孕妇的外周血，加入红细胞裂解液；(2)待红细胞裂解后，离心，磷酸缓冲液(PBS)洗涤后，将细胞重悬浮于RPMI-1640中；(3)将步骤(2)得到的细胞与本发明重组I型单纯疱疹病毒悬液(106Pfu/ml)混合并加入多孔培养板的孔中；(4)将多孔培养板孵育于含5％CO2的37℃孵箱内；(5)24小时后，收集细胞，洗涤后重悬浮于PBS中，加入荧光标记的CD45抗体(荧光标记的白细胞表面标志CD45抗体)，室温下避光孵育30分钟；以及(6)用PBS轻轻洗涤细胞，重悬后，流式分选CD45-/GFP+细胞，获得胎儿细胞。
更具体地，本发明提供了一种用于从妊娠期，优选妊娠早期母体血液样品中分离胎儿细胞方法，所述方法包括如下步骤：
(1)用EDTA抗凝管取8孕周孕妇外周血5ml，加入45ml红细胞裂解液，室温下孵育10分钟；
(2)待红细胞裂解后，离心(800g，10分钟)；
(3)去上清，将细胞沉淀重悬浮于10ml pH值为7.3的磷酸缓冲液(PBS)中，离心(800g，10分钟)；
(4)去上清，将细胞沉淀重悬浮于2ml RPMI-1640中；
(5)将2ml由步骤(4)得到的细胞与0.1ml本发明重组I型单纯性疱疹病毒悬液(106Pfu/ml)混合并加入6孔培养板的孔中；
(6)将培养板孵育于含5％CO2的37℃孵箱内；
(7)24小时后，收集细胞，将细胞吹打吸至离心管中，离心(500g，5分钟)；
(8)弃掉上清液，每支离心管加3ml PBS轻轻洗涤细胞，离心(500g，5分钟)；
(9)去上清，将细胞沉淀重悬浮于0.4ml PBS中，加入100μl荧光标记的CD45抗体(荧光标记的白细胞表面标志CD45抗体，室温下避光孵育30分钟；
(10)30分钟后每支离心管用4ml PBS轻轻洗涤，离心(500g，5分钟)；以及
(11)离心完成后弃掉上清，加PBS重悬，流式分选CD45-/GFP+细胞。
优选地，可以采用本发明的试剂盒进行上述方法，从而从妊娠期，优选妊娠早期母体血液样品中分离胎儿细胞。
第八方面，本发明提供了上述第三方面的重组I型单纯疱疹病毒或者由第四方面的制备方法制备的重组I型单纯疱疹病毒在从妊娠期，优选妊娠早期母体血液样品中分离胎儿细胞中的应用。
第九方面，本发明提供了上述第三方面的重组I型单纯疱疹病毒或者由第四方面的制备方法制备的重组I型单纯疱疹病毒在产前筛查中的应用。
第十方面，本发明提供了第六方面的试剂盒在从妊娠期，优选妊娠早期母体血液样品中分离胎儿细胞中的应用。
第十一方面，本发明提供了第六方面的试剂盒在产前筛查中的应用。
综上，本发明所述的重组I型单纯疱疹病毒可以从任何含有活性滋养层细胞或有核红细胞待测样本，例如母体外周血和宫颈巴氏涂片，特异性的捕获极微量的活性滋养层细胞或有核红细胞，且具有操作简单，快速，可重复性好，捕获灵敏度及特异性高的特点。
本发明提供了用于准确、灵敏，特异及安全地捕获和分离胎儿细胞的重组I型单纯疱疹病毒和试剂盒，以及他们的制备方法和应用。由于滋养层细胞发育形成胎盘而有核红细胞为胎儿循环系统细胞，它们携带有与发育的胚胎和胎儿相同的基因组。因此，捕获和分离到滋养层细胞或有核红细胞，并提取细胞中的DNA，可以提供与其他产前检测方法相同或更加全面的信息，而且检测时间更早，侵入性更小。
特异性捕获滋养层细胞或有核红细胞是本发明的核心内容。通过对胎儿细胞及母体细胞基因表达谱的分析，筛选出20个胎儿滋养层细胞和3个胎儿有核红细胞特异性表达而母体细胞不表达的基因。用上述基因启动子活性调控病毒的表达复制可以特异性的做到重组I型单纯疱疹病毒在胎儿滋养层细胞或胎儿有核红细胞中复制增殖，而在母体任何细胞内都不复制增殖。病毒在复制增殖过程中可以特异性的表达荧光蛋白，从而可以简单快速的区分母体细胞与胎儿细胞，实现特异性地捕获分离胎儿细胞。
本发明克服了现有的产前筛查检测手段检测窗口期较晚、存在一定的检测危险性、检出率低以及检测灵敏度差的缺点，提供一系列重组I型单纯疱疹病毒，使用该病毒可以快速、准确、灵敏并特异地捕获和分离稀有胎儿细胞，实现早期产前筛查。
附图说明
图1：图示了构建pICP4delGFP质粒；构建剔除ICP4基因的重组I型单纯疱疹病毒(oHSV1-d4GFP)；构建pcDNA3-NHN-Np-ICP4质粒；以及构建替换ICP4基因野生型启动子的重组I型单纯疱疹病毒17+NpICP4。
图2：图示了pH2d34.5GFP质粒的制备。
图3：图示了稳定细胞株BHK-ICP4的制备过程。
图4：图示了构建剔除ICP34.5基因的重组I型单纯疱疹病毒17+NpICP4d34.5GFP。
图5：是基因重组的示意图。
图6：图示了STR扩增凝胶电泳鉴定图。
图7：图示了STR测序分析示意图。
图8a-8h：图示了用本发明的包含本发明的启动子序列的试剂盒分离胎儿细胞的流式细胞结果。
具体实施方式
在胚胎发育成桑椹胚后，桑椹胚进一步发育，细胞开始分化，聚集在胚胎一端个体较小的细胞为滋养层细胞，将来发育成胎膜和胎盘。因此，通常在对胎儿进行基因诊断时取少量滋养层细胞不会显著影响胎儿的发育，但是属于侵入性的筛查方法。胎儿有核红细胞稳定地存在于妊娠妇女的外周血中，是胎儿循环系统细胞，在妊娠早期胎儿红系细胞比白系细胞发展得早，妊娠早期进入母体外周血的胎儿有核红细胞多于其他类型的胎儿细胞。胎儿滋养层细胞和胎儿有核红细胞具有与发育的胚胎和胎儿相同的基因组，捕获和分离到胎儿滋养层细胞或胎儿有核红细胞，并且提取细胞中的染色体和DNA，可用于胎儿遗传性疾病的筛选。而且检测时间更早，侵入性更小。
I型单纯疱疹病毒(HSV-I)是一种双链DNA病毒，宿主范围包括大量哺乳动物和鸟类，进入宿主细胞后不整合到宿主基因组染色体上，易于操作，包装外源基因的能力大，可插入长达50kb的外源基因。I型单纯疱疹病毒的ICP34.5基因是致病基因，其产物使宿主抗病毒的内源性干扰素系统失效从而发挥致病作用。
本发明的重组I型单纯疱疹病毒中可以插入本领域可用的各种荧光蛋白表达盒。所述荧光蛋白表达盒优选自绿色荧光蛋白表达盒、青色荧光蛋白表达盒、红色荧光蛋白表达盒和黄色荧光蛋白表达盒。最优选绿色荧光蛋白表达盒。其中，所述荧光蛋白的颜色(绿、青、红和黄等)是由它们的荧光发射光落入可见光谱的哪个公知波长范围内来确定的。所述青色(蓝色)荧光蛋白是将绿色荧光蛋白的66位的酪氨酸残基突变为组氨酸形成的。这一转变使蓝色发射光最大波长为450nm，而突变为色胺后，荧 光的峰值可在480nm。所述红色荧光蛋白可以来源于珊瑚、水母和海葵(例如Discosomastriata)。得自Discosomastriata红色荧光蛋白DsRed的荧光发射光谱峰值为583nm而激发光谱主要峰值为558nm，其他次要峰值在500nm附近。黄色荧光蛋白能通过将绿色荧光蛋白的203位苏氨酸突变为色氨酸，得到稳定生色团在激发状态的偶极矩，从而使激发光和发射光的波长均增加20nm。增强黄色荧光蛋白(EYFP)是目前应用最广最亮的荧光蛋白之一。所述荧光蛋白所发的荧光可以通过荧光显微镜或流式细胞仪等常规的检测手段和仪器得到定量或定性的检测。
本发明所得的重组I型单纯疱疹病毒可以采用常规的方法保存。例如短期保存可将直接将病毒封存于或悬浮于50％甘油盐水中，置于-30℃冰箱中。长期保存可以采用：
(1)快速低温冰冻法，在病毒悬浮液内加入灭活的动物血清或其它蛋白保护剂，优选再加二甲基亚砜(例如5％至10％)，并迅速冷冻和保存于-70℃或-196℃下。含有病毒的组织材料可以直接低温冰冻保存；如先浸入50％甘油缓冲盐水中，再行低温保存(-70℃或-196℃下)。
(2)冷冻干燥法，在真空条件下使冰冻的病毒悬浮液脱水。通常是用低温脱水法，并以干燥剂或冷凝法除去冷凝器内尚未凝结的多余水汽。常用的干燥剂有五氧化二磷、硫酸钙、氯化钙和硅胶等。冷冻干燥病毒时，一般应用脱脂牛乳、灭活的正常动物血清、饱和蔗糖溶液等作为保护剂。真空干燥时，将病毒悬浮液与5-10倍量的保护剂混合，分装安瓶，每支0.2-0.5ml，立即放入事先预冷的-30℃至-40℃酒精中冻结1-2小时，随后迅速置于盛有干燥剂的干燥器内，立即抽气干燥。充分干燥后，打开干燥器取出干燥毒种安瓶，再行抽气使其真空，并在火焰上熔封安瓶口。这样的冻干毒种一般可在4℃冰箱内保存几年到十年以上。这样可以得到本发明所得的重组I型单纯疱疹病毒干粉。
实施例：
材料来源：
1.单纯疱疹病毒I型17+(又名单纯疱疹病毒I型17)株，拉丁文学名 为HerpsSimplex Virus type I，可以商购自英国健康保护部培养物保藏协会(Health ProtectionAgency Culture Collections)(HPA)。单纯疱疹病毒I型17+的全基因组序列已知(Genbank编号NC_001806)。
2.质粒pSP37从Promega公司购买获得；质粒pcDNA3从Invitrogen公司购买获得；pcDNA3.1-eGFP从YRGENE公司购买获得。
3.参见图3，制备BHK-ICP4细胞株：(1)将图1中所示的pcDNA3-NHN-Np-ICP4质粒，用EcoRI/XhoI处理，获得ICP4基因表达盒，插入pcDNA3质粒的EcoRI/XhoI位点，获得pcDNA3-CMV-ICP4质粒；以及(2)将上述获得的pcDNA3-CMV-ICP4质粒，转染BHK细胞，筛选获得稳定细胞株BHK-ICP4。
4.本发明中所用的所有核苷酸序列都由上海生工合成。
实施例1
本实施例用于制备本发明的重组I型单纯疱疹病毒。
纯化野生型单纯疱疹病毒I型17+病毒的DNA
用BHK细胞培养野生型17+病毒，用DNAzolTM基因组DNA分离试剂盒(HelenaBiosciences Cat.No.DN127200)纯化野生型单纯疱疹病毒I型17+病毒DNA。
将BHK细胞生长于175平方厘米的培养瓶中，培养液为含10％胎牛血清、1％青链霉素的DMEM。培养条件为37℃，5％二氧化碳。当细胞长至90％汇合度时，接种野生型单纯疱疹病毒I型17+病毒。继续孵化24-48小时，当90％以上细胞出现细胞病变时，去除培养液，并加入10ml的DNAzol。用10ml吸管吸吹5次、并将细胞裂解液转移到50ml的Falcon试管中，加入5ml的100％乙醇，轻轻地作圆周运动摇动试管，让病毒DNA充分析出。用吸头将DNA挑到另一试管中，用70％的乙醇洗一遍，再用吸头将DNA挑到小离心管中。吸净残留的乙醇，将DNA溶于1ml灭菌水 中，分装后存于-20℃备用。
构建pICP4del-eGFP质粒
构建pICP4del-eGFP质粒：将SalI处理的ICP4US FLR(ICP4上游重复序列)片段以及SalI/HindIII处理的ICP4DS FLR(ICP4下游重复序列)片段插入从Promega公司购得的pSP73质粒的EcoRV/HindIII位点，获得pICP4del质粒；
从pcDNA3.1-eGFP质粒中，用EcoRI/XhoI酶切下CMV-eGFP片段，将CMV-EGFP基因表达盒插入pICP4del质粒的EcoRV位点，得到pICP4del-eGFP质粒。
构建剔除ICP4基因的重组I型单纯疱疹病毒(oHSV1-d4GFP)
准备所需的溶液和细胞：
1)野生型单纯疱疹病毒I型17+病毒DNA，1毫克/毫升，用DNAzol试剂盒制备(同上)；
2)pICP4del-eGFP质粒，1毫克/毫升；
3)Hepes转染缓冲液，140mM NaCL，5mM KCL，0.75mM Na2HPO4，5.5mM D-葡萄糖，20mM Hepes，pH为7.05；
4)2M CaCl2
5)6孔培养板上80-90％密度生长的BHK细胞；
6)1.6％的羧甲基纤维素(CMC)，经121℃下20分钟高压灭菌；
操作步骤：
1)取两个无菌的eppendorf试管，在其中一个里加入400微升的Hepes转染缓冲液；
2)在另一eppendorf试管中加入31微升2M CaCl2，20微升野生型单纯疱疹病毒I型17+病毒DNA，8微升pICP4del-eGFP质粒DNA，轻轻混匀后，用移液器将其缓慢加入到400微升的Hepes转染缓冲液中；
3)轻轻混匀后，于室温下静置40分钟；
4)40分钟后，吸去6孔培养板中80-90％密度生长的BHK细胞的培养液，将上述步骤2)的转染缓冲液缓慢加入培养板中，每一孔对应一个转染混合液，然后5％CO2、37℃孵箱中放置30分钟；
5)30分钟后在每孔中加入1毫升细胞培养液，然后再将细胞培养板放回37℃孵箱中，孵育5小时；
6)用Hepes缓冲液配制20％DMSO溶液，置于冰中；
7)5小时后，移去培养板中的所有培养液，并用1毫升新鲜培养液清洗细胞2次；
8)每孔加入1毫升20％DMSO液，室温下放置90秒；
9)迅速移去20％DMSO液、并用新鲜培养液小心清洗细胞2次；
10)每孔中加入2毫升新鲜细胞培养液，置37℃，5％CO2孵化箱。48小时可观察到病毒噬斑，将培养板置于-70℃冰箱冻存一次，解冻后，收获细胞和培养液；和
11)用6孔培养板培养BHK-ICP4细胞，待细胞达70％汇合度时，吸除培养液并每孔加入1ml无血清培养液，然后每孔加入0.1或10微升收获液并覆盖2ml的CMC:完全培养液(2:5)，培养两天后，在显微镜直视下，用20微升移液枪挑取带有绿色荧光的病毒噬斑，即为剔除了ICP4基因的17+重组病毒(oHSV1-d4GFP)，经5次挑斑纯化重组病毒，再用如前所述的方法培养病毒并制备提取oHSV1-d4GFP病毒基因组DNA。
胎儿滋养层细胞(20个特异基因)或有核红细胞(3个特异基因)特异性表达基因的 启动子的获得
通过基因表达谱芯片获得特异性胎儿基因列表，具体而言，对比胎儿与母体细胞基因表达谱，筛选胎儿细胞特异性表达的基因。筛选获得胎儿滋养层细胞的特异性表达基因(20个特异基因)和胎儿有核红细胞的特异性表达基因(3个特异基因)。
特异性表达基因的启动子序列通过美国国立生物技术信息中心(NCBI)查询获得(启动子序列见附表)，并通过碱基合成分别得到带有NruI/HindIII位点的正义链和反义链两条单链DNA，将单链链DNA退火形成双链DNA。
退火(50μl反应体积)体系及反应条件：
50μMol正向引物
50μMol反向引物
30mM Tris-HCl(pH9.2)
95℃5分钟，70℃10分钟，逐渐冷却至室温。
所获得的启动子参见下表3：
表3
构建替换ICP4基因野生型启动子的重组I型单纯疱疹病毒17+NpICP4
(1)PCR扩增ICP4基因
纯化野生型单纯疱疹病毒I型17+病毒的DNA，分三段PCR扩增ICP4基因，所用PCR引物序列见下表4：
表4
PCR(50μl反应体积)扩增上游和下游FLR时，均用以下反应条件：
20ng野生型病毒DNA
30mMTris-HCl(pH9.2)
10mM硫酸镁
15mM氯化钠
100μM dNTPs
50pMol正向引物
50pMol反向引物
1U(酶反应单位)TaqDNA聚合酶
35个循环扩增，每个循环的温度和时间为：95℃，60秒；62℃，20秒；72℃，120秒。
将上述扩增所得的ICP4-1st，ICP4-2nd以及ICP4-3rd分别插入pSP73质粒的EcoRV位点，分别获得pSP73-ICP4-1st，pSP73-ICP4-2nd以及pSP73-ICP4-3rd质粒；
(2)构建pICP4del-Np-ICP4质粒
1)将胎儿滋养层细胞(20个特异基因)或有核红细胞(3个特异基因)特异性表达基因的启动子双链DNA分别插入pcDNA3-NHN的NruI/HindIII的位点，形成一系列的质粒，统称为pcDNA3-NHN-Np；
2)pSP73-ICP4-1st质粒用EcoRI/BsrGI处理获得ICP4-1st序列，pSP73-ICP4-2nd质粒用BsrGI/PvuI处理获得ICP4-2nd序列，pSP73-ICP4-3rd质粒用PvuI/XhoI处理获得ICP4-3rd序列；
3)将步骤2)获得的ICP4-1st，ICP4-2nd及ICP4-3rd基因序列连接后，插入pcDNA3-NHN-Np质粒的EcoRI/XhoI位点，得到胎儿滋养层细胞特异性表达基因(20个特异基因)的启动子或胎儿有核红细胞特异性表达基因(3个特异基因)的启动子分别连接ICP4基因的pcDNA3-NHN-Np-ICP4质粒；
4)将步骤3)获得的pcDNA3-NHN-Np-ICP4质粒,用PmeI/HpaI处理，获得Np-ICP4基因表达盒，插入pICP4del质粒的SaII/BE位点，获得pICP4del-Np-ICP4质粒，所有质粒均经序列分析证实无突变；
(3)用6孔培养板准备80-90％汇合度的BHK-ICP4细胞。将上述oHSV1-d4GFP病毒DNA与pICP4del-Np-ICP4质粒DNA共同转染BHK-ICP4细胞内，经同源重组，oHSV1-d4GFP荧光蛋白质表达盒与pcDNA3-NHN-Np-ICP4质粒上的胎儿滋养层细胞特异性表达基因(20个特异基因)的启动子或有核红细胞特异性表达基因(3个特异基因)的启动子分别连接ICP4基因表达盒发生同源重组，发生重组病毒的毒斑无荧光产生,挑选无绿荧光毒斑，就能纯化重组病毒。重组病毒(17+NpICP4)经培养扩增，最终得到1010pfu的重组病毒溶液，溶剂为DMEM培养基。
构建剔除ICP34.5基因的重组I型单纯疱疹病毒17+NpICP4d34.5GFP
1)构建含有ICP34.5基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的质粒pH2dI34.5-GFP
使用表2所示的引物，以步骤A得到的全长病毒DNA为模板，PCR扩增ICP34.5基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列PCR扩增出ICP34.5基因上游侧翼区序列下游侧翼区序列(Flanking Region,简称FLR)。所用PCR引物序列见下表5：
表5
PCR(50μl反应体积)扩增上游和下游FLR时，均用以下反应条件：
20ng野生型病毒DNA
30mM Tris-HCl(pH9.2)
10mM硫酸镁
15mM氯化钠
100uM dNTPs
50pMol正向引物
50pMol反向引物
1U(酶反应单位)TaqDNA聚合酶
35个循环扩增，每个循环的温度和时间为：95℃，60秒；62℃，20秒；72℃，120秒。
首先，上游FLR的PCR产物插入到pSP72质粒的PvuII/XbaI位点，得到pSP72H2d34.5US。下游FLR的PCR产物则插入到pSP72H2d34.5US的EcoRV/BglII位点，得到含ICP34.5基因上下游侧翼区序列的pH2d34.5。最后，将CMV IE启动子控制的GFP表达盒插入到pH2d34.5的EcoRV位点，得到pH2d34.5-GFP。所有质粒均经序列分析证实无突变。
2)构建剔除ICP34.5基因的重组I型单纯疱疹病毒17+NpICP4d34.5GFP
用6孔培养板准备80-90％汇合度的BHK-ICP4细胞。将上述17+NpICP4病毒DNA与pH2d34.5-GFP质粒DNA共同转染BHK细胞内，经同源重组，GFP表达盒置换了ICP34.5基因，使重组病毒的毒斑发绿色荧光。经过5轮的噬斑纯化，挑选绿荧光毒斑，就能纯化重组病毒(17+NpICP4d34.5GFP)。重组病毒(17+NpICP4d34.5GFP)经培养扩增，最终得到1010pfu的重组病毒溶液，溶剂为DMEM培养基。
所构建的23种病毒显示在下表6中：
实施例2
本实施例描述了特异性地捕获和分离稀有胎儿细胞的方法。
将实施例1制得的1010pfu的重组病毒溶液在2000rpm的条件下离心10分钟，弃去上清的DMEM培养基，并使病毒悬浮在RPMI-1640培养基中，并且得到病毒滴度为1×107cfu的病毒悬浮液。
将上述制得的病毒滴度为1×107cfu的病毒悬浮液与pH为7的红细胞裂解液和pH为7.3的磷酸缓冲液组成用于下列实施例3和实施例6的胎儿细胞捕获和分离诊断试剂盒，其中，所述红细胞裂解液由0.15M氯化铵、10nM碳酸氢钾和1nM乙二胺四乙酸组成。
将上述制得的病毒滴度为1×107cfu的病毒悬浮液与比重为1.077±0.001千克/立方米的聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Urografin)和pH为7.3的磷酸缓冲液组成实施例4的胎儿细胞捕获和分离试剂盒。
将上述制得的病毒滴度为1×107cfu的病毒悬浮液单独组装为实施例5的胎儿细胞捕获和分离试剂盒。
实施例3
本实施例用于描述本发明的胎儿细胞捕获和分离诊断试剂盒的有效性和灵敏度。
材料和方法：
1)EDTA抗凝管取8孕周孕妇外周血5ml，加入45ml红细胞裂解液，室温下孵育10分钟；
2)待红细胞裂解后，离心(800g，10分钟)；
3)去上清，将细胞沉淀重悬浮于10ml pH值为7.3的磷酸缓冲液(PBS)，离心(800g，10分钟)；
4)去上清，将细胞沉淀重悬浮于2ml RPMI-1640中；
5)将2ml由步骤4)得到的细胞与0.1ml本发明重组I性疱疹病毒(PSG3型)悬液(106Pfu/ml)混合并加入6孔培养板的孔中；
6)将培养板孵育于含5％CO2的37℃孵箱内；
7)24小时后，收集细胞，将细胞吹打吸至离心管中，离心(500g，5分钟)；
8)弃掉上清液，每支离心管加3ml PBS轻轻洗涤细胞，离心(500g，5分钟)；
9)去上清，将细胞沉淀重悬浮于0.4ml PBS中，加入100μl APC-CD45抗体(APC标记的白细胞表面标志CD45抗体)，室温下避光孵育30分钟；
10)30分钟后每支离心管用4ml PBS轻轻洗涤，离心(500g，5分钟)；
11)离心完成后弃掉上清，加PBS重悬，流式分选CD45-/GFP+细胞；
12)STR鉴定分选所得细胞：
(1)将流式分选所得的CD45-/GFP+细胞注入装有10μL裂解缓冲液的EP管中，每EP管加入1μl蛋白酶K。56℃水浴2h，80℃水浴20分钟，迅速置于冰上，瞬离EP管，
根据反应数量(n)，在超净工作台中配制预扩增混合液：
预扩增缓冲液*20μL×n
预扩增酶*1.5μL×n
合计21.5μL×n
配制预扩增缓冲液：
10×ThermoPol缓冲液2μL
dNTPs(2.5mM/种)4μL
MgSO4(100mM)0.5μL
MA-G引物(15μM)1μL
MA-T引物(15μM)1μL
无核酸水11.5μL
用量20μL/反应
预扩增酶：
Bst DNA聚合酶(8U/μL)0.8μL
Deep Vent(exo－)(2U/μL)0.7μL
用量1.5μL/反应
(2)在超净工作台中，向每10μL细胞裂解样品中加入20μL预扩增混合液，将混合物移入200μL PCR管；
(3)在PCR仪中孵育；
(4)根据反应数量(n)，于超净工作台外，配制扩增混合液：
扩增缓冲液*30μL×n
扩增酶*0.8μL×n
合计30.8μL×n
配制扩增缓冲液：
10×ThermoPol缓冲液3μL
dNTPs(2.5mM/每种)4μL
MgSO4(100mM)1μL
MA引物(15μM)2μL
无核酸水20μL
用量30μL/反应
扩增酶：Deep Vent(exo－)(2U/μL)
用量：0.8μL/反应
(5)从PCR仪中取出预扩增产物，瞬离。每管加入30μL扩增混合液，混匀；
(6)在PCR仪中孵育；
(7)从PCR仪中取出扩增产物，瞬离。用PCR纯化试剂盒将产物纯化，Nanodrop测产物浓度；
13)对扩增的CFC基因组DNA的个体鉴定：
目前用于个体鉴定的短串联重复序列(short tandem repeats，STR)位点为12个。以扩增后的CFC基因组DNA与相应母亲基因组DNA为模板，利用12个STR位点的引物，进行12个普通PCR扩增反应。每个反应体系为20μL，其中含DNA模板40-50ng，引物(10mM)1μL，dNTPs(2.5mM/每种)2μL，rTaq酶(5U/μL)0.1μL。STR基因及引物序列见下表7：
表7
PCR仪中孵育条件为下表8：
表8
14)扩增后的产物各取5μL混合，将混合后的扩增产物送测序公司进行基因测序，结果如下表9所示：
表9
结果显示，分选所得的细胞，有和母体相同的特征序列，同时又包含有同母体相区别的特异性序列，证明所得为胎儿细胞。
实施例4
1)在50ml离心管中加入10ml比重为1.077±0.001千克/立方米的聚蔗糖-泛影葡胺(Ficoll-Urografin)；
2)取5ml肝素抗凝静脉血与等体积pH值为7.3的PBS充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。水平离心1000g×20分钟；
3)离心后管内分为三层，上层为血清和PBS液，下层主要为红细胞和粒细胞，中层为单个核细胞(包括淋巴细胞、单核细胞及肿瘤细胞)；
4)吸取单个核细胞层，置入另一离心管中，加入6倍体积的pH值为7.3的PBS，800g×10分钟，用所述PBS洗涤细胞两次。再将细胞重悬浮于0.4ml的RPMI1640中；
5)将2ml由步骤4)得到的细胞与0.1ml本发明重组I性疱疹病毒(PSG3型)悬液(106Pfu/ml)混合并加入6孔培养板的孔中；
6)将培养板孵育于含5％CO2的37℃孵箱内；
7)24小时后，收集细胞，将细胞吹打吸至离心管中，离心(500g，5分钟)；
8)弃掉上清液，每支离心管加3ml PBS轻轻洗涤细胞，离心(500g，5分钟)；
9)去上清，将细胞沉淀重悬浮于0.4ml PBS中,加入100μl APC-CD45抗体(APC标记的白细胞表面标志CD45抗体，室温下避光孵育30分钟；
10)30分钟后每支离心管用4ml PBS轻轻洗涤，离心(500g，5分钟)；
11)离心完成后弃掉上清，加PBS重悬，流式分选CD45-/GFP+细胞；
12)STR鉴定分选所得细胞(同实施例3步骤12-14)。
结果如下表10所示
表10
结果显示，分选所得的细胞，有和母体相同的特征序列，同时又包含有同母体相区别的特异性序列，证明所得为胎儿细胞。
实施例5
1)将含有细胞的宫颈擦片正中滴于载玻片上；
2)将步骤4)得到的细胞悬滴与0.02ml本发明重组I性疱疹病毒(PSG3型)悬液(106Pfu/ml)混合；
3)将培养板孵育于含5％CO2的37℃孵箱内；
4)24小时后，用荧光显微镜检测发滤色荧光的胎儿细胞；
5)收集发荧光的细胞，STR鉴定分选所得细胞；
6)STR鉴定分选所得细胞(同实施例3步骤12-14)；
结果如下表11所示：
表11
结果显示，分选所得的细胞，有和母体相同的特征序列，同时又包含有同母体相区别的特异性序列，证明所得为胎儿细胞。
实施例6
按照实施例2中的方式处理孕妇外周血，将制得的病毒滴度为1×107cfu的病毒悬浮液与pH为7的红细胞裂解液和pH为7.3的磷酸缓冲液组成胎儿细胞捕获和分离诊断试剂盒，其中，所述红细胞裂解液由0.15M氯化铵、10nM碳酸氢钾和1nM乙二胺四乙酸组成。分别用不同的病毒载体进行胎儿细胞捕获。结果见附图8a-8h以及下表12：
表12
可以看出，利用本发明的启动子构建的重组病毒均能实现捕获胎儿细胞的目的。
序列表
<110> 张婧
<120> 用于从母体捕获和分离胎儿细胞的无创方法和试剂盒
<130> PM2140LH66CN
<160> 25
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1358
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttctgacaca ataaagaagt ttgtgggcca ggcatggtga ctcacacctg taatctcagc 60
actttgggag gccaaaggcg agtcgatcac aaggtcatga gtttgagacc agcctaacat 120
ggtgaaaccc tgtctctact aaaaatacaa aaattagccg ggtgtggtgg cgtttgcctg 180
taatcccagc tgctcaggag cctgaggcaa gagaatcact tgaacccgga aggcggaggt 240
tgcagtgagc caacattgcc ccactgcact ctagcctggt cgacagagcg agactccgtc 300
tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaagtttg tattcctctt tctacacagg cacttaaatt 360
ctaatttctc tattgtaatg taatgaactt aatcagtaca gtgtattttt agagtgaata 420
tccaagtgga gtttttttaa agaataaagg tcagagctca gaaactgatg tttctaacgt 480
gacttaataa cagatctttc tatccaactg ttcggaaatg aaaatctttt gtaacttggc 540
tagtggttca agaatcaact aaaatcaatg aatctatttt tccctctgaa aaggcacacg 600
tttacaggag ccaaacttct tcctctttat ttgtaataac aaaaataaac cgaagtcctg 660
acctatttgt aatattttta ttcctaaagg aaaaaacagg aactttcatt gtacttcaac 720
attaaagtta ttacctcaga tattttgcca gcttagcacg gcaaaaatca gtttcagaca 780
aaagagatca actgctctct ctaggaaata cttaattggg gtggtgccta ggaaatgccc 840
aggggtcctg taacagatcg gtttttccca gagggtttct gcagcatggg tcctggttgg 900
agggcaggca ttctgctctg atttttcctg ttgcctggct agtgaccccc tacaggaaga 960
taacggctaa gccaggaggg cggagcagcc cactacacat gtctggctgc tcttatcaac 1020
ttatcatata aggaaaggaa agtgattgat tcggatactg acactgtagg atctggggag 1080
agaggaacaa aggaccgtga aagctgctct gtaaaagctg acacagccct cccaagtgag 1140
caggactgtt cttcccactg caatctgaca gtttactgca tgcctggaga gaacacagca 1200
gtaaaaacca ggtttgctac tggaaaaaga ggaaagagaa gactttcatt gacggaccca 1260
gccatggcag cgtagcagcc ctgcgtttta gacggcagca gctcgggact ctggacgtgt 1320
gtttgccctc aagtttgcta agctgctggt ttattact 1358
<210> 2
<211> 2000
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tggtccctag atgtctgggc agaggtggag aggccgaaga tgggggagct gctgctgcac 60
agtgagtttg gtgattggcg tctggtgtaa gtgatgtcga gaatatggag ttcttccaag 120
acctctggga tagggtctga tgtccccctc ccgcctccct ccagtttctc agccgatggc 180
acacagtcgt cctggtgcct gctcttggca ctcagccttt atccactcaa gccgtgggat 240
ccagctcagc tcagtcccag catccccgac gggtggagaa ctcgggcctg acatgttgtg 300
actcacgcag tctgatcatg cctggtgcat gtgctgatct attctctggc cccagaggtg 360
gggccgctgc cgggtggaat gcggcagctg ttgaacatct ggctagcaat gcagtccagc 420
agctgagcag aaggtggggt ggcccctgcc ctgtaggatg gctgactgga gccaaccagc 480
ccaaccggcc agggcaatag gctgttggag cctggagagg gaagtgcatt atgagggctc 540
tgtcctaagt cagctcccat ccaccaaggg tggtaacgct aagcttttac tctctgctta 600
aaccatccag caagtcatca aagttacaaa agcccctgct tagtgcgttc tgggttactt 660
cattgtgaag atcaggggac tgaagctcag ccagatcaag tgcctcgcct aaggtcatgc 720
agcttggcca aatccaaacc cttgggtgag tggacagagg agcgtcagct aggagaggtg 780
ggcgctggtc ttactgggga ggaggggcct gccccctgga ctgctgccct gacctcagcc 840
ccatcccatt ctgcctagcc ccttgctggg cacttccctc cccagggaca gccacagaaa 900
aatgatgatc tcggctgggc gtggtggctc acgcctgtaa tcccagcact ttgggaggcc 960
gaggcaggtg gatcacctta ggtcaggagt tcgagacaaa ccttgccaac atgatgaaac 1020
cccgtctcta ctaaaaatac aaacattagc tgggcgtggt ggtgtgtgcc tgtagtcccg 1080
gctacttggg aggctgaggc aggagaatca cttgaacccg gaggcgaagg ttgcagtgag 1140
ccgagatcaa gccgctgcac tccagctctg ggcaacagag caagactctg cctcgaaaaa 1200
aataaataaa taagaaagat gatctcaggg tccctaccct aggagtcaga tgcacggtgg 1260
ggccattcct agcgctgcct gccctggaca gcgcctgtct atgcctgtgg cccagcatca 1320
ttatgaggag tgctcccttg actctggctg tcctgatttg gacactagac ttcatggtca 1380
ccctggccac aggtacccta tcctgcatcc tgagctccgc tcttcctgga gtcatgggct 1440
ggtctttcct cctggtggcc ttgcgcccca gctccagctt cctgactttt ctcttctgga 1500
aatgggaatg ccaagtccta tttcatggag ttttgagaat gaaatgactg gtgtacggtg 1560
caaagtgcct gtgagtgccc aagaaatctc ttttattaac aagacacgaa ttcattccaa 1620
ttgatttgac gggccactgt tgtcacagca gccgcactgc cccaaaggca gcagtgatgt 1680
ttgagcgccg actccccgac ggcacttggt cctcacaacc accccatgga gttcatgcta 1740
agatcctcgc atttcatttg tgtggcaggg acttgctgag gtccggggag gggcagagag 1800
gaggggtgcg gccgccccgc gctttgcact ttccgcgtcc tccagcagag gggtcggccg 1860
gcgggctcag cgtcccgcat aatagccgct ttgaagcccg cggagcgggt ggcgggaggg 1920
gaggggagag gcgggagggg aggggagagg cgggagggga ggggcgaggc gggagggagg 1980
gagggagggg ccggcagcgg 2000
<210> 3
<211> 1374
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttgatagtat ttggaggtga aatgaacgag ttttttttta cagactcaat attgaccaat 60
gaaaacatgt aactaatgaa tttagccctg tagtcaagca gtttaagcct ttttcaacat 120
agattaggaa gttagaatgg atgcctctca ttgagtttgc attcagtaga ataagtaaag 180
cttgtttaac tcatgcatct ctcactggcc gcctctctct ttaatttggg aatagaaaag 240
ggagtccaca attaatttta gattgtgaga agagagacaa aaaaaggagc agagagtttc 300
tgagataacc taaaatcttt gccgcacccc ttactaaccc cggtttgtgc cccttcacta 360
tgggagtagc tcttgtcatc atctaaaaaa cttgaactgc attttgagag atttattggc 420
cttgcttctg caggctcata actcctttat gtgcttgctc ttgggaggaa aaagcagata 480
gacgtttaaa agctggatgt tcctgcacac ccctctcctg atgcttcatt cttttccagg 540
cagaaagatg gtgggactct gtctctagca aagggatatt tccagatact gaggtgttgt 600
cagagacacc tggtcaggga ggttaggaga aggggcatcc aggtccaccc cctccaactg 660
gctgctgctt tcctggcagg gctgcactgg gacacctcac ttccttccca cttccccttc 720
ctcctcccat tcgctgtctc tttgcacacc cctaatatgg cctttcatag taagaggtca 780
atatgttttc acacttggga aatctcattc aagaattttt gtcaatggac aagtcataag 840
aagcccttcc attttagggc tcgttgacgt caccaagagg cgataaatat ctgttgatat 900
aattggatgt gagattcagt gttgagatag caaaattctg cccctcgttc cttggcaggg 960
ccctatgatt tatgcaggag cagaggcagc acgcaatcga gctgtcaaga gagcgtcagc 1020
ttattaggca aatgctgcgt ggtttttgaa gagggtcgac actataaaat cccactccag 1080
gctctggagt ggagaaactc agagaccaag tccattgaga gactgagggg aaagagagga 1140
gagaaagaaa aagagagtgg gaacagtaaa gagaaaggaa gacaacctcc agagaaagcc 1200
cccggagacg tctctctgca gagaggcggc agcacccggc tcacctgcga agcgcctggg 1260
aaggtaggga gcgcctggac ggaacacgcc accaactttg cgttgcctga gctgccgcga 1320
tgtgcgccgc ggagccggct gcccctgcct gtgtacgtgt gtatgcatgt gtgt 1374
<210> 4
<211> 1344
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ttaataggaa cattgaccaa cttcagtatt cttagaagag catacaggat aagaagaaat 60
taggaaagca tgaaggtcca agtgtttcat aaagtacccc cactgtgggg atatgatgac 120
tgggagggga tggcagtgat gtaaaaagct ttgtccattt cctcccaact caaacgttct 180
gtgacctact tgaagaactg tcatgtatcc ttatctcttt tcatccaggt atcaggttta 240
gggccaatgg ggaggagcca ctgagaggga gggttgacac tcagcatcat tcagatcttc 300
atttaattca gtaaacactt aactgagcac ttcctgtgcc tggtatgata atgggcattg 360
gagatacgga agtaaaaaag acaggcagat taccctgtga gcagctggaa caccgtggag 420
ccttctgggc ttctctttat cctaacattc attgcagtta ctgttgactg atcatctctc 480
agcaataccc accattaacc atggaataga agcctcctga ggctaggggc catgtcaccc 540
ccaacacata gcacagttcc tgatttggaa ttcactatta cccgttgaat aaatgagtga 600
atgaacgaat gaataaatga aaagctgtat agtgaaggca cttctatgta gaacaatgtg 660
gtgtgtggtg gggggtgtga tcttatgatt acatgtatat agatttttgt ccatggttct 720
tgtccataac tcccatgaca cttgctgagg tcttttgcta taatgtagag gtgctttagg 780
cctcaggaaa cagaatattt ctctggcctt ctttgccctc ctttcatcca cccaaggcgg 840
gactctataa tctgattgtg ggtcataaga ccctcattcc agaggaggtc atgccccata 900
ccctggagga aggaatgctg cacaaagaga ggaagaagaa tctggacaga cagaccttgc 960
tgagattaga tcataccctt tttgtccaat cacattttgt tcaatcacat gcttcagtca 1020
tggacaacaa atgaaatctc cataaaaggc ccaaaggaca gggttcaggg agtttctgga 1080
gggctgaaca cgtggaggca aacaggaagg tgaagaagaa cttatcctat caggacggaa 1140
ggtcctgtgc tcgggatctt ccagacgtcg cgtatgtatc tcttaatctg actgagccct 1200
caacctgtgg gatcagacac tctttccagg tagatagtgt tggaactgag ttggaggaca 1260
cccagctggt gcccgctgct tggtgtgtgg gggaaaatcc cctacatttg gtcgcagaag 1320
tcttctgtgt tgatgactgt tgtc 1344
<210> 5
<211> 1493
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tgaacctaac cagcccccga aagcccagca cgctcccact ccaggatcac cactctcctg 60
acctctgaac tgttcttgcc tttttttttt tttttttttt tttttgagac ggagtctcac 120
tccgccgccc aggctggagt gcagtggtga gatctcggct cactgcaacc tccgtctccc 180
gggttcaggc gattctcctg cctcagcctc ccgagtagct gggactacag gtgtgcacca 240
ccatgcctgg ctaatttatt tttattttta tttttagtag agacagggtt tcaccatgtt 300
ggccaggctg gtttcgaact cctgacctca ggcaatccgc ccacttcatc ctcccaaagt 360
gctgggatta caggtgtgag ccaccgccac cggcctgttc ttgcctttta tgtaaatgga 420
atcatgcagc gagtgttcct ttgtggctga ctctattact ctgacttacg tctgtgagat 480
ttacccgtta tgtgagttgc ggatcattca ctcctgttcc gtttgtcgtg ctcctaagcc 540
cgaatactcc acgatattca tctgccttga tgacgctagg cttcccaatt ggaggaatta 600
tgaatgtgcg gctacatgtc tttctgtctt ttggagcaca tgttgtatgc gtttctgctg 660
agtgtaaggc tgggcggggc gtcggtggct caaggggtcc atggtgaact cacaggaaca 720
ccgctttgag ctgcccagtg gcgttcctat gcgtctcatc cagttcctcc gcatcttcac 780
ctgcaccatt ttattcttct tctttggaaa ataaatctac ttgtggttcc aaagcctaac 840
tcatcctcag taaccccggt agctatgaat tcctatacaa gaggctcccg caggcccagc 900
gccaaagctg cctcccctgc agcctcggtg acttcccggg tctctccctc cggccctggt 960
gtcccgggtg agcccagcac acgttgggat tttggttgtt tgttggcctg gcccgactgt 1020
ccctgtctct gagggcagag tcgggtccca tcccgggaca cgcctggggt tagccaccga 1080
cctgcagcct cccggccgag ggtgcggggt tggcggtaag gcctgcccca gtgcccccca 1140
gcagccgggc ctccgactgc aggcccgggt ccccgctcct ccgcgcggag tcgggcgggg 1200
ataacctttg atcccgagcc ctcccctcga gagggggtgg ggggaggagg ggatcgggtt 1260
tcacggagtg ttgggggata ggactggggg catccggccc gaaggcgccc cctctgtgcc 1320
ccctccgggg aagtctggga tccaggccct cgcccccagc cgtgggcgcg cgcccctcgc 1380
agccggggtc cggggaggga gggtcccggc agggggcgcc ggggagggag gaccaggaga 1440
cccgcggccc cgcctccgcc gcgccctcct cccgggcggg ataattgaac ggc 1493
<210> 6
<211> 1326
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tgggttagcc tggtcttgca ctcctgacct taagtgatcc acccacctca gcctcccaaa 60
gtgctgggat tataggcatg agccaccgtg cccggcctgg agaaaggact ttaaatgacg 120
caatgtggga agagcaaggt tgtgaagatc tgctgccctg gctgaggtag ctcatgtaat 180
cagtctctct gagcctcagt ctcctgatct gtgaaatggg atgatagtca tagctcctac 240
acaagacaag tggcagttca gacgtgagaa tgcacaggca ggcccttggc aactggataa 300
gctctacaca ggtctggaaa ggaggaggag acaaaagagg aggggcttcc atggctggat 360
agggcgtctt ttggcgtgat gtgttctgag ttttaaagct ggggaagaga ctcaaatctt 420
caagagctct tccaactttg agattctctg ttggtttcag gactatggga ggaagcgctt 480
gtggtccgtg tctgttcccg ggatttctgt ttcttggttt gtatctctgc tacaggtcca 540
aggagctggg gcaatacctt gagtctgggt tattcgtccc cagggacctg ggggagcccc 600
ccccccaccc ctcccacacc cacacccacc cccaccccca cccccatccc cacgccccgc 660
ccccgccccc gccccaaggc tcaggtaaag gggagagcaa agtgtggagt ttgttccctc 720
tagtggtcag tattagcact gcatccaggc gggcctgtct caggcgagcc caggagtcag 780
caaaagtgga attcagcact gaatcatgcc cagaaccccc gcaatctatt ggctgtgctt 840
tggccccttt tcccaacaca cacattctgt ctggtgggtg gaggggaaac atgcggggag 900
gaggaaagga ataggataga gagtgggatg gggtcggtag gggtctcaag gactggctat 960
cctgacatcc ttctccgcgt tcaggttggc caccatggcc tgctgccaga gggcacccac 1020
gtgaccctta aagagaggac aagttgggtg gtatctctgc tgacattctg tgcacaaccc 1080
tcacaacgct ggtgatggtg ggaagggaaa gatgacaagt cagggggcat gatcccagca 1140
tgtgtgggag gagcttctaa attatccatt agcacaagcc cgtcagtggc cccaggccta 1200
aacatgcaga gaaacaggtg aggagaagca gcgagagaga aggggccagg tataaaaagg 1260
gcccacaaga gaccagctca aggatcccaa ggcccaactc cccgaaccac tcagggtcct 1320
gtggac 1326
<210> 7
<211> 1237
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tctgtccggg ctgaagactg agtaaggtag ggcccctcct tctgcggatg ggtttctctc 60
tcattccacc ctccacccac ctccggttcc gcgtgcacgc gcgagatagt ccagtgggcc 120
cacagataac gaccatcaga gattaaagaa ggaaagtcag cgagcttgaa cacaggcgtc 180
ccgtgtggaa atgtccaagg agaccgccag aagtgcgcaa gccggagtcg gctagagttt 240
ccttctcacc gagaggggga gcccggcgtt cccggccggg agcgacccgg agtccccagc 300
cccgcgtccc agctgccgcc agcgccagtt ttggattcgg cggattagga agaggaggga 360
ggggggagag agcgcgaaga gggaggggac cgaagctgga gggtcccgag tccagcgccg 420
tgttggcgta gagaaacttt ccctctcggc ctcggagacg gcgccccggc cgtgccggag 480
tggagatcgc caggctcgga ggaaccggca gctctccacg cccctgcccg aagcctgacc 540
cgactgcctc tctcagtgag gtacggagat ttatctaggc tcttccctgg ctgcgaaccc 600
aggctccctc caggtagcgt ggaatcgctt agaagctgat atcccgaggg gcggtggggg 660
tggacagctc cggccaccag tgcccgggaa ggagggcgcg gggctgcgcg tagccgctgg 720
ccagcaggtt gtaaaaaatt aggacagcta aatgctcagg gagtcgtcca gcactaaagg 780
aggctaagac ctgttgacgc ctgctatggc agcgcttgag aaatgactgg gggagtccag 840
cgaggtcggg gacgcagcgg tctccgggct ccagaaacct ccttagcctt ttgtggtaac 900
tttggtccgg cggcgggggg ccggtgagca ggaactggag ggaggcggtg gggaaaccgt 960
ggatccgtcc ggctgagggt gcgtggatca gactgggctg agcaggcaag tcatcgtcgg 1020
gtcacagcga ggcgacccag gagcgaactt ccagggcagc ctcccttttg ttggcgctgg 1080
gagagaatgt gggcatgggg gtggggaggc gcgaagctcc gaggccgggc cgcggatact 1140
ttaaagctca gagctgggag ggcccaaagg aaggggcggc gtccacatgg ttacccttct 1200
gctgcgcggg tcaagtagct tcttctggag ggcgcaa 1237
<210> 8
<211> 2000
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gagaaccaag cattaatgcg ctgtggctga tgtgtagtag agcggcattt cccaatggga 60
gaaccctggg gctgtctagg agcccatgca tggctgggag cctaatccca gggacaccac 120
cgatgacagc tcccatagca cgtaggacag tggatacttg gaggcaaaga gaaatctctg 180
ttctgcagtg gtcatgactt ggaccccaaa gaacttgagc ccaaggtcca gagggagacc 240
ctcccaacag ggcctccagc aggaacaggg atcgtgggag cctgccaagc acagcgcaca 300
ggtatttctg gaggcttccc attcagtctt ggatgccagc ctcaccgagg gcggcccatc 360
ttgctgacct caccaaggga ggcccgtctc actgccctga tggcgcagaa tcggctgtac 420
gtgtggaatc agaagtggcc gcgcggcggc agtgcaggct cacacatcac agcccgagca 480
cgcctggctg gggttcaccc acagaaacgt cccaggtctc ccaggccagg tgccgcattg 540
gttcccgagg gttgtcagag atagacactc atgcgactaa catcgggcta tgtgtttgat 600
tcaccccagg gtgcattgtt gaaggttggg gagattggag gagatgcttg ggggacaatg 660
aggtgtccca gttccttgga tgatagggat ctcggcctaa gcgtgagacc cctcctacag 720
ggtctctggc aggcacagag cctgggggct cttgcatagc acatgtgtat ttctggaggc 780
ttccccttcg gtctcaccgc cccgatggtg cagaatcggt tgtagttgtg gaatcggaag 840
tggccgcgcg gcggcagtgc aggctcccac atcacagctc aagcccgccc cagctgaggt 900
tcacccgcgg aaacgtcccg ggtcacgcaa gctaggtgcc gcaaggttca cgggggtagt 960
gagggataga acactcatgg gagccacatt gggctacgtg tctgattcac cccagggtgc 1020
actattgagg gttggggaga tgagatactt tggtgacaat gaggtgtccc cattctttgg 1080
atgatgggga tctcggcctc agcgtgaggc ccctcccaca gggtctctgg caggcacaga 1140
aactgggggc tcttgcgtag cacatgggta tttgtggacg cttccccttc tgtctcacca 1200
cccggatggc acagaatcgg ttgtaagtgt ggactcaaaa gtggccgcgc ggcggcagtg 1260
caggctcaca catcacagcc caagccctcc ctggatgggg ttcgcccgcg gaaacgtcct 1320
gggtcaccca agccaggtgc cgcagggttc tcggaggtct tctgggaata ggacgctcat 1380
gggagccaca ccacgtcttc gtatcgggcc atatccacgg ccgcgtggcc ccaggtcaca 1440
ctctgagggc ttcagtgtca tggcctggga ctcaagtcac gcctacccgc gtgatgagca 1500
cagcaaattc cgccaaaagc ttatactttc cacatccatc ccagagcaca gatccgacta 1560
aggacagccc ccaaatcccg agcctttttc tgaactgaca attgcctccc cagtgaacac 1620
tctgagcttg tcaatcttaa gtggccagac attaacattc ccattcagtg caggtttgag 1680
atgctaattt aggagcttga gatgctaaag agctgggagt gccactgctg ctttattctg 1740
gggtctagga tccttgtgtt ggctgagata atctgctaat gtgggtgcag cagacatccc 1800
gcggtttgtg gaatcgataa aggatgggga tcaatggtgt ttgtgcactg tgcggtctgt 1860
gcccaattgc ctgccttgtg ctgtggaatc tgtacatctg gccaacatgt gcttgtgtga 1920
gcctgacagt gcattttcca gagcctcacc tcggctctgc cctggaggct ctgtgctgct 1980
ggaatcagac tcaaggacct 2000
<210> 9
<211> 1316
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ctccctgcac aaaacttcat ttcaaaataa ttttatattt aaatatatat ccagaaccac 60
agagatctta gaagaaaaaa ttagagaaat atagaaataa aatgagaact gtgggaataa 120
aaatcaggaa gtagttgcct atgaggtaga ttgggggaag gtcagggaat taacagggaa 180
caggcagaaa acaactttct ggagtgacgg aaatggtcta tatctttttt ggggtgctac 240
ttacatgggc atatataact gtcaagttcc actgaactga acactgaaga cctgggcatt 300
ttaatgcatg taaattatat ttcaattttt ttgagtaaag tgtcttggga agcttatggc 360
ggtgatattt gggcagttct ggggcatagg cttcagaagc attcacagta tgtccagttc 420
aagaatttgc tgagaatcgt tttgcagcca aaaatatgga taagttcgaa cacctatgat 480
aagagtcatt ggggcataca accacaaatc cccactcttg tgatacaggc catatcatta 540
agtggttatc accagatagc tttccttcaa tgatgttgtt catctaggaa cccagggctc 600
tccaggggca aatgaccatt gaggtttcag atatattggg taggaaagaa agtcacctca 660
cataaaacta agtgattgga gctgtcacca ttgcaaattt ctaaattttg taagacagca 720
gcaacatttc aaatgatagt ctgagagagg agataatggg cttacatgga tttccctcca 780
gatggattta ctgaacaagg gcacaattca aattgcactt gcagatttct cctggtctag 840
tttaagttca cagattgtgg atcccagaca gctggtatca actgactagt gtcctgttaa 900
ggctaaaccc aagactcttt gccacactgc agcattagga tgggacttct cttcctgttc 960
ctgggaagaa ttagagatgt aacccaaagg tcactatttt tctgagataa ggatcccata 1020
ggaggagaga gcaatgagta catggccaga gatcaaagtg ataagggttg ggccagaagc 1080
cacagtgcat aaagcttcag acttgccaca ggaaatgagg tgagaagtac gtccactctt 1140
ctgtccagct tttaacaatc taactaatgg ttagagattt ttcattttct ttcagctact 1200
cctgcagtgg tggggacaca gaatgtttgc aaaaaaaatg gggtggagga aaatgaggca 1260
tctgtgtgag tatataacca tttgacatct ctttttagcc ctctccaggg tcaccc 1316
<210> 10
<211> 2000
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gacactcagc agggctggaa ggttggaacc ctcagagtat gaaaattgct tcccatacct 60
tcccccaaat tcggtcatta cacccagagc atgttgaatc cttttctgaa tcataaacga 120
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gctattgaga atgttgtggg tgtgtgagtc acaaagcttt ggggcattaa cgtctatggc 240
tctatatgct gcctggccac gaatcaggtc ccttaagatg tagacagtgc cacccaggtc 300
cctggagcac actgagcagt taccaggagg tgctcaagtg tgacccagga ttctccaggt 360
ccccccaaat cacacagggt ctcccgggtc cctctgggct acaccaagca caaaaggacc 420
ccttgggcag agcctacttt tatttctgtt atgccaggtg ttgctaacgg ccccagttcc 480
caaacattcc gagcactttc tctgcatcac aacatattga ctattaaaca attctctggg 540
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tctgaatccc ctttctttaa aatgtacata tggaccccca agtcctccaa ggactctgag 900
caacttccct agatctttag attcaaaaac gattttcctg gagcccccaa attgcggtat 960
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tttttttttt taatactgat ttatgagtct cctgacttta tggtccctgc cctgggtccc 1080
cctacattta gaaaatgttc catggacccc caaagcacac taaaaaatgt ccctgggtcc 1140
caagaaatcc caggcatgga aaaacctgcg acctataagt ttcctagcta ctaactaggt 1200
ttccagaaat ttagatatca aatctccatt gggtaatttc catgtgtccc aaaaacttga 1260
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ttcttattta ccaaaaataa gctaatggaa atcatttaaa aattagcata gaaaaataat 1380
actgattttt tattttttta ttttttattt tgctttcccc aaatgtactg atcacactcc 1440
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actaacttat attcttaaga tgtgaaaatt aatctcagct tccccctaac acaccaagaa 1620
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tctacggcaa aattcccaat ttcatatgga gaattttctt taactacccc tcctcacaaa 1740
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ttcccggctc gccggccacc 2000
<210> 11
<211> 1248
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
ggtgaaacaa cacctctggg gaaactttca tgacaattta acagcagacg taaagcaact 60
taaaactaaa attttagaat cccttcacat gatagatcta catactcaac aaacagccat 120
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<210> 12
<211> 1373
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
atgccaatca atgacagatc ggttacagaa aatgtggtac atgtacacaa tgaaatacta 60
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accttcctcc cagaatctgc aggagaaaca gtgtctctga aacttttatt tacatggaca 480
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<210> 13
<211> 1267
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gggcctttgg gcttcagaaa atttaaaact atagaattac cttgttcttt cctcgggcca 60
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gccaagttgt tattcaactc tagtatttaa tcaagcatta cctgggcact tctgaaattc 360
tccagcttct aaagtgagag taaaccagag agaacacagg gtggaaacta cttaatcgag 420
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ctcctgaaag tcagcaagaa accgaatctc agtcatgatg attatttttc atgtaacacc 540
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attttctcta cttaggcttt aagtacacaa atagggcaat ctactagagt acagaaaaat 720
tgtttatgat ttcagagaat gtgcggctgg catagagcaa caagtgcagg gcatgacttg 780
tttggattcc tcacctgcaa ggagcagggg gcccagcaca tgtcagaaat tcctgctata 840
ccagatgact ttgccaaaat ctttgtcctt tttttcactt agggtgaaaa aaaaaattga 900
tgacccgtgt tttgctacca ctgacgagag taataccttg tcccaaagct aaaacgatca 960
acctatgaaa actggagggt tgggcttttg ttgttgttgt taaaggcctg aatgaggtga 1020
tatcttaatg cttacagctg agaagcaggt cagtcaggtt cctgggcgct ctgttacaca 1080
agcaagatac agccagcccc acctaatttt gtttccctgg caccctcctg ctcagtgcga 1140
cattgtcaca cttaacccat ctgttttctc taatgcacga cagattcctt tcagacagga 1200
caactgtgat atttcagttc ctgattgtaa atacctccta agcctgaagg taagtgtgcg 1260
ttgggtc 1267
<210> 14
<211> 1230
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
aaatatcttg ctgagaattt gataggaatt gcattaaatc tctaggttga gttgaggaga 60
gctaacacct ttgctgtgtt gaagcttcca gcccatgaac acattgtgcc tgtcctttac 120
cttaggtctt tgatttccct tccttgggtt cagagtttaa gtcctgtcca tatttggtga 180
gatttttgcc tacatgctgt gtgtgtgatt acaaatcctg aatttccagt ttcgggttct 240
gtctactcct tgacactgtg tgggaacacg gtggattttt gtgcgattga ccttgctgac 300
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gttatatgcg aatagagaca ggtatacctc ccccttccca atctgcctgc ctttagttac 420
catttcttgc ctagctgctc tggccggaat gacctgctct gatggatggg ggagtgggag 480
tggacacccg tgtcttgcct caggactcaa gtgctctcca gggagtgaga tgcgggctcg 540
attgtaagtt acaaagtgat gcttccctgt gggaaaaagt acatccaata tagactgtag 600
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tgtgcacacc tggggatgtc tgagtggaag gtacaggtca ggattatgac cgtgcagtca 780
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acccaacatt gtccaggagc cccaacccag aaggtgctcc cgccgctgcc agcctggacc 960
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<210> 15
<211> 1338
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ttttattagg cgggtgcaga agctactgca gtttttgcca gtactttttt gcaattactt 60
ttgcactaac ctaatacaaa acaaaatgtg cctacatcac aattcagaaa aatcacagct 120
ttattagcag agtataattt aaggaagtca atcaatcctg aaggcagaaa gacctaagtt 180
caaaactgat ttggaatctt ctcagctatt tagccttgtt caaagtatct aaccttgctg 240
aacctcagtt tactatctga aaatagagaa aattattact atattgtgga ggtatgaata 300
ttgaataatt taaagaactt gattgtacta ccattagcac acactgaata aaatattagt 360
ctgattatat tttcgtattt ccatatttag gcttttgcct aaaaagggaa tttggaagtg 420
gtcattggca ggtgtcatag gctttgggtg gcaagtcaga gcatagtatg aatgagcaaa 480
ttagtaaaga ctagagataa gagaagactt tgagtactaa ttaagagttt caggagacca 540
gaggagattt taagacttca gtgagaaacc actttctcag gaagcagata aattaatttt 600
atcagcagta tcgtcgtcca tgtaatatgg cttttaaaaa gcacagtgag accttagtag 660
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ctgttaacaa actcgaagac ccagattcgg ggcgtagata agcctgtgta ccttcctacc 840
ttctccaaac agccaacatt agatcaaagg gcaaccttaa tgacacctgg agcacaaacc 900
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
cgggatgtgg ccacctaaca ccagctgtcc cttgggaaga cagacctctc ctgtgtgctt 60
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aacccctgct ctgtcccagg ctccccctcc cgcatctcaa tgagccatgt cccgcagggt 360
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cagtcagctg ggcagagaag agaggacatc aaagatggtc aggaagaaca tgagaaacta 480
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tctgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtctgtg tgtctgcaca aagtgtgtct 1020
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ctgaaacaca gacaaaagga gaaacagaag gagggacaag gaggcaggac ttagagagga 1140
ggggacagag aggtgtcctg ggcctgaccc tgcccatgag cttgagaatt gctcctgccc 1200
tgggaagagg ctcagcacag aaagaggaag gacagcacag ctgacagcc 1249
<210> 17
<211> 1635
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
cacacggact ctgtcagctc ctccctgacc tgggggccgc caacctaaca ccactccccc 60
tgcagggagc tcctccccac acacctgctc cttccctggg cccagctaaa ggcatctccc 120
agggcagtgc tggtgcacgc gacactacac tgggtgcttt cccctcgtgg cctccctcca 180
tcctcatcaa ctcgttctgt cactgctccc taaatgcctg cccctgctcc atctgtcctg 240
ttctctgggg catcccaggc caagcctagc actgacacag aacagtggct gcctgagggc 300
ccacagcctc cccgggaatc agccaggcac cctgtgtcct gcctgctccc tgcaccccgg 360
ggggctcaga gcacgtgtga tgctcacaca caggcaccat ccgggatgtg gccacctacc 420
cccagctgtc ccttgggaag acagacctct cctgtgtgct tgctgggaga agggggatgt 480
tattgctctt tgctcccaga acacaactca cccccacacg cccactcagg tgtgagcaac 540
gtccctccag acaggctctc tggccactac ctgttcctcc tctacacaca gcagcttggc 600
caggtcaaaa acctcaggac agacccctgg gtatgtcggc acatggatgg ctgagcccat 660
catggccaca gagtaagttg ggatgaatct ctccagctct gaacccctgc tctgtcccag 720
gctccccctc ctgcatctca atgagccatg tcccccgggg ttcctgggta actccccact 780
tcctcctgca ccaccacggg gaaggtgtgg tgaccacagg acaataagct gggcagagaa 840
gagaggacat caaagatggt caggaagaac atgagaaacc atgagctcca gctcagccgc 900
cagaccccag ggagccatag agtgaccgag aactgtccct ttgactatgg gactcacagc 960
cccccactga gcaaccagca caggcctctc ctcacaagag gcatgagaga ttcatcctgc 1020
acacctccag gaaggacagt ttcctctggg acacccaggt cctgaatgtc catccttgga 1080
agctgcagcc aagctagaca cgattagaaa aaggaaggtt ccctctcatc aggcaacaca 1140
cagctcaccc acagcacaat ggggtgtcac tgtgacaggg acctggttca gctccagcct 1200
cctgcactga aggggagagc cagatgggga tgaaagaggc caaagggcat gaatgtgcac 1260
cccgacccag agccatgggg acagcaggag gctgaggccc aggactctgc ttgcccaacc 1320
tgcagggtat gtttctgact gtgtgggtct gtgtgtgtct cttctgtgtg tgtctgtgtg 1380
tgtgtgtgtc tgcacaaagt gtgtgatgag gcttggtgaa agaatcactg ctgaaaaagg 1440
cagaggcctc cacaattccc agggacctga aacacagaca aaaggaaaaa caggagggac 1500
aaggaggcag gactgagaga ggaggggaca gagaggtgtc ctgggcctga ccccgcccat 1560
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cagctgagag ccatg 1635
<210> 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tgcagggaga agcgggatgt tattgctctt tgctcccaga acacaactca cccccacacg 60
ccccctcagg tgtgagcaag gtccctccag acaggctctc tggccactgc ctgttcctcc 120
tctacacaca gcagcttggc caggtcaaaa ccctcaggac agacccctgg gtatgtcggc 180
acatggaggg ctgagcccat catggccacg gagtaagtca agatgaatct ctccagctct 240
gaacccctgc tctgtcccag gcacaccctc ttgcgtctca acgagccatc tcccttgggg 300
ttcctgggtg actccccact tcctcctgca ccaccacggg gaaggtgtgg tgaccacagg 360
acaatcagct gggcagagaa gagaggacat caaagatggt caggaagaac atgagaaacc 420
ctgagctcca gctcagtggc cagaccccac ggagtcacag agtgaccgag aactgtccct 480
ttgactatgg gactcacagc ccccactgag caaccagcac aggcctctcc tcccaagaga 540
catgagagat tcaccctgca cacctccagg aaggacagtt tcctctggga cacccaggtc 600
ctgagtgtcc atccttggaa gctgcagcca agctagacac gattagagaa aggaagggtc 660
cctctcacca ggcaacacac agctcaccca cagcacaatg gggtgtcact gtgacaggga 720
cctggtgcag ctccagcctc ctgcactgaa ggggagagcc agatggggat gaaagaggcc 780
aaagggcatg aatgtgcacc ccgacccaga gccatgggga cagcaggagg ctgaggccca 840
ggactctgct tgcccaacct gcagggtatg tttctgactg tgtaggtctg tgtgtgtcct 900
tctgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtc 960
tgcacaaagt gtgtgttgag gtttggtgaa agaatcactg ctgaaaaagg cagaggcctc 1020
cacaattccc agggacctga aacacagaca aaaggaaaaa caggagggac aaggaggcag 1080
gactgagaga ggaggggaca gagaggtgtc ctgggcctga ccccgcccat gaacctgaga 1140
ggtgctcctg ccccgggaag aagctcagcg cagaaggagg caggacagca ctgctgagag 1200
ctgtgctcag gaagcttctg gatcctaggc tcatctccac agaggagaac acacagacag 1260
cagagaccat 1270
<210> 19
<211> 1271
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gtgtgtgtgt ttgattgttt gtttttgtct actgccccaa taaattggtt tcttttctta 60
gagtctgatg ctaaagaagt ctcgactcag gaaaaccaca agggtggact tgggaagact 120
caacaggttg taatgactct ccagcaaatc atgtcaccat gccatttgat gatggtagga 180
agaaacaaag ccttgaagat tcatgcattg agagaataag agttagtgag taaaccagat 240
gtgtttcagg actgggaccc tgcagtcatc aaccacctca cacctgcgtc agtaacaaac 300
ccaagctaca gcatgatttt tgttctacct cagcagatat tttatagatg gaaaaactga 360
ggcataaagt gggtaaatac ctcccccaag gtcacgagat aaagataacg cagtcatcaa 420
atattctgtc tcctcaacat ctgtcttact ggaattcttg atggattggt acccccttat 480
tatagtactg attttaacat aggttggttt tgaatactgg gtttttaaaa atcttttcaa 540
atcatttgta aattatggaa atgtatacat cacatgaaac ttaccatttt aatcattttt 600
aagtgcacag tttagtttaa gtacattcac attgttgtgc actgatccat cactatacct 660
ttttcatctg ctccagctca aactctgtac ccattaaaca ataacttccc tttgcctcat 720
ccctccaggc cctggcaacc acctctgaat gctattttat agcaaaaaga aatattaact 780
tttgagcttg gtttacaacc aaaaaccaca attacatgca ggagagaggg ggtgggaaaa 840
agaggttaac tcagaactca gttacttaga agactctgtg agtgtgctgt gtgtgtgtgt 900
ctttaaaaga ctctccacct cccagcccgc ctcctcacac tttgccactg ggttgttcag 960
tccccaggtt ccctcagtcc ccagaaggag ccagcatgga caatctcctt tacagtttcg 1020
gaagcaggtt tgttgccatg gagttcacat tttgacggga gttgagaagt ataaaggtaa 1080
ccatttgttt tagtttcaac gatctgacaa aaagataggc tgttgctctt cttctggaaa 1140
agcctgattg gtaagattcc tttaagggct cagccccaaa gagctttatc ccatcccctc 1200
gcagactgaa aactaaagcc tgcagagacc tctgaaggaa aacctgtccc gggctctgtc 1260
acttcacacc c 1271
<210> 20
<211> 1679
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
aaggcaggca acaaaccaca gtagtattat cagtacctac aactttgttt cctacagaaa 60
ttattttcat actcagtaag ttgttgcaga tatcttgaac aattatacgt atatattcct 120
taagtattat atatataata tttttatatt ctgtatatat ttttggagac agggttttgc 180
tctgtctccc aggctggagt gctgtagcat gatcggaact cactgtaacc tcaaactcct 240
gggctctagt gatccttcca gcctcagtct tggaatagct aggactacaa gtactcccca 300
ccatacccag ctgttaattt tttttttttt cgtaaagaca aggtctcact atcttgccca 360
ggctgctctc caactcttgg acacaagcct cctgcatagg tctcccaaag cattgggttt 420
acaggtgtga gccaccgtgc ctggctaata ctatgtattt aatttcatgc gtttagaaat 480
atgtgctatt ttaagaaggc gtctacaggt tttatcacat taccaaaggt gttcatggca 540
caagtgaaga aatctctaga tactagagta ataaaaacca tgatgcatta gaacggatca 600
ggcccatatc aaacgttcaa catacagtct gctgctatgg ttcttttttt tttttttttt 660
ttttttttga gacagagtct cattctgtct cccaggctgg agtgcagtgg agtgatctcg 720
gctcactgca acctctgcct cccgggttta tgccattctc ctgcctcagc ctcccaagta 780
gaggaactgc aaggcgctcc accatgcccg gctacttttt gtatttttag tagaaatggg 840
gtttccccat gttacggcag gctggtcttg aactcctgac ctcaggtgag ccacctgcct 900
cagcctccca aagtgctggg attacaggca tgagccacca tgtccagtct gctatggttc 960
ttaaaatatt catagaatag aaattgaagt aagtctattc gtttttatat taaaagtagc 1020
tagtacggtg ctctgtactt atgcactcca tggatgctga atgagtcatt gaatgaagtg 1080
gagtctaggt tgtgcctcag gccttccagt ggggctggaa ggaacagttg tgaagttgtg 1140
gggcggcttc tgtgcatcgg gggactctgg agttagatgg tttcccaggg ctctgaagga 1200
gaagagctgt gttcctaata atgatctcaa tgggaataga gattgctggg gaccgcaggg 1260
gccaggttgt cattccccaa agcttcccct tcatcatcca agaaggcatt caggtctttc 1320
tgtgctaggc cccaggtaaa gtgctggact acccagtaat tgggttcagt agcaggatgg 1380
cctcagattg aggtcccagg gccaaaggac cactcctctc ctcagcgctg gtccgggaaa 1440
ggcaagctcc gggcgggagc gcacgccgcg cccccgaagc ctggctccct cgccacgccc 1500
acttcctgcc cccatcccgc gcctttccag gtcttctccc ggtgaaccgg atgctctgtc 1560
agtctcctcc tctgcgtcct cggccgcggc ccgggtccct cgcaaagccg ctgccatccc 1620
ggagggccca gccagcgggc tcccggaggc tggccgggca ggcgtggtgc gcggtagga 1679
<210> 21
<211> 1326
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
gcttagggga taaactaatt tgaagataca gcttgcctcc gataagccag aattccagag 60
cttctggcat tataatctag caaggttaga gatcatggat cactttcaga gaaaaacaaa 120
aacaaactaa ccaaaagcaa aacagaacca aaaaaccacc ataaatactt cctaccctgt 180
taatggtcca atatgtcaga aacagcactg tgttagaaat aaagctgtct aaagtacact 240
aatattcgag ttataatagt gtgtggacta ttagtcaata aaaacaaccc ttgcctcttt 300
agagttgttt tccatgtaca cgcacatctt atgtcttaga gtaagattcc ctgagaagtg 360
aacctagcat ttatacaaga taattaattc taatccacag tacctgccaa agaacattct 420
accatcatct ttactgagca tagaagagct acgccaaaac cctgggtcat cagccagcac 480
acacacttat ccagtggtaa atacacatca tctggtgtat acatacatac ctgaatatgg 540
aatcaaatat ttttctaaga tgaaacagtc atgatttatt tcaaataggt acggataagt 600
agatattgag gtaagcatta ggtcttatat tatgtaacac taatctatta ctgcgctgaa 660
actgtggctt tatagaaatt gttttcactg cactattgag aaattaagag ataatggcaa 720
aagtcacaaa gagtatattc aaaaagaagt atagcacttt ttccttagaa accactgcta 780
actgaaagag actaagattt gtcccgtcaa aaatcctgga cctatgccta aaacacattt 840
cacaatccct gaacttttca aaaattggta catgctttag ctttaaacta caggcctcac 900
tggagctaga gacaagaagg taaaaaacgg ctgacaaaag aagtcctggt atcctctatg 960
atgggagaag gaaactagct aaagggaaga ataaattaga gaaaaactgg aatgactgaa 1020
tcggaacaag gcaaaggcta taaaaaaaat tagcagtatc ctcttggggg ccccttcccc 1080
acactatctc aatgcaaata tctgtctgaa acggtccctg gctaaactcc acccatgggt 1140
tggccagcct tgccttgacc aatagccttg acaaggcaaa cttgaccaat agtcttagag 1200
tatccagtga ggccaggggc cggcggctgg ctagggatga agaataaaag gaagcaccct 1260
tcagcagttc cacacactcg cttctggaac gtctgaggtt atcaataagc tcctagtcca 1320
gacgcc 1326
<210> 22
<211> 1306
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
aataagccag atttccagag tttctgacgt cataatctac caaggtcatg gatcgagttc 60
agagaaaaaa caaaagcaaa accaaaccta ccaaaaaata aaaatcccaa agaaaaaata 120
aagaaaaaaa cagcatgaat acttcctgcc atgttaagtg gccaatatgt cagaaacagc 180
actgagttac agataaagat gtctaaacta cagtgacatc ccagctgtca cagtgtgtgg 240
actattagtc aataaaacag tccctgcctc ttaagagttg ttttccatgc aaatacatgt 300
cttatgtctt agaataagat tccctaagaa gtgaacctag catttataca agataattaa 360
ttctaatcca tagtatctgg taaagagcat tctaccatca tctttaccga gcatagaaga 420
gctacaccaa aaccctgggt catcagccag cacatacact tatccagtga taaatacaca 480
tcatcgggtg cctacataca tacctgaata taaaaaaaat acttttgctg agatgaaaca 540
ggcgtgattt atttcaaata ggtacggata agtagatatt gaagtaagga ttcagtctta 600
tattatatta cataacatta atctattcct gcactgaaac tgttgcttta taggattttt 660
cactacacta atgagaactt aagagataat ggcctaaaac cacagagagt atattcaaag 720
ataagtatag cacttcttat ttggaaacca atgcttacta aatgagacta agacgtgtcc 780
catcaaaaat cctggaccta tgcctaaaac acatttcaca atccctgaac ttttcaaaaa 840
ttggtacatg ctttaacttt aaactacagg cctcactgga gctacagaca agaaggtgaa 900
aaacggctga caaaagaagt cctggtatct tctatggtgg gagaagaaaa ctagctaaag 960
ggaagaataa attagagaaa aattggaatg actgaatcgg aacaaggcaa aggctataaa 1020
aaaaattaag cagcagtatc ctcttggggg ccccttcccc acactatctc aatgcaaata 1080
tctgtctgaa acggtccctg gctaaactcc acccatgggt tggccagcct tgccttgacc 1140
aatagccttg acaaggcaaa cttgaccaat agtcttagag tatccagtga ggccaggggc 1200
cggcggctgg ctagggatga agaataaaag gaagcaccct tcagcagttc cacacactcg 1260
cttctggaac gtctgaggtt atcaataagc tcctagtcca gacgcc 1306
<210> 23
<211> 2000
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gctgtggaga agctgagaca gtcgtaggag ccttattcat tcaaaccata cgttttcctc 60
tgtgcctttt tcccatatcc tagttcccta gctctcccat ttttgaatac agctgcatta 120
taaaccaaat ttactatgaa gtcctttgct gtggaggcaa tgttgttcca gagtcaacga 180
ggaagactaa tggccaaaac atagtggagg tgctgtgtgt gagtcaacca cttgtaccac 240
tataccactg gggggcccca gtctaagctc tgcttatgcc tatcttgaga tgcaattaca 300
cccaatttcc aatgtgaact cttgcctgag tctcattcat gtgggctatg agaaaaagga 360
tggatatggg agaagaagta gtgataaggg ctgtctctac atggatggaa ggacttggag 420
ggaaactaaa aggtctgaag ttagaagact cacaggtatg aagaacagag gaggaaatgt 480
tgctgcaacc ttttgaaggt cgaggcctgc aactttccca gtgttctttc agcgtttctt 540
cagattttgt gtcctgtagt agctgctacc aggtgctctg gttttccgag ctccctacca 600
ctagcctgac tgaaaagtgg ttatagtttc ttatttttat ctcccctgaa gactatcccc 660
caagcagctt gcacttccag gatttgatgc tgatctctaa gcagatagag atagagcagc 720
aaaggagtca gggtgacttc tcagattcct gaatcttacc gactttatac agtcccttgt 780
agccagatcc agagagttaa ttttttgcaa cttcaagctc aaaactgaag acatactttg 840
tgtatagcat tttgctagct attaggaatt caatatgagc aaaagagttt tactcactgc 900
cctgcctcaa tgaatttatg atcttatagc aagaattgtg caaattgtga ctatataatt 960
cacattatat ataattacaa actatgagaa atggtgtaaa gaaaaagatg aggagctgtg 1020
aaatagcatg aacagggtct tgatctagtc tggggagaaa ggaaaggctt ctgtgagtgt 1080
gtactgcaaa ctagaatcca aaaagtggta agaattaagt aggtaaagct ttcaaggcgg 1140
agggaagagc tttcctgcag aagagctatt atgtacaaag gcactgaggt aggaggtgca 1200
taacacatag aagatgccct tgggatctca gactagatcc ttgtttgcat tcaaggatgc 1260
cttccattaa ccatgtactt ctagggtaaa agtgttgcaa ttcataaatc aagccagtaa 1320
ataatgcttt ccagtccata tgcacacaaa tgtgtcaggt aaacccactg tagagaaacg 1380
cacaaacaca caatacacat ccacttaaat atgtcttcac atgggtatat tctatgtaca 1440
tatgtacaag catacataca aaacacagtc tgttaaatca gagtttcatc gcaaaatgga 1500
agtgtaaacc taagaaacat tcacagtatt ttcctatcaa ggaagtaaag aggtcttgat 1560
gggggatacc taaaagtggc tgtggtgtgt gtttagatgt cagagactca gtactgggag 1620
agagggaacc tctacttgga gctcaggata ttttgatcag cctgtgtaac ttagagctgc 1680
tagcacacgg tttaaaggag ataaaagcag cctttgggaa aacatttatt ctagcgattt 1740
aggtttcaat gtttaggtgg agcacaaggt tcctgatatg atttggctct gtggccccac 1800
ccaaatctca tcttgtagct cccataattc ccacctgttg tgggagggac ctggtgtgag 1860
atgattgaat catgggggtg ggtctttccc atgctgttct cgtgacagtg aatgggtctc 1920
acgagatctg atggttttaa aaaccggagt tgctctacac aagctctctt tttgcctgct 1980
gccattccag taggatgtga 2000
<210> 24
<211> 3309
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tctgacctga gattggcggc actgaggtag agatgcccga acccccccga gggagcgcgg 60
gacgcgccgg ggagggctgg ggccggggag ggctggggcc ggggagggct ggggccgggg 120
agggctgggg ccggggaggg ctggggccgg ggagggctgg ggccggggag ggctggggct 180
ggggagggct ggggctgggg agggggcggt ggtgtgtagc aggagcggtg tgttgcgccg 240
gggtacgtct ggaggagcgg gaggtgcgcg gtgacgtgtg gatgaggaac aggagttgtt 300
gcgcggtgag ttgtcgctgt gagttgtgtt gttgggcagg tgtggtggat gacgtgacgt 360
gtgacgtgcg gagtgcgccg tgctctgttg gtttcacctg tggcagcccg ggccccccgc 420
gggcgcgcgc gcgcgcaaaa aaggcgggcg gcggtccggg cggcgtgcgc gcgcgcggcg 480
ggcgtggggg gcggggccgc gggagcgggg ggaggagcgg ggggaggagc ggggggagga 540
gcggggggag gagcgggggg aggagcgggg ggaggagcgg ggggaggagc ggggggagga 600
gcggggggag gagcgggggg aggagcgggg ggaggagcgg ggggaggagc ggggggagga 660
gcggggggag gagcgggggg aggagcgggg ggaggagcgg ggggaggagc ggggggagga 720
gcggccagac gccgaaaacg ggcccccccc aaaacacacc ccccgggggt cgcgcgcggc 780
cctttaaagc ggtggcggcg ggcagcccgg gccccccgcg gccgagacta gcgagttaga 840
caggcaagca ctactcgcct ctgcacgcac atgcttgcct gtcaaactct accaccccgg 900
cacgctctct gtctccatgg cccgccgccg ccgccatcgc ggcccccgcc gcccccggcc 960
gcccgggccc acgggcgccg tcccaaccgc acagtcccag gtaacctcca cgcccaactc 1020
ggaacccgcg gtcaggagcg cgcccgcggc cgccccgccg ccgccccccg ccggtgggcc 1080
cccgccttct tgttcgctgc tgctgcgcca gtggctccac gttcccgagt ccgcgtccga 1140
cgacgacgat gacgacgact ggccggacag ccccccgccc gagccggcgc cagaggcccg 1200
gcccaccgcc gccgcccccc ggccccggcc cccaccgccc ggcgtgggcc cggggggcgg 1260
ggctgacccc tcccaccccc cctcgcgccc cttccgcctt ccgccgcgcc tcgccctccg 1320
cctgcgcgtc accgcggagc acctggcgcg cctgcgcctg cgacgcgcgg gcggggaggg 1380
ggcgccggag ccccccgcga cccccgcgac ccccgcgacc cccgcgaccc ccgcgacccc 1440
cgcgcgggtg cgcttctcgc cccacgtccg ggtgcgccac ctggtggtct gggcctcggc 1500
cgcccgcctg gcgcgccgcg gctcgtgggc ccgcgagcgg gccgaccggg ctcggttccg 1560
gcgccgggtg gcggaggccg aggcggtcat cgggccgtgc ctggggcccg aggcccgtgc 1620
ccgggccctg gcccgcggag ccggcccggc gaactcggtc taacgttaca cccgaggcgg 1680
cctgggtctt ccgcggagct cccgggagct ccgcaccaag ccgctctccg gagagacgat 1740
ggcaggagcc gcgcatatat acgcttggag ccagcccgcc ctcacagggc gggccgcctc 1800
gggggcggga ctggccaatc ggcggccgcc agcgcggcgg ggcccggcca accagcgtcc 1860
gccgagtctt cggggcccgg cccattgggc gggagttacc gcccaatggg ccgggccgcc 1920
cacttcccgg tatggtaatt aaaaacttgc aagaggcctt gttccgcttc ccggtatggt 1980
aattagaaac tcattaatgg gcggccccgg ccgcccttcc cgcttccggc aattcccgcg 2040
gcccttaatg ggcaaccccg gtattccccg cctcccgcgc cgcgcgtaac cactcccctg 2100
gggttccggg ttatgctaat tgcttttttg gcggaacaca cggcccctcg cgcattggcc 2160
cgcgggtcgc tcaatgaacc cgcattggtc ccctggggtt ccgggtatgg taatgagttt 2220
cttcgggaag gcgggaagcc ccggggcacc gacgcaggcc aagcccctgt tgcgtcggcg 2280
ggaggggcat gctaatgggg ttctttgggg gacaccgggt tgggccccca aatcgggggc 2340
cgggccgtgc atgctaatga tattctttgg gggcgccggg ttggtccccg gggacggggc 2400
cgccccgcgg tgggcctgcc tcccctggga cgcgcggcca ttgggggaat cgtcactgcc 2460
gcccctttgg ggaggggaaa ggcgtggggt ataagttagc cctggcccga cagtctggtc 2520
gcatttgcac ctcggcactc ggagcgagac gcagcagcca ggcagactcg ggccgccccc 2580
tctccgcatc accacagaag ccccgcctac gttgcgaccc ccagggaccc tccgtccgcg 2640
accctccagc cgcatacgac ccccatggag ccccgccccg gagcgagtac ccgccggcct 2700
gagggccgcc cccagcgcga ggtgaggggc cgggcgccat gtctggggcg ccatattggg 2760
gggcgccata ttggggggcg ccatgttggg ggacccccga cccttacact ggaaccggcc 2820
gccatgttgg gggaccccca ctcatacacg ggagccgggc gccatgttgg ggcgccatgt 2880
tagggggcgt ggaaccccgt gacactatat atacagggac cgggggcgcc atgttagggg 2940
gtgcggaacc ccctgaccct atatatacag ggaccggggt cgccctgttg ggggtcgcca 3000
tgtgaccccc tgactttata tatacagacc cccaacacat acacatggcc cctttgactc 3060
agacgcaggg cccggggtcg ccgtgggacc ccctgactca tacacagaga cacgccccca 3120
caacaaacac acaaggaccg gggtcgccgt gttgggggcg tggtccccac tgactcatac 3180
gcaggccccc cttactcaca cgcatctagg ggggtgggga ggagccgccc gccatatttg 3240
ggggacgccg tgggaccccc gactccggtg cgtctggagg gcgggagaag agggaagaag 3300
aggggtcgg 3309
<210> 25
<211> 1666
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
cccaggttcc gccggacacc tgcagcaaac ggcaccacgt gcgcggggcc agacgggctc 60
ggcagtatcc catcaggtaa cagtcgcgta tcaggtggcg caggcggttg gcactgccgt 120
gggggtcccg ggcgacccgc aggacccgaa acagctgatt gatacactgg cgcatgtagc 180
ccaggtcggg ggtccatcgt gcgctgctcc gcctctgggc ctggcgcacc gagcgccgta 240
gcattgcatt tgggcttggg gccgacgggg tgggggcccg gggctgcgtt tcccgggtag 300
accggacccg ccccatctta ggaaaaataa ccccatcccg ccgatcggga gagctcgtga 360
gccgcaggtt tacccgggcc cgcttgggtc gtgggggaat gtcgtcataa gaccagtcgg 420
acgtgtcgtc ggggtcgtcc gacaccgacg catccgtttc cgtccccgtg gtggattccg 480
ccgacatgtc cagaaaaaac cgccccccaa gcctccgggg ggccctacgg ccaccgatgc 540
ggggggcttc atcctggtcc ccagactcgg tcgaatccga tgctgtctcg gattcgacct 600
cagactccaa ggctgtatcg gattctacct cagactccga tgagaggggg cgggaagggc 660
gcttgcgctt gcgcgtgccc aggggcgggg atcggagagc gggacgccgc gcttttacac 720
aaggcgcaaa agcgcctggg gaaatgtcgg ccatccagaa aacgtcccgg aggaccacag 780
tggcttcccc ccgcccgacg agcaggaagc ggtccacgca acggtcgccg ccggtcgcct 840
cgacgaggac gttcctcctg cgggaaggca cgaacgcggg tgagccccct cctccgcccc 900
cgcgtccccc ctcctccgcc cccgcgtccc ccctcctccg cccccgcgtc ccccctcctc 960
cgcccccgcg tcccccctcc tccgcccccg cgtccccccc tcctccgccc acccaaggtg 1020
cttacccgtg caaaaaaggc ggaccggtgg gtttctgtcg tcggaggccc ccggggtgcg 1080
tcccctgtgt ttcgtgggtg gggtgggcgg gtctttcccc cccgcgtccg cgtgtccctt 1140
tccgatgcga tcccgatccc gagccggggc gtcgcgatgc cgacgccgtc cgctccgacg 1200
gccctctgcg actcccgctc ccggtccgcg tgctccgcag ccgctcccgt cgttcgtggc 1260
cggcgccgtc tgcgggcgtc ggtcgcgccg ggcctttatg tgcgccggag agacccgccc 1320
cccgccgccc gggcccgccc ccggggccgg cgcggagtcg ggcacggcgc cagtgctcgc 1380
acttcgccct aataatatat atatattggg acgaagtgcg aacgcttcgc gttctcactt 1440
cttttacccg gcggccccgc ccccttgggg cggtcccgcc cgccggccaa tgggggggcg 1500
gcaaggcggg cggcccttgg gccgcccgcc gtcccgttgg tcccggcgtc cggcgggcgg 1560
gaccgggggg cccggggacg gccaacgggc gcgcggggct cgtatctcat taccgccgaa 1620
ccgggaagtc ggggcccggg ccccgccccc tgcccgttcc tcgtta 1666

Claims (25)

1.胎儿滋养层细胞特异性表达基因的启动子，其特征在于所述启动子为选自SEQ IDNO:1-SEQ ID NO:20的任一项的启动子。
2.胎儿有核红细胞特异性表达基因的启动子，其特征在于所述启动子为选自SEQ IDNO:21-SEQ ID NO:23的任一项的启动子。
3.重组I型单纯疱疹病毒，其特征在于所述病毒剔除了与致病性相关的基因片段，并且将病毒基因组ICP野生型启动子替换为胎儿滋养层细胞特异性表达基因或有核红细胞特异性表达基因的启动子，并且其中插入了用于示踪重组I型单纯疱疹病毒的标记物。
4.根据权利要求3的重组I型单纯疱疹病毒，其特征在于所述重组I型单纯疱疹病毒剔除了与致病性相关的ICP34.5基因。
5.根据权利要求3的重组I型单纯疱疹病毒，其特征在于病毒基因组ICP4野生型启动子替换为胎儿滋养层细胞特异性表达基因或有核红细胞特异性表达基因的启动子。
6.根据权利要求3的重组I型单纯疱疹病毒，其特征在于所述胎儿滋养层细胞特异性表达基因的启动子为选自SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:20的任一项的启动子，所述胎儿有核红细胞特异性表达基因的启动子为选自SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:23的任一项的启动子。
7.根据权利要求4的重组I型单纯疱疹病毒，其特征在于所述重组I型单纯疱疹病毒中在剔除ICP34.5基因的位置处插入了荧光蛋白表达盒。
8.根据权利要求7的重组I型单纯疱疹病毒，其特征在于所述荧光蛋白表达盒选自绿色荧光蛋白表达盒、青色荧光蛋白表达盒、红色荧光蛋白表达盒和黄色荧光蛋白表达盒。
9.一种用于制备本发明的重组I型单纯疱疹病毒的制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)将野生型I型单纯疱疹病毒株的基因组ICP4野生型启动子替换为胎儿滋养层细胞的启动子或有核红细胞特异性表达基因的启动子；(2)从野生型I型单纯疱疹病毒株中剔除致病基因；以及(3)在基因组中插入荧光蛋白表达盒。
10.根据权利要求9的用于制备本发明的重组I型单纯疱疹病毒的制备方法，其特征在于所述野生型I型单纯疱疹病毒株为野生型I型单纯疱疹病毒17+株。
11.根据权利要求9的用于制备本发明的重组I型单纯疱疹病毒的制备方法，其特征在于所述胎儿滋养层细胞特异性表达基因的启动子为选自SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:20的任一项的启动子，以及所述胎儿有核红细胞特异性表达基因的启动子为选自SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:23的任一项的启动子。
12.根据权利要求9的用于制备本发明的重组I型单纯疱疹病毒的制备方法，其特征在于从野生型I型单纯疱疹病毒株中剔除致病基因ICP34.5基因。
13.一种用于制备本发明的重组I型单纯疱疹病毒的制备方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
(1)提取野生I型单纯疱疹病毒株的全长病毒DNA；
(2)构建胎儿滋养层细胞或胎儿有核红细胞特异性表达基因的启动子连接ICP4基因的质粒；
(3)构建ICP4稳定表达的BHK-ICP4细胞株；
(4)构建插入了荧光蛋白表达盒eGFP，并且含有ICP4基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的质粒；
(5)构建剔除ICP4基因的重组I型单纯疱疹病毒；
(6)构建替换ICP4基因野生型启动子的重组I型单纯疱疹病毒；
(7)提取步骤(6)获得的重组I型单纯疱疹病毒的全长病毒DNA；
(8)构建含有ICP34.5基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的质粒；以及
(9)构建剔除ICP34.5基因的重组I型单纯疱疹病毒。
14.一种用于制备本发明的重组I型单纯疱疹病毒的制备方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
(1)提取野生I型单纯疱疹病毒17+株的全长病毒DNA；
(2)构建pcDNA3-NHN-Np-ICP4质粒：
(2.1)构建pcDNA3-NHN质粒，将合成的核苷酸序列NheI-HpaI-NheI插入pcDNA3的EcoRⅤ位点即获得pcDNA3-NHN质粒；
(2.2)将合成的胎儿滋养层细胞或有核红细胞特异性表达基因的启动子的单链DNA退火形成双链DNA，并分别插入(2.1)获得的pcDNA3-NHN的NruI/HindIII的位点，形成一系列的质粒，统称为pcDNA3-NHN-Np；
(2.3)使用如下所示的引物，以步骤A得到的全长病毒DNA为模板，分三段PCR扩增ICP4基因：
ICP4-1st正向引物1：ttttttgaattc147105atggcgtcggagaacaagcagcgcc147129
反向引物2：148279tggagccaccccatggcctccgcgt148255
ICP4-2nd正向引物3：148205cgacgccgcgcagcagtacgccctg148229
反向引物4：149739cggcgggggcgggcccggcgcaccg149715
ICP4-3rd正向引物5：149675cctcatgtttgacccgcgggccctg149699
反向引物：ttttttctcgag151001ttacagcaccccgtccccctcgaac150977
(2.4)将步骤(2.3)获得的ICP4-1st序列用EcoRI/BsrGI处理，ICP4-2nd序列用BsrGI/PvuI处理，ICP4-3rd序列用PvuI/XhoI处理；和
(2.5)将步骤(2.4)获得的基因序列插入步骤(2.2)获得的pcDNA3-NHN-Np质粒的EcoRI/XhoI位点，得到胎儿滋养层细胞或有核红细胞特异性表达基因的启动子连接ICP4基因的pcDNA3-NHN-Np-ICP4质粒；
(3)构建ICP4稳定表达的BHK-ICP4细胞株：
(3.1)构建pcDNA3-CMV-ICP4质粒，将(2.5)获得的pcDNA3-NHN-Np-ICP4质粒，用EcoRI/XhoI处理，获得ICP4基因表达盒，插入pcDNA3质粒的EcoRI/XhoI位点，获得pcDNA3-CMV-ICP4质粒；和(3.2)将(3.1)获得的pcDNA3-CMV-ICP4质粒，转染BHK细胞，筛选获得稳定细胞株BHK-ICP4；
(4)将荧光蛋白表达盒eGFP插入含有ICP4基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的pICP4del质粒的EcoRV位点，得到pICP4delGFP质粒；
(5)构建剔除ICP4基因的重组I型单纯疱疹病毒oHSV1-d4GFP：
(5.1)将步骤(1)得到的野生I型单纯疱疹病毒17+株的全长病毒DNA与步骤(4)得到的pICP4delGFP质粒共转染(3.2)获得的BHK-ICP4细胞，全长病毒DNA上的ICP4基因与pICP4delGFP质粒上的荧光蛋白表达盒发生同源重组，发生重组的病毒的毒斑发荧光；和
(5.2)挑选荧光毒斑，纯化出重组I型单纯疱疹病毒oHSV1-d4GFP；
(6)构建替换ICP4基因野生型启动子的重组I型单纯疱疹病毒17+NpICP4：
(6.1)将(2.5)获得的pcDNA3-NHN-Np-ICP4质粒,用PmeI/HpaI处理，获得Np-ICP4基因表达盒，插入pICP4del质粒的SaII/BE位点，获得pICP4del-Np-ICP4质粒；
(6.2)将步骤(5.2)得到的I型单纯疱疹病毒oHSV1-d4GFP病毒DNA与步骤(6.1)得到的pICP4del-Np-ICP4质粒共转染BHK-ICP4细胞，oHSV1-d4GFP荧光蛋白质表达盒与pcDNA3-NHN-Np-ICP4质粒上的胎儿滋养层细胞或有核红细胞特异性表达基因的启动子连接ICP4基因表达盒发生同源重组，发生重组病毒的毒斑无荧光产生；和
(6.3)挑选无荧光毒斑，纯化出重组I型单纯疱疹病毒17+NpICP4；
(7)提取步骤(6.3)获得的重组I型单纯疱疹病毒17+NpICP4的全长病毒DNA；
(8)构建含有ICP34.5基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的质粒pH2dI34.5：
(8.1)使用下述引物，以步骤(1)得到的全长病毒DNA为模板，PCR扩增ICP34.5基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列：
扩增ICP34.5基因上游侧翼区序列：
正向引物：AAATCAGCTG124356CGGTGAAGGTCGTCGTCAGAG124376
反向应物：AAATTCTAGA125661GCCGGCTTCCCGGTATGGTAA125641
扩增ICP34.5基因下游侧翼区序列：
正向引物：AAATGATATC126943CAGCCCGGGCCGTGTTGCGGG126963
反向应物：AAATAGATCT127640CTCTGACCTGAGTGCAGGTTA127620
(8.2)将步骤(8.1)扩增所得PCR产物上游侧翼区序列插入到pSP72质粒的PvuII/XbaI位点，得到pSP72H2d34.5US质粒；
(8.3)将步骤(8.1)扩增所得PCR产物下游侧翼区序列插入到步骤(8.2)获得的pSP72H2d34.5US质粒的EcoRV/BglII位点，得到含ICP34.5基因上游侧翼区序列和下游侧翼区序列的pH2d34.5质粒；和
(8.4)将荧光蛋白表达盒插入到步骤(8.3)获得的pH2d34.5质粒的EcoRV位点，得到pH2d34.5GFP质粒；
(9)构建剔除ICP34.5基因的重组I型单纯疱疹病毒17+NpICP4d34.5GFP：
(9.1)将步骤(7)得到的重组I型单纯疱疹病毒17+NpICP4的全长病毒DNA与步骤(8.4)得到的pH2d34.5GFP质粒共转染BHK-ICP4细胞，全长病毒DNA上的ICP34.5基因与pH2d34.5荧光蛋白质粒上的荧光蛋白表达盒发生同源重组，发生重组病毒的毒斑发荧光；和
(9.2)挑选荧光毒斑，纯化出系列重组I型单纯疱疹病毒17+NpICP4d34.5GFP，所述胎儿滋养层细胞特异性表达基因的启动子为选自SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:20的任一项的启动子，所述胎儿有核红细胞特异性表达基因的启动子为选自SEQ ID NO:21-SEQ ID NO:23的任一项的启动子。
15.由权利要求9-14任一项的方法制备的重组I型单纯疱疹病毒。
16.一种用于妊娠期的产前筛查诊断试剂盒，其特征在于所述试剂盒中的活性成分为上述权利要求3-8和15任一项的重组I型单纯疱疹病毒。
17.一种用于妊娠期的产前筛查诊断试剂盒，其特征在于所述试剂盒由上述权利要求3-8和15任一项的重组I型单纯疱疹病毒与红细胞裂解液及磷酸缓冲液组成，重组I型单纯疱疹病毒与红细胞裂解液及磷酸缓冲液分别在不同的盒中。
18.根据权利要求17的产前筛查诊断试剂盒，其特征在于病毒滴度为1×107cfu，红细胞裂解液为pH7，由0.15M氯化铵、10nM碳酸氢钾和1nM乙二胺四乙酸组成，磷酸缓冲液pH为7.3。
19.一种用于妊娠期的产前筛查诊断试剂盒，其特征在于所述试剂盒由上述权利要求3-8和15任一项的重组I型单纯疱疹病毒与聚蔗糖-泛影葡胺及磷酸缓冲液组成，重组I型单纯疱疹病毒与聚蔗糖-泛影葡胺及磷酸缓冲液分别在不同的盒中。
20.根据权利要求17的产前筛查诊断试剂盒，其特征在于聚蔗糖-泛影葡胺的比重为1.077±0.001千克/立方米，磷酸缓冲液的pH为7.3。
21.一种用于从妊娠期母体血液样品中分离胎儿细胞的方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：(1)采集一定孕周的孕妇的外周血，加入红细胞裂解液；(2)待红细胞裂解后离心，经磷酸缓冲液(PBS)洗涤后，将细胞重悬浮于RPMI-1640中；(3)将步骤(2)得到的细胞与106Pfu/ml的本发明重组I型单纯疱疹病毒悬液混合并加入多孔培养板的孔中；(4)将多孔培养板孵育于含5％CO2的37℃孵箱内；(5)24小时后，收集细胞，洗涤后重悬浮于PBS中，加入APC-CD45抗体，室温下避光孵育30分钟；以及(6)用PBS轻轻洗涤细胞，重悬后，流式分选CD45-/GFP+细胞，获得胎儿细胞。
22.一种用于从妊娠期母体血液样品中分离胎儿细胞的方法，所述方法包括如下步骤：
(1)用EDTA抗凝管取8孕周孕妇外周血5ml，加入45ml红细胞裂解液，室温下孵育10分钟；
(2)待红细胞裂解后，离心(800g，10分钟)；
(3)去上清，将细胞沉淀重悬浮于10ml pH值为7.3的磷酸缓冲液(PBS)中，离心(800g，10分钟)；
(4)去上清，将细胞沉淀重悬浮于2ml RPMI-1640中；
(5)将2ml由步骤(4)得到的细胞与0.1ml本发明重组I型单纯性疱疹病毒悬液(106Pfu/ml)混合并加入6孔培养板的孔中；
(6)将培养板孵育于含5％CO2的37℃孵箱内；
(7)24小时后，收集细胞，将细胞吹打吸至离心管中，离心(500g，5分钟)；
(8)弃掉上清液，每支离心管加3ml PBS轻轻洗涤细胞，离心(500g，5分钟)；
(9)去上清，将细胞沉淀重悬浮于0.4ml PBS中，加入100ul APC-CD45抗体，室温下避光孵育30分钟；
(10)30分钟后每支离心管用4ml PBS轻轻洗涤，离心(500g，5分钟)；以及
(11)离心完成后弃掉上清，加PBS重悬，流式分选CD45-/GFP+细胞。
23.权利要求21或22任一项的方法，其特征在于采用本发明的试剂盒进行上述方法，从而从妊娠早期母体血液样品中分离胎儿细胞。
24.权利要求3-8和15任一项的重组I型单纯疱疹病毒在从妊娠早期母体血液样品中分离胎儿细胞中的应用。
25.权利要求16-20任一项的试剂盒在从妊娠早期母体血液样品中分离胎儿细胞中的应用。
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