KR101764855B1 - 세포포획용 고배향성 항체 고정을 위한 아가로우즈 필름 코팅 마이크로포스트 플레이트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포포획용 고배향성 항체 고정을 위한 아가로우즈 필름 코팅 마이크로포스트 플레이트(agarose film-coated micropost plate)에 관한 것으로, 마이크로포스트 구조체 바닥 및 벽면 표면에 아가로우즈 필름을 효율적으로 코팅한 후 페리오데이트(periodate) 용액으로 아민(amine) 결합이 가능한 알데히드기(aldehyde group)를 다량 생성하였으며, 표면에 말레이미드(maleimide) 및 Ni-NTA기를 도입한 후 광활성 단백질 G 변이체(6H-2×PG4m) 및 항체를 고정하여 고배향성의 세포포획이 가능하고 또한 포획된 세포들을 플레이트에서 직접 배양이 가능함을 밝힘으로써, 상기 아가로우즈 필름 코팅 마이크로포스트 플레이트는 세포포획 및 포획세포 배양을 위한 항체칩(antibody chip)으로 사용될 수 있음을 확인하였다.

Description

세포포획용 고배향성 항체 고정을 위한 아가로우즈 필름 코팅 마이크로포스트 플레이트{Agarose film-coated micropost plate with immobilization of highly oriented antibody for cell capture}

본 발명은 복잡한 구조를 지닌 마이크로포스트칩에 간편하고, 효율적으로 아가로우즈 필름을 코팅하고, 소듐 페리오데이트(sodium periodate)로 산화시켜 알데히드기(aldehyde group)를 유도하여 표면을 활성화시키고 광활성 단백질 G를 고정하여, 고배향성으로 항체를 고정한 세포포획용 아가로우즈 필름 코팅 마이크로포스트 플레이트(agarose film-coated micropost plate) 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

항체(antibody)는 항원(antigen)에 매우 특이적으로 결합하기 때문에 질병의 진단 및 치료에 관련된 연구와 생물학적인 물질을 분석하는데 광범위하게 사용되어왔다(Curr. Opin. Biotechnol. 12, 65-69, 2001; Curr. Opin. Chem. Biol. 5, 40-45, 2001). 최근에는 칩 표면에 항체를 고정 시킨 구조체들을 이용하여, 혈중암세포(circulating tumor cells; CTCs) 등 특정 암세포 및 CD4+ 면역세포를 포획하는 연구들이 시도되고 있다. Nagrath 등(Nature, 450, 1235-39, 2007)은 실리콘-기반 마이크로포스트 마이크로플루이딕 챔버(silicon-base micropost microfluidic chamber; CTC-chip)에 EpCAM 항체를 고정하여, 1 ml/h 속도로 65%의 혈중암세포를 포획하였고 98%의 세포가 계속 살아있는 결과를 보고 하였다. 그러나 속도를 3 ml/h로 증가시키면 회복률(recovery)이 25%로 떨어진다는 결과를 얻어, 다량시료를 분석할 경우, 시간이 오래 걸리는 단점이 있다. 또한 실리콘 플레이트 제조시 미세전자기계시스템(microelectromechanical systems; MEMS)을 사용하여, 시간 및 비용이 많이 드는 단점이 있다. 또한 Adams 등(J. Am. Chem. Soc. 130, 8633-41, 2008)은 마이크로칩-기반 고-처리량 마이크로샘플링 유닛(microchip-based high-throughput microsampling unit)으로 전혈에서 CTC를 한번에 포획하였는데, 이 방법은 폴리메틸 메타아크릴레이트(polymethyl methacrylate; PMMA) 소자로 이루어진 채널을 자외선으로 활성화 시키고 EDC/NHS(N-ethyl-N'-(3-(dimethylamino)propyl)carbodiimide/N-hydroxysuccinimide)법으로 활성화시킨 다음, 직접 항체를 결합시키는 방법을 사용하였다. 이 경우 2 ml/h 속도로 전혈을 흘려줄 경우, 97%까지 세포를 회복할 수 있음을 보고 하였다. 그러나 본 발명자들이 자외선 조사로 PMMA 플레이트를 조사한 결과 원하는 활성화를 얻을 수 없었다. 실제 이러한 구조체는 벽면에 자외선 등의 광원 처리가 어려운 단점이 있어, 간편하고 고효율 표면 마이크로포스트 등의 구조체 표면 활성화가 필수적이다.

마이크로포스트 등의 고체지지물질 표면에 항체 등의 유용 분석물질을 선택적이고 안정적이며 고밀도로 고정화시키는 방법은 매우 중요하다. 항체를 고정화하는 기술로는, 화학적 및 물리적인 고정방법이 있다. 물리적인 방법(Trends. Anal. Chem. 19, 530-540, 2000)은 간편하나 재현성이 적고 단백질을 변성시키기 때문에 거의 사용되지 않고 있으며, 화학적인 방법은 단백질을 공유결합으로 결합시켜 재현성이 좋고 적용범위가 넓으나(Langmur, 13, 6485-6490, 1997), 항체 등과 같이 항원 결합부위 및 근처에 결합이 형성되는 경우 항원 결합 활성을 잃게 되어 결합력이 감소 되는 단점이 있다(Analyst, 133, 697-701, 2008).

이러한 단점을 해결하기 위한 지지체로서 단백질 G(Protein G)를 사용하기도 하는데, 단백질 G는 대부분의 포유동물 면역글로블린 G(IgG) Fc 부위와 강한 결합을 하는 단백질로서, 항체칩 제조시 항체의 배향성을 높인 고감도 칩 제작에 유용하게 사용되고 있다. 또한, 단백질 G를 나노입자 등에 결합시키고 항체를 결합시켜, 표적지향적 전달체 제조에 활용 가능하다. 그러나, 단백질 G와 항체의 결합은 가역적이기 때문에 혈액 시료를 사용하는 경우 혈액 내 항체로 대체될 수 있어 (Saleemuddin, Adv Biochem Eng Biotechnol, 64, 203-26, 1999), 이들 간에 공유 결합 형성이 중요하다. 이들 분자 간의 공유 결합은 화학적으로 유도할 수 있으나, 이들 분자들에 비특이적인 수식을 유발시키는 단점이 있다.

아가로우즈(agarose) 용액은 용융점 온도(melting temperature)가 90℃ 이상이나, 응고점(geling temperature)은 40 내지 45℃ 이하로 일반적으로 아가로우즈 겔(gel)로 만들어져, 상기 아가로우즈 겔은 핵산 전기영동에 많이 이용되고 있다. 아가로우즈 겔은 항체 및 핵산칩 제조에도 이용이 되었는데, 유리 슬라이드 표면에 아가로우즈 겔을 코팅하여 증발시키는 과정으로, 아가로우즈 필름을 만들고, 이를 소듐 퍼리오데이트(sodium periodate)로 활성화하여 직접 단백질 및 핵산을 고정시켜 어레이칩(array chip) 제조에 유용성을 확인하였다(Nucleic acids Res., 28, e66, 2000). 반면 아가로우즈 용액은 점성이 높아, 지름 150 내지 200 ㎛ 및 높이 약 100 ㎛의 마이크로포스트가 약 50 내지 70 ㎛ 간격으로 배열되어 있는 마이크로포스트 구조체에는 효율적으로 채우기 어려운 단점이 있으며, 또한 소수성 표면에 코팅이 안 되는 단점이 있다.

한편, 선행기술 조사 결과, S Gannavaram 등은 실린더형 껍데기 모양의 마이크로포스트 마이크로플루이딕 칩에 관하여 개시하고 있고(2014, dl.umsu.ac.ir), Catherine Alix-Panabie'res 등은 CTC의 탐지 및 분리를 위한 기술 현황에 대하여 개시하고 있으며(Clinical chemistry, 59:1, 110-118, 2013), Celeste M. Nelson 등은 세포배양용 아가로우즈 마이크로웰 플레이트에 관하여 개시하고 있으나(Methods in Molecular Biology, vol. 370: Adhesio Protein Protocols, 2nd edition), 본 발명의 점성을 낮춘 아가로우즈 필름 코팅 방법을 사용하여 50 내지 70 ㎛ 간격으로 배열되어 있는 마이크로포스트 구조체를 채운 플레이트에 관하여는 현재까지 알려진 바 없다.

이에, 본 발명자들은 항체칩 제조에서의 상기 단점을 극복할 수 있는 제조 방법을 개발하고자 노력하던 중, 폴리스틸렌(polystyrene; PS)를 사출 성형하여, 마이크로포스트 구조체 플레이트를 만들고 표면에 산소 플라즈마를 처리한 후 점성을 감소시킨 아가로우즈로 마이크로포스트 전체를 채워 아가로우즈 필름이 코팅된 마이크로포스트 플레이트를 제조하고, 표면활성화 과정 및 고배향성의 항체를 고정하여, 상기 아가로우즈 필름 코팅 마이크로포스트 플레이트는 항체 특이적으로 세포를 포획할 수 있는 항체칩으로 사용이 가능하고 또한 포획한 세포를 상기 항체칩에서 직접 배양이 가능함을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 세포포획용 고배향성 항체 고정을 위한 아가로우즈 필름 코팅 마이크로포스트 플레이트(agarose film-coated micropost plate) 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 아가로우즈(agarose) 필름이 코팅된 세포포획 및 배양용 마이크로포스트 플레이트(micropost plate)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 마이크로포스트 플레이트에 시료를 처리하는 단계를 포함하는 세포포획 및 배양방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 아가로우즈를 에탄올, 메탄올 및 아세토나이트릴(acetonitrile)로 구성된 군으로 부터 선택되는 어느 하나 이상의 용액 및 증류수와 혼합하여 혼합액을 제조하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)의 혼합액을 마이크로포스트 구조체에 코팅하는 단계를 포함하는 세포포획 및 배양용 마이크로포스트 플레이트의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 1) 아가로우즈 필름이 코팅된 마이크로포스트 구조체를 제조하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 구조체에 말레이미드기(maleimide group) 또는 Ni-NTA기를 도입하는 단계; 및 3) 상기 단계 2)의 말레이미드기 또는 Ni-NTA기가 도입된 마이크로포스트 구조체에 항체 또는 지지체가 결합된 항체를 도입하는 단계를 포함하는 세포포획 및 배양용 마이크로포스트 플레이트 제조방법을 제공한다.

본 발명은 사출성형으로 값싸게 생산할 수 있는 플라스틱 마이크로포스트 구조체의 바닥 및 벽면에 아가로우즈 수용액을 내부에 균질하게 채우고, 또한 페리오데이트(periodate) 용액으로 아민(amine) 결합이 가능한 알데히드기(aldehyde group)를 다량 생성하였으며, 궁극적으로 표면에 말레이미드기 및 Ni-NTA기를 도입한 후 광활성 단백질 G 변이체(6H-2×PG4m) 및 항체를 고정하여, 본 발명의 아가로우즈 필름 코팅 마이크로포스트 플레이트는 항체 특이적으로 세포를 포획할 수 있는 항체칩으로 사용이 가능하고 또한 포획한 세포를 상기 항체칩에서 직접 배양이 가능함을 밝힘으로써 세포포획 및 포획세포 직접 배양에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

도 1은 마이크로포스트 플레이트(micropost plate) 구조체의 모양 및 구조체에 아가로우즈 필름(agarose film)을 코팅하는 과정을 나타낸 도이다.
도 2는 마이크로포스트 구조체를 주사형 전자현미경(scanning electron microscope; SEM)으로 측정한 도이다:
A: 아가로우즈 필름을 처리하지 않은 마이크로포스트 플레이트,
B: 1% 아가로우즈 수용액을 처리하여 코팅한 플레이트,
C: 80% 증류수 및 20% 에탄올 용액에 들어있는 1% 아가로우즈 용액을 처리하여 코팅한 플레이트,
D: C 플레이트를 아민기로 활성화시킨 플레이트.
도 3은 자외선 특이 pM(photomethionine) 표지 6H-2xPG4m와 IgG 또는 Fc간의 광활성 공유결합 형성을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 마이크로포스트 플레이트의 제작방법으로, 말레이미드(maleimide)기를 매개하여 N-말단 시스테인(cyctein) 특이적으로 광활성 단백질 G를 고정시킨 플레이트에 항체를 UV 조사에 의해 결합시키는 과정을 나타낸 도이다.
도 5는 도 4의 방법으로 제작한 마이크로포스트 플레이트에 각각 항 EGFR 항체 및 항 HER2 항체를 UV 조사에 의해 결합시킨 다음, 표면에 EGFR을 발현하는 A549 세포 및 HER2를 발현하는 T67 세포들의 결합을 나타낸 도이다:
Micropost: 본 발명의 아가로우즈 필름 코팅된 마이크로포스트 플레이트;
Plain: 대조군;
EGFR: 표피성장인자수용체(epidermal growth factor receptor);
HER2: 인간상피증식인자수용체2(human epidermal growth factor receptor 2).
도 6은 Ni-NTA를 매개하여 N-말단 6×Histidine에 특이적으로 광활성 단백질 G를 고정시킨 플레이트에 항 EGF 항체를 UV 조사에 의해 결합시키고, EGFR을 발현하는 A549 세포들의 결합 및 트립신-EDTA 처리에 의한 세포 회수능을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 마이크로포스트 플레이트칩을 체결하고, 여기에 세포 용액을 교반하면서 일정속도로 주입하는 장치를 나타낸 도이다.
도 8은 말레이미드 기를 매개하여 광활성 단백질 G를 고정시킨 플레이트에 항 HER2 항체를 UV 조사에 의해 결합시킨 다음, 도 5와 같이 체결한 장치에 T67 세포를 일정속도(3 ml/h)로 주입 시, 마이크로포스트 구조체에 포획된 세포들을 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 마이크로포스트 플레이트칩에 포획한 세포들의 세포 성장을 확인하기 위해, 상기 플레이트칩에 세포 배양배지를 첨가한 후 0, 24 및 48시간 후의 세포의 모습을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 아가로우즈 필름이 코팅된 세포포획 및 배양용 마이크로포스트 플레이트(agarose film-coated micropost plate)를 제공한다.

상기 마이크로포스트 플레이트에 코팅된 아가로우즈 필름은 말레이미드기(maleimide group) 또는 Ni-NTA가 도입된 것이 바람직하고, 상기 말레이미드기는 아민기(amine group) 도입 후, 말레이미드기가 순차적으로 도입될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

상기 마이크로포스트 플레이트는 항체가 고정된 것이 바람직하고, 상기 항체는 지지체와 결합된 것이 보다 바람직하다.

상기 마이크로포스트 플레이트는 폴리스틸렌(poly styrene), 플라스틱, 유리판, 금속 및 실리콘으로 구성된 군에서 선택하여 제조될 수 있으며, 폴리스틸렌으로 사출성형하는 것이 바람직하다.

상기 지지체는 단백질 G 또는 단백질 G 변이체인 것이 바람직하고, 단백질 G 변이체인 것이 보다 바람직하다.

상기 단백질 G 변이체는 단백질 G(protein G)의 첫 번째 항체 결합 부위(immunogloblin G binding region C1, PG-C1), 두 번째 항체 결합 부위(immunogloblin G binding region C2, PG-C2) 및 세 번째 항체 결합 부위(immunogloblin G binding region C3, PG-C3)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열 N-말단으로부터 32번째 위치의 글루타민(Gln), 35번째 위치의 아스파라긴(Asn) 및 40번째 위치의 아스파르트산(Asp)이 각각 메티오닌(Met)으로 치환되고, 37번째 위치의 아스파라긴(Asn)이 아르기닌(Arg)으로 치환된 아미노산 서열로 구성된 단백질 G 변이체인 것을 특징으로 하는 마이크로포스트 플레이트인 것이 바람직하고, 상기 단백질 G의 첫 번째 항체 결합 부위는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되고, 상기 단백질 G의 두 번째 항체 결합 부위는 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되며, 상기 단백질 G의 세 번째 항체 결합 부위는 서열번호 3의 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하다.

상기 단백질 G의 첫 번째 항체 결합 부위, 두 번째 항체 결합 부위 또는 세 번째 항체 결합 부위는 1 개 또는 2 개 포함되는 것이 바람직하다.

상기 단백질 G의 치환된 항체 결합 부위는 단백질 G의 첫 번째 항체 결합 부위(서열번호 1: TYKLILNGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE), 두 번째 항체 결합 부위(서열번호 2: TYKLVINGKTLKGETTTEAVDAATAEKVFKQYANDNGVDGEWTYDDATKTFTVTE) 및 세 번째 항체 결합 부위(서열번호 3: TYKLVINGKTLKGETTTKAVDAETAEKAFKQYANDNGVDGVWTYDDATKTFTVTE) 간 아미노산 서열 및 3차 구조가 서로 보존되어 있다(Olsson et al., Eur J Biochem, 168, 319-24, 1987).

상기 본 발명의 마이크로포스트 플레이트는 하기와 같은 방법으로 제조되는 것이 바람직하다:

1) 아가로우즈를 에탄올, 메탄올 및 아세토나이트릴(acetonitrile)로 구성된 군으로 부터 선택되는 어느 하나 이상의 용액 및 증류수와 혼합하여 혼합액을 제조하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 혼합액을 마이크로포스트 구조체에 코팅하는 단계.

상기 단계 2)의 마이크로포스트 구조체는 산소 플라즈마를 처리한 것이 바람직하고, 아가로우즈는 소수성 표면에 코팅하는 것이 어려우므로 산소 플라즈마의 처리는 마이크로포스트 플레이트에 아가로우즈 필름을 코팅하기 위해 마이크로포스트 플레이트 표면을 친수성으로 만드는 것임이 바람직하다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 아가로우즈 필름 코팅 마이크로포스트 플레이트를 제작하기 위하여, 폴리스틸렌(polystyrene)으로 사출성형한 마이크로포스트 플레이트칩을 제작한 후, 20% 에탄올이 들어있는 아가로우즈 용액을 사용하여 마이크로포스트 구조체를 코팅하였고, 그 결과 아가로우즈를 증류수에만 녹여 코팅한 경우보다 마이크로포스트 구조체에 아가로우즈 필름이 비교적 균일하게 코팅됨을 확인할 수 있었다(도 1).

따라서, 상기 제조방법을 이용한 본 발명의 아가로우즈 필름 코팅 마이크로포스트 플레이트는 산소 플라즈마 처리로 아가로우즈 코팅에 용이하며, 또한 점성이 낮은 아가로우즈를 사용하여 50 내지 70 ㎛ 간격의 마이크로포스트 구조체 및 플레이트의 표면을 효율적으로 채울 수 있다.

또한, 본 발명은 하기와 같은 제조방법으로 제조되는 것이 바람직하다:

1) 아가로우즈 필름이 코팅된 마이크로포스트 구조체를 제조하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 구조체에 말레이미드기(maleimide group) 또는 Ni-NTA기를 도입하는 단계; 및

3) 상기 단계 2)의 말레이미드기 또는 Ni-NTA기가 도입된 마이크로포스트 구조체에 항체, 또는 지지체가 결합된 항체를 도입하는 단계.

상기 단계 2)의 말레이미드기는 소듐 페리오데이트(sodium periodate)를 처리하여 알데히드기(aldehyde group)를 도입한 후, 말레이미드기가 도입된 것이 바람직하다.

상기 단계 2)의 말레이미드는 소듐 페리오데이트를 처리하고, 아민기를 도입한 후, 말레이미드기가 도입된 것이 바람직하다.

상기 단계 2)의 말레이미드기의 도입은 단계 1)의 플레이트에 페리오데이트 용액을 처리하여 알데히드기를 도입하고, 양끝에 아민기와 말레이미드기를 갖는 화합물을 처리하여, 말레이미드기를 도입하거나, 단계 1)의 플레이트에 페리오데이트 용액을 처리하여 알데히드기를 도입하고, 양끝에 아민기를 갖는 화합물을 처리하여 아민화된 플레이트를 만들고, 양끝에 N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimde)기 및 말레이미드기를 갖는 화합물을 처리하여 말레이미드기를 도입하는 것이 바람직하다.

상기 단계 2)의 Ni-NTA기의 도입은 단계 1)의 플레이트에 페리오데이트 용액을 처리하여 알데히드기를 도입하고, 비스(카복시메틸)-L-리신(bis(carboxymethyl)-L-lysine)을 처리하여, 니트릴로트리아세트트산(nitrilotriacetic acid)기를 도입하고 니켈 설페이트(nikel sulfate) 용액을 처리하여 Ni-NTA기를 도입하는 것이 바람직하다.

상기 단계 3)은 단계 2)의 말레이미드기 도입 플레이트에 pM이 표지되고 N-말단에 시스테인 잔기를 갖는 광활성 단백질 G 변이체를 도입하고, 상기 플레이트 N-말단에 6xhistidine (6xHis)잔기를 갖는 광활성 단백질 G를 결합시키고 광활성 단백질 G 플레이트에 세포포획용 항체를 광활성 결합시키는 것이 바람직하다.

상기 지지체는 항체에 특이적으로 결합하는 단백질 G 변이체인 것을 특징으로 하는 세포포획 및 배양용 마이크로포스트 플레이트의 제조방법인 것이 바람직하다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 말레이미드기에 의한 마이크로포스트 플레이트 표면의 활성화를 확인하기 위하여, 상기 방법으로 말레이미드기를 도입한 후, 마이크로포스트 플레이트의 표면을 SEM(scanning eletron microscope)으로 측정한 결과, 아민기로 활성화시킨 플레이트에 균일한 한 겹의 층이 더 있는 것을 확인할 수 있었다(도 2).

또한, 본 발명자들은 상기 단백질 G 변이체의 pM(photomethionine) 표지 단백질 G 변이체와 인간 항체 IgG간의 공유결합을 확인하기 위하여, SDS-PAGE 분석 및 공유결합 형성능 분석을 수행한 결과, UV 조사시 pM 도입 단백질 G, 및 IgG 중쇄(heavy chain) 및 Fc 부위와 공유결합이 효과적으로 유도되고, 이때 Met으로 치환된 잔기 수가 많을수록 공유 결합 형성률도 함께 증가함을 확인하였다(도 3).

또한, 본 발명자들은 상기 방법으로 말레이미드기를 매개하여 항체를 고정한 칩에 세포 특이적인 포획능 및 세포 회수능을 확인하기 위하여, A549 및 T67세포를 사용하여 실험을 수행한 결과, 말레이미드기를 매개하여 고정한 항체칩은 항체 특이 세포 결합능이 있고, 비특이적 결합이 거의 없거나 최소로 나타남을 확인할 수 있었다(도 5).

또한, 본 발명자들은 상기 방법으로 Ni-NTA기를 매개한 항체 고정칩으로 세포 포획 및 회수능을 확인한 결과, 상기 Ni-NTA기를 매개한 항체칩에 트립신-0,25% EDTA를 처리하였을 때, 70% 이상의 세포들이 회수됨을 확인할 수 있었다(도 6).

또한, 본 발명자들은 말레이미드기를 매개한 항체칩을 이용하여 유체 조건에서 세포 포획능을 분석한 결과, 세포들이 바닥보다는 마이크로포스트 벽면에 많이 포획됨을 확인할 수 있었다(도 8).

따라서, 본 발명의 아가로우즈 필름 코팅 마이크로포스트 플레이트는 말레이미드기를 매개하여 마이크로포스트 플레이트를 제조하였을 때, 항체 특이 세포 결합능이 있고, 비특이적 결합이 거의 없거나 최소로 나타났으며, 유체 조건에서 세포들이 상기 플레이트의 바닥보다는 마이크로포스트 벽면에 많이 포획되었고, Ni-NTA기를 매개한 마이크로포스트 플레이트를 제조하였을 때는 70% 이상의 세포들을 회수함으로써, 항체 특이적으로 세포를 포획할 수 있는 항체칩으로 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 마이크로포스트 플레이트에 시료를 처리하는 단계를 포함하는 세포포획 및 배양방법을 제공한다.

상기 시료는 세포 배양액, 세포 분쇄액, 세포 또는 조직의 조추출물, 소변, 땀, 타액, 눈물 등 각종 분비액, 또는 혈액, 혈장, 림프액, 혈청 등 각종 체액 등 당업자에게 알려진 모든 생물학적 시료가 사용될 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 상기 항체칩에 포획된 세포들의 성장을 측정하기 위하여, 상기 방법으로 96웰 플레이트에 아가로우즈 필름으로 코팅한 후, 말레이미드기를 도입하고 광활성 단백질 G를 결합하여 EGFR 항체를 자외선 조사 조건에서 결합한 결과, 상기 플레이트에 포획된 세포들이 대부분 단일 세포의 형태로 관찰되었고, 많은 세포들이 시간이 지남에 따라 비 부착 상태로 계속 분열함을 확인할 수 있었다(도 9).

따라서, 본 발명의 아가로우즈 필름 코팅 마이크로포스트 플레이트는 항체 특이적으로 세포를 포획할 수 있는 항체칩으로 사용이 가능하고 또한 포획한 세포를 상기 항체칩에서 직접 배양이 가능함을 밝힘으로써 세포포획 및 포획세포의 직접 배양에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실험예 1> 아가로우즈 필름 코팅 폴리스틸렌 (polystyrene) 사출성형 마이크로포스트 플레이트의 제작

폴리스틸렌으로 사출성형 한 플레이트의 마이크로포스트 구조체에 아가로우즈 필름을 코팅하기 위하여 하기와 같이 수행하였다.

구체적으로 먼저, 성형온도 250℃, 금형온도 70℃, 사출속도 100 mm/sec의 성형조건에서 사출성형한 폴리스틸렌 마이크로포스트 플레이트 칩을 제조하였으며, 여기에 산소 플라즈마를 산소농도 30 sccm 조건에서 30 watt의 전력으로 30초 동안 조사하여 표면의 친수성을 높였다. 상기 구조체에 아가로우즈 필름 코팅을 위하여, 1 g의 아가로우즈를 가열하여 각각 8 ml 및 10 ml의 증류수에 녹이고, 60℃ 내지 70℃에서 식힌 다음, 8 ml에 녹인 용액에는 2 ml의 에탄올을 가하여 최종 1%의 아가로우즈 용액을 만들고, 2cm × 8cm 마이크로포스트 구조체를 60℃로 가열한 평판위에 놓고 0.1 ml의 아가로우즈 용액을 가한 다음 잉여 아가로우즈 용액을 제거하였다. 그 다음, 상기 플레이트를 얼음 위에서 5 내지 10분, 실온에서 1시간 이상 방치하여 아가로우즈 용액을 겔로 만든 후, 60℃에서 20시간 이상 완전히 건조하여 마이크로포스트 구조체 표면에 아가로우즈 필름을 코팅하였다(도 1).

아가로우즈 필름이 코팅 된 마이크로포스트 플레이트는 1cm × 1cm 크기로 자른 다음 SEM으로 분석한 결과, 아가로우즈를 증류수에만 녹여 코팅한 경우, 점도가 높아 코팅이 어려울 뿐만 아니라, 마이크로포스트 구조체에 코팅도 균질하지 않음을 확인할 수 있었다. 반면, 20% 에탄올이 들어있는 아가로우즈 용액으로 코팅한 경우, 마이크로포스트 구조체에 아가로우즈 필름이 비교적 균일하게 코팅되어 있음을 알 수가 있었다. 상기와 같이 제조된 플레이트의 아가로우즈 코팅은 상온에서 수개월 동안 안정하였다.

< 실험예 2> 아가로우즈 필름 표면에 말레이미드기 도입

1cm × 1cm 크기로 절단한 마이크로포스트칩 상의 아가로우즈 필름 표면에 말레이미드기 도입은 직접 도입하는 방법과 먼저 아민기(amine group)를 도입한 후 말레이미드기를 도입하는 방법을 사용하였다.

구체적으로, 24 웰(well) 플레이트에서 각 웰에 1cm × 1cm의 칩을 넣고 먼저 아가로우즈 필름에 20 mM 소듐 페리오데이트 용액을 0.4 ml, 20분간 처리하여 알데히드기(aldehyde group)로 활성화시킨 다음, 증류수로 4 내지 5회 세척하였다. 또한, 직접 말레이미드기를 도입하는 경우에는 PBS(50 mM 소듐 포스페이트(sodium phosphate), 150 mM 소듐 클로라이드(sodium chloride), pH 7.2)에 2-아미노에틸말레이미드(2-aminoethylmaleimide)를 10 mM로 녹여, 0.4 ml을 가하고 1시간 동안 반응시켰다. 그 후, 플레이트를 증류수로 3 내지 4회 세척하여, 말레이미드로 활성화된 칩을 제조하였다.

아민기의 도입은, 상기와 같이 24 웰 플레이트에서 알데히드기로 활성화한 칩에, 100 mM 1,2-bis(2-아미노에톡시)에탄(1,2-bis(2-aminoethoxy)ethane), pH 7.5 용액 0.4 ml을 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, 1% 소듐 시아노보로하이드레이트(sodium cyanoborohydrate)를 처리하여 환원시키고 증류수로 3 내지 4회 세척한 후, 60℃에서 건조하여 사용하였다. 상기 칩은 상온에서 수개월 보관이 가능하였다.

상기 칩의 SEM 이미지를 측정한 결과, 도 2D에 나타난 바와 같이, 도 2C에 비해서 균일한 한 겹의 층이 더 둘러 싸인 구조를 확인할 수 있었다(도 2).

그 후, 말레이미드기를 도입하기 위하여, N-하이드록시숙신이미드(NHS)-3-말레이미도프로피오네이트(N-hydroxysuccinimide(NHS)-3-maleimidopropionate) 또는 NHS-4-말레이미도뷰티레이트(NHS-4-maleimidobutylate)를 10 mg/ml의 농도로 디메틸설폭시드(dimethylsulfoxide)에 녹이고, PBS로 1/10 농도로 희석한 다음 아민기를 도입한 플레이트에 상기 용액 0.1 ml을 가하고 1시간 동안 반응시킨 뒤, 증류수로 세척하였다.

대조군으로는 마이크로포스트가 없는 플레이트 부위에 상기와 같은 방법으로 아가로우즈 필름을 코팅하고, 1cm × 1cm 크기의 칩으로 자른 다음 상기와 동일한 방법으로 표면을 말레이미드기로 활성화하였다.

< 실험예 3> 아가로우즈 필름에 Ni - NTA기 도입

상기 <실험예 2>를 통해 준비한 아가로우즈 필름을 코팅한 칩에 Ni-NTA(nikel-nitrilotriacetic acid)기 도입은 상기와 같은 방법으로 칩 표면을 알데히드기로 활성화한 다음, 20 mM 비스(카복시메틸)-L-리신(bis(carboxymethyl)-L-lysine)을 1시간 동안 결합하여 NTA기를 도입한 다음, 증류수로 3회 세척하고, 1% 소듐 시아노보로하이라이드(sodium cyanoborohyride)를 처리하여 결합을 안정화하였다. 그 후, 증류수로 3회 세척한 다음, 100 mM 소듐 설페이트(sodium sulfate)를 처리하여, Ni-NTA를 표면에 도입하였다. 칩은 마이크로포스트 구조체 칩 및 대조군으로 평면칩을 사용하였다.

< 실험예 4> 단백질 G 변이체의 제조

<4-1> 메티오닌( Methionine ) 도입을 위한 단백질 G(protein G) 벡터 제조

메티오닌(methionine, Met) 도입을 위한 단백질 G(protein G) 벡터를 획득하기 위하여, NdeI과 BamHI 사이에 3개 메티오닌 잔기가 제거된 pET-28at 벡터(대한민국 특허출원 10-2013-0061895)에 1개 또는 2개 단백질 G 모티프(motif)를 포함한 벡터를 제조하였다.

구체적으로, pET-2XFcBP(Jung et al., Anal Chem, 81, 936-42, 2009)를 주형으로 하기 [표 1]의 프라이머(primer)로 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction: PCR)을 수행하여 1개 또는 2개 단백질 G의 세 번째 항체결합 부위(immunogloblin G-binding region C3: PG-C3, Olsson et al., Eur J Biochem, 168, 319-24, 1987, 서열번호 3)가 들어 있는 PCR 산물을 얻었다. 그 다음, 상기 PCR 산물을 제한효소 BamHI 및 XhoI으로 절단하여 pET-28at 벡터의 BamHI/XhoI 부위(site)로 클로닝(cloning)하고, 상기 1개 또는 2개 PG-C3을 포함한 플라스미드를 각각 pET-PG 및 pET-2xPG라 명명하였다.

프라이머	서열
PG-Bam-F 정방향 프라이머	5'-ATAGGATCCTGCTGCGGCGGGACAACTTACAAACTTGTTATT-3'(서열번호 4)
PG-Xho-R 역방향 프라이머	5'-GCGCCTCGAGTTATTCAGTTACCGTAAAGGTC-3'(서열번호 5)

<4-2> 메티오닌 치환 단백질 G 플라스미드 제조

단백질 G와 항체 결합 구조(Sauer-Eriksson et al., Structure, 3, 265-78, 1995)를 바탕으로 32, 35, 40 위치에 도입하기 위하여, 상기 <4-1>에 기재된 방법으로 획득한 2개 PG-C3 모티프가 포함된 pET-2xPG 플라스미 및 1개 PG-C3 모티프가 포함된 pET-PG 플라스미드 내 PG-C3를 메티오닌(Met)으로 치환하여 변이 단백질 G 플라스미드를 제조하였다.

구체적으로, 메티오닌을 도입을 위하여 치환시킨 아미노산 잔기 번호들은 PG-C3 모티프를 기준으로 하였으며, Met으로 치환시키는 잔기들은 단백질 G와 항체 간의 3차 결합 구조를 바탕으로 선정하였다. 그 다음, 변이체 제조를 위하여 하기 [표 2]의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하였다. 먼저, 32 번째 글루타민(Glutamine, Gln32)를 Met으로 치환하기 위하여 상기 <4-1>에 기재된 방법으로 획득한 pET-2xPG를 주형으로 하기 [표 2]의 프라이머 세트 중 ET-Xba-F/PG-Q32M-R 및 PG-Q32M-F/Ins-Cla-R를 사용하여 PCR을 수행하고 각 PCR 산물을 획득하였다. 상기 획득한 PCR 산물을 혼합하고, 이를 주형으로 하기 [표 2]의 프라이머 세트 중 ET-Xba-F/Ins-Cla-R를 사용하여 PCR DNA를 획득한 후, BamHI 및 ClaI으로 절단 및 정제하여 insert 1 DNA를 획득하였다. 그 다음, pET-2xPG를 주형으로 하기 [표 2]의 프라이머 세트 중 Ins-Cla-F/PG-Q32M-R 및 PG-Q32M-F/ET-R를 사용하여 상기와 같이 PCR을 수행하여 각 PCR 산물을 획득하였다. 상기 획득한 PCR 산믈을 혼합하고, 이를 주형으로 하기 [표 2]의 프라이머 세트 중 Ins-ClaI-F/ET-R를 사용하여 PCR DNA를 획득한 후, ClaI 및 XhoI으로 절단 및 정제하여 insert 2 DNA를 얻었다. 그 후, 상기 insert 1 DNA 및 inser 2 DNA를 혼합하여 pET-28at의 BamHI/XhoI 부위 내로 클로닝하여 pET-2xPG1m 플라스미드를 획득하였다. 그 다음, 상기 pET-2xPG1m 플라스미드를 주형으로 상기와 같은 방법으로 PCR을 수행하여 PG-C3 모티프의 40 번째 아스파르트산(aspartic acid, Asp40) 및 Gln32가 Met으로 치환된 pET-2xPG2m을 제조하였다. 또한, 상기 pET-2xPG2m 플라스미드를 주형으로 상기와 같은 방법으로 PCR을 수행하여 37번 아스파라긴(asparagine, Asn37)을 아르기닌(arginine, Arg)으로 치환되고, Asp40 및 Gln32가 Met으로 치환된 pET-2xPG3m을 제조하였다. 그 다음, 상기 pET-2xPG3m 플라스미드를 주형으로 상기와 같은 방법으로 PCR을 수행하여 35번 아스파라긴(Asn35), Asp40 및 Gln32가 Met으로 치환되고, Asn37이 Arg으로 치환된 pET-2xPG4m을 제조하였다.

프라이머 세트	서열(5'→3')
PG-Bam-F	ATAGGATCC TGCTGCGGCGGGACAACTTACAAACTTGTTATT(서열번호 6)
PG-XhoI-R	GCGCCTCGAG TTATTCAGTTACCGTAAAGGTC(서열번호 7)
PG-Q32M-F	AAAGCCTTCAAAATGTACGCTAACGAGAACGG(서열번호 8)
PG-Q32M-R	GTTAGCGTACATTTTGAAGGCTTTTTCTGCAGTTTCTGC(서열번호 9)
PG-D40M-F	GACAACGGTGTTATGGGTGTTTGGACTTATGATG(서열번호 10)
PG-D40M-R	CCAAACACCCATAACACCGTTGTCGTTAGCG(서열번호 11)
PG-N37R-F	GCTAACGACCGCGGTGTTATGGGTGTTTGG(서열번호 12)
PG-N37-R	CATAACACCGCGGTCGTTAGCGTACATTTT(서열번호 13)
PG-35,37-F	GCTATGGACCGCGGTGTTATGGGTGTTTGG(서열번호 14)
PG-35,37-R	CATAACACCGCGGTCCATAGCGTACATTTTGAAGGC(서열번호 15)
Ins-Cla-F	GAAGTGATCGATGCGTCTGAATTA(서열번호 16)
Ins-Cla-R	TAATTCAGACGCATCGATCACTTC(서열번호 17)
ET-Xba-F	TTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAAC(서열번호 18)
ET-R	TTATGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGCAG(서열번호 19)

또한, Protein G 모티프가 1개 있는 변이체를 제조하기 위하여, 상기에 기재된 방법으로 획득한 pET-2xPG1m, pET-2xPG2m, pET-2xPG3m 및 pET-2xPG4m 변이 플라스미드를 주형으로 상기 [표 2]의 프라이머 세트 중 ET-Xba-F/PG-XhoI-R로 PCR을 수행하여 1개 PG 모티프가 들어 있는 PCR DNA를 획득하였다. 상기 획득한 PCR DNA를 정제 후 BamHI 및 XhoI을 이용하여 절단하고 pET-28at의 BamHI/XhoI 부위로 클로닝하였다. 각각의 PG 변이 플라스미드들은 pET-PG1m, pET-PG2m, pET-PG3m 및 pET-PG4m이라 명명하였다.

<4-3> MRS 변이체에 의한 광메티오닌 ( photomethionine ) 표지 단백질 G 발현벡터 및 형질전환체의 제작

광메티오닌(photomethionine, pM) 표지 단백질 G 변이체 발현을 위하여, 본 발명자들이 발명한 메티오닐 tRNA 합성효소(methionyl tRNA synthase) 변이체인 MRS5m을 코딩하는 pBAD-MRS5m 플라스미드(대한민국 특허출원 10-2013-0061895)와 상기 <4-2>에 기재된 방법으로 획득한 각각의 PG-C3 변이체들을 코딩하는 플라스미드를 Met 영양요구주(auxotroph) 대장균 E. coli B834로 형질전환하였다. 그 다음, 상기 MRS5m 및 PG-C3 변이체 플라스미드들을 모두 포함하는 형질전환 E. coli 콜로니들을 100 ㎍/㎖ 엠피실린(ampicillin) 및 50 ㎍/㎖ 가나마이신(kanamycin)이 함유된 LB 고체 배지에서 선별하고, 이를 LB 액체배지에 현탁하여 24시간 배양하였다. 그 다음, 상기 양액을 1/10 내지 1/20 부피로 희석하여 엠피실린 및 가나마이신이 함유된 LB 액체배지에서 1 내지 2시간 배양한 다음, 0.02% L-아라비노스(L-arabinose)를 2시간 동안 37℃에서 처리하여 MRS5m을 발현시켰다. 그 다음, 상기 MRS5m 발현 대장균을 M9B 용액(48 mM Na₂HPO₄, 22 mM KH₂PO₄, 9 mM NaCl 및 19 mM NH₄Cl)로 2번 세척하고, M9BV+1/2 CMS-MET 용액[M9B+0.4% 글루코오스(glucose), 2 mM MgSO₄, 0.1 mM CaCl₂, 0.05 mM MnCl₂, 0.1 M FeCl₃, 1 mg/㎖ 티아민(thiamine), 0.2 mg/㎖ 니코틴아마이드(nicotinamide), 0.2 mg/㎖ 엽산(folic acid), 0.2 mg/㎖ 염화콜린(choline chloride) 및 0.02 mg/㎖ 리보플라빈(riboflavine)+375 μg/㎖ CSM-MET(methionine을 제외한 19개 아미노산 혼합물)]에 1/2 내지 1/3로 희석시켰다. 그 다음, 상기 대장균을 37℃에서 1 내지 2시간 또는 18℃에서 3시간 더 배양하여 Met을 결핍시킨 다음, 375 ㎍/㎖ CSM-MET를 50 ㎍/㎖ 메티오닌 또는 50-100 ㎍/㎖ pM이 되게 가하고, 1 mM IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)로 18℃에서 16 내지 20시간 단백질 발현을 유도하였다. 각 발현된 단백질들은 2개의 PG-C3 모티프를 갖고 있는 경우에는 6H-2xPG1m, 6H-2xPG2m, 6H-2xPG3m1, 6H-2xPG3m2 및 6H-2xPG4m으로, 1개의 PG-C3 모티프를 갖고 있는 경우에는 6H-PG1m, 6H-PG2m, 6H-PG3m1, 6H-PG3m2 및 6H-PG4m으로 명명하였다.

<4-4> 단백질 G 변이체 부분 분리 정제 및 질량분석

상기 <4-3>에 기재된 방법으로 발현된 단백질 G 변이체들은 모두 용해된 형태로 발현되었으며, 이들 단백질의 아미노말단에 6xH기가 결합되 있어 Ni-NTA-agarose(Qiagen, 미국) 크로마토그라피로 부분 정제하였다.

구체적으로, 상기 <4-3>에 기재된 방법으로 6H-2xPG1m, 6H-2xPG2m, 6H-2xPG3m1, 6H-2xPG3m2 및 6H-2xPG4m, 및 6H-PG1m, 6H-PG2m, 6H-PG3m1, 6H-PG3m2 및 6H-PG4m가 발현된 형질전환 E. coli를 원침시킨 다음, 100 ㎖ 배양액당 세포파괴용 완충액(20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCL, 2 mM 2-머갑토에탄올(mercaptoethanol), 1 mM PMSF 및 5% 글리세롤(glycerol)) 1 내지 2 ㎖에 분산시키고 초음파 파쇄를 하였다. 상기 파쇄액은 15,000 rpm에서 10 내지 20분간 원침시킨 다음, 상층액을 모아 Ni-NTA-agarose 크로마토그라피로 부분 분리 정제하였다.

<4-5> 단밸질 G 변이체에 의한 인간 항체(immunogloblin G, IgG) 간의 공유 결합 확인

pM 표지 단백질 G 변이체와 인간 항체간의 공유결합을 확인하기 위하여, SDS-PAGE 분석 및 공유결합 형성능 분석을 수행하였다.

구체적으로, 상기 <4-4>에 기재된 방법으로 정제한 6H-2xPG4m 단백질 G 변이체 및 항-EGFR 인간단일클론항체(Erbitux, Merck, USA) 또는 Fc 분획(abcam, 미국)을 혼합하여 아이스에서 365 nm UV를 30 분간 조사한 후, SDS-PAGE를 수행하여 공유결합 유무를 관찰하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, PG-C3 변이체와 IgG간의 공유결합은 pM 표지 PG-C3 변이체와 IgG 또는 Fc 혼합액에 UV 조사시에만 형성되었으며, 1 개의 단백질 G 분자에 2 개의 IgG 중쇄(heavy chain, H) 또는 Fc 부위가 단백질 G 농도 의존적으로 결합함을 확인함으로써, 단백질 G 변이체는 IgG 중쇄에 특이성을 나타냄을 확인하였다(도 3). 또한, pM 표지 PG-C3과 IgG 또는 Fc 간의 공유 결합 형성은 Met 치환 수에 비례하여 6H-2xPG1m에 비해 6H-2xPG2m이 공유 결합을 더 잘 형성하였으며, 37번 Arg을 도입한 6H-2xPG3m은 6H-2xPG2m에 비해 유사한 공유 결합능을 나타내었다. 6H-2xPG3m의 35번 위치에 Met를 더 도입한 6H-2xPG4m은 6H-2xPG3m에 비해 가장 높은 공유 결합 형성능을 나타내었다. 6H-2xPG3m 및 6H-2xPG4m등 2개 PG-C3 부위을 갖는 경우에는 1 분자당 2 분자의 IgG 중쇄 및 Fc 부위와도 공유 결합을 하는 것을 확인하였다.

<4-6> 칩 표면에 고배향성 항체의 고정

말레이미드로 활성화 시킨 칩 표면에 고배향성으로 항체를 고정시키기 위하여, 상기 방법을 통해 본 발명자들이 개발한, 항체와 광활성 공유결합 형성능이 높으며, 2개 항체 결합 도메인을 갖는 단백질 G 변이체(6H-2×PG4m)를 10 mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드(tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride; TCEP-HCl)가 들어있는 PBS에 50 ㎍/ml의 농도로 희석하여, 칩 표면에 0.1 ml씩 가하고, 상온에서 2시간 동안 반응하였다. 그 후, 칩에 10 mM 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol)이 들어있는 PBS를 0.4 ml을 가하여 30분간 더 반응하였고, PBS로 세 번 세척하였다. 또한, 칩에 PBS에 100 ㎍/ml의 농도로 희석한 항 인간 표피성장인자수용체(epidermal growth factor receptor; EGFR) 인간 단일클론항체(EGFR-hmAb) 또는 항 EGFR2(인간상피증식인자수용체2(human epidermal growth factor receptor 2; HER2)) 인간 단일클론항체(HER2-hmAb)를 0.1 ml씩, 가하고 1시간 동안 결합한 다음, 365 nm 자외선을 30분간 조사하여, 항체를 고배향성으로 고정하였다. 상기 칩은 PBS로 세 번 세척한 다음, 0.1 ml의 인간 혈청을 1시간 처리하여, 비특이적으로 결합한 항체를 제거하고, 그 후 PBS로 세 번 더 세척하여 항체칩을 제조하였다.

Ni-NTA가 고정된 칩에 항체의 고정은 먼저 20 mM Tris-HCl, 300 mM 소듐 클로라이드, pH 7.5(TBS)에 6H-2 ×PG4m을 50 ㎍/ml의 농도로 희석하여, 0.1 ml씩 가하고 1시간 동안 결합시킨 다음, 365 nm 자외선을 30분간 조사하여, 항체를 고배향성으로 고정시키고, PBST(PBS와 tris의 혼합 용액)로 세척한 다음 0.1 ml의 인간 혈청을 1시간 처리하여, 비특이적으로 결합한 항체를 제거하고, 그 후 PBS로 세 번 더 세척하여 항체칩을 제조하였다.

< 실험예 5> 말레이미드 매개 항체 고정 칩을 이용한 세포특이적 포획능 분석

말레이미드기를 매개하여 항체를 고정한 칩에 세포특이적인 포획능을 분석하기 위하여, EGFR을 발현하는 A549 인간 폐암 세포주 및 마우스 NIH-3T3 세포에 인간 HER2를 발현시킨 T67 세포를 사용하여 실험을 수행하였다.

구체적으로, 세포들은 100 mm 배양접시(culture dish)에서 10% 어린소혈청(fetal bovine serum; FBS)-DMEM 배지로 70 내지 80%의 세포밀집도(confluency)로 배양하고, 트립신-EDTA 용액(Invitrogen, 미국)을 처리하여 단일 세포들로 현탁하였다. 현탁된 세포들은 10% FBS-DMEM 배지로 3번 세척한 다음 동일 용액에 10⁵개/ml 또는 10⁶개/ml의 농도로 현탁하고, 각 칩에 0.1 ml씩 가한 다음 30분 동안 방치하였다. 그 후, 칩을 10% FBS-DMEM 배지로 2회 세척한 다음, 칩에 결합한 세포들을 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 말레이미드기를 매개하여 고정한 항체칩은 항체 특이 세포 결합능이 있고, 비특이적 결합이 거의 없거나 최소로 나타남을 확인할 수 있었다. 방치한 조건에서 세포를 포획할 때, 다수의 경우 비특이적으로 세포가 바닥에 달라붙는 단점이 있으나, 아가로우즈 필름으로 코팅한 경우에는 세포가 비특이적으로 달라붙지 않아, 구(sphere)모양으로 세포의 배양이 가능함을 확인하였다. 이러한 이유로 아가로우즈 코팅 플레이트는 플라스틱 표면의 비특이적인 결합을 최소화하여 항체 특이적인 세포 포획을 할 수 있음을 확인하였다. 마우스 세포에 HER2 유전자를 형질주입(transfection)하여 제조한 T67 세포는 항 HER2 항체로는 포획이 잘 되고, 항 EGFR 항체로는 포획이 되지 않아 높은 특이성을 나타냈으나, 반면 인간 폐암 유래 A549 세포는 항 EGFR 항체에 높은 포획성을 나타내고, 항 HER2 항체에도 일부 포획된 것을 확인하였다(도 5). 상기 결과의 이유는 A549 세포가 인간 유래 암세포라서 미량의 HER2 단백질이 세포 표면에 발현되기 때문이다.

< 실험예 6> Ni - NTA 매개 항체 고정칩을 이용한 세포 포획 및 회수능 분석

Ni-NTA기를 매개하여 항체를 고정한 칩에 세포특이적인 포획능 및 세포회수능을 확인하기 위하여, HER2 항체를 표지한 칩에 A549 세포를 사용하여 분석하였다. <실험예 5>와 같은 과정을 통해 Ni-NTA 칩을 이용한 세포 포획 실험을 진행하였다.

그 결과 도 6에 나타난 바와 같이, 10⁶개/ml 농도의 세포를 0.1 ml 가한 칩에 세포를 포획한 결과, 대조군 칩에는 많은 세포가 포획되었으나, 상기 Ni-NTA 칩에 트립신-0.25% EDTA(Invitrogen, 미국)를 처리하였을 때는 대부분의 세포들이 회수됨을 확인하였다. 일반적으로 마이크로포스트 구조체 칩에 세포를 포획한 경우에는 구조체 특성상 일부 세포들이 구조체 내부에서 회수되지 않았으나, 상기 본 발명의 방법으로 실험을 수행한 결과 70% 이상의 세포들이 회수되었다. 이는 비특이적 세포 결합 특성이 거의 없는 아가로우즈 필름 코팅칩에 Ni-NTA를 표지하고, 광활성 단백질 G 및 항체를 고정시킨 경우에는 트립신-0.25% EDTA 처리시, 트립신에 의한 세포 유리뿐만 아니라, EDTA에 의한 Ni-NTA에서 광활성 단백질 G가 해리되어 나타나는 결과로 여겨진다. 선행 기술에서 많은 세포들이 플라스틱 표면에 쉽게 부착하는 성질을 나타내는데, 본 발명의 아가로우즈 코팅 칩은 표면을 쉽게 활성화할 수 있을 뿐만 아니라, 비특이적 세포의 부착을 최소화하여, 항체특이적인 포획 및 세포회수를 용이하게 할 수 있음을 확인하였다(도 6).

< 실험예 7> 말레이미드 매개 항체 고정 칩을 이용한 유체( fluidic ) 조건에서 세포 포획능 분석

2cm × 4cm 마이크로포스트 구조체를 지닌 플레이트 칩에 <실험예 1>과 같이 마이크로포스트 구조체 부위에 아가로우즈 필름을 코팅한 다음, <실험예 2>를 일부 수정하여 아민기를 도입하였다. 알데히드기로 활성화는 먼저 1 ml의 소듐 페리오데이트 용액을 마이크로포스트 부위에 도포한 다음, 30분간 실온에 방치하여 형성하였으며, 증류수로 4 내지 5회 세척하였다. 칩의 다른 부위는 흡습지로 수분을 제거한 다음 100 mM 1,2-비스(2-아미노에톡시)에탄, pH 7.5 용액 1 ml을 가하여 1시간 동안 실온에서 반응한 다음, 용액을 제거한 후 1% 소듐 시아노보로히드레이트 1 ml을 처리하여 환원시키고 증류수로 4 내지 5회 세척한 다음 60℃에서 건조하여 사용시까지 보관하였다. 말레이미드기를 도입하기 위하여, N-하이드록시숙신이미드(NHS)-3-말레이미도프로피오네이트 또는 NHS-4-말레이미도뷰티레이트를 10 mg/ml의 농도로 디메틸설폭시드에 녹이고, PBS로 1/10의 농도로 희석한 다음 아민기를 도입한 플레이트에 0.5 ml을 가하고 1시간 동안 반응시킨 뒤, 증류수로 세척하였다. 상기 플레이트에 <실험예 4>와 같이 HER2-hmAb를 고정하였으며, 다만 용액의 부피만 0.5 ml로 증가하였다.

그 결과 도 8에 나타난 바와 같이, <실험예 5>와 같이 준비한 T67 세포를 10⁵개/ml의 농도로 계속 교반하는 상태에서 3 ml/h의 속도로 2시간 동안 세포를 흘려주었을 때, 세포들이 바닥보다는 마이크로포스트 벽면에 많이 포획됨을 확인할 수 있었다(도 8). 상기 결과는 본 발명에서 제시하는 방법으로 아가로우즈 필름이 마이크로포스트 벽면에도 잘 코팅되어, 결과적으로 마이크로포스트 벽면에도 항체를 고효율로 고정시키고, 표적 세포를 효율적으로 포획할 수 있음을 알 수 있다.

< 실험예 8> 항체칩에 포획된 세포들의 성장 분석.

항체칩에 포획된 세포들의 성장을 측정하기 위하여, 96웰 세포배양 플레이트에 0.5% 아가로우즈 용액을 30 내지 50 ㎕/웰로 가하고 2000 rpm에서 원심하면서 고형화하였다. 그 후 상기 플레이트를 60 ℃에서 건조시켜 아가로우즈 필름으로 코팅 한 다음, <실험예 2>의 방법에서 모든 용액의 농도는 동일하나 부피는 50 ㎕로 하여 말레이미드기를 도입하였다. 상기 말레이미드로 활성화된 플레이트에 실험예 4와 같이, 광활성 단백질 G를 먼저 결합한 다음, EGFR 항체를 365 nm 자외선을 조사하면서 결합하였다.

그 결과 도 9에 나타난 바와 같이, 상기 플레이트에 A549 세포들의 결합을 분석하였을 때, 포획된 세포들은 대부분 단일 세포의 형태로 관찰되었으며, 많은 세포들이 시간이 지남에 따라 비 부착 상태로 계속 분열함을 확인할 수 있었다. 이는 아가로우즈 필름에 고배향성으로 부착된 항체에 의해 포획된 세포들이, 플레이트에 포획된 상태로 계속 성장이 가능함을 제시하는 결과로, 본 발명의 아가로우즈 필름 코팅 플레이트에 항체를 고정시키는 방법은 혈중암 세포 등을 별도의 회수과정의 필요없이 포획 플레이트에서 직접 배양이 가능하다는 것을 알 수 있다(도 9).

<110> Korea Research Institute Bioscience and Biotechnology(KRIBB) <120> Agarose film-coated micropost plate with immobilization of highly oriented antibody for cell capture <130> 15P-04-020 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tykngktkgt ttavdaatak vkyandngvd gwtyddatkt ftvte 45 <210> 2 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tykvngktkg tttavdaata kvkyandngv dgwtyddatk tftvte 46 <210> 3 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tykvngktkg tttkavdata kakyandngv dgvwtyddat ktftvte 47 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 ataggatcct gctgcggcgg gacaacttac aaacttgtta tt 42 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 gcgcctcgag ttattcagtt accgtaaagg tc 32 <210> 6 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ataggatcct gctgcggcgg gacaacttac aaacttgtta tt 42 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 gcgcctcgag ttattcagtt accgtaaagg tc 32 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 aaagccttca aaatgtacgc taacgagaac gg 32 <210> 9 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 gttagcgtac attttgaagg ctttttctgc agtttctgc 39 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gacaacggtg ttatgggtgt ttggacttat gatg 34 <210> 11 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ccaaacaccc ataacaccgt tgtcgttagc g 31 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gctaacgacc gcggtgttat gggtgtttgg 30 <210> 13 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 cataacaccg cggtcgttag cgtacatttt 30 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gctatggacc gcggtgttat gggtgtttgg 30 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 cataacaccg cggtccatag cgtacatttt gaaggc 36 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 gaagtgatcg atgcgtctga atta 24 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 taattcagac gcatcgatca cttc 24 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 ttcccctcta gaaataattt tgtttaac 28 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 ttatgctagt tattgctcag cggtggcag 29

Claims (14)

1) 아가로우즈를 에탄올, 메탄올 및 아세토나이트릴로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 용액 및 증류수와 혼합하여 혼합액을 제조하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 혼합액으로 마이크로포스트 구조체를 코팅하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 아가로우즈 필름이 코팅된 세포포획 및 배양용 마이크로포스트 플레이트(agarose film-coated micropost plate)의 제조방법.

제 1항에 있어서,
상기 단계 2)는 마이크로포스트 구조체를 산소 플라즈마 처리하여 표면을 친수성으로 만든 후, 단계 1)의 혼합액을 가하여 혼합액을 겔로 만들고 건조하여 수행하는 것을 특징으로 하는 마이크로포스트 플레이트의 제조방법.

제1항에 있어서,
상기 마이크로포스트 플레이트에 코팅된 아가로우즈 필름에 말레이미드기(maleimide group) 또는 Ni-NTA를 도입하여 표면을 활성화 시키는 것을 특징으로 하는 마이크로포스트 플레이트의 제조방법.

제3항에 있어서,
상기 말레이미드기는 마이크로포스트 플레이트에 소듐 페리오데이트(sodium periodate)를 용액을 처리하여 알데히드기(aldehyde group)를 도입하고, 양끝에 아민기를 갖는 화합물 및 소듐 시아노보로하이드레이트 (sodium cyanoborohydrate)를 순차적으로 처리하여 아민화된 플레이트를 만들고, N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide)기 및 말레이미드기를 양 끝에 갖는 화합물을 처리하여 말레이미드기를 도입하는 것을 특징으로 하는 마이크로포스트 플레이트의 제조방법.

제3항에 있어서,
상기 Ni-NTA는 마이크로포스트 플레이트에 소듐 페리오데이트 용액을 처리하여 알데히드기를 도입하고, 비스(카복시메틸)-L-리신(bis(carboxymethyl)-L-lysine)을 처리하여 NTA기를 도입한 후, 니켈 설페이트(nikel sulfate)를 처리하여 Ni-NTA 를 도입하는 것을 특징으로 하는 마이크로포스트 플레이트의 제조방법.

제3항에 있어서,
상기 마이크로포스트 플레이트에 항체가 고배향성으로 고정된 것을 특징으로 하는 마이크로포스트 플레이트의 제조방법.

제6항에 있어서,
상기 항체는 지지체와 고배향성으로 결합된 것을 특징으로 하는 마이크로포스트 플레이트의 제조방법.

제7항에 있어서,
상기 지지체는 항체에 특이적으로 결합하는 단백질 G 변이체이고, 상기 단백질 G 변이체는 단백질 G(protein G)의 서열번호 1로 구성되는 첫 번째 항체 결합 부위(immunogloblin G binding region C1, PG-C1), 서열번호 2로 구성되는 두 번째 항체 결합 부위(immunogloblin G binding region C2, PG-C2) 및 서열번호 3으로 구성되는 세 번째 항체 결합 부위(immunogloblin G binding region C3, PG-C3)로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 32번째 위치의 글루타민(Gln), 35번째 위치의 아스파라긴(Asn) 및 40번째 위치의 아스파르트산(Asp)이 각각 메티오닌(Met)으로 치환되고, 37번째 위치의 아스파라긴(Asn)이 아르기닌(Arg)으로 치환된 아미노산 서열로 구성된 단백질 G 변이체인 것을 특징으로 하는 마이크로포스트 플레이트의 제조방법.

삭제

제1항에 있어서,
상기 마이크로포스트 플레이트는 유체조건에서 세포들이 포획되는 것을 특징으로 하는 마이크로포스트 플레이트의 제조방법.

제1항 내지 제8항 및 제10항 중 어느 한 항의 제조방법을 통하여 제조된 마이크로포스트 플레이트에 시료를 처리하는 단계를 포함하는 세포포획 및 배양방법.

제11항에 있어서,
세포들이 70% 이상 회수되는 것을 특징으로 하는 세포포획 및 배양방법.

제1항 내지 제8항 및 제10항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 마이크로포스트 플레이트 항체칩.

제13항에 있어서,
상기 마이크로포스트 플레이트 항체칩은 포획된 세포가 상기 항체칩에서 직접 배양이 가능한 것을 특징으로 하는 마이크로포스트 플레이트 항체칩.

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