KR102138195B1 - 고체-상 고정화된 미생물 트랜스글루타미나제 mtg 및 용액 중 mtg를 사용한 항체 리신 잔기에의 부위-특이적 접합 - Google Patents

고체-상 고정화된 미생물 트랜스글루타미나제 mtg 및 용액 중 mtg를 사용한 항체 리신 잔기에의 부위-특이적 접합 Download PDF

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로저 쉬블리
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폴 슈레 앙스띠뛰
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Abstract

미생물 트랜스글루타미나제 (MTG)를 사용한 단백질의 부위-특이적 변형은 생리학적 조건 하에서 제어된 방식으로 단백질을 변형시킬 수 있는 강력한 다용도 전략법이다. 본 발명자들은 scFV, Fab-단편 및 항체를 포함한, 치료 관련 단백질에 추가의 하류 적용에 중요한 상이한 관능성 분자를 부위-특이적으로 및 효율적으로 부착시키는데 고체-상 마이크로비드 고정화가 사용될 수 있다는 증거를 제공한다. 본 발명자들은 MTG는 검출가능한 칼럼 블리딩 없이, 단단히 고정화된 상태 그대로 유지되었고, 효소 활성은 연속 조작 동안 그대로 지속되었고, 이를 통해, 효소는 편리하게 재사용될 수 있었는 바, 이에, 용액-상 MTG 접합을 넘어서서 그보다 우수하다는 것을 증명한다. 추가적으로, 고정화된 MTG는, 접합이 용액 중에서 수행되었다면, 모두가 표적화되는 수개의 반응성 잔기의 존재 하에 특정 잔기에 대하여 증진된 선택성을 보인다는 것을 제시한다. 고정화된 MTG 및 용액 중 MTG를 사용한, 강력한 글루타민 함유 펩티드를 사용하는 항체의 부위-특이적 리신 접합을 또한 보고한다. 추가적으로, 고정화된 MTG 및 용액 중 MTG를 사용한, 이중 부위-특이적으로 접합된 IgG1의 생성, 즉, IgG1 항체의 글루타민 및 리신 잔기에의 부위-특이적 접합을 보고한다. 리신 잔기 및 관능성 모이어티를 함유하는 소형 펩티드와의 부위-특이적 글루타민 접합을 또한 기술한다.

Description

고체-상 고정화된 미생물 트랜스글루타미나제 MTG 및 용액 중 MTG를 사용한 항체 리신 잔기에의 부위-특이적 접합
본 발명은 마이크로비드-고정화된 MTG (미생물 트랜스글루타미나제 MTG) 및/또는 용액 중 MTG 중합체 접합체 및/또는 용액 중 유리 MTG를 사용한 유기 분자의 단백질에의 접합 및 융합 단백질의 생성을 위한 방법에 관한 것이다.
최근, 생체접합 분야에서 단백질의 효소적 부위-특이적 관능화가 상당한 관심을 얻고 있다. 효소에 의해 수행된 생체-접합 반응은 전형적으로 낮은 시약 농도 (서브밀리몰)에서 빠른 동역학, 높은 전환 효율을 보이며, 이는 생리학적 조건 하에서 수행될 수 있다.
이러한 이점에도 불구하고, 효소는 임의의 하류 간섭을 방지하기 위해 순차적으로 혼합물로부터 제거될 수 있고, 이로써, 상실된다. 고체-상 고정화를 통해, 이는 간단한 효소 회수로 회피될 수 있다. 현재까지 효소의 고정화는 거의 독점적으로 소형 화합물의 전환에 적용되어 왔고, 이는 효소 안정성을 증진시키고 또한 활성, 선택성 또는 선택도를 증가시킨 것으로 보고되었다. 상이한 단백질 포맷의 수회 라운드의 접합을 위한 연속 작동 하에서 단백질과 같은 고분자량 기질의 부위-특이적 변형을 위한 고정화된 효소의 조정가능한 특성 (즉, 특정 잔기에 대한 증진된 선택성)에 대해서는 아직 보고된 바 없다.
가장 최근에 폴리카르포(Policarpo) 등은 Ni-NTA 아가로스 비드 상에의 효소 접합을 제시하였다. 불행하게도, 상기 접합은 비-공유 성질을 가지며, 칼럼-블리딩의 위험이 높다.
그러므로, 본 발명의 목적은 효소의 임의의 칼럼-블리딩을 유의적으로 방지하면서, 유기 분자의 단백질에의 목적하는 접합을 위해, 높은 비율을 달성하면서 능동 유동 반응기 칼럼에서 또는 스핀-칼럼에서 사용하기 위한 단단히 고정화된 효소 및/또는 용액 중 효소를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
이러한 목적은 본 발명에 따르면, 하기 단계를 포함하는, 고정화된 및/또는 비-고정화된 형태의 MTG (미생물 트랜스글루타미나제)를 사용한 유기 분자의 표적 단백질에의 접합 및 융합 단백질의 생성을 위한 방법에 의해 달성된다:
a) MTG의 고정화를 위해 중합체의 교차-반응성 기를 노출시킴으로써 MTG를 상기 중합체에 부착시키는 단계;
b) MTG 중합체 접합체를 마이크로비드 상에 흡착시키거나 또는 MTG 중합체 접합체를 용액으로 만드는 단계;
c) 능동 유동 반응기 칼럼을, MTG 중합체 접합체 흡착된 마이크로비드로 및/또는 MTG 중합체 접합체를 포함하는 용액 및/또는 MTG를 포함하는 용액으로 충전시키는 단계;
d) 표적 단백질 및 유기 분자를 유체 내에 제공하고 결정된 조건 하에서 유체를 충전된 능동 유동 반응기 칼럼을 통해 통과시키거나 또는 유체를 MTG 중합체 접합체를 포함하는 용액 및/또는 MTG를 포함하는 용액과 혼합하여, 그에 의해 MTG의 촉매화 효과 하에 유기 분자를 단백질에 접합시키는 단계;
e) 유체로부터 단백질 유기 분자 접합체를 추출하는 단계.
본 방법은 단백질 유기 분자 접합체를 효율적으로 형성하기 위해 추출물의 높은 전환율로 유기 분자를 단백질에 접합시키는 기회를 최초로 제공한다. MTG의 중합체에의 공유 결합에 기인하여, MTG의 블리딩은 유리한 정도로 억제될 수 있다. 본 방법은 놀랍게도, 접합이 용액 중의 비-고정화된 효소로 수행되었다면, 모두가 표적화되는 다중 반응성 잔기의 존재 하에 접합되는 단백질, 펩티드 또는 다른 생체분자 상의 하나의 (또는 그 이상의 목적하는) 효소-반응성 잔기로의 증진된 선택성으로 이루어지는 효소의 고정화에 의해 이루어진다. 이는 상이한 정도로 접합되는 분자의 원치않는 혼합물 또는 모든 잔기의 완전한 접합으로 이어질 것이다. 이에 따라 고정화된 형태의 MTG를 사용하면, 단지 하나의 (또는 그 이상의 목적하는) 잔기만이 각각 표적화되고 접합된다. 물론, MTG는 또한 용액 중 그의 유리 형태로 및/또는 용액으로 만들어진 MTG 중합체 접합체로서 사용될 수 있다. MTG와 관련하여, MTG는 유기체 스트렙토마이세스 모바라엔시스(streptomyces mobaraensis)로부터의 것이 바람직하다는 것을 통상의 기술자는 이해한다.
중합체의 마이크로비드에의 결합은 중합체가 마이크로비드에 대한 이온 및/또는 공유 결합을 겪을 때에 안정적인 방식으로 달성될 수 있다. 중합체에 대한 바람직한 예는 제2 세대 덴드론화된 중합체 (de-PG2)일 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에 따르면, 표적 단백질은 IgG, IgM, IgA 또는 IgE 포맷의 항체, 또는 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 이는 바람직하게는, N297 돌연변이 (예를 들어 N297Q 또는 N297A) (EU 넘버링 체계)를 함유하고, 바람직하게는 또한, MTG-매개 접합을 가능하게 하는 항체 백본 내 다른 반응성 글루타민 잔기 돌연변이를 포함하는, 탈글리코실화된 또는 비-글리코실화된, 키메라, 인간화 또는 이중특이적인 것으로 임의로 선택된 모노클로날이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 실시양태에 따르면, 표적 단백질은 펩티드 예컨대 Fab, Fab', F(ab)'2, F(ab)'3, Dab, Fv, 단일 쇄 Fv (scFv) 단편 scFv-Fc (scFv)2이며, 여기서 추가의 가능한 단백질 및/또는 펩티드는 단백질 키나제 예컨대 미토겐 활성화된 단백질 (MAP) 키나제, 및 MAP 키나제를 직접적으로 또는 간접적으로 인산화시키는 키나제, 야누스 키나제 (JAKI) 및 시클린 의존성 키나제, 표피 성장 인자 (EGF) 수용체, 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF) 수용체, 섬유모세포-유래 성장 인자 (FGF) 수용체, 인슐린 수용체 및 인슐린-유사 성장 인자 (IGF), 조작된 단백질 예컨대 darpin, 아피바디/나노바디 또는 피브로넥틴 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 다른 단백질 및 펩티드의 인식에 수반되는 단백질 및 펩티드, 또는 면역 반응을 도출하고 따라서 백신화에 중요한 캐리어 단백질 또는 합텐 예컨대 CRM197, 디프테리아 독소의 돌연변이체, 또는 GBS67 (PI-2a의 보조 단백질)을 포함하고; 추가로, 이는 바람직하게는 또한 비-단백질 구조물 예컨대 예를 들어 단일 또는 다량체 덱스트란 예컨대 글루칸에의 접합을 포함한다.
효소와 관련하여, 효소는 유기 분자로 표적 단백질 상의 하나 이상의 반응성 글루타민 잔기 (예를 들어 항체 내 Q295 및 N297Q) 또는 하나 이상의 반응성 리신 잔기 (예를 들어 항체 내 K288 또는 K290, K340)를 변형시킬 수 있고; 여기서 잔기는 내인성으로 또는 유전적 수단에 의해 인공적으로 도입되거나 또는 그의 조합에 의해 도입된다.
표적 단백질에 접합되는 유기 분자에 대한 바람직한 실시양태는 형광 염료/표지 (예를 들어 알렉사488, 알렉사647), 세포-세포독성 또는 영향 모이어티 예컨대 독소 또는 세포 조절인자, 면역 세포 면역조정/자극 화합물, SPECT/PET 또는 MRI에 적합한 금속-킬레이터 (예를 들어 NODA-GA), 관능성 펩티드 (예를 들어 알파 데펜신 NP-1), 클릭-반응 예컨대 스트레인-촉진 아지드-알킨 클릭 화학 (SPAAC) 또는 테트라진-알켄 라이게이션 예컨대 아지드 및 시클로옥틴 유도체 (예를 들어 DIFO, BCN, DIBAC, DIBO, ADIBO), 및 테트라진 및 트랜스-시클로옥텐 유도체에 적합한 화학적 모이어티로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 이는 MTG-매개 접합을 위한 1급 아민, 및 Cn>20인 스페이서 모이어티를 갖는다.
추가로, 유기 분자는 관능성 모이어티 예컨대 세포독성 모이어티, 형광 염료, 금속 킬레이터, 또는 SPAAC 클릭-반응 (예를 들어 아지드 또는 DBCO-기), 또는 테트라진 및 트랜스-시클로옥텐 기 또는 그의 유도체에 적합한 화학적 모이어티에 접합된, (C+N)n>20인 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특히, 펩티드는 리신 (예를 들어 KNAA 또는 KAYA) 또는 글루타민 잔기 (예를 들어 FGLQPRY)를 포함할 수 있고, MTG에 의해 표적화되고 (즉, MTG에 대한 기질임), 임의로 이는 Cn>20인 스페이서 모이어티 (예를 들어 폴리-에틸렌 글리콜, 알킬 기)를 포함하고/거나 1급 아민을 통해 접합된다.
추가로, 유기 분자는 임의의 위치에서의 리신 (예를 들어 KNAAGGG 또는 KDAAGGG 또는 KAYAGGG 또는 AKETAA) 또는 임의의 위치에서의 글루타민 잔기 (예를 들어 FGLQPRY, SLLQGR)를 포함하는 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 이는 MTG에 의해 표적화되고 (즉, MTG에 대한 기질임), 효소에 의해 절단가능한 펩티드 서열 (예를 들어 발린-시트룰린 (VC), KNAAGGG-VC)을 임의로 함유하며; 상기 리신 펩티드 크기 (길이)는 (C+N)n>20이고, 상기 글루타민 펩티드 크기 (길이)는 1<(C+N)n<200이다.
마이크로비드 또는 마이크로비드 수지에 대한 바람직한 실시양태는 유리, 니켈, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(4-메틸부텐), 폴리스티렌, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 레이온, 나일론, 폴리(비닐 부티레이트), 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PCDF), 실리콘, 폴리포름알데히드, 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 니트로셀룰로스 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 다른 고체 지지체는 젤라틴, 유리, 세파로스 마크로비드, 세파덱스 비드 또는 덱스트란 마이크로캐리어 예컨대 시토데스(CYTODES)® (파마시아(Pharmacia), 스웨덴 웁살라)), 폴리사카라이드 예컨대 아가로스, 알기네이트, 카라기난, 키틴, 셀룰로스, 덱스트란 또는 전분, 폴리카프로락톤 (PCL), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리아크롤레인, 폴리디메틸실록산, 폴리비닐 알콜, 폴리메틸아크릴레이트, 퍼플루오로카본, 무기 화합물 예컨대 실리카, 유리, 규조토, 알루미나, 금, 산화철, 그래핀 & 산화그래핀 또는 다른 금속 산화물, 또는 2종 이상의 자연적으로 발생된 중합체, 합성 중합체 또는 무기 화합물의 임의의 조합으로 이루어진 공중합체를 포함한다. 비드 크기는 1 내지 100 nm, 또는 100 내지 1000 nm, 또는 1 μm 내지 10 μm, 또는 10 μm 내지 1000 μm 범위일 수 있다.
유체에 대한 적합한 예는 적합한 완충제 (예를 들어 트리스) 및 염 첨가제 (예를 들어 NaCl)를 함유하는 물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 상기 수성 완충제 용액은 또한 글리세롤 및 다른 유기 용매 예컨대 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 1-프로판올, DMSO, 메탄올, 아세토니트릴을 최대 60% 함유할 수 있다.
제1 및 제2 및 그 초과 세대 덴드론화된 중합체 (de-PG2) 이외에, 적합한 중합체는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌옥시드, 폴리(알킬옥사졸린), 폴리비닐피롤리디온, 폴리리신 및 폴리글루타메이트, 폴리(에틸옥사졸린), 폴리메타크릴산 및 폴리프로프아크릴산 또는 그의 혼합물 및 덴드리머 구조물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 당 잔기를 기재로 하는 중합체, 폴리-N-이소프로필아크릴아미드 (폴리NIPAM), 폴리(글리시딜 메타크릴레이트), 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE) 및 폴리(에틸렌-alt-테트라플루오로에틸렌) (ETFE), 폴리(올리고에틸렌 글리콜)메타크릴레이트 (POEGMA), 폴리(2-메틸-2-옥사졸린) (PMOXA), 폴리(비닐 알콜) (PVA) 및 폴리(에틸렌 이민) 및 그의 유도체가 또한 포함된다.
일부 실시양태에서, MTG 및 중합체의 접합은 중합체 및 MTG 사이에 링커 (스페이서)를 수반하며, 상기 링커는 이관능성 링커 시스템 S-HyNic (숙신이미딜-6-히드라지노-니코틴아미드, S-4FB (4-포르밀벤조에이트) 또는 그의 유도체, 또는 SMCC (숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트) 또는 그의 유도체, Y-S-Z (Y는 또한 Z일 수 있고, 그 반대로 Z는 또한 Y일 수 있음)와 같은 구조를 갖는 동종- 또는 이종이관능성 스페이서로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 여기서 Y 및 Z는 하기 기 또는 그의 유도체: 테트라진, 트랜스-시클로옥텐, 아지드, 시클로옥텐 (예를 들어 디벤질시클로옥틴 또는 비시클로노닌), n-히드록시숙신이미드, 말레이미드, 이소티오시아네이트, 알데히드, 에폭시드, 알콜, 아민, 티올, 포스포네이트, 알킨, 포타슘 아실트리플루오로보레이트, a-케토산-히드록실아민, O-아실히드록실아민, 카르복실산, 히드라진, 이민, 노르보렌, 니트릴 및 시클로프로펜이고, S는 알킬 모이어티, 아미노산 또는 펩티드 유도체로 구성된 중합체 또는 그의 유도체, 예를 들어 올리고 또는 폴리(에틸렌 글리콜) (PEG), 덱스트란인 스페이서 엔티티이다.
접합 진행에 적합한 조건은 결정된 조건이 하기 세부사항: 0℃ 내지 50℃의 온도 범위, 수초 내지 168h (또는 7일)의 접촉 시간, 능동 유동 반응기 칼럼에서의 1 μL/min 미만, 또는 1 μL/min - 10 ml/min의 유동-속력/속도, 1 μM 내지 1 mM의 단백질 농도, 0.5 내지 50x 또는 50 내지 500x 또는 500 내지 10,000x의 표적 단백질 대비 유기 분자 몰비 및 수지 또는 마이크로비드 또는 접합 용액 ml당 0.001 mg/ml 내지 0.01 mg/ml, 또는 0.01 mg/ml 내지 10 mg/ml의 MTG 농도, 추가로 바람직하게는 또한 적어도 30% 내지 최대 100% 전환율의 유기 분자와의 표적 단백질에 대한 접합 효율, 및 0.1 bar 내지 20 bar의 유동-압력을 포함할 때 달성될 수 있다.
추가적으로, 관능화된 마이크로비드는 또한 스핀-칼럼에 적합한 장치에 배치될 수 있고, 여기서 반응 혼합물은 1s 내지 60s, 1min 내지 60min, 1h 내지 168h의 특정 기간 동안 마이크로비드와 함께 인큐베이션된다. 이어서, 혼합물은 다시 원심분리 및 상청액의 배출에 의해 마이크로비드로부터 제거되거나, 또는 용액은 원심분리 동안 적합한 필터 장치를 통해 통과되어 마이크로비드는 보유하나 반응에서 목적되는 혼합물/접합체는 보유하지 않는다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시양태는 도시된 첨부된 도면을 참조하여 더욱 상세하게 기술된다:
도 1은 de-PG2 중합체 상의 미생물 트랜스글루타미나제 MTG 고정화 프로세스, 및 이어서, 마이크로비드 상의 흡착을 개략적으로 나타낸 것이고;
도 2는 de-PG2 중합체 상의 MTG의 접합의 특징 및 정량화, 및 1 μM MTG로 정규화된 MTG, MTG-중합체 접합체 활성을 나타낸 것이고;
도 3은 마이크로비드-고정화된 MTG를 사용한 항체-유사 스캐폴드 예컨대 scFV 및 Fab-단편에의 관능성 분자의 접합을 개략적으로 나타낸 것이고;
도 4는 마이크로비드-고정화된 MTG를 사용한 (비-글리코실화된) 항체 (N297S 또는 N297Q 돌연변이체)에의 관능성 분자의 접합; 및 또한 항-MTG 항체에 의한 중합체에 부착된 MTG 검출을 개략적으로 나타낸 것이고;
도 5는 접합이 용액 중에서 수행되는 경우와 비교하여, 고정화된 MTG가 수개의 반응성 아미노산의 존재 하에서 선택성을 증진시켰다는 것을 나타낸 것이다.
도 6은 상이한 pH 조건을 사용한 탈글리코실화된 IgG1 (헤르셉틴(Herceptin))에의 글루타민 함유 펩티드 (서열은 표 우측에 제공)의 스크리닝을 나타낸 것이다. 펩티드 2가 pH 7.6에서 ≥50%의 접합을 생성하며, 가장 강력한 효능을 보인 것으로 나타났다.
도 7은 펩티드 2 (좌측) 및 그의 아지드-유도체 (우측)의 구조를 나타낸 것이다.
도 8은 고체-상 고정화된 MTG를 사용한 펩티드 FGLQRPY (펩티드 2)와의 탈글리코실화된 IgG1의 접합을 나타낸 것이다.
도 9는 고정화된 MTG (좌측) 및 용액 중 MTG (우측)를 사용한 (N297S 돌연변이를 함유하는) IgG1에의 펩티드 2의 접합으로서, 여기서 >70%의 접합이 생성되었다는 것을 나타낸 것이다.
도 10은 고정화된 MTG (좌측) 및 용액 중 MTG (우측)를 사용한 IgG1 N297S 항체의 리신 340 및 리신 288/290에의 펩티드 2-아지드 유도체의 접합으로서, 여기서 >70%의 접합이 생성되었다는 것을 나타낸 것이다.
도 11은 고정화된 MTG (좌측) 및 용액 중 MTG (우측)를 사용한 IgG1 N297S 항체에의 이중 부위-특이적 접합으로서, 여기서 ~40%의 이중 부위-특이적으로 변형된 IgG1이 생성되었다는 것을 나타낸 것이다. 글루타민 Q295 접합을 위해 기질 TCO-PEG3-NH2 및 리신 340 (및 288/290) 접합을 위해 기질 펩티드 2 아지드-유도체가 사용되었다.
도 12는 리신 접합된 항체의 SDS-PAGE 쿠마시 및 형광 분석을 나타낸 것이다. 경쇄가 아닌, 단지 중쇄만이 선택적으로 접합된다.
MTG -중합체-접합체의 형성 및 특징규명
N-숙신이미딜-4-포르밀벤즈아미드 (4FB)의 미생물 트랜스글루타미나제 (MTG)에의 접합을 위해 (도 1), MTG당 하나의 링커를 목표로 하여 상이한 링커 과량을 조사하였다. LC-MS로, 및 UV-VIS에 의해 분광광도측정법으로 링커 비를 정량화하였으며, 상기 방법 둘 다는 우수한 상관관계가 있는 것으로 나타났다 (도 2a). MTG의 4FB에의 동등한 링커 양일 때, 대략 0.4의 접합 비가 수득되었으며, 과량 2일 때, 이는 ~0.8로 증가하였다 (도 2a). 비록 비가 0.8인 것이 바람직한 것으로 보이기는 하였지만, 실험을 진행하는 동안, 본 발명자들은 0.8 정도로 너무 높은 링커 비는, 샘플 침전에 기인하여 초원심분리로 정제될 수 없는 효소-중합체 접합체를 생성하였다는 것을 관찰하였는 바, 이에 본 발명자들은 1.5 당량의 4FB를 사용하기로 선택하고, 이를 통해 ~0.5인 링커 비를 얻었다. 이는 2 당량인 경우에 이중으로 연결된 MTG (MTG-(4FB)2)의 양이 >20%이고, 그에 반해, 1.5 당량인 경우에 양은 <10%인 것으로 유지된 것에 기인할 수 있다 (도 2b). 너무 많은 양의 MTG-(4FB)2는 동일한 또는 또 다른 중합체 가닥 상의 원치않는 과다-가교결합, MTG 활성 감소 뿐만 아니라, 효소-중합체 접합체의 가용성 감소로 이어질 수 있다. 이러한 이유에서, MTG를 과다-접합시키지 않는 것이 특히 강조되었고, MTG 대비 1.5 과량의 4FB를 선택하였고, 이를 통해, >90% 순수한, 단일-연결된 MTG가 생성되었다.
이어서, N-숙신이미딜 6-히드라지노니코티네이트 (S-HyNic)-링커에 접합된 중합체 de-PG2500 (도 1)을 MTG-4FB와 함께 인큐베이션하였다. 이들 2종의 연결된 화합물의 혼합은 특징적인 피크의 형성 및 UV-VIS에 따른 354 nm에서의 흡광도 증가로 이어졌고 (도 2c), 이는 비스-아릴-히드라존 (BAH)-결합의 형성, 및 효소-중합체 접합체의 성공적인 생성에 상응하는 것이었다.
중합체-효소 접합체의 활성을 용액 중에서 비색 히드록실아민-아민 검정법으로 검정하였고, 비록 활성이 천연 MTG와 비교하였을 때, 명백하게 감소되기는 하였지만, MTG는 여전히 효소적으로 활성인 것으로 나타났다 (도 2d). 활성 감소는 비결합된, 천연 MTG와 비교하여, 중합체-고정화된 MTG의 감소된 회전 자유도 및 배열 가능성으로 설명될 수 있는데, 이는, 히드록실아민이 효소의 활성 부위로 진입하는 것을 더 어렵게 만든다. 용액 중 동일한 중합체 상에 고정화된 프로테이나제 K에 대해서도 활성 감소라는 유사한 관찰 결과가 보고된 바 있다. 그럼에도 불구하고, 가장 중요하게는, MTG는 고정화 후에도 여전히 효소적으로 활성이었다.
마이크로비드 유리 표면 상의 흡착된 MTG -중합체 접합체의 양의 계산
354 nm에서 UV-VIS 정량화가능한 비스-아릴-히드라존 결합 (29,000 M-1cm-1)을 통해 용출된 부피로부터 비드-고정화된 MTG의 양을 추정할 수 있었다. 1h 인큐베이션 후, 농도는 용출된 부피 중에서 1.6±0.15 μM인 것으로 결정되었고, 출발 농도가 5 μM이었을 때, 약 70%의 접합체가 비드 상에 흡착되었다. MTG는 대개 중합체에 단일 가교-결합되기 때문에, 본 발명자들은 흡착 질량은 ~300 ng/㎠ 또는 ~7.8 pmol MTG/㎠라고 추정할 수 있다. 이들 값은 덴폴-중합체 상에 고정화된 프로테이나제 K 또는 호스래디시-퍼옥시다제, 및 실리카-중합체-표면 상에 고정화된 다른 효소를 사용하여 얻은, 앞서 공개된 결과와 일치한다.
관능성 분자의 단백질에의 부위-특이적 접합을 위한 마이크로비드-고정화된 MTG
MTG-중합체 접합체의 안정적인 고정화를 위해, 양으로 하전된 덴폴-아민의 음으로 하전된 유리 표면에 대한 강한 친화성에 기인하여, 및 비드는 유동-기반 마이크로반응기 내로 쉽게 어셈블리될 수 있기 때문에, 유리 마이크로비드를 선택하여 사용하였다. 상기 셋-업은 우수한 제어가능 방식으로 반복된 샘플 비드-오버플로잉을 가능하게 하며, 이에, 완성되도록 반응을 구동시키는데 사용될 수 있다. 추가로, 마이크로비드는 접합 프로세스 후에 후속 라운드의 접합을 위해 고정화된 MTG를 회수하면서, 간단하게 세척될 수 있다.
scFV, 나노바디 또는 Fab-단편을 포함한, 더 소형인 항체-유사 스캐폴드인 치료 관련 단백질은 더욱 큰 항체와 비교하여 그의 증가된 종양 침투 능력, 그의 용이한 제조 및 더욱 빠른 제거에 기인하여 상당한 관심을 받아오고 있다. 단백질을 관능화시키기 위한 첫 번째 시도에서는 이에, Fab-단편 및 scFV를 접합시키는 것을 목표로 하였으며, 상기 둘 다는 앞서 그의 C-말단 myc-태그에서 스트렙트아비딘 코팅된 표면 상에의 고정화를 포함한 추가의 하류 적용에 이상적인 기질인, 아민으로서 비오틴-카다베린을 사용하여 글루타민 2 ('Q2')를 통해 용액 중의 MTG에 효율적으로 접합된 것으로 밝혀졌다. 비록 글루타민을 함유하는 단백질 상의 가요성 루프 및 말단 태그가 MTG에 의해 우선적으로 표적화되는 것으로 공지되어 있기는 하지만, 구형 구조 및 접근가능한 말단 태그의 존재를 통해 표면-고정화된 MTG의 접합이 이루어질 수 있었고, 벌키한 항체 상의 글루타민 295와 같은 루프 구조와 비교하였을 때, 효소의 활성 부위로의 진입은 덜 어려운 도전과제가 된다. 비오틴-카다베린을 c-말단 myc-태그부착된 Fab-단편 및 scFV과 혼합하였고, 용액을 마이크로반응기 중의 마이크로비드-고정화된 MTG 상에 부었다 (도 1 및 3a). 용액을 마이크로반응기 상에서 30 min 동안 펌핑하였고, 그에 대해 LC-MS 분석을 수행하였다. 목적하는 비오틴-접합된 Fab-단편으로의 ≥95%의 완전한 전환이 관찰되었고, 검출가능한 비접합된 물질은 없었다 (도 3b). 또한, c-myc-태그부착된 scFV는 동일한 조건 하에서 단지 30 min 이내에 효율적으로 접합되어 ≥95%의 목적하는 접합체를 수득하였다 (도 3b).
MTG에 대한 형광 아민 공여자인 단실-카다베린이 또한 단지 8 등몰의 과량에서 Fab 및 scFV에 접합되었고 (도 3a), 그 결과로, 30 min 이내에 ≥95% 단실-표지된 Fab-단편 및 ≥90% scFV가 생성되었다 (도 3b).
일부 경우에, 벌키한 1급 아민 함유 기질의 MTG-반응성 글루타민에의 직접적인 접합은 종종 비접합된 물질을 잔류시키면서, 불완전한 생성물 전환을 일으킨다. 이는 특히 금속 킬레이터 상에 카르복시 기와 같은, 고도로 친수성인 기를 함유하는 기질인 경우에 발생한다. 먼저 "클릭-가능한" 모이어티를 단백질 상에 장착시킨 후, 목적하는 분자의 클릭-접합을 수행하는 2-단계 접근법을 사용함으로써 상기 문제가 회피될 수 있고, 정량적 접합이 발생할 수 있다. 그러므로, SPAAC (스트레인-촉진 알킨-아지드 고리화 첨가) 클릭-화학에 적합한 아민-PEG3-아지드 (도 3c)를 사용하였을 때, myc-태그부착된 scFV에의 접합이 이루어질 수 있는지 여부를 조사하였다. myc-태그부착된 scFV를 칼럼 상에 붓고, 30 min 후, 샘플을 회수하고, LC-MS 분석을 수행하였고, 이미 82%까지 목적하는 scFV-N3 전환이 이루어진 것으로 나타났다 (도 3c). 90 min 동안 지속적인 비드-오버플로잉 결과, 전환율은 97%가 되었고, 밤새도록 진행된 연속 플로잉 (14h) 이후, 검출가능한 비접합된 물질은 전혀 없었다 (도 3c). 이러한 결과는 마이크로비드-고정화된 MTG가 90 min 미만인 시간 이내에, 심지어는 낮은 시약 과량에서도 각종의 기질을 myc-태그부착된 단백질에 정량적으로 접합시킬 수 있다는 것을 명백하게 입증한다.
상기 결과에 기초하여, 전체 항체가 또한 비드-고정화된 MTG에 의해 접합될 수 있는지 여부를 조사하였다. 앞서, 항체 백본 내의 단일 MTG 표적-부위로서, Fc-도메인의 가요성 C'E 루프 상에 위치하는, 탈글리코실화된 항체의 글루타민 295 (Q295)를 정확하게 특정하였고, 이로써, 글리코실화 부위를 제거하는 N297Q 점 돌연변이가 도입된다면, 2 또는 4개의 부착 부위를 포함하는 정의된 항체-접합체가 생성된다. 항체의 벌키성이 그의 배향 가능성을 제한하고, 이에, 루프와 비교하였을 때, 각각 Q295 및 Q297에의 MTG 접근은 가능하게는 더욱 어려워지기 때문에, 표면 상에서의 항체 접합이 용액 중에서의 것보다 더욱 어려운 도전과제가 될 수 있다.
그러므로, 탈글리코실화를 방지하기 위해 N297S 점 돌연변이를 함유하는 IgG1 항체 및 비오틴-카다베린에 고정화된 MTG를 가하였다 (도 4a). 30 min 후, 감소된 항체에 대한 LC-MS 분석을 수행하였고, 그 결과 이미 37%의 중쇄 전환이 일어났으며, 실온에서 1h 후에는 72%였고, 밤새도록 인큐베이션하는 동안 ≥95%로 증가되었다 (도 4a). 동일한 약물 로드를 갖는 종래의 비-특이적으로 접합된 항체와 비교하였을 때, 4-6으로 약물-대-항체-비 (DAR)가 높은, 부위-특이적으로 변형된 항체가 접합된 약물을 종양 표적 부위로 효과적으로 전달하는 것으로 간주되는데, 이는 상기 ADC를 개선된 암 치료제로서 매우 큰 관심의 대상이 되게 만든다. 이에, 고정화된 MTG가 매우 가깝게 인접해 있는 2개의 SPAAC가 용이한 이관능성 링커를 N297Q 항체에 접합시킬 수 있는 그의 능력을 그대로 유지하는지 여부를 조사하였다 (도 4b). 비드-고정화된 MTG는 실제로 링커 둘 다를 정량적으로 및 효율적으로 접합시켜 항체당 4개 링커의 비로 N297Q 항체를 생성하는 것으로 나타났다 (도 4b).
본 연구를 통해 MTG의 특이적이고 효율적인 접합 능력은 고정화 시 그대로 유지되었고 심지어는 단백질의 잔기 특이성을 조정할 수 있다는 것이 명백하게 밝혀졌다.
마이크로비드 상에서의 MTG -중합체 접합체 및 MTG 활성의 안정성 연구
앞서, 덴폴-중합체의 다가양이온 성질이 수주 동안 음이온성 유리 표면 상에 안정적인 표면-고정을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 고체 효소 고정화가 하류 적용에, 특히, 유망한 치료 단백질에 중요하기 때문에, 슬롯-블롯 검정법 및 항-MTG 항체를 사용하여 효소-누출에 관하여 초점을 맞추어 다루었다. 슬롯-블롯은 대량의 샘플을 적용시킬 수 있기 때문에, 및 그의 감도에 기인하여 선택되었다. 양성 대조군으로서 MTG-중합체 접합체는 강한 신호를 나타내었고 (도 4c, 레인 1 i), 또한 비접합된 MTG도 검출될 수 있는 반면 (레인 1, ii), HyNic-중합체는 어떤 신호도 생성하지 않았으며 (레인 1 iii), 이는 항체가 중합체에 접합되었을 때에도, MTG를 특이적으로 인식하였다는 것을 입증하는 것이다. 14h 연속 작동 후, MTG는 여전히 그대로 단단히 부착된 상태로 유지되었고 (레인 2, i 및 ii), 또한 수회의 접합이 이루어진 40h의 작동 후에도, MTG는 여전히 그대로 중합체에 단단히 부착된 상태로 유지되었고, 검출가능한 효소는 없었다 (레인 2, iii). 후자의 조건 하에서, 고정화된 MTG는 3h 후에도 여전히 BC를 N297S IgG1에 >90%로 접합시킬 수 있었다. 상기 데이터로부터 MTG는 여전히 그대로 유리 마이크로비드에 단단히 부착된 상태로 유지되었을 뿐만 아니라, 연장된 기간 동안 및 수회 라운드의 접합에도 각각 활성이었고, 따라서, 이는 MTG보다 크기 범위가 유사한 단백질의 접합을 위해 매우 유망한 도구가 된다는 결론을 얻었다.
고정화된 MTG의 다중 MTG 반응성 아미노산의 존재 하의 잔기 선택성의 증가
고정화된 효소가 기질에 대하여 증가된 선택성을 보인다고 보고되어 있고, 따라서, 이는 고정화된 MTG에 대해서도 적용될 수 있을 것으로 추정되었다. MTG를 사용하였을 때, 반응성 리신 잔기를 보유하는 (모델 단백질로서 작용하는) 아비딘에의 ZQG-Tamra-카다베린 (ZQG-TC)의 용액 중에서의 접합은 디콘볼루션된 LC-MS 스펙트럼에서 2개의 주요 피크를 보였다. 이들 피크는 1개의 ZQG-TC를 포함하는 아비딘 및 2개의 접합된 ZQG-TC를 포함하는 아비딘 뿐만 아니라, 일부 변형되지 않은 아비딘에 상응하는 것이다 (도 5, 좌측 패널). 동일한 실험을 수행하되, 단, 고정화된 MTG를 사용하였을 때, 놀랍게도, MTG는 거의 독점적으로 아비딘의 1개의 리신 잔기를 표적화하였고, 제2 잔기에의 접합은 단지 제한적으로만 일어났는데 (도 5, 우측 패널), 이는 아마도 감소된 회전 MTG-가요성 때문일 것이다. 상기 데이터는 실제로 고정화된 MTG가, 대개는 2개의 잔기가 접합된 용액-상의 경우에는 접근이 불가능한 잔기 선택성을 조정하는데 사용될 수 있다는 것을 보여주는 것이다.
소형 글루타민 함유 펩티드의 탈글리코실화된 및 비- 글리코실화된 IgG1의 리신 잔기에의 부위-특이적 접합
비록 ZQG-유도체를 사용한 리신 측쇄를 통한 항체의 MTG-매개 관능화가 보고되어 있기는 하지만, 접합 수율을 만족스럽지 못하였고 (즉, <20%), 변형된 리신 부위는 보고된 바 없었다. 따라서, 추가 연구는 용액 중 MTG 및 고정화된 MTG를 사용하여 비-글리코실화된 및 탈글리코실화된 IgG1의 리신 잔기를 표적화하는 것을 목표로 하였다. 보편적으로 적용되는 ZQG 또는 그의 유도체보다 상이한 글루타민 펩티드가 IgG1 상의 리신 잔기에 대하여 더욱 효율적으로 접합될 수 있을 것으로 추론되었다. 따라서, 먼저 상이한 pH 조건 하에 용액 중에서 보고된 높은 MTG 활성을 사용하여 글루타민 함유 펩티드로 이루어진 소형 라이브러리를 스크리닝한 후, 이어서, 본 발명자들은 이를 고정화된 MTG에 적용시키고자 하였다. 실제로, 실온에서 16h 인큐베이션 후, 분석을 위해 LC-MS를 사용하였을 때, ZQG보다 더 높은 반응성을 보이는 (도 6), 탈글리코실화된 IgG1에 대해 바람직한 접합 비를 가지는 서열을 확인할 수 있었다. 특히, 펩티드 서열 NH2-FGLQRPY-COOH는 용액 중 pH 7.6에서 탈글리코실화된 IgG1에 대하여 ZQG 대비 2배 더 높은, 거의 50%에 달하는 접합 효율을 보였다 (도 6). 실온에서 밤새도록 고정화된 MTG에 탈글리코실화된 IgG1 및 펩티드 FGLQRPY (펩티드 2, 펩티드 구조는 도 7 좌측)를 가하였을 때, 접합은 30%인 것으로 나타났다 (도 8). 놀랍게도, IgG1 비-글리코실화된 N297S 돌연변이체 및 FGLQRPY를 사용하였을 때, 고정화된 MTG 및 용액 중 MTG의 경우 (각각 도 9 좌측 및 우측), 접합 비는 71%로 증가하였다. FGLQRPY 아지드-유도체 (펩티드 구조는 도 7 우측) 사용시, 분석을 위해 LC-MS를 사용하였을 때, 고정화된 MTG 및 용액 중 MTG의 경우 (각각 도 10 좌측 및 우측), 동일한 결과를 얻었다. 분석을 위해 LC-MS를 사용하였을 때, 주로 단일 변형된 종, 및 단지 소량의 제2 접합만을 발견하였으며, 상기 둘 다는 독점적으로 중쇄에 위치하는 것이었다. 펩티드 맵핑을 통해 Lys288 또는 Lys 290 및 Lys340의 2개의 변형 부위를 확인하였다.
고정화된 MTG 및 용액 중 MTG를 사용한 비- 글리코실화된 IgG1 ( N297S 돌연변이체)에의 부위-특이적 이중 접합
고정화된 MTG 및 용액 중 MTG를 사용한 글루타민 및 리신 접합이 확립되었는 바, 고정화된 MTG 및 용액 중 MTG를 사용하여 N297S IgG1의 Q295 및 K340, K288/K290을 변형시킴으로써 부위-특이적 이중 변형이 실현가능한지 여부가 추론되었다. 예를 들어, 2개의 영상화 프로브를 포함하는 상기 이중 변형된 항체는, 예를 들어 비-침습적 및/또는 수술 중/수술 후 조직 영상화에 매우 적합할 것이다. 대안적으로, 시너지 효과를 보이는 2개의 상이한 독성 페이로드가 부착될 수 있다. 먼저, NH2-PEG3-TCO를 사용하여 Q295를 ≥95%까지 변형시킨 후, 펩티드-2 아지드 유도체로 변형시켜 38%의 약간 더 낮은 수율의 이중 부위-특이적으로 변형된 IgG1을 얻었다 (도 11, 좌측). 용액 중 MTG를 사용한 이중 부위-특이적 접합을 통해서 유사한 결과를 얻었다 (도 11, 우측). SDS-PAGE를 통해 리신 잔기에의 중쇄 특이적 접합을 확인하였고, 또한, 이중-접합된 항체에 대한 LC-MS 결과도 확인되었다 (도 12).
관능성 리신 펩티드의 탈글리코실화된 항체에의 접합
리신 잔기를 함유하는 펩티드가, 용액 중 MTG를 사용하여 글루타민 295 위치에서 탈글리코실화된 항체를 부위-특이적으로 변형시키는데 또한 사용될 수 있는지 여부도 조사하였는데, 이는 현재까지는 문헌상에 기술된 바 없었다. 상기 펩티드에 관능성 기 예컨대 N3-기 (KAYA-GGG-N3) 또는 금속 킬레이터 (예를 들어 NODAGA)를 장착시킴에 따라, 첫 번째 경우에는, 예를 들어 SPAAC-클릭 화학에 의해 낮은 몰 당량으로 또 다른 모이어티를 순차적으로 부착시킬 수 있을 것이다. 두 번째 경우에는, 관능성 모이어티는 직접적으로 접합될 수 있고, 이에, 추가의 하류 프로세싱을 촉진시키는 제2 단계는 필요하지 않다. 추가적으로, 펩티드에의 친수성 아미노산의 도입에 의해, 관능성 모이어티 ("페이로드")의 가용성이 증가될 수 있으며, 이는 소수성 페이로드에 매우 유익하다. 본 연구에서는, KAYA-GGG-N3 뿐만 아니라, KNAA-GK-PEG3-NODAGA 및 KAYA-GK-PEG3-NODAGA도 탈글리코실화된 항체에 높은 효율 (>95%)로 접합될 수 있는 것으로 밝혀졌다.

Claims (15)

  1. 하기 단계를 포함하는, 고정화된 및/또는 비-고정화된 형태의 MTG (미생물 트랜스글루타미나제)를 사용한 유기 분자의 표적 단백질에의 접합 및 융합 단백질의 생성을 위한 방법:
    a) MTG의 고정화를 위해 중합체의 교차-반응성 기를 노출시킴으로써 MTG를 상기 중합체에 부착시키는 단계;
    b) MTG 중합체 접합체를 마이크로비드 상에 흡착시키거나 또는 MTG 중합체 접합체를 용액으로 만드는 단계;
    c) 능동 유동 반응기 칼럼을, MTG 중합체 접합체 흡착된 마이크로비드로 충전시키거나 MTG 중합체 접합체를 포함하는 용액 또는 MTG를 포함하는 용액을 제공하는 단계;
    d) 표적 단백질 및 유기 분자를 유체 내에 제공하고 유체를 충전된 능동 유동 반응기 칼럼을 통해 통과시키거나 또는 유체를 MTG 중합체 접합체를 포함하는 용액 또는 MTG를 포함하는 용액과 혼합하여, 그에 의해 MTG의 촉매화 효과 하에 유기 분자를 단백질에 접합시키는 단계,
    여기서 유기 분자가 글루타민 또는 리신 잔기를 포함하고, MTG에 대한 기질인 펩티드이고,
    펩티드가 관능성 모이어티를 포함하고, 상기 관능성 모이어티는 세포독성 모이어티, 형광 염료, 금속 킬레이터, 또는 SPAAC 클릭-반응을 위한 화학적 모이어티이며,
    글루타민-포함 펩티드가 아미노산 서열 FGLQPRY 또는 SLLQGR를 포함하거나 리신-포함 펩티드가 아미노산 서열 KNAAGGG, KDAAGGG, KAYAGGG, 또는 AKETAA를 포함하는 것임.
  2. 제1항에 있어서, 상기 SPAAC 클릭-반응을 위한 화학적 모이어티가 아지드, DBCO 기, 테트라진, 또는 트랜스-시클로옥텐 기 또는 그의 유도체를 포함하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 펩티드가 펩티드 및 관능성 모이어티 사이에 스페이서 모이어티, 또는 자기-희생 기를 포함하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 스페이서 모이어티는 폴리-에틸렌 글리콜, 또는 알킬 기이고, 자기-희생 기는 p-아미노벤질옥시카르보닐 (PAB)인 것인 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 트랜스글루타미나제가 유기 분자로 표적 단백질 상의 하나 이상의 반응성 리신 잔기 또는 하나 이상의 반응성 글루타민 잔기를 변형시키고; 여기서 잔기는 내인성으로 또는 유전적 수단에 의해 인공적으로 도입되는 것인 방법.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적 단백질이 IgG, IgM, IgA 또는 IgE 포맷의 항체, 또는 그의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 항체가 글루타민-포함 펩티드와 함께면 K288, K290 또는 K340 위치에 변형되고, 항체가 리신-포함 펩티드와 함께면 Q295 또는 N297Q 위치에 변형되는 것인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab)'2, F(ab)'3, Dab, Fv, 단일 쇄 Fv (scFv), scFv-Fc, 또는 (scFv)2 단편인 것인 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중합체가 마이크로비드에 대한 이온 및/또는 공유 결합을 겪는 것인 방법.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중합체가 제2 세대 덴드론화된 중합체, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌옥시드, 폴리(알킬옥사졸린), 폴리비닐피롤리디온, 폴리리신, 폴리글루타메이트, 폴리(에틸옥사졸린), 폴리메타크릴산, 폴리프로프아크릴산 또는 그의 혼합물 및 덴드리머 구조물, 당 잔기를 기재로 하는 중합체, 폴리-N-이소프로필아크릴아미드 (폴리NIPAM), 폴리(글리시딜 메타크릴레이트), 폴리테트라플루오로에틸렌 (PTFE) 및 폴리(에틸렌-alt-테트라플루오로에틸렌) (ETFE), 폴리(올리고에틸렌 글리콜)메타크릴레이트 (POEGMA), 폴리(2-메틸-2-옥사졸린) (PMOXA), 폴리(비닐 알콜) (PVA) 및 폴리(에틸렌 이민) 또는 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  11. 제10항에 있어서, 제2 세대 덴드론화된 중합체가 de-PG2인 방법.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 마이크로비드가 유리, 니켈, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리(4-메틸부텐), 폴리스티렌, 폴리아크릴레이트, 폴리에틸렌 테레프탈레이트, 레이온, 나일론, 폴리(비닐 부티레이트), 폴리비닐리덴 디플루오라이드 (PCDF), 실리콘, 폴리포름알데히드, 셀룰로스, 셀룰로스 아세테이트, 니트로셀룰로스, 젤라틴, 세파로스 마크로비드, 세파덱스 비드, 덱스트란 마이크로캐리어, 아가로스, 알기네이트, 카라기난, 키틴, 셀룰로스, 덱스트란, 전분, 폴리카프로락톤 (PCL), 폴리아크릴아미드, 폴리아크롤레인, 폴리디메틸실록산, 폴리비닐 알콜, 폴리메틸아크릴레이트, 퍼플루오로카본, 실리카, 규조토, 알루미나, 금, 산화철, 그래핀, 산화그래핀, 금속 산화물로 이루어진 군으로부터 선택되고; 마이크로비드의 크기는 1 내지 100 nm, 또는 100 내지 1000 nm, 또는 1 μm 내지 10 μm, 또는 10 μm 내지 1000 μm 범위인 것인 방법.
  13. 제1항 또는 제2항에 있어서, 유체가 수성 완충제 용액이고, 상기 수성 완충제 용액은 염, 글리세롤, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 1-프로판올, DMSO, 메탄올, 또는 아세토니트릴로 이루어진 군에서 선택된 첨가제를 60% 이하로 추가 함유하는 것인 방법.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서, 중합체 MTG 접합체가 중합체 및 MTG 사이에 링커를 수반하며, 상기 링커는 이관능성 링커 시스템 S-HyNic (숙신이미딜-6-히드라지노-니코틴아미드), S-4FB (4-포르밀벤조에이트) 또는 그의 유도체, SMCC (숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트) 또는 그의 유도체, Y-S-Z (Y는 또한 Z일 수 있고, 그 반대로 Z는 또한 Y일 수 있음)와 같은 구조를 갖는 동종- 또는 이종이관능성 스페이서이며, 여기서 Y 및 Z는 하기 기 또는 그의 유도체: 테트라진, 트랜스-시클로옥텐, 아지드, 시클로옥텐, n-히드록시숙신이미드, 말레이미드, 이소티오시아네이트, 알데히드, 에폭시드, 알콜, 아민, 티올, 포스포네이트, 알킨, 포타슘 아실트리플루오로보레이트, α-케토산-히드록실아민, O-아실히드록실아민, 카르복실산, 히드라진, 이민, 노르보렌, 니트릴 및 시클로프로펜이고, S는 중합체 또는 그의 유도체인 스페이서 엔티티이고, 상기 스페이서 엔티티의 중합체 또는 그의 유도체는 올리고 또는 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG), 덱스트란, 알킬, 아미노산 또는 펩티드 유도체인 방법.
  15. 삭제
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