JP2012519558A - マイクロ流体素子を使用する血小板凝集 - Google Patents
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Abstract
被験体から得られた生体サンプルの血小板凝集のリアルタイム・モニタリングを提供するためのマイクロ流体素子。その素子は、生体サンプルの流路用に構成されたチャネルを備え、前記チャネルは、下流のせん断減速領域と連結した上流のせん断加速領域を誘導するように構成され、その間にせん断ピーク速度領域を定義し、前記下流のせん断減速領域が血小板凝集域を定義する、突起を備える。素子は、さらに、前記生体サンプルが前記チャネルを通過する結果としてのの、凝集域における血小板の凝集を検出するための血小板検出手段も備える。さらに、被験体から得られた生体サンプルのリアルタイムの血小板凝集を評価する方法についても説明する。
Description
本願は、2009年3月10日出願のオーストラリア仮特許出願第2009901033号および2009年10月29日出願のオーストラリア仮特許出願第2009905303号の優先権の利益を主張し、その内容は、参照することによって本明細書に援用される。
本発明は、生体サンプル中の血小板またはそれらの前駆体の凝集の解析を促進する素子に関する。その素子は、空間的に制御された血小板凝集をもたらす、血流の局部的かつ制御された外乱を生じる。本発明はまた、血小板の機能および活性の診断を促進するように、既知の場所で血小板を凝集させる方法に関する。本発明は、血小板凝集の速度および範囲を制御可能に調節する方法にも関する。本発明の方法は、被験体の血小板機能の異常の評価に特に有用である。この素子はまた、薬物療法に応答する血小板およびそれらの前駆体の機能および活性を分析するのに有用である。
動脈血栓は、依然として工業化社会における罹患率および死亡率の最も一般的な単一の原因である。この過程の中核をなすのは、血管閉塞、組織梗塞および臓器不全をもたらす、アテローム斑崩壊部位における血小板およびフィブリンの過剰な蓄積である。進行したアテローム斑の血栓形成能力の増大は、病変における組織因子の高い含量;強力な血小板活性化基質(すなわちコラーゲン)の存在;ならびに、アテローム血栓症の過程の血管腔の狭さによって生じた高いせん断応力の直接的な血小板活性化効果を含む、多数の因子に起因する。流動学的な外乱は、アテローム性動脈硬化の過程の各段階の調節において重要な役割を果たす血流の外乱とともに、アテローム血栓症の基本的特徴である。アテローム性動脈硬化症は、典型的には動脈の分岐点または湾曲部(すなわち頸動脈洞)で発現し、せん断速度が遅くなり、不均一に流れうる。病変が進行するにつれて、内腔の狭窄は、せん断勾配、流れの分離、渦形成および乱流などのさまざまな流れの変化を生じ、そのそれぞれがアテローム性動脈硬化の過程における明確な影響を有しうる。血流における最大の変化は、血栓の発達の間に生じうる。流速およびせん断速度は、進行性の血管閉塞に伴って極端な状態になる場合があり、血栓症の過程のせん断依存性の伝播の潜在的に危険なサイクルを確立する。
血管損傷部位における血小板凝集は、止血およびその後の血管修復にとって中心的な重要性を持つ;しかしながら、誇張された血小板凝集反応は、動脈血栓の発現につながり、ひいては、急性の冠不全症候群および虚血性脳梗塞などの疾患を生じうる。血管系疾患の病因における流体力学的要因の重要性についての正しい認識が次第に高まっている。しかしながら、レオロジー変化がアテローム血栓症の過程を加速させる正確な機構は完全には解明されていない。血流の摂動は、血小板の粘着および活性化の機構に重大な影響を有し、高いせん断は特に、血小板活性化および血栓成長を急速に発達させる場合がある。
管を通る流体の流れは、流体粘度が流体せん断速度と無関係なニュートン流体、または、流体粘度が流体せん断速度の関数として変化しうる非ニュートン流体のいずれかに分類できる。血液の場合、細胞成分が流速および血管の幾何学形状に応じて変化しうる、複雑な粘度プロファイルを与え、したがって、当然ながら、血液は非ニュートン流体である。ほとんどの生体外またはインビトロ条件下では、血流は流線または層流であると考えることができ、隣接した流体層は互いに並行に移動する。対称性を有する血管内を流れるニュートン流体では、血管壁における流体抗力は、流れの中心における最大流速および血管壁における最小流速を有する、放物線状のフロープロファイルの発現をもたらす。この仮説に基づいた並行な血流の配置は、粘性抵抗の結果として、隣接した流体層間にせん断力の発生をもたらす。
限局性の血流によって付与された機械的せん断力は、特にマイクロスケールにおける血管狭窄の場合には、複雑であり、単純な層流(並流)モデルとは著しく異なる。狭窄血管を通る血流は、狭窄の入口点における速度の低下、狭窄を越えた流れの急な加速、および狭窄の流出口にある流れの反転および分離(分岐流の流線)を経験しうる。これらの複合的なレオロジー条件は、血小板機能を大いに変化させる場合がある。
血流の影響下における血小板凝集は、表面発現性の糖タンパク質であるGPIb/V/IXおよびインテグリンの一種であるαIIbβ3(GP IIb−IIIa)の両方の接着機能に決定的に依存する。高いまたは上昇するせん断速度条件下では、GPIb/V/IXは可逆的な血小板同士の接着接触を開始させるが、一方、インテグリンαIIbβ3は凝集の形成を安定させる。
本明細書に含まれる資料、行為、材料、素子、物品などについての論述は、単に、本発明のための状況を提供することを目的としている。これらの件のいずれかまたはすべては、先行技術基準の一部を形成するか、または、本願の各請求項の優先日前に存在した本発明に関する分野における周知の一般的知識であると認めたとは受け取られない。
第1の態様によれば、本発明は、被験体から得られた生体サンプルの血小板凝集のリアルタイム・モニタリングを提供するためのマイクロ流体素子を提供し、前記素子は、
前記生体サンプルの流路用に構成されたチャネル、および、
前記生体サンプルが前記チャネルを通過する結果として、凝集域における血小板の凝集を検出するための血小板検出手段
を備え、
前記チャネルは、下流のせん断減速領域と連結した上流のせん断加速領域を誘導するように構成された突起を備え、その領域の間にせん断ピーク速度領域を定義し、
前記下流のせん断減速領域は血小板凝集域を画成する。
前記生体サンプルの流路用に構成されたチャネル、および、
前記生体サンプルが前記チャネルを通過する結果として、凝集域における血小板の凝集を検出するための血小板検出手段
を備え、
前記チャネルは、下流のせん断減速領域と連結した上流のせん断加速領域を誘導するように構成された突起を備え、その領域の間にせん断ピーク速度領域を定義し、
前記下流のせん断減速領域は血小板凝集域を画成する。
突起は、生体サンプルが、初期のせん断速度を生理学的範囲(150秒-1から~10,000秒-1)に定義および律則する適切な速度で、素子を通じて送り出される際に、10×103秒-1〜150×103秒-1の範囲内のせん断ピーク速度を誘発するように構成されうる。突起は、初期のせん断条件を300秒-1〜7000秒-1の範囲内に定義および律則するように構成されうる。突起は、初期のせん断条件を450秒-1 〜3,500秒-1の範囲内に定義および律則するように構成されうる。突起は、初期のせん断条件を約1,800秒-1に定義および律則するように構成されうる。流速は、実質的に一定であって差し支えなく、あるいは、脈動するか、別の方法で変動し、それによって血小板凝集の速度および範囲を変化させてもよい。
突起は、せん断の加速領域を定義するために、チャネルを通過する流れの優勢方向に対して0°〜90°の角度にある上流面、および、せん断の減速領域を定義するために、チャネルを通過する流れの優勢方向に対して0°〜90°の角度にある下流面を備えうる。さらに好ましくは、上流面および下流面が、チャネルを通過する流れの優勢方向に対して、それぞれ30°〜90°の角度であり、さらに好ましくは、流れの優勢方向に対して約85°である。上流および下流面は、実質的に平面、凹面または凸面でありうる。
1つの実施の形態では、ピークせん断領域は、突起とそれに対向するチャネル壁に関するギャップ幅によって定義され、ギャップ幅は、10μm〜40μmの範囲、例えば、限定はしないが、15μm、20μm、25μm、30μmおよび35μmなどから選択される。チャネルを通過する流れの優勢方向に対して並行に測定したギャップの幅は、0.5μm〜20μmである。
第2の態様によれば、本発明は、被験体から得られた生体サンプルの血小板凝集を評価するためのマイクロ流体素子を提供し、前記素子は、
前記生体サンプルの流路用に構成されたチャネル、および
前記生体サンプルが前記チャネルを通過する結果としての、凝集域における血小板の凝集を検出するための血小板検出手段
を備え、
前記チャネルは前記サンプルの流れを摂動するための突起を有し、
前記突起の少なくとも1つの断面寸法は実質的に100マイクロメートル未満であり、
前記突起は前記チャネル内に血小板凝集域を画成するように構成される。
前記生体サンプルの流路用に構成されたチャネル、および
前記生体サンプルが前記チャネルを通過する結果としての、凝集域における血小板の凝集を検出するための血小板検出手段
を備え、
前記チャネルは前記サンプルの流れを摂動するための突起を有し、
前記突起の少なくとも1つの断面寸法は実質的に100マイクロメートル未満であり、
前記突起は前記チャネル内に血小板凝集域を画成するように構成される。
第2の態様の実施の形態では、突起はチャネル内に配置された球形の突起を含んで差し支えなく、サンプルはその周りを流れなければならない。球形の突起のそれぞれの側に実質的に等量のサンプルが流れるように、球形の突起はチャネル内の中央に配置されて差し支えない。
突起または特徴物は、チャネル内に配置された柱を含んでもよく、サンプルはその周りを流れなければならない。このような実施の形態では、柱は、チャネルを部分的に横切る、チャネルの1つの壁から延在しうる。別の実施の形態では、柱のそれぞれの側に実質的に等量のサンプルが流れるように、柱はチャネル内の中央に配置される。
第1または第2の態様の実施の形態では、各チャネルが実質的に同一寸法の突起を有する、複数のチャネルが提供されて差し支えない。このような実施の形態では、検出手段は、すべてのチャネルにおけるすべての血小板凝集の合計を検出するように動作可能でありうる。1つの実施の形態では、複数のチャネルが並行して配列される。本発明のこのような実施の形態は、単一のサンプルが分割され、複数のチャネルのそれぞれを通過する場合の血小板凝集の検出の信頼性の改善に有利でありうる。
第1または第2の態様の実施の形態では、各チャネルが実質的に異なる寸法の突起を有する、複数のチャネルが提供されて差し支えない。このような実施の形態では、検出手段は、チャネルの配列において異なった血小板凝集を並行検出するように動作可能でありうる。1つの実施の形態では、複数のチャネルが並行して配列される。本発明のこのような実施の形態は、単一のサンプルが分割され、複数のチャネルのそれぞれを通過する場合の血小板異常のスクリーニング検出の改善に有利でありうる。
第1または第2の態様の実施の形態では、チャネル表面の少なくとも一部には、血小板凝集を改善するため、血清タンパク質、粘着性の基質またはポリマーが備わっていて差し支えない。
第1または第2の態様の実施の形態では、流れの分離または渦の形成のない、十分に安定な血流を維持するために、チャネルの構成および流速は、チャネル内のレイノルズ数を約26以下に維持するように適合される。1つの実施の形態では、20マイクロメートルの直径のマイクロチャネルを通る8マイクロリットル/分の流速は、0.86のレイノルズ数を生じ、それによって減速流を確保し、または、流動不安定性または渦の形成のないせん断を生じさせる。
血小板凝集の検出およびモニタリングが可能な、いかなる検出装置を使用してもよい。検出装置は、時間の関数としての血小板凝集の画像を記録しうる。
第1または第2の態様の実施の形態では、本発明は、さらに、素子に組み込まれても組み込まれなくてもよい、血小板検出手段としての役割を果たしうる、光検出手段を包含する。光検出手段は、チャネル突起に隣接して配置され、血小板凝集域におけるリアルタイムの血小板凝集をモニタリングする、全反射センサを備えていてもよい。光検出手段は、随意的に、発光素子および位置合わせした光検出器を備えていて差し支えなく、ここで、発光素子は、光検出器が血小板凝集域における血小板の凝集によって生じた内部の光反射の変化を検出するように、チャネルを形成する材料内において内部反射のための光を発光するように構成される。光検出手段は、随意的に、発光素子および位置合わせした光検出器を備えていて差し支えなく、発光素子は、前記光検出器が、血小板の凝集によって生じた伝達される光強度の低下を検出するように、血小板凝集域を通じた伝達のための光を発するように構成される。光検出手段は、随意的に、発光素子および位置合わせした光検出器を備え、発光素子は、光検出器がすべてのチャネルにおける全血小板凝集によって生じた伝達される光強度の低下を検出するように、それぞれの突起によって画成される複数のチャネルの各々の血小板凝集域を通じて発光するように構成される。
光検出手段および/または血小板検出手段は、血小板の挙動における側壁の影響を防ぐために、チャネルの側壁から離れた位置の血小板凝集を観察するように構成されうる。例えば、光検出手段および/または血小板検出手段は、チャネルの側壁から実質的に35マイクロメートル離れた位置の血小板凝集を観察するように構成されうる。
随意的に、血小板検出手段はカメラを備えていてもよい。カメラはCCDカメラでありうる。カメラは、物体からの放射をカメラの画像捕捉要素へと方向付ける、例えば1つ以上のレンズおよび/またはフィルタおよび/または鏡などの放射指向装置を備えていてもよい。検出装置は、顕微鏡を備えていて差し支えない。顕微鏡は、相互に作用する物体に由来する例えば可視光などの放射を検出することによって、物体の相互作用を検出しうる。顕微鏡を明視野モードで操作し、可視光を含む放射を検出してもよい。顕微鏡を蛍光モードで操作し、蛍光信号を含む放射を検出してもよい。顕微鏡は、落射蛍光顕微鏡でありうる。顕微鏡は、物体からの放射を顕微鏡の画像捕捉要素へと方向付ける、例えば1つ以上のレンズおよび/またはフィルタおよび/または鏡などの放射指向装置を備えていて差し支えない。顕微鏡の画像捕捉要素はカメラでありうる。
第1または第2の態様の実施の形態では、素子は、内部に1つ以上の液密チャネルが形成、埋入、または成形された、製造ブロックを含みうる。ブロック材料は、ポリマー、樹脂、ガラス、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、またはケイ素からなる群より選択されうる。
実施の形態では、素子を製造するブロック材料は、 ポリジメチルシロキサン(PDMS)、ホウケイ酸ガラス、SF11ガラス、SF12ガラス、ポリスチレンおよびポリカーボネートのうちの1つである。 好ましい例では、ブロック材料はPDMSである。
理論に縛られることは望まないが、ブロック材料は血液サンプル中に存在する可溶性のタンパク質を拘束し、ブロック材料のこの特性がマイクロ流体素子の有効性に寄与すると考えられる。したがって、ブロック材料は、可溶性の血液タンパク質を材料に結合可能にする特性を有するものが好ましい。
マイクロ流体素子のマイクロチャネルは、ブロック材料と同一の材料または異なる材料でできていて構わない。1つの実施の形態では、マイクロチャネルの断面直径は1000μm未満である。別の実施の形態では、断面直径は100〜200μmである。さらなる実施の形態では、マイクロチャネルの長さは、入口から出口まで、約3mm〜7mmの範囲であり、好ましくは約5mmである。
素子は、各チャネルの付着物を実質的に防ぐために、突起または複数の突起のそれぞれに対して上流に位置した防汚トラップを備えていてもよい。
素子は、さらに、ブロックを置くための実質的に水平な表面を有する固体構造を具備した「固体支持体」を備えていてもよい。1つの実施の形態では、固体支持体は、例えば、顕微鏡スライドなどのガラス、ポリマー、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル、セルロースまたは他の光学的に透明な材料でありうる。
本発明のマイクロ流体素子は、使い捨てまたは交換式の製品として、またはシステムの一部として提供することができることが認識されよう。
さらなる態様によれば、本発明は、被験体から得られた生体サンプルの血小板凝集のリアルタイム・モニタリングを提供するためのシステムを提供し、本システムは、
筺体、および、
第1または第2の態様に従った実施の形態のうちのいずれか1つに従ったマイクロ流体素子
を備え、
前記マイクロ流体素子は前記筺体内に格納される。
筺体、および、
第1または第2の態様に従った実施の形態のうちのいずれか1つに従ったマイクロ流体素子
を備え、
前記マイクロ流体素子は前記筺体内に格納される。
本システムは、マイクロ流体素子の1つ以上の注入口および/または1つ以上の流出口に取り付けられた流体送達システムを備えていてもよい。流体送達システムは、マイクロ流体素子の1つ以上の注入口および/または1つ以上の流出口に直接取り付けられて差し支えない。随意的に、流体送達システムは、筺体の対応する注入口および/または流出口を介して、マイクロ流体素子の1つ以上の注入口および/または1つ以上の流出口に間接的に取り付けられてもよい。
流体送達システムは、マイクロ流体素子の流路または複数の流路のそれぞれを通過する流体サンプルの流速を調節するように構成されうる。マイクロ流体素子の流出口に取り付けられた流体送達システムは、吸引ポンプであってもよい。マイクロ流体素子のサンプル注入口に取り付けられた流体送達システムは、シリンジポンプ、重力送りポンプ、蠕動ポンプまたはいずれかの形態の圧力駆動ポンプでありうる。吸引および圧力ポンプは、動力ポンプまたは手動のポンプ(シリンジなど)でありうる。
本システムは、マイクロ流体素子に熱を供給する加熱器をさらに備えてもよい。加熱器は、マイクロ流体素子を設置するプラットフォームに与えられうる、または取り付けられうる。加熱器には、抵抗電気コイル、抵抗インクの印刷パターンなどが含まれうる。加熱器は、熱伝導性の接着剤でコーティングした、曲がりくねったワイヤを含む抵抗加熱器であってもよい。加熱器は、マイクロ流体素子内のサンプル流体の温度を37℃〜60℃の範囲内、好ましくは37℃前後に制御可能でありうる。
本システムは、システムのさまざまな要素の制御、例えば、マイクロ流体素子が設置されるプラットフォームの温度調節、素子への流体注入のポンプ制御、素子内の流速の計算、キャプチャ・パラメータなどのカメラ構成の制御、および画像処理を可能にする、システム内に統合されたソフトウェアを含みうる。これらの制御域のそれぞれは、モジュールで構成されて差し支えなく、主制御プロセッサから独立して、または主制御プロセッサと連動して用いられうる。
本システムは、検出装置に対しマイクロ流体素子を位置付けるための位置決め装置を備えていてもよい。
光検出装置は、血小板の凝集を記録するための手段をさらに包含して差し支えない。画像が検出装置によって記録される場合には、マイクロ流体素子内でリアルタイムに観察される血小板凝集の度合いを判断するために、異なる時点における多くの画像が記録されうる。
物体の視覚化は、生体サンプル中の物体を色素マーカーまたは蛍光マーカーで標識化することによって強化され、血小板凝集はさらに容易に判断されうる。よって、本方法は、色素マーカーまたは蛍光マーカーを生体サンプルと混合する工程を含みうる。この工程は、生体サンプルをチャネルに供給する工程の前、最中、または後に行って差し支えない。例えば、生体サンプルは、例えば、素子の外部において生体サンプルがサンプル注入口に導入される前に;あるいは、サンプル注入口とフローキャビティの間(例えば、注入口とフローキャビティの間の流路に提供された混合ウェル内)になど、色素マーカーまたは蛍光マーカーと混合されうる。
本発明に従って使用することができる適切な蛍光マーカーの例としては、例えば、Dil、DiOおよび類似体などの長鎖カルボシアニンが挙げられる。具体例としては、Invitrogen社が製造した脂肪親和性のカルボシアニンであるDilC18、DiIC6、DiOC18、DiOC6、ならびに、Sigma社が製造した膜プローブが挙げられる。本発明における使用に適した他の膜プローブは、当業者によく知られているであろう。
蛍光マーカーを含む物体の視覚化の際に、本方法は、励起放射源からの放射線を標識化した血小板に浴びせて蛍光マーカーを励起させる工程を含みうる。放射線は、適切な励起フィルタを通じて血小板に浴びせて差し支えない。励起放射源は、本発明の全般的なシステムの一部を構成しうる。励起放射源は、例えば、ダイオードまたは他の適切な放射源など、青色発光源でありうる。検出装置は、放射源が、放射線が素子に到達する前にそこを通過するように放射線を導くように位置付けられた、蛍光フィルタを含みうる。
第3の態様によれば、本発明は、被験体から得られた生体サンプルのリアルタイムの血小板凝集を評価する方法を提供し、本方法は、
血小板凝集域を定義する下流のせん断減速領域に連結した上流のせん断加速領域を生じさせ、その間にせん断ピーク速度領域を定義するように、前記生体サンプルを、前記サンプルの流れを摂動するチャネル特性を生じる速度で特性化チャネルに通し、
前記生体サンプルが前記チャネルを通過する結果としての、凝集域における血小板の凝集を検出する、
各工程を有してなる。
血小板凝集域を定義する下流のせん断減速領域に連結した上流のせん断加速領域を生じさせ、その間にせん断ピーク速度領域を定義するように、前記生体サンプルを、前記サンプルの流れを摂動するチャネル特性を生じる速度で特性化チャネルに通し、
前記生体サンプルが前記チャネルを通過する結果としての、凝集域における血小板の凝集を検出する、
各工程を有してなる。
特性化チャネルは、第1の態様、第2の態様、またはその実施の形態のいずれか1つに関する上述の突起を備えることが理解されるべきである。
本発明はまた、被験体から得られた生体サンプルの血小板凝集を評価する方法も提供し、本方法は、
前記生体サンプルを、前記サンプルの流れを摂動するための突起を有するチャネルに通す工程であって、前記突起の少なくとも1つの断面寸法が実質的に100マイクロメートル未満であり、前記突起が前記チャネル内に血小板凝集域を画成するように構成される工程と、
前記生体サンプルが前記チャネルを通過する結果として、前記凝集域における血小板の凝集を検出する工程と、
を有してなる。
前記生体サンプルを、前記サンプルの流れを摂動するための突起を有するチャネルに通す工程であって、前記突起の少なくとも1つの断面寸法が実質的に100マイクロメートル未満であり、前記突起が前記チャネル内に血小板凝集域を画成するように構成される工程と、
前記生体サンプルが前記チャネルを通過する結果として、前記凝集域における血小板の凝集を検出する工程と、
を有してなる。
本発明はまた、被験体から得られた生体サンプルの血小板凝集を評価する素子も提供し、前記素子は、
前記生体サンプルの流路用に構成されたチャネルであって、前記チャネルを適切な流速で通過する際に前記サンプルに高せん断区域を誘発し、かつ、前記高せん断区域の下流の負のせん断勾配領域に血小板凝集域を誘発するように、前記サンプルの流れを摂動する方法で特性化されたチャネルと、
前記生体サンプルが前記チャネルを通過する結果として、凝集域における血小板の凝集を検出するための血小板検出手段と、
を備える。
前記生体サンプルの流路用に構成されたチャネルであって、前記チャネルを適切な流速で通過する際に前記サンプルに高せん断区域を誘発し、かつ、前記高せん断区域の下流の負のせん断勾配領域に血小板凝集域を誘発するように、前記サンプルの流れを摂動する方法で特性化されたチャネルと、
前記生体サンプルが前記チャネルを通過する結果として、凝集域における血小板の凝集を検出するための血小板検出手段と、
を備える。
本発明はまた、被験体から得られた生体サンプルの血小板凝集を評価する方法も提供し、本方法は、
前記サンプルに高せん断区域を誘発し、かつ、前記高せん断区域の下流の負のせん断勾配領域に血小板凝集域を誘発するように、前記生体サンプルを、前記サンプルの流れを摂動するチャネル特性を生じる速度で特性化チャネルに通し、
前記生体サンプルが前記チャネルを通過する結果として、前記凝集域における血小板の凝集を検出する、
各方法を有してなる。
前記サンプルに高せん断区域を誘発し、かつ、前記高せん断区域の下流の負のせん断勾配領域に血小板凝集域を誘発するように、前記生体サンプルを、前記サンプルの流れを摂動するチャネル特性を生じる速度で特性化チャネルに通し、
前記生体サンプルが前記チャネルを通過する結果として、前記凝集域における血小板の凝集を検出する、
各方法を有してなる。
本発明の一部の実施の形態では、サンプルの灌流の前に、ガス抜きしたタイロード緩衝液(4.3mMのK2HPO4、4.3mMのNaHPO4、24.3mMのNaH2PO4、113mMのNaCl、5.5mMのD−グルコース、pH7.2)を用いてチャネルに下塗りし、気泡を除去する。典型的には、タイロード緩衝液は45℃に加熱される。
突起または特徴物は、チャネルを部分的に遮る障壁を備えていてもよい。このような実施の形態では、障壁とそれに対向するチャネル壁との間のギャップは、実質的に0.5〜40マイクロメートルであることが好ましい。ギャップの幅は、チャネルを通る流れの優勢方向に対して平行に測定して、好ましくは0.5〜20マイクロメートルであり、さらに好ましくは約15マイクロメートルであり、適切な流速下で、20,000秒-1前後のせん断条件を生じるように構成されることが好ましい。しかしながら、ピークせん断速度は、実質的に10,000秒-1〜150,000秒-1またはそれ以上の範囲でありうることが理解されるべきである。流入チャネルは、ギャップの上流に1,800秒-1前後のせん断条件を生じるように構成されることが好ましい。障壁は、チャネルを通過する流れの優勢方向に対して30度〜90度の角度である、上流面を備えることが好ましい。障壁は、チャネルを通過する流れの優勢方向に対して30度〜90度の角度である、下流面をさらに備えることが好ましい。上流面および下流面は、実質的に、平面、凹面または凸面でありうる。
1つの実施の形態では、素子は、生体サンプルを受け入れるための注入口または開口部、および流出口をさらに備える。注入口および流出口は、それらと接続した各微小毛細血管またはマイクロチャネルのいずれかの末端に位置している。
ここで意図される典型的な流速は、インビボにおける血管系で存在するといわれるものの発現に必要とされる範囲に及ぶ。典型的には、微小毛細血管またはマイクロチャンバを通る生体サンプルの流速は500〜0.5マイクロリットル/分の範囲であり、例えば2〜42μl/分の範囲でありうる。
本発明はまた、血小板またはそれらの前駆体の異常な機能または活性を伴う疾病または障害を有するまたはそれらの進行の危険性のある被験体の検出または評価のための診断方法も提供し、本方法は、本発明のマイクロ流体素子を包含する。
本発明はまた、被験体における血小板またはそれらの前駆体の異常な機能または活性を伴う疾病または障害の存在またはそれらの進行の危険性を診断する方法も提供し、本方法は、
i)前記被験体から生体サンプルを入手し、
ii)前記生体サンプルを、定義されたフロー条件下、前記生体サンプルから得た細胞を凝集可能にするのに十分な時間、本発明に従った素子に通し、
iii)前記細胞の凝集を検出し、
iv)前記生体サンプルの細胞凝集に至る時間およびその大きさを所定の基準値と比較する、
各工程を有してなり、ここで、
変動は、血小板またはそれらの前駆体の異常な機能または活性を伴う疾病または障害の存在、またはそれらの進行の危険性の指標となる。
i)前記被験体から生体サンプルを入手し、
ii)前記生体サンプルを、定義されたフロー条件下、前記生体サンプルから得た細胞を凝集可能にするのに十分な時間、本発明に従った素子に通し、
iii)前記細胞の凝集を検出し、
iv)前記生体サンプルの細胞凝集に至る時間およびその大きさを所定の基準値と比較する、
各工程を有してなり、ここで、
変動は、血小板またはそれらの前駆体の異常な機能または活性を伴う疾病または障害の存在、またはそれらの進行の危険性の指標となる。
本発明の1つの実施の形態では、本方法は、血栓の発達および分解、心臓血管系の疾患、疾患および薬物に起因する止血機構の変化、血小板機能障害および受容体異常、薬物療法に対する感受性、フォン・ヴィレブランド病またはビタミンK欠乏症などの出血障害、狭窄、真性糖尿病、凝固障害、脳卒中リスク、または、グランツマン血小板無力症、ベルナール・スーリエ症候群および貯蔵プール病などの血小板機能障害の診断に使用して差し支えない。
「血小板の異常機能または異常活性」とは、血小板粘着、血小板凝集、血小板の移動(translocation)、血小板速度、血小板の形態、および血栓の安定性に関する活性または欠陥を意味している。この用語はまた、血小板の細胞質顆粒の脱顆粒および放出における欠陥を含むことが意図されている。この用語はまた、血小板機能に影響を及ぼす血漿因子における異常を含むことが意図されている。
さまざまな血小板の欠陥は、本発明の当業者にとって周知であろう。
本発明はまた、生体サンプル中の血小板またはそれらの前駆体の凝集における試薬の調節作用を検査または評価する方法も提供し、本方法は、
i)前記生体サンプルを、定義されたフロー条件下、血小板凝集が前記素子内で生じるか否かを決定するのに十分な時間、本発明のマイクロ流体素子に通し、
ii)工程(i)から得られた結果を、工程(i)を前記試薬の不存在下で行った結果と比較する、
各工程を有してなる。
i)前記生体サンプルを、定義されたフロー条件下、血小板凝集が前記素子内で生じるか否かを決定するのに十分な時間、本発明のマイクロ流体素子に通し、
ii)工程(i)から得られた結果を、工程(i)を前記試薬の不存在下で行った結果と比較する、
各工程を有してなる。
本発明の素子および方法は、抗血小板薬で治療した被験体における抗血小板薬の有効性の評価に使用することができることが認識されよう。このような被験体には、心臓カテーテルインターベンションで治療した被験体が含まれる。これには、 血管造影図、血管形成、およびステント留置が含まれる。加えて、素子は、人工心臓弁を受け入れた患者における抗血小板薬の有効性をモニタリングするために使用することができる。
本発明の素子および方法は、過剰の血小板活性に起因する冠状動脈血栓症(心発作)、肺塞栓症、脳卒中、または深部静脈血栓症などの心血管系イベントを防ぐために薬剤を摂取する被験体における、アスピリンまたは他の抗血小板薬の有効性の評価に使用することができる。
本発明の素子および方法はまた、過度の出血の危険性がある被験体の診断に使用することもできる。この試験は、例えば、外科的または歯科的処置の前に必要とされうる。例えば、本方法は過度の出血の危険性を判断するために、抜歯または親知らずを抜く前に患者に使用することができる。
本発明はまた、血小板またはそれらの前駆体の異常な機能または活性を伴う疾病または障害を有する、またはそれらの進行の危険性のある被験体の診断方法における本発明のマイクロ流体素子の使用も提供する。
1つの実施の形態によれば、素子内に灌流させる前に、試薬を生体サンプルに加えてもよい。あるいは、試薬は、生体サンプルを被験体から採取する前に、被験体に投与してもよい。
別の例では、試薬は、マイクロチャネルの壁に施用することにより、生体サンプルが素子のマイクロチャネルを通過する際に生体サンプルに加えてもよい。
例えば、抗血小板薬クロピドグレルを投与した患者から採取した血液サンプルの場合には、生体サンプルは、システムをクロピドグレルの効果に感応性にするために、試薬P2Y1(ADP)受容体拮抗薬MRS2179で前処理されうる。
マイクロ流体素子に灌流させる前にサンプルを前処理するための試薬の適切な容量の選択は、当業者に周知であろう。前処理に用いられる阻害剤濃度は、血小板サンプルに加えた外因性のADPに応答する標準化された血小板凝集測定によって、血小板サンプルに加えた外因性のADPによる血小板インテグリンαIIbβ3の活性化に基づいた蛍光活性化細胞分類によって、またはマイクロ流体素子自体のさまざまな反復における用量反応測定を介して、決定されうる。
本発明はまた、試薬を用いた療法を受ける被験体の治療をモニタリングする方法も提供し、本方法は、
(i)定義されたフロー条件下、血小板凝集が前記素子内で生じるか否かを決定するのに十分な時間、前記被験体に由来する第1の生体サンプルを本発明の素子に通す工程であって、前記第1の生体サンプルが、前記被験体への前記試薬の投与前に得られる工程と、
(ii)定義されたフロー条件下、血小板凝集が前記素子内で生じるか否かを決定するのに十分な時間、同一の被験体に由来する第2の生体サンプルを本発明の素子に通す工程であって、前記第2の生体サンプルが、前記被験体への前記試薬の投与後に得られる工程と、
(iii)工程(i)から得られた結果を工程(ii)で得られた結果と比較する工程と、
を有してなる。
(i)定義されたフロー条件下、血小板凝集が前記素子内で生じるか否かを決定するのに十分な時間、前記被験体に由来する第1の生体サンプルを本発明の素子に通す工程であって、前記第1の生体サンプルが、前記被験体への前記試薬の投与前に得られる工程と、
(ii)定義されたフロー条件下、血小板凝集が前記素子内で生じるか否かを決定するのに十分な時間、同一の被験体に由来する第2の生体サンプルを本発明の素子に通す工程であって、前記第2の生体サンプルが、前記被験体への前記試薬の投与後に得られる工程と、
(iii)工程(i)から得られた結果を工程(ii)で得られた結果と比較する工程と、
を有してなる。
本発明に従った別の実施の形態では、第1および第2のサンプルは、両方とも、試薬の効果を経時的にモニタリングすることができるように、被験体への試薬の投与後に入手される。例えば、第2の生体サンプルは、患者の治療を漸次、モニタリングするために、第1のサンプルの後、例えば、1日後、5日後、1週間後、1ヶ月後、4ヶ月後の規定された期間に採取して差し支えない。
したがって、本発明は、試薬を用いた療法を受ける被験体の治療をモニタリングする方法も提供し、本方法は、
(i)定義されたフロー条件下、血小板凝集が前記素子内で生じるか否かを決定するのに十分な時間、前記被験体に由来する第1の生体サンプルを本発明の素子に通す工程であって、前記第1の生体サンプルが、前記被験体への前記試薬の初回投与前に得られる工程と、
(ii)定義されたフロー条件下、血小板凝集が前記素子内で生じるか否かを決定するのに十分な時間、同一の被験体に由来する第2の生体サンプルを本発明の素子に通す工程であって、前記第2の生体サンプルが、前記被験体への前記試薬の2回目の投与後に得られる工程と、
(iii)工程(i)から得られた結果を工程(ii)で得られた結果と比較する工程と、
を有してなる。
(i)定義されたフロー条件下、血小板凝集が前記素子内で生じるか否かを決定するのに十分な時間、前記被験体に由来する第1の生体サンプルを本発明の素子に通す工程であって、前記第1の生体サンプルが、前記被験体への前記試薬の初回投与前に得られる工程と、
(ii)定義されたフロー条件下、血小板凝集が前記素子内で生じるか否かを決定するのに十分な時間、同一の被験体に由来する第2の生体サンプルを本発明の素子に通す工程であって、前記第2の生体サンプルが、前記被験体への前記試薬の2回目の投与後に得られる工程と、
(iii)工程(i)から得られた結果を工程(ii)で得られた結果と比較する工程と、
を有してなる。
試薬で処理した後、血小板凝集の挙動を経時的に比較することによって、臨床医が被験体に投与されている試薬の用量を修正し、それと同時に、試薬を用いた治療を打ち切るか否か、または、投与する試薬を変更するか否かについて、詳細な情報を得た上での決断をすることが可能になる。
本発明はまた、被験体における抗血小板治療をモニタリングするため、本発明に従った素子の使用も提供する。1つの実施の形態では、素子は、アスピリンおよびクロピドグレル「耐性」または治療の失敗の他の兆候を示す被験体の識別に使用してもよい。
「血小板凝集が生じたか否かを決定するのに十分な時間」という用語は、生体サンプルが素子を通過する時間であり、このような時間は本発明の当業者にとって周知てあろう。1つの実施の形態では、時間は、少なくとも約10分間である。別の例では、時間は少なくとも約20分間である。
本発明はまた、生体サンプルにおける血小板機能および/または生存能力をモニタリングするため、本発明に従ったマイクロ流体素子の使用も提供する。
例えば、素子は、血小板に関連する出血障害を患う患者の臨床治療に使用するための血小板単離物および製剤(例えば点滴)のスクリーニングおよび、それらの品質管理の役割で使用して差し支えない。素子はまた、患者に投与する前の、血小板輸血製品の生存能力および有効性の評価に使用してもよい。素子は、長期保管後の血小板の生存能力および有効性の評価に使用してもよい。
本発明はまた、出血障害のスクリーニングとしての本発明に従ったマイクロ流体素子の使用も提供する。
1つの実施の形態では、被験体から得られた生体サンプルを、1つ以上の血小板阻害剤を使用して前処理し、マイクロ流体素子の多くの画成された幾何学形状に通して差し支えなく、ここで、素子内で観察された血小板凝集の程度は、出血障害と関連性がありうる。
素子は、先天的な出血欠陥(例えばビルブラント卿病)および後天的な出血欠陥(例えば薬物、後天的血小板症)の両方の出血の原因の決定に使用することができる。先天的出血障害として、次のものが挙げられる:
ビルブラント卿病、グランツマン血小板無力症、ベルナール・スーリエ症候群、スコット症候群;
グレイ血小板症候群、ケベック血小板症候群、α−SPD(貯蔵プール欠乏症)、α,δ−SPDなどのα顆粒欠損症;
ハーマンスキー・パドラック症候群、チェディアック・東症候群、グリセリ症候群、δ−SPDなどの密顆粒欠乏症;
ウィスコット・アルドリッチ症候群およびMYH9および関連する巨大血小板障害などの細胞骨格欠損。
ビルブラント卿病、グランツマン血小板無力症、ベルナール・スーリエ症候群、スコット症候群;
グレイ血小板症候群、ケベック血小板症候群、α−SPD(貯蔵プール欠乏症)、α,δ−SPDなどのα顆粒欠損症;
ハーマンスキー・パドラック症候群、チェディアック・東症候群、グリセリ症候群、δ−SPDなどの密顆粒欠乏症;
ウィスコット・アルドリッチ症候群およびMYH9および関連する巨大血小板障害などの細胞骨格欠損。
素子はまた、薬物反応における患者間の差異を評価するために使用して差し支えなく、また、出血の危険性の高い患者の特定に使用することもできる。
本発明は、小児科の被験体における出血障害の解析のための本発明に従ったマイクロ流体素子の使用も提供する。例えば、素子は、少量の血液サンプルしか入手できない新生児および小児患者のスクリーニングに使用してもよい。別の例では、素子は、頭蓋内出血の危険性がある乳幼児および/または新生児の発見に使用して差し支えない。素子は、出血が主に血小板機能障害に関連するか否かを見定めるのに使用してもよい。
本発明の他の実施の形態では、本発明は、初回通過アッセイ用の装置として、並行に並んだ変動する幾何学形状を、6〜300の幾何学的形状の変動範囲で包含する場合もありうる。この広範囲のスペクトル配列の結果は、対象とする血小板サンプルに最も適した幾何学形状の特異的集合を定義するのに使用することができよう。これは、幾何学形状の一部のアッセイに着目した較正の過程と見なされうる。素子の配列バージョンは、高スループットスクリーニングの手順における有用性を見出す。
したがって、本発明は、抗血小板治療のための薬剤開発の実験的な高スループットスクリーニング手段としての本発明のマイクロ流体素子の使用も提供する。1つの実施の形態では、複数の血小板サンプルは、さまざまな小分子またはペプチド阻害剤で処理され、サンプルをマイクロ流体素子に通すことによって分析する。このようにして、新規の抗血小板薬が、大規模な化学ライブラリーから迅速かつ効率的に識別されうる。抗血小板活性を有する分子またはペプチドを、分析し、定義された一連のマイクロチャネルの幾何学形状を灌流させた未処理の対照サンプルと比較する。
本発明はまた、複数の候補抗血小板化合物の高スループットスクリーニング方法も提供し、本方法は、
(i)被験体から入手した少なくとも1つの生体サンプルを、前記複数の候補抗血小板化合物のうち少なくとも第1の候補化合物と接触させ、
(ii)前記サンプルを、定義されたフロー条件下、血小板凝集が前記素子内で生じるか否かを決定するのに十分な時間、本発明のマイクロ流体素子に通し、
(iii)前記少なくとも1つの生体サンプルの血小板凝集における前記複数の候補抗血小板化合物のうちの第1の候補化合物の効果を検出し、
(iv)(iii)で見られた効果を前記候補化合物と接触していない対照サンプルと比較する、
各工程を有してなる。
(i)被験体から入手した少なくとも1つの生体サンプルを、前記複数の候補抗血小板化合物のうち少なくとも第1の候補化合物と接触させ、
(ii)前記サンプルを、定義されたフロー条件下、血小板凝集が前記素子内で生じるか否かを決定するのに十分な時間、本発明のマイクロ流体素子に通し、
(iii)前記少なくとも1つの生体サンプルの血小板凝集における前記複数の候補抗血小板化合物のうちの第1の候補化合物の効果を検出し、
(iv)(iii)で見られた効果を前記候補化合物と接触していない対照サンプルと比較する、
各工程を有してなる。
素子における血小板凝集の検出および観察を容易にするために、候補抗血小板化合物に、検出可能な標識化群を含めてもよいことは、本発明の当業者に認識されよう。
上記高スループットスクリーニング方法は、せん断依存性の血小板欠陥に関する、トランスジェニックマウスなどのトランスジェニック動物に由来する複数の血小板サンプルをスクリーニングするためのスクリーニング手段として有利でありうることもまた認識されよう。素子の高スループット配列バージョンは、組み換えまたは化学的突然変異を被ったマウスに由来する数多くのサンプルを、血小板の欠陥について迅速にスクリーニング可能にする。本方法は、多数のトランスジェニックマウスのサンプルのスクリーニングにも使用されうる。
本発明はまた、新規の抗血小板試薬も提供し、前記試薬は、本発明に従ったマイクロ流体素子を組み込んだ高スループットスクリーニングによってもたらされる。
本発明は、血小板機能のモニタリングに使用するためのキットであって、
(i)本発明に従ったマイクロ流体素子と、
(ii)前記素子が血小板機能のモニタリング用のシステムに使用されることを示す使用説明書と
を具備する包装材料を備えたキットも提供する。
(i)本発明に従ったマイクロ流体素子と、
(ii)前記素子が血小板機能のモニタリング用のシステムに使用されることを示す使用説明書と
を具備する包装材料を備えたキットも提供する。
本実施の形態は、局所的なせん断マイクロ勾配が、高せん断加速区域の直後に生じるせん断の減速区域における血小板凝集を促進するという認識で開発された。よって、せん断の加速区域と、その後に続く密結合したせん断減速区域(せん断勾配)は、安定化した血小板凝集の発現をもたらす条件である。
本発明の一例を、 添付の図面とともに説明する。
本発明者らは、血管損傷部位での血小板凝集および血栓成長の開始における、血液流動学上の急激な変化についての鍵となる役割を特定した。特に、本発明者らは、膜連結の再構築とも呼ばれる特異的な膜付着構造の発現に依存する凝集の安定化を伴う、円盤状の血小板凝集の誘発におけるマイクロスケールのせん断勾配の重要な役割を実証した。したがって、局部的なせん断マイクロ勾配に応じて、血栓の発現は、形成された凝集の安定化における二次的な役割を担う、トロンビン、ADPおよびTXA2などの可溶性の血小板作動薬の生成を伴った、主に円盤状の血小板から成る。これらの新しい発見は、可溶性の作動薬の生成が血小板凝集および血栓成長の主な駆動力であるという長年抱かれてきた考えに異議を唱えるものである。
図1は、血小板凝集域を画成する球形の突起を通るサンプルの流れを一般に例証する概略図である。これは、以下にさらに説明するマイクロせん断勾配技術を裏付ける、せん断勾配依存性の血小板凝集(S.G.A)の実用モデルを示している。血管壁の幾何学形状の変化に起因する、または、部分的な内腔の閉塞結果すなわち発現する血栓による、血流の限局性の摂動は、せん断が加速する狭小な区域と、それに続く、せん断が減速する密結合した区域を特徴とする、局所的なせん断勾配を確立する。せん断の加速区域を横断する流跡線を辿る円盤状の血小板は、ピークせん断領域(区域2)内にフィラメント状の膜連結相互作用を形成する。これらの血小板がその後に減速せん断区域(区域3)へと移動(translocation)することにより、全般的な連結が密になり接着が強化されることを特徴とする、膜連結の能動的な(Ca2+依存性の)再構築をもたらす。円盤状の血小板の動員および連結の再構築の進行は、血管損傷部位から下流の安定化した円盤状の血小板凝集および血栓増加を促進する。
図2aは、マウスの腸間膜細動脈壁の化学損傷部位において生じる円盤状の血小板凝集を示す、一連の代表的な微小画像である。成長する血小板凝集は、名目上、上流の象限(区域1)、側部の象限(区域2)および下流の象限(区域3)に区画化されていることに留意されたい。黒い矢印は、化学的処理によって生じた損傷を示している。白い矢印は、初期の血小板の動員が見られた点を示している。白い破線は、円盤状の血小板凝集の外側縁の境界を定めている。スケールバーは5μmである。図2bは、インビトロにおける血小板血栓の表面の異なるせん断区域(区域1、2および3)における円盤状の血小板凝集の存続時間を示すグラフを提示している(n=24実験)。結合の存続時間は、低せん断区域(区域3)で著しく大きいことに留意されたい。
図2cは、インビトロおよびインビボにおけるネズミ科の動物の血栓の発達、すなわち;インビトロの血栓表面のインビトロの血栓凝集の頻度(n=24実験);C57Bl/6野生型マウスのインビボの血栓表面におけるインビボの血栓凝集の頻度;200mg/kgのアスピリン、50mg/kgのクロピドグレル(経口)+50mg/kgのヒルジン(静脈)を投与したP2Y1 -/-マウスのインビボの血栓表面におけるADP、TXA2拮抗薬+ヒルジンのインビボにおける凝集の頻度(n=14)の、異なるせん断区域(区域1、2および3)内における円盤状の血小板の連結の相対的画分を示すグラフである。血小板の動員の主な領域は、減速区域(区域3)で生じることに留意されたい。
図2dは、適用したバルクせん断速度(γ)の関数としての、インビトロにおけるあらかじめ形成された血小板単分子層の表面における円盤状の血小板凝集の存続時間を示すグラフである[n=3]。このデータセットは、連結の形成を通じた血小板の動員が、インビトロおよびインビボにおける区域3内に見られる血栓に近い、300秒-1以下のせん断速度において、最も効率的であることを実証している。
全般的なこのデータセットは、休止している円盤状の血小板の粘着および凝集性の相互作用が、インビトロおよびインビボにおける血栓の下流面に生じるせん断の減速領域に感受性になることを実証している。これは、素子設計の生物学的基礎を形成する基本的な観察であり、Nesbitt W. S. et. al., “A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation”. Nat Med. 2009 Jun;15(6):665-73に公開されている。
図3aは、一連の差分コントラスト画像であり、図3bは、それぞれ、マイクロせん断勾配適用の関数としての血小板の動的構造再構築を示す、走査型電子顕微鏡画像を含む。 図3aは、固定化した繊維性I型コラーゲン上にあらかじめ形成された、血栓の下流面における動的血小板連結挙動を示す微分干渉コントラスト(DIC)画像を示している(適用バルクせん断速度=1800秒-1)[スケールバー=2μm]。白い庇状部分(marquee)は、円盤状の血小板連結の進行を強調している:初期の血小板相互作用は、短い連結(144秒)を形成し、急速に密集し(161〜188秒)、円盤状の本体部分の近位に球根状の膜構造を生成する(白い矢印:191秒)。図3bは、広がった血小板単分子層の表面に接着する間に、フィラメント状の再構築された膜連結を発現する、円盤状の血小板の走査型電子顕微鏡(SEM)画像を示している(流速300秒-1)[スケールバー=1μm]。
この新規のせん断勾配依存性の血小板凝集機構の特定につながる試験の結果、血小板凝集および血栓の発達を誘発する一次的なせん断勾配を利用するマイクロ流体工学系の流体素子が開発された。
図4a〜4cは、それぞれ、階段状の形状を有するマイクロせん断勾配素子の概略図を例証している。図4aは、階段状の形状の構成の全般的な原理を示す、マイクロせん断勾配素子の概略図である。血液サンプルは、マイクロせん断勾配チャンバを通じて左から右に灌流する。サンプルとマイクロスケールの階段状の形状との相互作用は、障壁にわたる初期のせん断加速と、その後の、凝集区域内における円盤状の血小板の凝集を促進する、障壁および階段のすぐ下流の密結合した減速段階とをもたらす。図4bは、この実施の形態において、階段状の形状が、6つの主要なパラメータによって定義されることを例証している、すなわち:i.初期の血液せん断速度を生理学的範囲(150〜10,000秒-1)に定義および律則する流入チャネル幅(100〜1000μm);ii.血流の加速度を定義する0° 〜90°(さらに好ましくは30°〜90°)の範囲の流入角度、または接触角度(θc);iii.加速段階に続くピークせん断段階を定義する10μm〜40μmの範囲の階段のギャップ高さ;iv.血小板凝集域を画成する拡張幾何学形状内に入る重要な血流の減速度を定義する0°〜90°(さらに好ましくは30°〜90°)の範囲の漸拡角度(θe);v.減速段階の規模を定義する100〜1000μmの範囲の拡張チャネル幅;およびvi.突起の幅を定義する0.5〜20μmの範囲のギャップ幅。図4cは、100μmの流入幅、θc=90°、10μmのギャップ高さ、θe=30°、および700μmの拡大幅(図では部分的にしか見えない)で構成される、製造したマイクロせん断勾配素子を示す顕微鏡写真(倍率40倍)である。
図5a〜5dは、それぞれ、図4に示した種類の階段状の形状を有するマイクロせん断勾配素子の概略図を示している。図5aおよび5bは、マイクロチャネルのポリジメチルシロキサン(PDMS)ブロック500の断面図であり、長方形のマイクロチャネル510の位置および寸法が示されている。図5cは、階段状の形状を有するマイクロチャネル素子500の上面図であり、直径16mmの入口520および直径2mmの出口522が示されている。図5dは、ブロック500の階段状の形状の詳細な上面概略図であり、マイクロチャネル512に対する階段状の形状の位置が示されている。図5dに示すように、入口520から続く供給チャネル516は幅725マイクロメートルであり、マイクロチャネル512は幅100マイクロメートルであり、階段514の障壁はマイクロチャネル512の下流端に10μm〜40μmのギャップ幅を残し、流出路518は100〜1,000マイクロメートルの範囲の幅である。階段514の障壁の上流面は、0〜90度(さらに好ましくは30°〜90°)の間で選択される流れ方向に対する角度θcを提示し、下流面は、0〜90度(さらに好ましくは30°〜90°)の間で選択される角度θeを提示する。
図6a〜6dは、球体の形状を使用するマイクロせん断勾配素子の実施の形態を示している。 図6aは、マイクロせん断勾配素子の概略図であり、球体形状の構成の全般的な原理を図示している。矢印610は、血液サンプルがマイクロせん断勾配チャンバ612を通って左から右に灌流することを示している。サンプルとマイクロスケールの球体形状614との相互作用は、球体614のすぐ上流の側部および軸方向のせん断の加速と、その後の、球体614のすぐ下流の密結合した減速段階とをもたらし、減速段階は、球体の形状614の下流面における円盤状の血小板の凝集を促す。球体形状は、2つの主要なパラメータ:i.流速の関数としての初期の血液せん断速度を定義および律則するチャネル幅(100〜200μm);およびii.実質的な層流フロープロファイルのピーク流速領域への球体の侵入を定義し、かつ、せん断勾配の変化の規模、空間分布および速度を定義する、0.5〜100μmの範囲の球体直径によって定義される。図6b〜6dは、本発明の代替となる実施の形態において生じうる球体形状の全体的なバリエーションを示している。これらの3次元の幾何学形状または特徴は、6(b)に示す624などの半球体から、そのままの状態の(in situ)血栓の形状にさらによく似ている図6(c)に示す634などの涙滴の形状、および/または、図6(d)に示す644などの、さまざまな度合いの反り(camber)を有する凸面の形状に及びうる。
図7a〜7dは、発明の別の実施の形態に従って、内部に球体形状のマイクロチャネルを有するマイクロせん断勾配素子が製造された、ポリジメチルシロキサン(PDMS)ブロック700の概略図である。図7aおよび7bは、マイクロチャネルブロック700の断面図を示しており、長方形のマイクロチャネル710の位置および寸法が示されている。図7cは、球体の形状を有するマイクロチャネル素子700の上面図であり、直径16mmの入口720および直径2mmの出口722が示されている。図7dおよび7eは、それぞれ、球体の形状714の詳細にわたる側面および上面の概略図を示しており、マイクロチャネル712に対する球体形状714の位置が示されている。図7dに見られるように、マイクロチャネル712は100〜200マイクロメートルの高さを有し、球体714は頭上に50〜99.75マイクロメートルのギャップの幅を残し、流出路718は100〜200マイクロメートルの範囲の高さを有する。球体714は、0.5〜100マイクロメートルの直径を有する。図7eの上面図に示すように、球体714は、チャネル712の床面上の中央に配置され、50〜99.75マイクロメートルの範囲の同じ大きさの側面ギャップを残す。マイクロチャネル712の上流の流入チャネル716は、725マイクロメートルの幅を有する。
図8は、突起がチャネル812における柱814からなる、本発明の実施の形態を例証している。矢印810は、血液サンプルがマイクロせん断勾配チャンバ812を通って左から右へと灌流することを示唆している。サンプルとマイクロスケールの柱状形状814との相互作用は、柱814のすぐ上流および周りの側部のせん断の加速と、それに続く柱814の周りおよびすぐ下流の密結合した減速段階をもたらし、これが、柱状の形状814の下流面における円盤状の血小板の凝集を促す。このような柱状の形状は、3つの主要なパラメータ:i.流速の関数としての初期の血液せん断速度を定義および律則するチャネル幅(100〜200μm);ii.実質的に層流のフロープロファイルのピーク流速領域への柱の侵入を定義する、0.5〜100μmの範囲の柱の高さ;およびiii.せん断勾配の変化の規模、空間分布および速度を定義する、0.5〜100μmの範囲の柱の直径、によって定義される。
図9a〜9eは、本発明のさらなる実施の形態に従った柱の形状を有するマイクロせん断勾配素子900の断面の概略図である。 図9aおよび9bは、マイクロチャネルブロック900の断面図であり、長方形のマイクロチャネル912の位置および寸法が示されている。図9cは、柱状の形状を備えたマイクロチャネル素子900の上面図であり、直径16mmの入口920および直径2mmの出口922が示されている。図9dおよび9eは、それぞれ、柱状の形状の詳細にわたる側面および上面の概略図であり、マイクロチャネル912に対する柱914の位置が示されている。図9dに見られるように、マイクロチャネル912は、100〜200マイクロメートルの範囲の高さを有し、柱914は、頭上に50〜99.75マイクロメートルのギャップを残し、流出路918は、100〜200マイクロメートルの範囲の高さを有する。柱914は、0.5〜100マイクロメートルの直径、および0.5〜100マイクロメートルの高さを有する。図9eの上面図に示すように、柱914は、チャネル912の床面上の中央に配置され、50〜99.75マイクロメートルの範囲の同じ大きさの側部ギャップを残す。マイクロチャネル912の上流の流入チャネル916は、725マイクロメートルの幅を有する。
図10aは、本発明の実施の形態に従ったマイクロ流体素子を概略的に例証している。マイクロ流体素子は、第1の外層(図示せず)、第2の外層1008および、製造した挿入層1000の3つの層を含む使い捨てのカートリッジである。カートリッジは、多目的の筺体(図示せず)内に入れることができる。
製造した挿入層1000は、特有の注入口および流出口の形状以外は同一である、2つのマイクロ製造した流路1002aおよび1002bを有する。マイクロチャネル1002aおよび1002bは、それぞれのマイクロチャネルを封止するカバースリップ1008上に基礎を置く、ポリジメチルシロキサン(PDMS)ブロック内に形成される。各マイクロチャネル1002a、1002bの各末端には、注入口1004および流出口1006が存在する。
各チャネル1002a、1002bは、長方形の断面の5mm長のチャネルで構成され、その中心には対称的な階段または突起が導入される。階段状の形状は、6つのパラメータによって定義される、すなわち:
i)初期の血液せん断速度を生理学的範囲(150〜10,000秒-1)に定義および律則する流入チャネル幅(100〜1000μm);
ii)血流の加速度を定義する、0°〜90°(さらに好ましくは30°〜90°)の範囲の流入角度または漸縮角度(θc);
iii)加速段階に続くピークせん断段階を定義する、10μm〜40μmの範囲の階段のギャップ高さg;
iv)血小板凝集域を画成する、拡張した形状内への重要な血流の減速度を定義する、0°〜90°(さらに好ましくは30°〜90°)の範囲の漸拡角度(θe);
v)減速段階の規模を定義する、100μm〜1000μmの範囲の拡張チャネル幅;および
vi)突起または障壁の幅を定義する、0.5〜20μmの範囲のギャップ幅。
i)初期の血液せん断速度を生理学的範囲(150〜10,000秒-1)に定義および律則する流入チャネル幅(100〜1000μm);
ii)血流の加速度を定義する、0°〜90°(さらに好ましくは30°〜90°)の範囲の流入角度または漸縮角度(θc);
iii)加速段階に続くピークせん断段階を定義する、10μm〜40μmの範囲の階段のギャップ高さg;
iv)血小板凝集域を画成する、拡張した形状内への重要な血流の減速度を定義する、0°〜90°(さらに好ましくは30°〜90°)の範囲の漸拡角度(θe);
v)減速段階の規模を定義する、100μm〜1000μmの範囲の拡張チャネル幅;および
vi)突起または障壁の幅を定義する、0.5〜20μmの範囲のギャップ幅。
マイクロチャネルの作製
3インチ(7.62cm)のケイ素ウエハ上の標準的なソフトリソグラフィー技術を使用して、KMPR1025フォトレジスト(microChem Corp製)鋳型から、PDMSであるSylagardにマイクロチャネル1002a、1002bを作製した(Weibel, D.B., Diluzio, W.R. & Whitesides, G.M. Microfabrication meets microbiology. Nature reviews 5, 209-218 (2007))。高解像度のクロムマスクを用いて、鋳型を構築するための明確に定義された特徴を達成した。良好な均一性を有する130μmの厚さの膜を得るために、300rpmおよび100rpm・秒-1のスプレッドサイクルを10秒間、および、1000rpm・秒-1および300rpmの現像サイクルを30秒間用いて、4インチ(10.16cm)のケイ素ウエハをKMPR1025(M Corp.製)フォトレジストでスピンコーティングした。端面除去溶媒を用いて、端面除去のサイクルを30秒間行った。KMPRでコーティングしたウエハを、23℃から開始して6℃・分-1の速度で温度上昇させ、その温度を100 ℃で4分間保持して溶媒を乾固することによってソフトベークした。基板の過熱を防ぐために、各1分間の2回の露光を使用して、KMPR膜を、360nmの波長および8mW・cm-2の出力を用いたMJB3コンタクト・マスク・アライナ上で、マスクパターンを用いてUVに2分間露光させた。露光後、100℃で4分間、ホットプレート上でベイクし、23℃から開始して6℃・分-1の速度で温度を上昇させ、その温度を100 ℃で4分間保持して溶媒を乾固させることによって、パターンを架橋した。温度の急激な変化に起因する膜上の熱応力および亀裂の可能性を防ぐために、露光および架橋した膜を、サンプルとともにホットプレート上で室温までゆっくりと冷却した。周期的に攪拌しつつ、露光したKMPRを12分間現像し、未露光の材料を除去した。KMPRパターンを現像後、イソプロパノールおよび脱イオン水でウエハを清浄化し、架橋したKMPROパターンを改善および強化するため、サンプルを120℃に3時間加熱することによって、最終的なハードベイクを行った。
3インチ(7.62cm)のケイ素ウエハ上の標準的なソフトリソグラフィー技術を使用して、KMPR1025フォトレジスト(microChem Corp製)鋳型から、PDMSであるSylagardにマイクロチャネル1002a、1002bを作製した(Weibel, D.B., Diluzio, W.R. & Whitesides, G.M. Microfabrication meets microbiology. Nature reviews 5, 209-218 (2007))。高解像度のクロムマスクを用いて、鋳型を構築するための明確に定義された特徴を達成した。良好な均一性を有する130μmの厚さの膜を得るために、300rpmおよび100rpm・秒-1のスプレッドサイクルを10秒間、および、1000rpm・秒-1および300rpmの現像サイクルを30秒間用いて、4インチ(10.16cm)のケイ素ウエハをKMPR1025(M Corp.製)フォトレジストでスピンコーティングした。端面除去溶媒を用いて、端面除去のサイクルを30秒間行った。KMPRでコーティングしたウエハを、23℃から開始して6℃・分-1の速度で温度上昇させ、その温度を100 ℃で4分間保持して溶媒を乾固することによってソフトベークした。基板の過熱を防ぐために、各1分間の2回の露光を使用して、KMPR膜を、360nmの波長および8mW・cm-2の出力を用いたMJB3コンタクト・マスク・アライナ上で、マスクパターンを用いてUVに2分間露光させた。露光後、100℃で4分間、ホットプレート上でベイクし、23℃から開始して6℃・分-1の速度で温度を上昇させ、その温度を100 ℃で4分間保持して溶媒を乾固させることによって、パターンを架橋した。温度の急激な変化に起因する膜上の熱応力および亀裂の可能性を防ぐために、露光および架橋した膜を、サンプルとともにホットプレート上で室温までゆっくりと冷却した。周期的に攪拌しつつ、露光したKMPRを12分間現像し、未露光の材料を除去した。KMPRパターンを現像後、イソプロパノールおよび脱イオン水でウエハを清浄化し、架橋したKMPROパターンを改善および強化するため、サンプルを120℃に3時間加熱することによって、最終的なハードベイクを行った。
次に、KMPRパターンを PDMSチャネルの鋳造のための鋳型として使える状態に準備した。鋳型を製作後、PDMSおよびその硬化剤を10:1の比で混合し、30分間ガス抜きした。あらかじめ作製し、ポリメチルメタクリレート(PMMA)内に含めたKMPR鋳型に混合物を注いだ。次に、PDMSを、100℃で20分間、オーブン内で硬化した。PDMSチャネルをKMPR鋳型からはがし、生検パンチを使用して6mmの注入口容器の穴1004をあけた。流出口をシリンジポンプに接続するため、2mmの生検パンチを使用した。両方の穴を開けた後、PDMSチャネルを65×22mmのガラススライド1004上に直接設置した。PDMSの低い表面エネルギーを原因として、接着を達成した。
第1の外層は、挿入層1000の寸法に合わせて機械加工した、6mmの厚さのPDMSの細長いプレートを備える。第1の外層は、サンプルの流入路およびサンプルの入口を備えたサンプル注入口を提供する。サンプル流入路は第1の外層を貫通する。サンプルの入口は、第1の外層の外表面のサンプル流入路によって画成される。サンプル流入路は、第1の外層を通じて機械加工され、流体送達システムへのカートリッジの迅速な接続を可能にする、M5接続具を組み込んだタップ付きである。第1の外層はさらに、流出路および出口を備えた流出口を提供する。
カートリッジは、第1の層を挿入層1000上に押圧し、加圧のみで接着する接着剤で一方を他方に接着することによって組み立てられる。カートリッジは、第1の外層がカートリッジの最上層を形成し、カバースリップ1004がカートリッジの基層を形成するように、方向付けられる。組み立てられると、第1の外層のサンプル流入路は、それぞれ、挿入層の注入口1004と位置合わせされる。同様に、第1の外層のサンプル流出路は、それぞれ、挿入層の流出口1006と位置合わせされる。よって、カートリッジは、流路1002aおよび1002bを画成する。このようにして形成された流路は、実質的に真っ直ぐに走り、第1の末端でサンプル注入口1004に、第2の末端で流出口1006に、それぞれ接続される。
素子の使用において、被験体に由来する血液サンプルまたは細胞懸濁液は、それぞれの注入口を介して素子に導入され、次に、シリンジポンプ、重力送りポンプ、蠕動ポンプまたはいずれかの形態の圧力駆動ポンプの制御下、所定の流速で、マイクロチャネル1002a、1002bを通じて灌流される。マイクロチャネル1002a、1002b内の血小板凝集は、DIC、落射蛍光顕微鏡または他の光学的な方法などの検出手段によって検査される。とりわけ、マイクロチャネル1002aおよび1002bは完全に同一に構成され、血小板凝集区域は直接隣接していることから、各マイクロチャネル1002aおよび1002b内の血小板凝集の合計は、光学的にモニタリングすることができる(PDMSは光学的に透明であることに留意されたい)。このような累積モニタリング法は、血小板凝集測定の信頼性を改善し、マイクロチャネル内の血小板凝集の不規則変動の影響を低減する。
本明細書の実施例にはわずか2つのマイクロチャネルしか示されていないが、例えば、これらの測定をさらにスムーズにするために、より多くのマイクロチャネルがPDMSブロック内に適切に(例えば 3、4、5、6またはそれ以上)提供されうる。
図10bは、並行な配列構成の素子設計の幾つかの物理的な実施の形態を示す、微分干渉コントラスト画像(倍率10倍)を例証している。cXgYeZという記号が用いられ、cXは突起の上流面の角度であり、gYはギャップのマイクロメートルの長さであり、eZは突起の下流面の角度である。6回の反復(iteration)実験が行われるが、配列は、それぞれ、独立した流れ(ポンプ)制御を使用した、最大300の異なる反復または300の同一のチャネルで構成されうる。
図10cは、本発明の実施の形態に従った別の素子1040の概略図を示している。図10aに示した素子1000とは対照的に、マイクロせん断勾配素子1040の階段状の形状をした構成は、3つのマイクロ製造した流路1042a、1042bおよび1042cを備え、それぞれが特有の注入口容器1044および流出口容器1046を有する。それぞれの注入口容器1044の幾何学形状は、各々、8mmの直径を有し、各々、同一の定義された歪み速度マイクロ勾配の幾何学形状を有する。それぞれの流出口容器1046の幾何学形状は、それぞれ1.5mmの直径を有する。
上流トラップ1050は、少なくとも、不適切な抗凝固に起因して血液サンプルに形成されたかもしれない微粒子物質および/またはマイクロ凝血塊の付着を防ぐために、各マイクロチャネル1042a、1042bおよび1042cのそれぞれに提供される。トラップ1050は、素子を通る血液の流れ効率の最大化を補助する。各トラップ1050を単一のマイクロ収縮1054を介してそれぞれのマイクロチャネルに接続する、フィーダー・チャネル1052が提供される。
図10aに示す素子の使用において、被験体に由来する液サンプルまたは細胞懸濁液は、注入口1020を介して素子内に導入され、次いで、シリンジポンプ、重力送りポンプ、蠕動ポンプまたはいずれかの形態の圧力駆動ポンプの制御下、所定の流速で、マイクロチャネル1012を通じて灌流される。マイクロチャネル1012内の血小板凝集は、DIC、落射蛍光顕微鏡または他の光学的な方法によって検査される。とりわけ、マイクロチャネル1012は完全に同一に構成され、血小板凝集区域は直接隣接していることから、各マイクロチャネル1012内の血小板凝集の合計は光学的にモニタリングすることができる(PDMSは光学的に透明であることに留意されたい)。このような累積モニタリング法は、血小板凝集測定の信頼性を改善し、マイクロチャネル内の血小板凝集の不規則変動の影響を低減する。これらの測定をさらにスムーズにするために、より多くのマイクロチャネルがPDMSブロック1000内に適切に提供されて差し支えない。
階段状の構成は、これらのパラメータのすべてまたは1つが変更された、多数のマイクロスケールの幾何学形状を構築する。重要な制約は階段の全般的な寸法であり、その長さおよび高さは、ほぼ0〜100μmである。0μmの高さの階段または拡張形状の場合には、チャネルは、200〜1000μm幅の直線的なチャネルへと所定の漸拡角度で拡張する、100μm幅のチャネルからなる。
これらの本発明の実施の形態は、止血および血栓形成における血小板粘着過程の決定的な役割を所与として、インビトロにおける血小板の接着機能を正確に評価することができる、比較的単純かつ信頼性のある診断検査の開発の重要な臨床的必要性が存在するという認識で開発された。従来の血小板機能検査の使用は、出血障害に寄与する血小板欠陥を特定し、出血の危険性が増加した患者における止血治療をモニタリングし、周術期における正常な血小板機能を確実にする。しかしながら、上述の実施の形態は、より単純かつより信頼性のある血小板機能検査が、過反応性の血小板を有し、血栓形成の危険性が増加した患者の特定のための抗血小板治療の有効性のモニタリング、血小板濃縮物の品質管理、血小板ドナーのスクリーニング、および潜在的な外科的出血の危険性の予測にも、潜在的に有用であるという認識の下で開発された。前述の本発明の実施の形態は、理想的なインビトロにおける血小板機能検査は、実施が簡単であり、迅速かつ容易に解釈できる検査結果を提供し、少量の血液(自然(native)血液または抗凝固血液のいずれか)を使用し、幅広い血流条件で血小板機能を評価することができ、生理的に適切な血栓形成性表面上で血小板粘着および凝集の両方を評価することができ、非常に再現性および信頼性があるべきであるという認識の下で開発された。
よって、上述の本発明の実施の形態は、被験体から得られた生体サンプルにおける血小板凝集を評価するための素子、およびその素子の使用を取り込んだ方法を提供する。実施の形態は、血流の微細な変化(せん断勾配)が、インビボにおける血栓の発達の一般的な特徴を表すという認識を利用する。それぞれが定義された幾何学形状を有する、1つ以上の微小毛細血管またはマイクロチャネルを含む、生体外で使用するための素子を提供することによって、これらの実施の形態は、典型的にはインビボで生じる流速および壁せん断応力などのさまざまな条件を模倣することによって、インビボにおける自然の環境に非常に近い模倣を提供する。したがって、これらの素子は、例えば、血栓症、心臓疾患、脳卒中または他の血管系の疾患(深部静脈血栓症(DVT)を含む)を生じる血小板活性または機能の異常を有する疑いのある被験体、または、これらの疾患の治療に使用する標準的な治療(例えばヘパリンまたは他の血栓溶解剤)に対する反応の欠如を示しうる被験体における、血栓の発達(または凝血活性)の評価のための用途を有する。
生体サンプル
本明細書では「生体サンプル」という用語は、血小板を含むサンプルを含めることが意図されており、限定はしないが、全血(自然血液または抗凝固血液)、血漿、血小板、または赤血球などの処理済みおよび未処理の生体サンプルが挙げられる。好ましい実施の形態では、サンプルは血小板またはそれらの前駆体を含む。
本明細書では「生体サンプル」という用語は、血小板を含むサンプルを含めることが意図されており、限定はしないが、全血(自然血液または抗凝固血液)、血漿、血小板、または赤血球などの処理済みおよび未処理の生体サンプルが挙げられる。好ましい実施の形態では、サンプルは血小板またはそれらの前駆体を含む。
理論に縛られることは望まないが、シリンジ素子を用いた生体サンプルの採取は、結果的に、血液サンプルのせん断を生じうる。したがって、正確な結果を得るためには、サンプルは、せん断を最小限に抑える方法で採取することが推奨される。1つの例は、血液サンプルの採取に16ゲージの針などの高ゲージの針を使用することである。せん断を最小限に抑える他の機構は当業者によく知られている。
本発明の生体サンプルは、ヒトまたは霊長類に由来することが好ましい。生体サンプルはまた、家畜または愛玩動物由来であることも好ましい。
被験体
本明細書では「被験体」という用語は、健康な被験体のほかに、血小板の活性または機能における既知のまたは疑わしい異常を有する被験体も含むことが意図される。被験体は、上述のいずれかを含む。好ましくは、被験体はヒト被験体である。
本明細書では「被験体」という用語は、健康な被験体のほかに、血小板の活性または機能における既知のまたは疑わしい異常を有する被験体も含むことが意図される。被験体は、上述のいずれかを含む。好ましくは、被験体はヒト被験体である。
本発明に従った被験体としては、例えば フォン・ヴィレブランド病の被験体、ベルナール・スーリエ症候群を有する被験体、グランツマン血小板無力症を有する被験体、ビタミンK欠乏を有する被験体など、疑わしいまたは既知の出血の危険性を有するものが挙げられる。
本発明に従った他の適切な被験体とは、例えば 脳卒中患者、糖尿病を有する被験体、喫煙者、心臓疾患を有する被験体、最近 手術を受けた被験体または、過度の出血の危険性がありうる、医療処置または歯科処置を受けようとしている被験体など、疑わしいまたは既知の凝固の危険性を有するものである。
「流速」という用語もまた、明細書全体を通じて、同等の用語:「灌流速度」とも称される。生体サンプルは、単一速度ポンプ、可変速度ポンプ、シリンジポンプまたは重力ポンプなどの流れ制御手段のいずれかを用いて、微小毛細血管またはマイクロチャネルを一定方向に通過しうる。流速の制御は、ポンプ速度の変化などの適切な方法で達成されうる。
流速は、ミリリットルの流体/分として定義される。せん断は、血管における壁の近くの流体の速度が中心方向よりも遅くなるような、流れる際の流体面の比較的並行な動きの結果である。この流体の同心円層間の流速の差異は、「せん断」効果を生み出す。せん断は、せん断速度またはせん断応力として定義される。せん断速度は、cm/秒(または秒の逆数、秒-1)として表される。せん断応力は、単位面積当たりの力であり(Dyn/cm2またはパスカルで表される)、せん断速度×粘度と等しい。
本発明の文脈で用いられる「せん断マイクロ勾配」という用語は、生物由来物質の流れの速度変化によって生じたせん断効果のことを称することが意図されている。変動する流入および流出の幾何学形状を有するように微小毛細血管またはマイクロチャネルを明確に設計することにより、本実施の形態は、血小板凝集におけるせん断マイクロ勾配の差異の影響の検査を提供する。
とりわけ、図10の実施の形態に適用した約250マイクロリットル/分未満の流速では、マイクロチャネルを通って流れる流体のレイノルズ数は約26未満である。この計画では、流れの分離または渦の形成はなく、血液の流速は安定している。本発明の特に好ましい実施の形態では、流速は約8マイクロリットル/分であり、レイノルズ数は約0.86であり、流れの分離および渦形成の発生を頼りにする他の素子とは対照的に、分離または渦形成の状況を絶対に生じさせない。本発明の実施の形態は、代わりに、減速流および得られたせん断勾配を利用する。
さらに具体的には、本実施の形態は、局所的なせん断マイクロ勾配が、せん断の減速が高せん断加速区域の直後に生じる区域で血小板凝集を促進するという認識で開発された。よって、せん断の加速区域と、その後の密結合した減速せん断区域(せん断勾配)は、安定化した血小板凝集の発現をもたらす条件である。
血小板機能の正確な評価は、診断および被験体の治療の適切な管理を補助することが認識されよう。さらには、血小板機能のモニタリングの続行は、特定の治療計画に対する被験体の応答の評価も助けるであろう。
特に、本発明の方法は、被験体の血液凝固または血小板血栓の進行の危険性の判断に特に適している。被験体の凝血塊の進行の危険性は、被験体の異なる群間の比較を行うことによって判断されうる。例えば、比較は、健常な被験体に由来する血液サンプルと、血液凝固の発現の病歴または危険性が増加した被験体に由来する血液サンプルとを、規定の流速および温度で、標準化された特定期間にわたり、多くの異なる微小毛細血管またはマイクロチャネルの幾何学形状にわたるサンプルの血小板凝集挙動の比較をすることによって、行って差し支えない。
本発明の素子および方法はまた、異なる血小板欠陥間の識別に使用することもできることが認識されよう。
本発明の素子および方法はまた、特定の薬物または物質の有効性のアッセイに使用することができることもさらに認識されよう。例えば、本発明者らは、ヒト血液に由来する、インテグリリン(一般的な抗血小板薬)治療したサンプルと正常なサンプルとの特定のマイクロチャネルの幾何学形状に、異なる血小板凝集プロファイルが観察されることを見出した。
本発明の方法が意図する臨床症状としては、限定はしないが、そうでなければ健康な被験体における、数多くの心血管系リスクの評価;血栓事象を経験している患者の評価;所定の抗血小板治療の有効性のモニタリング;大手術が予定される患者の出血または凝固の危険性の評価;真性糖尿病、高血圧症、高血液コレステロール、凝血の強い家族の病歴、喫煙者および特定可能な血栓形成マーカーを有する者を含めた、心臓血管系の疾患の危険性が高い患者における凝固のリスクプロファイルの評価;抹消血管系の疾患を有する患者の凝固の危険性の評価;および、出血障害を有する患者のプロファイルの調査が挙げられる。
試薬
本発明に従った試薬は、薬物または他の非医学的な物質でありうる。例えば、試薬は、抗血小板薬、抗凝血剤、血栓溶解薬/線維素溶解薬、またはクエン酸、EDTAまたはシュウ酸などの非医学的な物質から選択されうる。
本発明に従った試薬は、薬物または他の非医学的な物質でありうる。例えば、試薬は、抗血小板薬、抗凝血剤、血栓溶解薬/線維素溶解薬、またはクエン酸、EDTAまたはシュウ酸などの非医学的な物質から選択されうる。
適切な抗血小板薬の例としては、アブシキシマブ、エプチフィバチドおよびチロフィバンなどの糖タンパク質IIb/IIIa阻害剤;チエノピリジン(クロピドグレル、プラスグレル、チクロピジン)およびチカグレロールなどのADP受容体/P2Y12阻害剤;ベラプロスト、プロスタサイクリン、イロプロスト、トレプロスチニル、アセチルサリチル酸/アスピリンなどのCOX阻害剤、アロキシプリン、カルバサラートカルシウム、および、ジタゾール、クロリクロメン、ジピリダモール、インドブフェン、ピコタミドおよびトリフルサルなどの他のものなど、プロスタグランジン類似体;クマリンなどのビタミンK拮抗薬:アセノクマロール、クマテトラリル、ジクマロール、ビスクマ酢酸エチル、フェンプロクモン、およびワルファリン、1,3−インダンジオン:クロリンジオン、ジフェナジオンおよびフェニンジオン、および、チオクロマロールなどの他のものが挙げられる。
適切な抗凝血剤の例としては、ヘパリンなどの第Xa因子阻害剤:ベミパリン、セルトパリン、ダルテパリン、エノキサパリン、ナドロパリン、パルナパリン、レビパリン、チンザパリン;フォンダパリヌクス、およびイドラパリヌクスなどのオリゴ糖;アピキサバン、オタミキサバン、およびリバロキサバンなどのキサバンが挙げられる。
他の適切な抗凝血剤としては、ヒルジン(ビバリルジン、レピルジン、デシルジン)、アルガトロバン、ダビガトラン、メラガトラン、キシメラガトランおよび、REG1、デフィブロチド、ラマトロバン、抗トロンビンIII、タンパク質Cなどの他のものなど、直接的なトロンビン阻害剤が挙げられる。
適切な血栓溶解薬/線維素溶解薬の例としては、TPA(アルテプラーゼ、レテプラーゼ、テネクテプラーゼ)、UPA(ウロキナーゼ、サルプラーゼ)、ストレプトキナーゼ、アニストレプラーゼ、モンテプラーゼ、ならびに、アンクロッドおよびフィブリノリジンなどのセリンエンドペプチダーゼが挙げられる。
本明細書では、「試薬」という用語は、単一の化合物または化合物の混合物を包含する、広い意味で用いられる。この用語は、抗体、ホルモン、他のタンパク質またはポリペプチドなどの生物由来物質を含めた、合成または天然の物質を含む。
試薬は、例えば、コラーゲン、ADP、トロンビン、トロンボキサンA2、セロトニンおよびエピネフリンなど、血小板を活性化する薬剤でありうる。
試薬は、例えば、既知の抗血小板薬であってもよい。あるいは、物質は、血小板またはそれらの前駆体、または他の細胞における調節作用についてスクリーニングされる物質でありうる。
「調節」という用語は、本明細書では、物質が、生体サンプル内に存在する血小板または前駆体の血小板凝集活性に関して有する、いずれかの効果のことを称する。したがって、この用語は、血小板凝集活性の増進または阻害を包含する。
とりわけ、本システムは、血小板凝集域における突起の下流側にせん断微小勾配を提供し、したがって、自然のインビボ環境をさらに適切に模倣する、幅広いせん断速度に及ぶ。さらには、本システムは、アッセイの前に血液サンプルの操作を必要としない。さらには、本システムは、少量の血液体積を用いることができる。これは、乳児または幼児から採取する血液体積が少量である、および/または入手困難である小児科では特に重要である。さらには、本システムは、閉塞の速度に頼るのではなく、血小板凝集を動的平衡に向かわせることができ、したがって最大の血栓の大きさについての情報を与える。さらには、本システムは、リアルタイムでの血栓の安定性の測定を可能にする。
本システムの一部の実施の形態のさらなる利点は、本素子が、リアルタイムでモニタリングする血小板凝集の視覚化および分析を可能にすることである。さらには、本システムは、血小板凝集の速度および程度における動的データをもたらすことができる。
幅広く記載された本発明の範囲から逸脱することなく、特定の実施の形態に示される本発明に、多くの変形および/または変動がなされうることが当業者には理解されよう。したがって、本実施の形態は、あらゆる点で、例証でと見なされるべきであってあって制限するものとは見なされるべきではない。
本願全体を通して、「含む」という用語、またはその変形、または「含んでいる」は、規定された要素、整数または工程、または、要素、整数または工程の群を含むという意味になるが、他の要素、整数または工程、または要素、整数または工程の群を除外するものではない。
本発明のさらなる特徴は、以下の詳細な説明および実施例に、さらに十分に説明される。しかしながら、実施例は、単に本発明を例証する目的で含まれることが理解されるべきである。多少なりとも、上記の本発明の広範な説明における制限と理解されるべきではない。
方法
血液サンプルの回収
抗凝血剤として800U/mlのヒルジンを含む19ゲージの針を取り付けた10mlのシリンジを使用して、肘正中静脈の瀉血によって、被験体の血液サンプルを採取した。
血液サンプルの回収
抗凝血剤として800U/mlのヒルジンを含む19ゲージの針を取り付けた10mlのシリンジを使用して、肘正中静脈の瀉血によって、被験体の血液サンプルを採取した。
血液サンプルの処理
ヒルジン(800U/ml)および承諾したヒトドナーから採取した抗凝固性の全血を使用して、素子を通る血液の灌流の研究を行った。全血サンプルを、37℃で10分間、脂肪親和性膜染料DiOC6(1μg/ml)またはDiIC12(1μg/ml)とともにインキュベートし、素子を通じて細胞をさらに容易に視覚化にした。
ヒルジン(800U/ml)および承諾したヒトドナーから採取した抗凝固性の全血を使用して、素子を通る血液の灌流の研究を行った。全血サンプルを、37℃で10分間、脂肪親和性膜染料DiOC6(1μg/ml)またはDiIC12(1μg/ml)とともにインキュベートし、素子を通じて細胞をさらに容易に視覚化にした。
マイクロチャネルの作製
3インチ(7.62cm)のケイ素ウエハに標準的なソフトリソグラフィー技術を使用して、KMPR1025フォトレジスト(microChem Corp製)鋳型からポリジメチルシロキサン(PDMS、Sylagard)にマイクロチャネルを作製した(Weibel, D.B., Diluzio, W.R. & Whitesides, G.M. Microfabrication meets microbiology. Nature reviews 5, 209-218 (2007))。高解像度のクロムマスクを使用して、鋳型を構築するための明確に定義された特徴を達成した。Su8現像剤を使用してKMPRを現像した。これにより、チャネルの逆鋳型が形成された。全般的なチャネルの深さは80μmであった。鋳型を構築した後、ポリジメチルシロキサン(PDMS)と硬化剤を10対1の比で混合し、20分間ガス抜きし、鋳型に約4mmの厚さまで注いだ。PDMSを90℃で20分間硬化した。最後に、160μmの厚さのホウケイ酸塩カバーガラス上に直接、PDMSチャネルを接着させた。
3インチ(7.62cm)のケイ素ウエハに標準的なソフトリソグラフィー技術を使用して、KMPR1025フォトレジスト(microChem Corp製)鋳型からポリジメチルシロキサン(PDMS、Sylagard)にマイクロチャネルを作製した(Weibel, D.B., Diluzio, W.R. & Whitesides, G.M. Microfabrication meets microbiology. Nature reviews 5, 209-218 (2007))。高解像度のクロムマスクを使用して、鋳型を構築するための明確に定義された特徴を達成した。Su8現像剤を使用してKMPRを現像した。これにより、チャネルの逆鋳型が形成された。全般的なチャネルの深さは80μmであった。鋳型を構築した後、ポリジメチルシロキサン(PDMS)と硬化剤を10対1の比で混合し、20分間ガス抜きし、鋳型に約4mmの厚さまで注いだ。PDMSを90℃で20分間硬化した。最後に、160μmの厚さのホウケイ酸塩カバーガラス上に直接、PDMSチャネルを接着させた。
必要とされる耐性を達成するため、フォトリソグラフィ法の各段階で高度の品質管理が必要とされる。この一例として、厳密に定義された隅部は、初期の設計の一部であったが、製造工程における電流制限に起因して、半径約5マイクロメートルの丸みを帯びた隅部を製造した(これはCFDモデリングにおける検討事項であった)。この制限は血小板の反応には著しい影響は与えなかったが、製造方法のさらなる改善により、最終的には、血行動態および結果として得られた血小板凝集のさらに正確な制御をもたらすであろう。PDMSは費用および製造容易性の点で多くの利点をもたらすが、さらに正確な幾何学形状を可能にする他の材料は、本発明の他の実施の形態において有利であることが判明するであろう。
流体流れの数値シミュレーション(CFD)
歪み速度の評価は、非圧縮性の流体流れについての質量保存および運動量方程式を用いて速度場を解いた後、有限体積スキームに基づいて、コンピュータによる流体力学(CFD)ソフトウェアパッケージFLUENT6.0(Fluent USA社製(米国ニューハンプシャー州レバノン所在))を使用して計算した。実行のさらなる詳細は、FLUENT社のマニュアルで確認することができる。連続体仮説および滑りなし境界条件の妥当性は保持されると仮定した。流れは、三次元の、安定した、層流および非圧縮性とみなした。流体媒質は、998.2km/m3の一定密度および0.00345Pa・sの粘度で検討した。離散化スキーム圧力は標準であり、2次的な風上の運動量オプションは計算に使用可能であった。
歪み速度の評価は、非圧縮性の流体流れについての質量保存および運動量方程式を用いて速度場を解いた後、有限体積スキームに基づいて、コンピュータによる流体力学(CFD)ソフトウェアパッケージFLUENT6.0(Fluent USA社製(米国ニューハンプシャー州レバノン所在))を使用して計算した。実行のさらなる詳細は、FLUENT社のマニュアルで確認することができる。連続体仮説および滑りなし境界条件の妥当性は保持されると仮定した。流れは、三次元の、安定した、層流および非圧縮性とみなした。流体媒質は、998.2km/m3の一定密度および0.00345Pa・sの粘度で検討した。離散化スキーム圧力は標準であり、2次的な風上の運動量オプションは計算に使用可能であった。
実施例1:階段状の形状を通る血液の灌流
図11aは、100μmの流入(入口)幅、90°の漸縮角度(θc )、10μmのギャップ高さ、60°の漸拡角度(θe )、および700μmの拡張/出口幅からなるマイクロせん断勾配素子を通る、ヒト(ヒルジン抗凝固)血液の灌流の一連の代表的な顕微鏡写真(倍率40倍)である。灰色の矢印は、初期の凝集点[t=12秒]を意味し、黒い矢印は、拡張区域における血栓成長の限界を示す(代表的なn=3実験)。
図11aは、100μmの流入(入口)幅、90°の漸縮角度(θc )、10μmのギャップ高さ、60°の漸拡角度(θe )、および700μmの拡張/出口幅からなるマイクロせん断勾配素子を通る、ヒト(ヒルジン抗凝固)血液の灌流の一連の代表的な顕微鏡写真(倍率40倍)である。灰色の矢印は、初期の凝集点[t=12秒]を意味し、黒い矢印は、拡張区域における血栓成長の限界を示す(代表的なn=3実験)。
図11bは、(a)におけるマイクロチャネル壁の幾何学形状の表面から1μm(円盤状の血小板の直径の2分の1)移動する血小板(粒子)の速度変化を示す、コンピュータによる流体力学(CFD)シミュレーションから生じた結果(速度υの変位プロット)を示している。直線的なマイクロチャネル部分(1,800秒-1の層流)の場合には、血小板はその流路長全体を一定速度で移動する。血小板がせん断勾配の幾何学形状を通って移動するときに、急速な減速段階に連結した急速な加速段階が存在する。
図11cは、図11aに示したPDMSマイクロチャネル素子を通る、全血の灌流の反応を示す代表的な凝集のトレースを含んでいる。階段状の形状は、1,800秒-1の流入(狭窄前)せん断速度におけるヒルジン抗凝固処理した全血の灌流を表し(代表的なn=3実験);血液の灌流前に30μg/mlのc7E3 Fabで10分間処理した、抗αIIbβ3−ヒルジン抗凝固性の全血(代表的なn=2実験)。インテグリンαIIbβ3の係合なしでは、狭窄の頂点(apex)における初期の動員は著しく遅延し、凝集が全般的に抑制されることに留意されたい;抗GPIbは、50μg/mlの抗GPIbブロッキングIgG ALMA12で10分間処理したヒルジン抗凝固性の全血である(代表的なn=3実験)。GPIb/V/IXの係合の不存在下における血小板相互作用の完全欠損に留意されたい。
図11dは、せん断勾配を誘発しない直線的なマイクロ流体素子と比較した、図11aに示したマイクロチャネルを通る全血の灌流の反応を示す、代表的な凝集のトレースを示している;階段状の形状は、1,800秒-1の流入(狭窄前)せん断速度における、ヒルジン抗凝固処理した全血の灌流を表す(代表的なn=3実験);直線的なチャネルは、20,000秒-1のバルクせん断速度における、100μmの直線的なマイクロチャネルを通るヒルジン抗凝固処理した全血の灌流である(代表的なn=3実験)。
図11eは、(a)に示したマイクロせん断勾配素子を通る全血の灌流の血小板凝集反応の可溶性の作動薬の非依存性を示す、代表的な凝集のトレースを含む;階段状の形状は、1,800秒-1の流入(狭窄前)せん断速度における、ヒルジン抗凝固処理した全血の灌流を表す;+ADP/TXA2拮抗薬+ヒルジンは、MRS2179(100μm)、2−MeSAMP(10μm)およびインドメタシン(10μm)で10分間処理したヒルジン抗凝固性の全血である(代表的なn=3実験)。
提案した階段状の形状のサンプルにおけるヒルジン(50mg/kg)抗凝固性の全血を使用する血流の試行実験は、血小板凝集のせん断勾配モデルのように、血小板血栓が階段状の形状の下流面における特定された流れ減速区域内に排他的に形成されることを実証した(図11a参照)。対照試験は、階段状の形状のない直線的なマイクロチャネルにおける持続した、高まった層流せん断(20,000秒-1)が、血小板の凝集を促進する表現型を誘発することができないことを実証した(図11b〜d)。血小板凝集のせん断勾配モデルによれば、化学的な血小板作動薬(ADPおよびTXA2)の封鎖は、階段状の形状におけるせん断勾配依存性の凝集を遮断しない(図11e)。しかしながらこの凝集過程は、血小板インテグリンαIIbβ3係合に非常に依存する(図11c)。
実施例2:2つの階段状の形状の反復の流速依存性
図12aは、100μmの流入/入口幅、90°の漸縮角度(θc)、20μmのギャップ高さ、30°の漸拡角度(θe)、および700μmの拡大/出口幅からなるマイクロせん断勾配素子を通る流速(Q=2、4、6および8μl/分)の関数としての代表的な凝集のトレースを含む。
図12aは、100μmの流入/入口幅、90°の漸縮角度(θc)、20μmのギャップ高さ、30°の漸拡角度(θe)、および700μmの拡大/出口幅からなるマイクロせん断勾配素子を通る流速(Q=2、4、6および8μl/分)の関数としての代表的な凝集のトレースを含む。
図12bは、100μmの流入幅、90°の漸縮角度(θc)、20μmのギャップ高さ、90°の漸拡角度(θe)、および700μmの拡張幅からなるマイクロせん断勾配素子を通る流速(Q=2、4、6および8μl/分)の関数としての代表的な凝集のトレースである。
流速(Q=2、4、6および8μl/分)依存性の分析は、30°および90°の漸拡角度を有する2つの階段状の形状構造(それぞれ図12aおよび12b)において試験した。凝集の大きさは、両方の形状の場合において、8μl/分未満の流速の減少に伴って、顕著に増大した。θe=90°を有する第2の形状(図12b)について観察された初期の凝集に対して時間が短縮したが、これは、ヒト血液の血小板凝集の開始が、漸拡角度の形状に非常に依存していることを示している。
実施例3:球体の形状
図13aは、10,000秒-1の適用γにおける、ヒト全血(100μmのMRS2179、10μmの2−MeSAMPおよび10μmのインドメタシンで前処理した)の灌流後のVWFでコーティングした球体の形状の下流面における円盤状の血小板凝集の性質および程度を示すDIC画像フレームを含む(n=5)。
図13aは、10,000秒-1の適用γにおける、ヒト全血(100μmのMRS2179、10μmの2−MeSAMPおよび10μmのインドメタシンで前処理した)の灌流後のVWFでコーティングした球体の形状の下流面における円盤状の血小板凝集の性質および程度を示すDIC画像フレームを含む(n=5)。
図13bは、τ≦30.4Paを示す、下流の低いτx,yポケット(μm2で表した区域3の表面積)の関数としての、平均の円盤状の血小板の凝集サイズ(μm2で表した表面積)を示している(n=3)。
図13cは、10,000秒-1の適用バルクγにおける、5μmのVWFでコーティングした球体の形状の下流面における、平均の円盤状の血小板凝集サイズを示している;対照は、ヒルジン抗凝固性の全血である;抗αIIbβ3は、血液の灌流前に30μg/mlのc7E3 Fabで10分間処理したヒルジン抗凝固性の全血であり;抗GPIbは、50μg/mlの抗GPIbブロッキングIgG ALMA12で10分間処理したヒルジン抗凝固性の全血である(n=3)。
図13dは、10,000秒-1の適用バルクγにおける、球体形状の周りの血液の平面的なせん断応力(τx,y)のCFDのシミュレーションの結果を示している。
図13eおよびfは、2μmおよび15μmの球体形状の側面から1μmの距離(血小板の直径の2分の1)における、個別の血小板軌跡のCFDの分析結果を示している。
提案した球体形状のヒルジン抗凝固全血の少量サンプルを使用する血流の試行実験は、血小板凝集のせん断勾配モデルのように、血小板血栓は、球体形状の下流面における、特定された流れ減速区域内に排他的に形成されることを実証した(図13a)。
有意に、血小板凝集の程度は、球形の直径および流入流速に非常に依存することが実証された。図13dに示すように、直径および球体の下流面における低いτx,y区域(区域3)の関数としての球体側面におけるせん断応力(τx,y)の増大が見られる;その大きさは、球形の直径に直接的に依存する。平面的なせん断応力(τx,y)は、血小板の直径の2分の1と等しい距離に、ビーズ表面に垂直に自由に流れる血小板が経験する予測応力を表している。
血小板は、球体表面に対するそれらの位置に依存するτx,yの変化の規模および速度の変動を経験する。ビーズの赤道における粒子の流跡線は、100Pa(15μmのビーズ)に近づき、その後、区域3において30.4Pa未満に低下する、τx,yの増大を経験する。有意に、変化速度(時間に対するτx,y)、空間分布(流路長に対するτx,y)およびピークτx,y は、小さい場合(2μm)には顕著に低下するが、このせん断勾配は、依然として、強固な凝集反応を誘発することができる。
実施例4:3つのマイクロチャネルの幾何学形状における血小板凝集動力学
図14aは、100マイクロメートルの流入部分、90°(c90)の漸縮角度、20×15マイクロメートルのピークギャップ、700マイクロメートルの流出部分、および90°から30°(e90、e60、e30)まで変化する漸拡角度で構成されるチャネルの形状を通る、ヒルジン抗凝固処理したヒト全血灌流の結果を例証している。20,000秒-1に近づくマイクロ形状の頂点におけるピーク歪みを有する1,800秒-1の流入歪み速度で10分間、全血を灌流した後に、平均の血小板凝集サイズ(パネル1)を決定した。n=5の独立した血液ドナーに由来するデータを合わせた(SEMを示す)。パネル2〜4は、13分間にわたる、3つの規定のマイクロ幾何学形状における血小板凝集動力学を示している。トレースは、n=5の独立した血液ドナーに由来する複合材料である(SEMを示す)。
図14aは、100マイクロメートルの流入部分、90°(c90)の漸縮角度、20×15マイクロメートルのピークギャップ、700マイクロメートルの流出部分、および90°から30°(e90、e60、e30)まで変化する漸拡角度で構成されるチャネルの形状を通る、ヒルジン抗凝固処理したヒト全血灌流の結果を例証している。20,000秒-1に近づくマイクロ形状の頂点におけるピーク歪みを有する1,800秒-1の流入歪み速度で10分間、全血を灌流した後に、平均の血小板凝集サイズ(パネル1)を決定した。n=5の独立した血液ドナーに由来するデータを合わせた(SEMを示す)。パネル2〜4は、13分間にわたる、3つの規定のマイクロ幾何学形状における血小板凝集動力学を示している。トレースは、n=5の独立した血液ドナーに由来する複合材料である(SEMを示す)。
図14bは、血小板の増幅信号を阻害するために、MRS2179(100μM)、2−MeSAMP(10μM)およびインドメタシン(10μM)で10分間処理した、ヒルジン抗凝固処理した全血から得られた結果を示している。このデータセットは、血小板分泌の複合作用とは独立した、血小板凝集反応における血流パラメータの直接的な影響を示している。血液サンプルを、100 マイクロメートルの流入部分、90°の漸縮角度(c90)、20マイクロメートルのピークギャップ、15マイクロメートルのギャップ長、700マイクロメートルの流出部分および90°から30°まで変化する漸拡角度(e90、e60、e30)からなるチャネルの形状を通じて灌流した。20,000秒-1に近づくマイクロ形状の頂点におけるピーク歪みを有する1,800秒-1の流入歪み速度で10分間、全血を灌流した後に、平均の血小板凝集サイズ(パネル1)を決定した。n=5の独立した血液ドナーに由来するデータを合わせた(SEMを示す)。パネル2〜4は、13分間にわたる、3つの規定のマイクロ幾何学形状における血小板凝集動力学を示している。トレースは、n=5の独立した血液ドナーに由来する複合材料である(SEMを示す)。
実施例5:4つのマイクロチャネルの形状の加速および歪み速度の分析
図15aは、100マイクロメートルの流入部分、90°の漸縮角度(a90)、10×15マイクロメートルのピークギャップ、60°の漸拡角度(e60)および700マイクロメートルの流出部分からなる階段状の形状についての歪み速度および加速度解析を示している。血流におけるマイクロ形状の効果を実証する、関連した歪み速度(γ・秒-1)および加速規模のCFD分析が示されている(パネル2および3)。
図15aは、100マイクロメートルの流入部分、90°の漸縮角度(a90)、10×15マイクロメートルのピークギャップ、60°の漸拡角度(e60)および700マイクロメートルの流出部分からなる階段状の形状についての歪み速度および加速度解析を示している。血流におけるマイクロ形状の効果を実証する、関連した歪み速度(γ・秒-1)および加速規模のCFD分析が示されている(パネル2および3)。
図15bは、100マイクロメートルの流入部分、90°の漸縮角度(c90)、20マイクロメートルのピークギャップ、15マイクロメートルのギャップ長、90°の漸拡角度(e90)および700マイクロメートルの流出部分からなる階段状の形状についての歪み速度および加速度解析を示している。血流におけるマイクロ形状の効果を実証する、関連した歪み速度(γ・秒-1)および加速規模のCFD分析が示されている(パネル2および3)。
図15cは、100マイクロメートルの流入部分、90°の漸縮角度(c90)、20マイクロメートルのピークギャップ、15マイクロメートルのギャップ長、60°の漸拡角度(e60)および700マイクロメートルの流出部分からなる階段状の形状についての歪み速度および加速度解析を示している。血流におけるマイクロ形状の効果を実証する、関連した歪み速度(γ・秒-1)および加速規模のCFD分析が示されている(パネル2および3)。
図15dは、100マイクロメートルの流入部分、90°の漸縮角度(c90)、20マイクロメートルのピークギャップ、15マイクロメートルのギャップ長、30°の漸拡角度(e30)および700マイクロメートルの流出部分からなる階段状の形状についての歪み速度および加速度解析を示している。血流におけるマイクロ形状の効果を実証する、関連した歪み速度(γ・秒-1)および加速規模のCFD分析が示されている(パネル2および3)。これは、1,800秒-1の流入せん断を達成するためにこの特定の製造形状に必要な速度である、11μl/分の血流速度における、チャネル形状における歪み速度(せん断)勾配の確立を実証するものである。先に定義した3つの識別できるせん断区域の確立に留意されたい:i.区域1−せん断加速区域;区域2−ピークせん断区域;および区域3−せん断の減速または凝集区域。
モデル条件下で血小板が経験する歪み速度環境における変化する壁の形状の影響への洞察を得るため、4つの異なる狭窄の進行度についての血管壁の1μm(血小板の直径の1/2)以内の血液成分の歪み速度の履歴を、図16a〜dに示すように分析した。
図16は、側壁圧縮を被る代表的なマウスの腸間膜細動脈の構造およびCFDのシミュレーションを示している。図16aは、挫滅外傷後にガラスのマイクロ針(破線)を用いた血管の側壁圧縮を被るマウスの腸間膜細動脈(直径42μm)の狭窄(〜80%の断面収縮)を示す、生体内のビデオ映像から得た代表的な顕微鏡写真である。血小板凝集の形成は、左から右への流れ方向を有する、図16aにおける黄色い影に示されている(および、16eの対応する白黒図に示される矢印が示す領域によっても示される)。流れの主方向と壁との角度は、針の先端が血管壁に接触する際に生じる関連した概略図は、30、65および80%の狭窄における、進行する血管の側壁圧縮の影響の構造モデル予測を示している。収縮および漸拡角度は、狭窄の程度の関数として、35から55°まで漸増すると予測されることに留意されたい。黒い矢印は、血流の方向を示している。
図16bは、図16aに示す、65%および80%の狭窄の予測される歪み速度分布の等高線図を示している。水力学的領域の低減は、紺青色の区域(最低値)から赤い区域(最高値)まで進む、流体の変形速度の進行性の増加/減少を生じることに留意されたい。jこれらの変化は、幾何学形状および、針によって生じる角度に明確に依存し、局所的に、血管を移動する粒子の経験する応力に影響を与えうる。
図16cは、狭窄(血管圧縮)の程度の関数としてのマウスの血管壁における最大歪み速度を示している。指数関数的関係は、一定の流速での、最大の壁歪み速度と狭窄の程度との間に生じることに留意されたい。
図16dは、4つの異なる狭窄の進行度(領域の30、65、80および90%)についてのマイクロ針の圧縮によって変形した側壁から1マイクロメートル(血小板の直径の2分の1)の地点を移動する血小板の予測される(CFD)歪み速度履歴を与えている。歪み速度の増大は、血小板が収縮を開始するとすぐに明らかになることに留意されたい。この流線を移動する粒子は、数ミリ秒以内に加速、ピークせん断区域および減速を経験する。65%の狭窄(面積)では、歪み速度の小幅な上昇が予測されるが、80%の狭窄度合いでは、血小板は、狭窄収縮を通過する際に、歪み速度の2倍の増加を経験することが分かった。さらには、モデリングは、重度の狭窄(80%を超える)の5%の上昇(2.1μm)が、3倍の歪み速度の増大(40,000〜120,000秒-1)をもたらすことを予測し、80%またはそれを超える狭窄における血管の側壁の小さい修正は、血管を通じて流れる血小板の歪み速度履歴における劇的効果を有しうることを示唆している。
実験者のインビボでの観察とともに総合すれば、図16のこれらの数値シミュレーションから、狭窄を通過する血管壁に近い血小板は、1×106秒-1に近いピーク歪み速度を有する、せん断の加速および減速の急速かつ極端な段階を経験することが予想される。これらの値は極めて高いが、応力の持続時間が1〜5ミリ秒以内であれば、血小板は約1000Paの上昇するせん断応力(2.6×105秒-1の歪み速度)に耐えることができることが示唆された。この分析は、実験者の血管模倣体の設計の中で、血小板機能および凝集に有意に影響を与えうる、3つの原則的な幾何学的パラメータ、すなわち:
i.漸縮角度および関連した血流の加速度;
ii.狭窄のギャップ直径(%狭窄)および関連したピーク歪み速度;および
iii.漸拡角度および関連した血流の減速度
を特定可能にした。
i.漸縮角度および関連した血流の加速度;
ii.狭窄のギャップ直径(%狭窄)および関連したピーク歪み速度;および
iii.漸拡角度および関連した血流の減速度
を特定可能にした。
図17は、実験者の概念実証研究のすべての可能な事例から選択された、3つの対称的なマイクロチャネル設計の事例を示している。この場合もやはり、記号cXgYeZが用いられ、ここで、eXは突起の上流面の角度であり、gYはギャップのマイクロメートル単位の長さであり、eZは、突起の下流面の角度である。速度場、生じる歪み速度分布を予測し、素子内の血流の選択された流線内の粒子挙動を研究するため、数値の(CFD)シミュレーションを行った。
図18a〜18dは、それぞれ、腸間膜細動脈およびc60g20e60血管模倣体におけるコンピュータ計算した歪み速度分布を示している。図18aは、狭窄(側壁圧縮)の上流のマウス腸間膜細動脈(42マイクロメートル)における血流のコンピュータ計算した歪み速度分布のカラー地図を示している。粘性効果および円筒形の幾何学形状に起因して、壁における均一な歪み速度が、流体流れによって生じることに留意されたい。
図18bは、画成された収縮の幾何学形状の上流のc60g20e60の血管模倣体における血流のコンピュータ計算した歪み速度分布のカラー地図を示している。長方形のチャネル形状および低いアスペクト比に起因して、マイクロチャネルの内側の流れは、中心で最大、角端部で最小の歪み速度を有し、壁に沿って放物線状の分布を生じることに留意されたい。カバースリップから30マイクロメートルに位置する平面をすべての画像化実験について選択し、この位置の流体および粒子が、65マイクロメートルの中央平面で最大の1960秒-1に近い歪み速度を示す、約〜1700秒-1の歪み速度を経験するようにした。
図18cは、80%の狭窄面積のマウス腸間膜細動脈における血流のコンピュータ計算した歪み速度分布のカラー地図を示している。血管の収縮区域の幾何学形状は、先が尖っていない針の形状と血管の側壁の弾性効果との組み合わせによって与えられる。拡張区域に近づくと急速に低下する44,600秒-1の2つのピークを有する、3次元における、不均一な歪み速度分布を生み出す、不規則な表面トポグラフィが生じる。
図18dは、画成された収縮の幾何学形状におけるc60g20e60の血管模倣体における血流のコンピュータ計算した歪み速度分布のカラー地図を示している。血管模倣体では、より大きいアスペクト比が生じ、さらに一様な歪み速度分布をもたらすことに留意されたい。示される流線は、マイクロチャネル壁から1マイクロメートル(血小板の直径の2分の1)の地点を移動する粒子のコンピュータ計算した軌跡を表している;この距離では、最大41,200秒-1が生じるが、流速がゼロの場合には、壁においてより高い歪み速度を経験しうることに留意されたい。
よって、図18aおよび18bは、それぞれ、モデル血管およびc60g20e60のマイクロチャネル型の比較歪み速度分布(収縮の上流)を提示している。Note that in the 血管において、軸対称の/一様な歪み速度分布が予測されるが、マイクロチャネル型の長方形の幾何学形状および低いアスペクト比(幅−高さ=1.3)に起因して、流れは、壁の中心で最大、隅部で最低値を有するとともに、側壁に沿って、放物線状の分布を辿ることに留意されたい (図18b)。しかしながら、血流面の観察が30〜65マイクロメートルの流れ体積に制限される場合には、血小板は、1,500〜1,960秒-1の均一な歪み速度を経験し、腸間膜動脈および細動脈について報告される公称の生理学的範囲内に入る。チャネル(フォトレジストの厚さによって定義される寸法)にわたる歪み速度のさらに一様な分布は、チャネルのアスペクト比の上昇(設計マスクによって与えられる幅の増大またはフォトレジストの厚さによって与えられる高さの増大のいずれか)によって達成することができるかもしれないが、これは、水力学的直径に影響を与えうる(収縮におけるレイノルズ数および歪み速度勾配への血小板の曝露時間に影響を与える)。この調査では、実験者は、インビボの事例と同様の慣性効果を有する高い歪み速度区域をモデル化するために、同様の滞留時間を有する、収縮における最低の可能なレイノルズ数を保持することに興味を持った(インビボにおける収縮のレイノルズ数は0.45であり、マイクロチャネル内のレイノルズ数は2.4である)。
図18cおよび18dは、それぞれ、モデル細動脈(80%の狭窄)およびc60g20e60のマイクロチャネル型についての収縮区域内における歪み速度分布のコンピュータ計算の結果を提示している。血管の場合には、マイクロニードル圧縮の不均一な性質が、収縮区域の上流および下流端に配置された高せん断(〜44,600秒-1)の2つの局所領域を有する、歪み速度の不規則分布を生じる起伏のある側壁トポグラフィをもたらすことに留意されたい(図18c)。対照的に、合成のc60g20e60のマイクロチャネル型の重要な利点は、収縮の幾何学的形状が均一であり(より大きいアスペクト比を有する)、より一様な歪み速度分布をもたらす(図18d)ことである。さらには、図18dは、c60g20e60のマイクロチャネル壁から1マイクロメートルにおける流れの流線では、血小板は、ほぼ血管に近い、41,200秒-1の収縮の幾何学形状の中心における予測されるピーク歪み速度を経験することを実証している。全般的な実験者のシミュレーションは、c60g20e60のマイクロチャネル型が、公開されたインビボモデル内に生み出される血流力学条件の非常に理想的な近似値を示すことを示唆している。
図19a〜19dは、それぞれ、素子の流体力学的性能を示している。図19aは、c30g20e30、c60g20e60およびc90g20e90の血管模倣体についての予測される歪み速度分布の等高線図を示している。水力学的領域の低減は、進行性の増大を生じ、したがって、流体の変形速度の低下を生じ、紺青色の区域(最低値)から赤色の区域(最高値)まで進むが、しかしながら、「進行性」の増大の減少に対する比は各幾何学形状によって異なることに留意されたい。
図19bは、時間の関数としての3つの指定されたマイクロチャネルの幾何学形状についての階段状の壁から1マイクロメートルの地点を移動するモデル血小板が経験する予測される歪み速度「履歴」を実証するCFDプロットを示している。
図19cは、距離の関数としての3つの指定されたマイクロチャネルの幾何学形状についての階段状の壁から1マイクロメートルの地点を移動するモデル血小板が経験する予測される歪み速度「履歴」を実証するCFDプロットを示している。0マイクロメートルの基準点は、定義された収縮の幾何学形状の中心線に位置している。
図19dは、階段状の壁から1マイクロメートルの流線を辿る、定義された収縮の幾何学形状の中心線から10マイクロメートルおよび30マイクロメートルの地点で経験する歪み速度勾配の比較を示すCFDプロットを示している。
よって、図19a〜19dは、実験者が、実験者の概念実証幾何学において、漸拡角度を60°に変化させることによって修正することを目的とした、重要な水力学変数に対する洞察、すなわち、収縮区域内で初期に連結する血小板が経験する全般的な減速勾配を提供する。図19cは、3つのマイクロチャネル型の拡大へと移行する際に血小板が経験する歪み速度の減速における漸拡角度の影響の分析を示している。収縮区域(ピーク段階)の中心から10マイクロメートルおよび30マイクロメートルの地点における、階段状の壁から1マイクロメートルの血小板が経験する歪み速度の瞬時値の試験は、血小板が、同等距離にわたる3つの角度の関数としての歪み速度の減速規模における有意な差異を経験することを実証している。すなわち;θe=30°では、拡張区域の最初の10マイクロメートルにわたり、歪み速度における35%の低下(41,000〜28,000秒-1)をもたらし、θe=60°では46%の低下(41,000〜22,200秒-1)をもたらし、θe=90°では65%の低下(41,000〜14,400秒-1)をもたらす(図19c)。
実施例6:マイクロチャネル設計の関数としての血小板凝集
図20aは、ADPを遮断するための血小板阻害剤アピラーゼ(0.02U/ml)、N6−メチル−2’−デオキシアデノシン−3’,5’−ビスリン酸(100μMにおけるMRS2179)および2−メチルチオ−AMP(10μMにおける2−MeSAMP);TXA2を遮断するためのインドメタシン(10μM);およびトロンビンを遮断するためのヒルジン(800U/ml)を用いて、10分間、前処理した後に、10分間にわたりc60g20e60の形状型を通る、16μL/分の一定の流速(流入歪み速度=1,800秒-1)のDiOC6で標識した全血の灌流のリアルタイム落射蛍光画像を表している。c60g20e60のマイクロチャネル型を通る灌流は、特にピークせん断(収縮)区域の下流端で開始する強固な血小板凝集をもたらした(図20a)。顕著に、下流の歪み速度の減速(拡張)区域内に漸次生じた血小板凝集は、比較的大きい、安定な血小板凝集の形成をもたらした。3つの独立したドナーサンプルの比較は、全般的な凝集動力学および閉塞に至る時間に関して密接な一致を示した。凝集反応に介在する血小板接着受容体を試験するため、血小板インテグリン αIIbβ3を遮断する抗インテグリン αIIbβ3 Fab c7E3(20μg/ml)、または、VWFの血小板GPIb/V/IXの係合を遮断する抗GPIb IgG Alma12(50μg/ml)を用いて全血サンプルを調製した。図21aに示すように、インテグリンまたはGPIbの封鎖下では、c60g20e60の幾何学形状内の血小板凝集は完全に阻害され、凝集過程における3つの主要な血小板接着受容体にとって、重要な要件であることを実証している。
図20aは、ADPを遮断するための血小板阻害剤アピラーゼ(0.02U/ml)、N6−メチル−2’−デオキシアデノシン−3’,5’−ビスリン酸(100μMにおけるMRS2179)および2−メチルチオ−AMP(10μMにおける2−MeSAMP);TXA2を遮断するためのインドメタシン(10μM);およびトロンビンを遮断するためのヒルジン(800U/ml)を用いて、10分間、前処理した後に、10分間にわたりc60g20e60の形状型を通る、16μL/分の一定の流速(流入歪み速度=1,800秒-1)のDiOC6で標識した全血の灌流のリアルタイム落射蛍光画像を表している。c60g20e60のマイクロチャネル型を通る灌流は、特にピークせん断(収縮)区域の下流端で開始する強固な血小板凝集をもたらした(図20a)。顕著に、下流の歪み速度の減速(拡張)区域内に漸次生じた血小板凝集は、比較的大きい、安定な血小板凝集の形成をもたらした。3つの独立したドナーサンプルの比較は、全般的な凝集動力学および閉塞に至る時間に関して密接な一致を示した。凝集反応に介在する血小板接着受容体を試験するため、血小板インテグリン αIIbβ3を遮断する抗インテグリン αIIbβ3 Fab c7E3(20μg/ml)、または、VWFの血小板GPIb/V/IXの係合を遮断する抗GPIb IgG Alma12(50μg/ml)を用いて全血サンプルを調製した。図21aに示すように、インテグリンまたはGPIbの封鎖下では、c60g20e60の幾何学形状内の血小板凝集は完全に阻害され、凝集過程における3つの主要な血小板接着受容体にとって、重要な要件であることを実証している。
実施例7:マイクロチャネルの幾何学形状の機能としての血小板凝集の調節
先に述べたように、実験者の素子設計コンセプトの主な目的は、重要な幾何学的パラメータを調節することによって、血小板凝集を制御可能に調節し、したがって、与えられた歪み速度のマイクロ勾配の規模および度合いを調節することであった。図21aおよび21bは、マイクロチャネルの幾何学形状の収縮角度および漸拡角度が対称的に修正された、一連のテストケース実験を示している。流入の狭窄前の歪み速度が1,800秒-1で一定に保たれた、c60g20e60の幾何学形状型とc90g20e90の幾何学形状型との比較は、血小板凝集の全般的な規模における感知できるほどの差異がないことを実証している(図21b)。しかしながら、c90g20e90の幾何学形状は、形成された凝集の安定性の増大をもたらし、これは、経時的な、凝集サイズの変動の全般的な低下によって浮き彫りにされた(図21b)。対照的に、60°から30°(c30g20e30型)への収縮および漸拡角度の低下は、血小板凝集の初期の速度および規模の両方を有意に低下させた(図21aおよび21b)。興味深いことに、c30g20e30型における初期の血小板凝集部位は、狭窄の頂点から下流にシフトし、血小板凝集の顕著な安定化が生じる前に、全般的な歪み速度の減速が達成されたことを示唆している(図21aおよび21b)。
先に述べたように、実験者の素子設計コンセプトの主な目的は、重要な幾何学的パラメータを調節することによって、血小板凝集を制御可能に調節し、したがって、与えられた歪み速度のマイクロ勾配の規模および度合いを調節することであった。図21aおよび21bは、マイクロチャネルの幾何学形状の収縮角度および漸拡角度が対称的に修正された、一連のテストケース実験を示している。流入の狭窄前の歪み速度が1,800秒-1で一定に保たれた、c60g20e60の幾何学形状型とc90g20e90の幾何学形状型との比較は、血小板凝集の全般的な規模における感知できるほどの差異がないことを実証している(図21b)。しかしながら、c90g20e90の幾何学形状は、形成された凝集の安定性の増大をもたらし、これは、経時的な、凝集サイズの変動の全般的な低下によって浮き彫りにされた(図21b)。対照的に、60°から30°(c30g20e30型)への収縮および漸拡角度の低下は、血小板凝集の初期の速度および規模の両方を有意に低下させた(図21aおよび21b)。興味深いことに、c30g20e30型における初期の血小板凝集部位は、狭窄の頂点から下流にシフトし、血小板凝集の顕著な安定化が生じる前に、全般的な歪み速度の減速が達成されたことを示唆している(図21aおよび21b)。
このコンセプト研究の証明は、実験者の原型素子における歪み速度、幾何学形状および結果として得られた歪み速度分布の修正が、制御された方法での血小板凝集動力学の調節に直接使用することができることを明確に実証している。実験者の現在の作用仮説および実験者の詳細にわたるCFDシミュレーションに基づいて、c30g20e30型の安定な血小板凝集を支持する能力の欠如は、凝集の発現が経験する全般的な高い歪み速度(流れの速い速度領域内で発現するように強いられる際に)および、拡張区域内の歪み速度の変化速度における全般的な低下によって説明できよう。対照的に、c90g20e90型における凝集の安定性の増大は、さらに急速な歪み速度の減速、および、流れの速い速度領域から形成された凝集の保護によって説明できよう。
さらに詳細には、図21aは、c90g20e90およびc30g20e30のマイクロチャネル型を通る血液の灌流の一連の代表的な落射蛍光画像を示している。Note that すべての場合において、血液サンプルは、灌流の前に10分間、増幅ループ遮断薬(ALB);アピラーゼ(0.02U/ml)、MRS2179(100μM)および2−MeSAMP(10μM);インドメタシン(10μM)およびヒルジン(800U/ml)を用いて準備した(各模倣体について、代表的なn=3実験)。
図21bは、c60g20e60、c90g20e90およびc30g20e30のマイクロチャネル型を通るALB処理した全血の灌流の反応を示す代表的な凝集のトレースを示している(n=3実験)。
実施例8:マイクロチャネル配列における抗血小板阻害剤の効果の比較
本実施例は、マイクロ形状設計の1回の反復を用いて実証される特定の血小板受容体の活性化流路を目的とする、さまざまな個別の抗血小板薬、または抗血小板薬の組合せの血小板凝集における効果を説明する。試験する抗血小板薬は、ADP受容体/P2Y12 拮抗薬である。ADPは、活性化された血小板によって放出される顆粒の1種であり、これが、今度は、さらなる血小板を活性化する。顆粒成分は、Gq結合タンパク質受容体カスケードを活性化し、血小板サイトゾルにおけるカルシウム濃度の増大をもたらす。
本実施例は、マイクロ形状設計の1回の反復を用いて実証される特定の血小板受容体の活性化流路を目的とする、さまざまな個別の抗血小板薬、または抗血小板薬の組合せの血小板凝集における効果を説明する。試験する抗血小板薬は、ADP受容体/P2Y12 拮抗薬である。ADPは、活性化された血小板によって放出される顆粒の1種であり、これが、今度は、さらなる血小板を活性化する。顆粒成分は、Gq結合タンパク質受容体カスケードを活性化し、血小板サイトゾルにおけるカルシウム濃度の増大をもたらす。
本実施例で用いられるマイクロ形状素子は、85°の漸縮角度(θc)、85°の漸拡角度(θe)、30μmのギャップ幅、15μmのギャップ長および、100μmのチャネルの入口幅および出口幅を有する(c85 g30 e85 100〜100μm型)。
以下の抗血小板薬を単独で、または組み合わせて使用した:
1.ヒルジン: 対照としてヒルジン(800U/ml)で抗凝固させたヒト全血。
2.ヒルジン+MRS:100μMのP2Y1アデノシン−5'−二リン酸(ADP)拮抗薬N6−メチル−2’−デオキシアデノシン−3',5’−ビスリン酸(MRS2179)で10分間前処理した、ヒト(ヒルジンで抗凝固させた)全血。
3.ヒルジン+2Me:10μMのP2Y12(ADP)拮抗薬2−メチルチオ−AMP(2MeAMP)で10分間前処理した、ヒト(ヒルジンで抗凝固させた)全血。
4.ヒルジン+MRS+2Me:P2Y1(ADP)およびP2Y12(ADP)拮抗薬MRS2179(100μM)および2MeAMP(10μM)で10分間前処理した、ヒト(ヒルジンで抗凝固させた)全血。
1.ヒルジン: 対照としてヒルジン(800U/ml)で抗凝固させたヒト全血。
2.ヒルジン+MRS:100μMのP2Y1アデノシン−5'−二リン酸(ADP)拮抗薬N6−メチル−2’−デオキシアデノシン−3',5’−ビスリン酸(MRS2179)で10分間前処理した、ヒト(ヒルジンで抗凝固させた)全血。
3.ヒルジン+2Me:10μMのP2Y12(ADP)拮抗薬2−メチルチオ−AMP(2MeAMP)で10分間前処理した、ヒト(ヒルジンで抗凝固させた)全血。
4.ヒルジン+MRS+2Me:P2Y1(ADP)およびP2Y12(ADP)拮抗薬MRS2179(100μM)および2MeAMP(10μM)で10分間前処理した、ヒト(ヒルジンで抗凝固させた)全血。
データを図22に示す。これは、P2Y12(ADP)受容体の阻害剤(クロピドグレルの実験的等価物(Plavix(登録商標)))が、素子における全般的な凝集の50%の低下をもたらすことを実証している。
P2Y1(ADP)受容体遮断薬MRSは、組み合わせでは、素子の凝集プロファイルにおける、はるかに著しい効果を有し、凝集が大幅に低減する。阻害剤の有効性は、利用する幾何学形状のタイプに応じて決まるように思われる。例えば、マイクロ形状 が90°の漸縮角度、60°の漸拡角度、および10μmのギャップ幅ならびに、それぞれ100μmおよび700μmにおけるマイクロチャネルセットの入口および出口部分(c90 g10 e60 100〜700μmの型)を表す場合には、血小板凝集はこれらの阻害剤に耐性を示した。このデータは、図11eに示されており、ADP拮抗薬を上記と同一濃度で使用した、P2Y1、P2Y12、トロンビンおよびTXA2阻害剤の複合効果は、凝集反応には効果を有しない。
このデータは、血小板凝集反応、角度および収縮寸法を変動させることによって特別にカスタマイズできることを実証している。これは、多くの素子設計を、臨床の場での異なる抗血小板薬の評価に使用可能にする。
実施例9:清浄な健康ドナーの血液サンプルとフォン・ヴィレブランド病の血液サンプルの比較
本実施例は、マイクロ形状素子が、健常ドナーに由来する血液サンプルと、アッセイ時における臨床的に測定したvWF血液レベルが正常値の7%であるIII型の フォン・ヴィレブランド病(vWB)を有する患者に由来する血液サンプルとの識別に使用することができるというコンセプトの証明を実証する。フォン・ヴィレブランド病は、最も一般的な遺伝性の出血障害であり、遺伝性の常染色体劣性または常染色体優性であるとして特徴づけられる。この病気では、糖タンパク質Ib(GPIb)のコラーゲンへの結合に介在するvWFに欠陥が存在する。この結合は、of 血小板の活性化および一次止血の形成の介在に役立つ。
本実施例は、マイクロ形状素子が、健常ドナーに由来する血液サンプルと、アッセイ時における臨床的に測定したvWF血液レベルが正常値の7%であるIII型の フォン・ヴィレブランド病(vWB)を有する患者に由来する血液サンプルとの識別に使用することができるというコンセプトの証明を実証する。フォン・ヴィレブランド病は、最も一般的な遺伝性の出血障害であり、遺伝性の常染色体劣性または常染色体優性であるとして特徴づけられる。この病気では、糖タンパク質Ib(GPIb)のコラーゲンへの結合に介在するvWFに欠陥が存在する。この結合は、of 血小板の活性化および一次止血の形成の介在に役立つ。
85°の漸縮角度(θa)、85°の漸拡角度(θb)、30μmのギャップ幅、15μmのギャップ長および、100μmのチャネル幅(c85 g30 e85 100〜100μmの型)を含むマイクロチャネルの幾何学形状を用いた。
ヒルジンおよびさまざまな抗血小板薬で前処理した健康な血液を、ヒルジンならびに以下のさまざまな抗血小板薬で前処理したフォン・ヴィレブランド病のサンプルと比較した:
対照:P2Y1(ADP)およびP2Y12拮抗薬MRS2179(100μM)および2MeAMP(10μm)およびトロンボキサンA2阻害剤のインドメタシン(10μM)を用いて10分間前処理したヒト(ヒルジンで抗凝固させた)全血。
vWD: P2Y1(ADP)およびP2Y12拮抗薬MRS2179(100μM)および2MeAMP(10μm)およびインドメタシン(10μM)を用いて10分間前処理したフォン・ヴィレブランド病患者のサンプル(ヒルジンで抗凝固させた)の全血。
対照:P2Y1(ADP)およびP2Y12拮抗薬MRS2179(100μM)および2MeAMP(10μm)およびトロンボキサンA2阻害剤のインドメタシン(10μM)を用いて10分間前処理したヒト(ヒルジンで抗凝固させた)全血。
vWD: P2Y1(ADP)およびP2Y12拮抗薬MRS2179(100μM)および2MeAMP(10μm)およびインドメタシン(10μM)を用いて10分間前処理したフォン・ヴィレブランド病患者のサンプル(ヒルジンで抗凝固させた)の全血。
データは図23に示されており、このvWFレベルでは、フォン・ヴィレブランド病患者に由来する血液サンプルは、上記幾何学形状を備えた素子において凝集不能であることを実証している。
実施例10:血小板凝集反応における漸縮角度の低下の比較
この実施例は、収縮(加速)角度が素子の1回の反復において果たす役割を研究する。素子は、20μmのギャップ幅、15μmのギャップ長、85°の拡張(減速角度)および、100μmのマイクロチャネルの入口および出口幅からなる(cX g20 e85 100〜100μmの型、cX=漸縮角度)。ヒト全血を、ヒルジン800U/mlおよび、それぞれP2Y1(ADP)およびP2Y12拮抗薬であるMRS2179(100μM)および2MeAMP(10μM)、およびインドメタシン(10μM)で10分間前処理した。漸縮角度が0、60、75および85°と異なる素子を通して、サンプルを灌流させた。この反復において、漸縮角度が60°未満になる場合、凝集は効果的に排除された(図24参照)。
この実施例は、収縮(加速)角度が素子の1回の反復において果たす役割を研究する。素子は、20μmのギャップ幅、15μmのギャップ長、85°の拡張(減速角度)および、100μmのマイクロチャネルの入口および出口幅からなる(cX g20 e85 100〜100μmの型、cX=漸縮角度)。ヒト全血を、ヒルジン800U/mlおよび、それぞれP2Y1(ADP)およびP2Y12拮抗薬であるMRS2179(100μM)および2MeAMP(10μM)、およびインドメタシン(10μM)で10分間前処理した。漸縮角度が0、60、75および85°と異なる素子を通して、サンプルを灌流させた。この反復において、漸縮角度が60°未満になる場合、凝集は効果的に排除された(図24参照)。
実施例11:血小板凝集反応における漸拡角度の縮小の比較
この実施例は、拡張(減速)角度が素子の1回の反復に果たす役割を研究する。この反復は、20μmのギャップ幅、15μmのギャップ長、85°の収縮(加速角度)、および100μmのマイクロチャネルの入口および出口幅で構成された(形式:c85 g20 eX 100〜100μmの型;eX=漸拡角度)。ヒト全血を、ヒルジン800U/mlおよび、それぞれP2Y1(ADP)およびP2Y12拮抗薬であるMRS2179(100μM)および2MeAMP(10μM)、およびインドメタシン(10μM)で10分間前処理した。サンプルを、漸拡角度が、15、60、75および90°と異なる素子に通して灌流させた。この反復では、漸拡角度が30°未満になる場合、凝集は効果的に排除された(図25参照)。
この実施例は、拡張(減速)角度が素子の1回の反復に果たす役割を研究する。この反復は、20μmのギャップ幅、15μmのギャップ長、85°の収縮(加速角度)、および100μmのマイクロチャネルの入口および出口幅で構成された(形式:c85 g20 eX 100〜100μmの型;eX=漸拡角度)。ヒト全血を、ヒルジン800U/mlおよび、それぞれP2Y1(ADP)およびP2Y12拮抗薬であるMRS2179(100μM)および2MeAMP(10μM)、およびインドメタシン(10μM)で10分間前処理した。サンプルを、漸拡角度が、15、60、75および90°と異なる素子に通して灌流させた。この反復では、漸拡角度が30°未満になる場合、凝集は効果的に排除された(図25参照)。
実施例12:血小板凝集反応のギャップ幅の解析
この実施例は、ギャップ幅、ひいてはピークせん断成分が、素子の1回の反復における凝集反応に果たす役割を研究する。この反復は、75°の漸縮角度、75°の漸拡角度、および100μmのマイクロチャネルの入口および出口幅で構成される(c75 g20 gX e75 100〜100μmの型;gX=可変ギャップ幅)。ヒト全血を、ヒルジン800U/mlおよび、それぞれ、P2Y1(ADP)およびP2Y12拮抗薬であるMRS2179(100μM)および2MeAMP(10μM)、およびインドメタシン(10μM)で10分間前処理した。サンプルを、10、20、30および40μmと異なるギャップを有する素子に通して灌流させた。。データは、凝集の速度および程度が、ギャップを30〜10μmの範囲に狭くすることによって修正できることを実証している。血小板凝集は、ギャップ幅が30μm未満に下降した場合に停止する(図26参照)。
この実施例は、ギャップ幅、ひいてはピークせん断成分が、素子の1回の反復における凝集反応に果たす役割を研究する。この反復は、75°の漸縮角度、75°の漸拡角度、および100μmのマイクロチャネルの入口および出口幅で構成される(c75 g20 gX e75 100〜100μmの型;gX=可変ギャップ幅)。ヒト全血を、ヒルジン800U/mlおよび、それぞれ、P2Y1(ADP)およびP2Y12拮抗薬であるMRS2179(100μM)および2MeAMP(10μM)、およびインドメタシン(10μM)で10分間前処理した。サンプルを、10、20、30および40μmと異なるギャップを有する素子に通して灌流させた。。データは、凝集の速度および程度が、ギャップを30〜10μmの範囲に狭くすることによって修正できることを実証している。血小板凝集は、ギャップ幅が30μm未満に下降した場合に停止する(図26参照)。
実施例13:血小板凝集反応におけるギャップ長の分析
この実施例は、ギャップ長、ひいてはピークせん断成分の持続時間が、素子の1回の反復における凝集反応に果たす役割を実証する。この反復は、75°の漸縮角度、75°の漸拡角度、および、100μmのマイクロチャネルの入口および出口幅で構成される(c75 g20 e75 100〜100μmの型;ギャップ長は、10、15、20、50および70μmと変化させる)。ヒト全血を、ヒルジン800U/mlおよび、それぞれP2Y1(ADP)およびP2Y12拮抗薬であるMRS2179(100μM)および2MeAMP(10μM)、およびインドメタシン(10μM)で10分間前処理した。サンプルを、ギャップ長が10〜70μmの範囲で変化する素子に通して灌流させた。データは、凝集は、ギャップ長が10μmより短い場合、およびギャップ長が70μmを超える場合にも停止することを実証している。さらには、データセットは、凝集の速度および程度は、ギャップ長を15〜50μmの範囲内で変動させることによって修正できることも実証している(図27参照)。
この実施例は、ギャップ長、ひいてはピークせん断成分の持続時間が、素子の1回の反復における凝集反応に果たす役割を実証する。この反復は、75°の漸縮角度、75°の漸拡角度、および、100μmのマイクロチャネルの入口および出口幅で構成される(c75 g20 e75 100〜100μmの型;ギャップ長は、10、15、20、50および70μmと変化させる)。ヒト全血を、ヒルジン800U/mlおよび、それぞれP2Y1(ADP)およびP2Y12拮抗薬であるMRS2179(100μM)および2MeAMP(10μM)、およびインドメタシン(10μM)で10分間前処理した。サンプルを、ギャップ長が10〜70μmの範囲で変化する素子に通して灌流させた。データは、凝集は、ギャップ長が10μmより短い場合、およびギャップ長が70μmを超える場合にも停止することを実証している。さらには、データセットは、凝集の速度および程度は、ギャップ長を15〜50μmの範囲内で変動させることによって修正できることも実証している(図27参照)。
Claims (31)
- 被験体から得られた生体サンプルの血小板凝集のリアルタイム・モニタリングを提供するためのマイクロ流体素子であって、
前記生体サンプルの流路用に構成されたチャネルと、
前記生体サンプルが前記チャネルを通過する結果としての、凝集域における血小板の凝集を検出するための血小板検出手段と、
を備え、
前記チャネルが、下流のせん断減速領域と連結した上流のせん断加速領域を誘導し、その間にせん断ピーク速度領域を定義するように構成された突起を備え、
前記下流のせん断減速領域が血小板凝集域を定義する、
マイクロ流体素子。 - 生体サンプルが、前記素子を通って、初期のせん断速度を生理学的範囲(150〜10,000秒-1)に定義および抑制する速度で送り出される際に、10×103秒-1〜150×103秒-1の範囲のせん断ピーク速度を誘発するように、突起が構成されることを特徴とする請求項1記載のマイクロ流体素子。
- 前記突起が、
せん断の加速領域を定義するために、前記チャネルを通じた流れの優勢方向に対して0°〜90°の角度である上流面と、
せん断の減速領域を定義するために、前記チャネルを通じた流れの優勢方向に対して0°〜90°の角度である下流面と
を備えていることを特徴とする請求項1または2記載のマイクロ流体素子。 - 前記上流面および下流面が、前記チャネルを通るそれぞれ流れの優勢方向に対して30°〜90°の角度であることを特徴とする請求項3記載のマイクロ流体素子。
- 前記ピークせん断領域が、前記突起とそれに対向するチャネル壁に関するギャップ幅によって定義され、
前記ギャップ幅が10μm〜40μmの範囲から選択されることを特徴とする請求項3または4記載のマイクロ流体素子。 - 前記チャネルを通る流れの優勢方向に対して並行に測定した前記ギャップの幅が、0.5〜20μmであることを特徴とする請求項5記載のマイクロ流体素子。
- 前記上流および下流面が実質的に平面、凹面または凸面であることを特徴とする請求項3〜6いずれか1項記載のマイクロ流体素子。
- 被験体から得られた生体サンプルの血小板凝集を評価するためのマイクロ流体素子であって、
前記生体サンプルの流路用に構成されたチャネルと、
前記生体サンプルが前記チャネルを通過した結果として、凝集域における血小板の凝集を検出するための血小板検出手段と、
を備え、
前記チャネルが前記サンプルの流れを摂動するための突起を有し、
前記突起の少なくとも1つの断面寸法が実質的に100マイクロメートル未満であり、
前記突起が前記チャネル内に血小板凝集域を画成するように構成されている、
マイクロ流体素子。 - 流れの分離または渦の形成のない、十分に安定な血流を維持するために、前記チャネルの構成および流速が、前記チャネル内のレイノルズ数を約26以下に維持するように適合されることを特徴とする請求項1〜8いずれか1項記載のマイクロ流体素子。
- 前記突起が、前記チャネル内に配置された球形の突起を構成し、その周りを前記サンプルが流れることを特徴とする請求項8記載のマイクロ流体素子。
- 実質的に等量のサンプルが前記球形の突起のそれぞれの側に流れるように、前記球形の突起が、前記チャネルの幅にわたって中央に配置されることを特徴とする請求項10記載のマイクロ流体素子。
- 複数のチャネルが提供され、
各チャネルが実質的に同一寸法の突起を有し、
前記検出手段が、すべてのチャネルにおけるすべての血小板凝集の合計を検出するように動作可能である
ことを特徴とする請求項1〜11いずれか1項記載のマイクロ流体素子。 - 複数のチャネルが提供され、
各チャネルが実質的に異なる寸法の突起を有し、
前記検出手段がチャネルのアレイにおける異なった血小板凝集を並行に検出するように動作可能である
ことを特徴とする請求項1〜11いずれか1項記載のマイクロ流体素子。 - 血小板の凝集を改善するため、前記チャネル表面に、血清タンパク質、粘着性の基質またはポリマーが備わっていることを特徴とする請求項1〜13いずれか1項記載のマイクロ流体素子。
- 前記血小板検出手段が光検出手段を備えることを特徴とする請求項1〜14いずれか1項記載のマイクロ流体素子。
- 前記光検出手段が、前記血小板凝集域におけるリアルタイムの血小板凝集をモニタリングするために、前記チャネル突起に隣接して位置する全反射センサを備えることを特徴とする請求項15記載のマイクロ流体素子。
- 前記光検出手段が発光素子および、位置合わせした光検出器を備え、
前記光検出器が前記血小板凝集域における血小板の凝集によって生じた内部の光反射の変化を検出するように、前記発光素子が、前記チャネルを形成する材料内において内部反射のための光を発するようにに構成されることを特徴とする請求項15記載のマイクロ流体素子。 - 前記光検出手段が、発光素子および、位置合わせした光検出器を備え、
前記光検出器が血小板の凝集によって生じた伝達される光強度の低下を検出するように、前記発光素子が前記血小板凝集域を通じた伝達のために光を発するように構成されることを特徴とする請求項15記載のマイクロ流体素子。 - 前記光検出手段が、発光素子および、位置合わせした光検出器を備え、
前記光検出器がすべてのチャネルにおける全血小板凝集によって生じた伝達される光強度の低下を検出するように、前記発光素子が、それぞれの突起によって画成される複数のチャネルの各々の血小板凝集域を通じて発光するように構成されることを特徴とする、請求項12または13に従属する場合の請求項15記載のマイクロ流体素子。 - 前記素子が、内部に1つ以上の液密チャネルが形成、埋入、または成形された製造ブロックを備えることを特徴とする請求項1〜19いずれか1項記載のマイクロ流体素子。
- 前記素子を製造したブロック材料が、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、ホウケイ酸ガラス、SF11ガラス、SF12ガラス、ポリスチレンおよびポリカーボネートのうちの1つであることを特徴とする請求項20記載のマイクロ流体素子。。
- 血小板またはそれらの前駆体の異常な機能または活性を伴う疾病または障害を有する、またはそれらの進行の危険性のある被験体の検出または評価のための診断方法であって、
請求項1〜21いずれか1項記載のマイクロ流体素子を包含することを特徴とする方法。 - 被験体における血小板またはそれらの前駆体の異常な機能または活性を伴う疾病または障害の存在、またはそれらの進行の危険性を診断する方法であって、
i)前記被験体から生体サンプルを入手し;
ii)定義されたフロー条件下、かつ、前記生体サンプルから得た細胞が凝集可能にするのに十分な時間、請求項1〜21いずれか1項記載の生体サンプルを、前記素子に通し;
iii)前記細胞の凝集を検出し;
iv)前記生体サンプルの細胞凝集に至る時間およびその大きさを所定の基準値と比較する、
各工程を有してなり、
任意の変動が、血小板またはそれらの前駆体の異常な機能または活性を伴う疾病または障害の存在、またはそれらの進行の危険性の指標となる、
方法。 - 生体サンプル中の血小板またはそれらの前駆体の凝集における試薬の調節作用を検査または評価する方法であって、
i)定義されたフロー条件下、血小板凝集が前記素子内で生じるか否かを決定するのに十分な時間、前記生体サンプルを前記試薬の存在下で請求項1〜21いずれか1項記載のマイクロ流体素子に通し;
ii)工程(i)から得られた結果を、工程(i)が前記試薬の不存在下で行われた時の結果と比較する、
各工程を有してなる方法。 - 試薬を用いた療法を受ける被験体の治療をモニタリングする方法であって、
(i)定義されたフロー条件下、血小板凝集が前記素子内で生じるか否かを決定するのに十分な時間、前記被験体への前記試薬の投与前に得られた前記被験体に由来する第1の生体サンプルを、請求項1〜21いずれか1項記載の素子に通し;
(ii)定義されたフロー条件下、血小板凝集が前記素子内で生じるか否かを決定するのに十分な時間、前記被験体への前記試薬の投与後に得られた同一の被験体に由来する第2の生体サンプルを、請求項1〜21いずれか1項記載の素子に通し;
(iii)工程(i)から得られた結果を工程(ii)で得られた結果と比較する、
各工程を有してなる方法。 - 試薬を用いた療法を受ける被験体の治療をモニタリングする方法であって、
(i)定義されたフロー条件下、血小板凝集が前記素子内で生じるか否かを決定するのに十分な時間、前記被験体への前記試薬の初回投与前に得られた前記被験体に由来する第1の生体サンプルを、請求項1〜21いずれか1項記載の素子に通し;
(ii)定義されたフロー条件下、血小板凝集が前記素子内で生じるか否かを決定するのに十分な時間、前記被験体への前記試薬の2回目の投与後に得られた同一の被験体に由来する第2の生体サンプルを、請求項1〜21いずれか1項記載の素子に通し;
(iii)工程(i)から得られた結果を工程(ii)で得られた結果と比較する、
各工程を有してなる方法。 - 生体サンプルにおける血小板機能および/または生存能力をモニタリングすることを目的とした、請求項1〜21いずれか1項記載のマイクロ流体素子の使用方法。
- 複数の候補抗血小板化合物の高スループットスクリーニング方法であって、
(i)被験体から得られた少なくとも1つの生体サンプルを、前記複数の候補抗血小板化合物のうち少なくとも第1の候補化合物と接触させ;
(ii)定義されたフロー条件下、血小板凝集が前記素子内で生じるか否かを決定するのに十分な時間、前記少なくとも1つのサンプルを、請求項1〜21いずれか1項記載のマイクロ流体素子に通し;
(iii)前記少なくとも1つの生体サンプルの血小板凝集における前記複数の候補抗血小板化合物のうちの第1の候補化合物の効果を検出し;
(iv)(iii)で見られた効果を前記候補化合物と接触していない対照サンプルと比較する、
各工程を有してなる方法。 - 請求項1〜21いずれか1項記載のマイクロ流体素子を組み込んだ高スループットスクリーニングによって得られる、新規の抗血小板試薬。
- (i)請求項1〜21いずれか1項記載のマイクロ流体素子;および
(ii)前記マイクロ流体素子が血小板機能のモニタリング用のシステムに使用されることを表示する使用説明書
を備えた包装材料を具備する、血小板機能のモニタリングに使用するためのキット。 - 被験体から得られた生体サンプルのリアルタイムの血小板凝集を評価する方法であって、
血小板凝集域を定義する下流のせん断減速領域に連結した上流のせん断加速領域を生じさせ、その間にせん断ピーク速度領域を定義するように、前記生体サンプルを、前記サンプルの流れを摂動するチャネル特性を生じる速度で特性化チャネルに通し;
前記生体サンプルが前記チャネルを通過する結果としての、凝集域における血小板の凝集を検出する、
各工程を有してなる方法。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20160086924A (ko) * | 2013-11-19 | 2016-07-20 | 플라토드 | 혈소판 생산용 유체 장치 |
Families Citing this family (26)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2733361C (en) * | 2008-08-11 | 2017-08-29 | Fujimori Kogyo Co., Ltd. | Blood-platelet test method and blood-platelet test device |
WO2011099569A1 (ja) * | 2010-02-10 | 2011-08-18 | 藤森工業株式会社 | 血小板検査用マイクロチップ及びそれを用いた血小板検査装置 |
US9541480B2 (en) | 2011-06-29 | 2017-01-10 | Academia Sinica | Capture, purification, and release of biological substances using a surface coating |
US20130083311A1 (en) * | 2011-09-29 | 2013-04-04 | Melissa Li | Microfluidic system for optical measurement of platelet aggregation |
US9140684B2 (en) | 2011-10-27 | 2015-09-22 | University Of Washington Through Its Center For Commercialization | Device to expose cells to fluid shear forces and associated systems and methods |
US9494500B2 (en) | 2012-10-29 | 2016-11-15 | Academia Sinica | Collection and concentration system for biologic substance of interest and use thereof |
KR101481240B1 (ko) * | 2012-12-27 | 2015-01-19 | 고려대학교 산학협력단 | 마이크로 유동칩 기반 혈소판 기능 및 약물반응 검사 장치 및 방법 |
US10168341B2 (en) | 2013-03-08 | 2019-01-01 | Emory University | Devices for determining cell force properties and methods of manufacturing the devices |
US9138746B2 (en) * | 2013-05-01 | 2015-09-22 | Honeywell International Inc. | Fluid stop for measured sample containment |
US9452199B2 (en) * | 2014-01-17 | 2016-09-27 | General Electric Company | Platelet activation and growth factor release using electric pulses |
US20170000414A1 (en) * | 2014-02-04 | 2017-01-05 | Rheovector, Llc | Use of Blood Flow Parameters to Monitor or Control the Dosing of Anti-Platelet Agents |
EP2918263B1 (en) * | 2014-03-13 | 2017-05-03 | Sabanci Üniversitesi | Pharmaceutical drug delivery system |
EP3126814B1 (en) | 2014-04-01 | 2019-06-12 | Academia Sinica | Methods and systems for cancer diagnosis and prognosis |
KR102195769B1 (ko) | 2014-07-10 | 2020-12-30 | 주식회사 미코바이오메드 | 미세유체 칩, 이의 제조 방법 및 이를 이용한 분석 장치 |
US10112198B2 (en) | 2014-08-26 | 2018-10-30 | Academia Sinica | Collector architecture layout design |
US10413901B2 (en) | 2014-08-29 | 2019-09-17 | Arizona Board Of Regents On Behalf Of The University Of Arizona | Methods, devices, and systems for microfluidic stress emulation |
CN108602064B (zh) * | 2015-10-23 | 2021-06-29 | 国家科学研究中心 | 用于控制活体几何形状的微米流体装置 |
EP3384275A2 (en) | 2015-12-02 | 2018-10-10 | Maastricht University | Method for determining haemostasis under shear |
US20170191982A1 (en) * | 2016-01-06 | 2017-07-06 | Massachusetts Institute Of Technology | Constriction-Expansion Blood Plasma Separation |
US10107726B2 (en) | 2016-03-16 | 2018-10-23 | Cellmax, Ltd. | Collection of suspended cells using a transferable membrane |
CN106053392B (zh) * | 2016-05-19 | 2019-12-10 | 西北大学 | 基于微纳流控反射干涉光谱成像系统的装置及实现方法 |
GB201617869D0 (en) | 2016-10-21 | 2016-12-07 | Blacktrace Holdings Limited | A microfluidic device |
GB201701946D0 (en) * | 2017-02-06 | 2017-03-22 | Univ Leeds Innovations Ltd | Fluid flow device |
CN107213929B (zh) * | 2017-06-06 | 2020-02-14 | 国家纳米科学中心 | 一种基于界面效应的微纳颗粒分离系统 |
CN109622078B (zh) * | 2018-12-11 | 2020-09-22 | 西安交通大学 | 一种用于非牛顿流体中颗粒单一位置富集的微流控芯片 |
CN115166224B (zh) * | 2021-04-06 | 2024-01-02 | 清华大学 | 微流控芯片、血小板功能检测装置及方法 |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1312473C (zh) * | 1998-09-17 | 2007-04-25 | 阿德文生物科学公司 | 液相色谱系统 |
WO2003008931A2 (en) * | 2001-07-17 | 2003-01-30 | Georgi Hvichia | Microstructure for particle and cell separation, identification, sorting, and manipulation |
US20060113190A1 (en) * | 2002-12-27 | 2006-06-01 | Kurnik Ronald T | Microfluidic device and method for improved sample handling |
US20090181421A1 (en) * | 2005-07-29 | 2009-07-16 | Ravi Kapur | Diagnosis of fetal abnormalities using nucleated red blood cells |
US20070090026A1 (en) * | 2005-10-06 | 2007-04-26 | Jongyoon Han | Continuous biomolecule separation in a nanofilter |
CN101292161B (zh) * | 2005-10-18 | 2012-11-28 | 藤森工业株式会社 | 监测血栓形成的装置和监测血栓形成的方法 |
JP4915690B2 (ja) * | 2006-05-23 | 2012-04-11 | 国立大学法人電気通信大学 | マイクロ化学チップ装置 |
WO2008036083A1 (en) * | 2006-09-19 | 2008-03-27 | Vanderbilt University | Microfluidic flow cytometer and applications of same |
WO2008070324A2 (en) | 2006-10-25 | 2008-06-12 | Placor, Inc. | Methods and devices for monitoring platelet function |
-
2010
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20160086924A (ko) * | 2013-11-19 | 2016-07-20 | 플라토드 | 혈소판 생산용 유체 장치 |
JP2016538859A (ja) * | 2013-11-19 | 2016-12-15 | プラトードPlatod | 血小板産生流体装置 |
KR102331655B1 (ko) * | 2013-11-19 | 2021-11-30 | 플라토드 | 혈소판 생산용 유체 장치 |
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