CN103194370B - 制备与富集单个微纳米珠携带单根多聚物分子的装置 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种生物技术领域的制备与富集单个微纳米珠携带单根多聚物分子的装置，包括一内部有溶液通道的流室，流室溶液通道上游设有进样口和电泳缓冲液填充口；流室溶液通道下游设有单个微纳米珠携带单根多聚物分子的目的复合物收集口和空微纳米珠出口；所述目的复合物收集口和空微纳米珠出口分别连接收集容器，其中连接复合物收集口的目的复合物收集容器连接电源正极，与所述复合物收集容器相对的流室溶液通道另一处连接电源负极。本发明获得的目的复合物纯度高、数量多，可用于单分子水平的核酸-蛋白质相互作用动力学、免疫学观察、单分子测序以及新一代测序仪的样品制备等。

Description

制备与富集单个微纳米珠携带单根多聚物分子的装置

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域的多聚物制备与富集装置，具体是一种制备与富集单个微纳米珠携带单根多聚物分子的装置。

背景技术

经微纳米珠连接单根多聚物（DNA、RNA、蛋白质和肽核酸等）分子进行单分子操纵，可用于检测多种生命现象的单分子基本行为，包括核酸与核酸、核酸与相关蛋白相互作用动力学、抗体筛选、核酸单分子测序和新一代测序仪的样品制备等。比较常用的办法是采用光学镊和磁镊操纵连接单分子多聚物的微纳米珠，但如何快速和简便制备这种单个微纳米珠连接单根多聚物分子，一直没有很好解决。

经对现有文献检索发现，Dapprich,J.&Nicklaus,N.等在《生物成像》上发表了“通过监控珠子位移将DNA连接到被光学捕获在微结构的珠子上”一文（Dapprich,J.&Nicklaus,N.DNA attachment to optically trapped beads inmicrostructures monitored by bead displacement.Bioimaging6:25-32,1998），文中称他们的研究结果可获得一个磁珠只连接一根DNA片段，但该方法需要光学镊，步骤比较繁琐，效率也较低。因此，本发明要解决的技术问题是提供快速、简便制备并富集大量的“单个微纳米珠携带单根多聚物分子”（以下称“目的复合物”）的装置。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种快速、简便制备与富集单个微纳米珠携带单根多聚物分子的装置，用于在单分子水平研究核酸与相关蛋白分子相互作用动力学、遗传诊断、抗体筛选、核酸单分子测序和新一代测序仪的样品制备等。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明提供一种制备与富集单个微纳米珠连接单根多聚物分子的装置，该装置包括一内部有溶液通道的流室，所述流室溶液通道上游设有进样口和电泳缓冲液填充口；所述流室溶液通道下游设有目的复合物收集口和空微纳米珠出口；所述目的复合物收集口和空微纳米珠出口分别连接收集容器，其中连接复合物收集口的目的复合物收集容器连接电源正极，与所述目的复合物收集容器相对的流室溶液通道另一处连接电源负极。

本发明上述装置中，电泳缓冲液流的设置方式可以是侧流方式，也可以是鞘流方式，侧流方式（即填充流）在样品流一侧形成屏蔽液流，鞘流方式则在样品流的四周形成屏蔽液流，目的是确保从进样口进入的溶液经过溶液通道后完全从对应的空微纳米珠出口流出，并防止空微纳米珠因布朗运动和扩散而进入目的复合物收集口。填充电泳缓冲液设置为测流时，目的复合物收集口及空微纳米珠出口的位置分别对应于填充缓冲液进入流室溶液通道时的位置以及样品溶液进入流室溶液通道时的位置；设置为鞘流时，目的复合物出口与空微纳米珠出口分叉即可，不受上游样品和填充电泳缓冲液入口的位置影响。填充电泳缓冲液可部分进入目的复合物收集容器，目的复合物收集容器也可以事先加满电泳缓冲液，流室通道的溶液不进入容器，只允许电拉动的目的复合物进入。

本发明上述装置中，所述进样口和电泳缓冲液填充口设有进样控制器，如注射泵、蠕动泵或鞘流泵，用于控制进样速度。

本发明用于制备与富集单个微纳米珠携带单根多聚物分子时，多聚物一端用活性基团标记，另一端或测链用荧光分子标记，微纳米珠用能够与多聚物携带的活性基团发生连接反应的活性基团包被；包被微纳米珠的活性基团可以是中性、酸性或碱性，包被中性基团时，直接按下述步骤分离与富集目的复合物，包被酸性或碱性基团时，连接反应的产物用能与所述的的包被活性基团中和的试剂钝化微纳米珠表面，纯化并悬浮于电泳缓冲液。将所得的连接单根多聚物分子的单个微纳米珠（目的复合物）和空微纳米珠的混合物，通过进样口注入流室，同时将电泳缓冲液通过电泳缓冲液填充口注入流室，流室溶液通道下游分叉后分别经目的复合物收集口和空微纳米珠出口连接目的复合物收集容器和空微纳米珠收集容器。样品在通过流室溶液通道时，目的复合物因携带负电荷，在电场作用下被拉向与其电性质相反的收集容器，实现分离和收集目的复合物，空微纳米珠进入空微纳米珠出口。目的复合物收集口与空微纳米珠出口的分叉处，安装高灵敏成像系统装备的光学显微镜，待进样控制器启动时，从小向大调节连接流室正负电极间的电压，使目的复合物进入收集口，观察并记载目的复合物进入收集口的过程。

本发明是根据核酸在中性溶液携带负电荷、微纳米珠本身不携带电荷，用核酸电泳和流体力学原理分离目的复合物的装置。在外加电场下，使目的复合物离开溶液通道中的样品溶液流，进入目的复合物收集口。流室通道的溶液可以进入目的复合物收集容器，也可以不进入目的复合物收集容器。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效益：得到的目的复合物纯度高、数量多，在单分子DNA与相关蛋白分析中，在光学显微镜或荧光显微镜辅助下，直接拾取目的复合物，准确、便捷，不再需要复杂而缓慢的光学镊、磁镊或原子力显微镜操作步骤；目的复合物经修饰可用于研究DNA与相关蛋白相互作用动力学、结合高灵敏纳米孔传感器测序DNA、检测免疫反应以及新一代DNA测序仪的样品制备等。

附图说明

图1为流室通道溶液可以进入目的复合物收集容器的装置，其中电泳缓冲液流采用侧流方式，目的复合物收集容器连接电源正极，溶液通道相对一侧连接电源负极；

图2为流室通道溶液可以进入目的复合物收集容器的装置，其中电泳缓冲液流采用侧流方式，目的复合物收集容器连接电源正极，进样口连接电源负极；

图3为流室通道溶液不能进入目的复合物收集容器的装置，其中电泳缓冲液流采用侧流方式，目的复合物收集容器连接电源正极，溶液通道相对一侧连接电源负极；

图4为流室通道溶液不能进入目的复合物收集容器的装置，其中电泳缓冲液流采用侧流方式，目的复合物收集容器连接电源正极，进样口连接电源负极；

图5为电泳缓冲液流采用鞘流方式的实施示意图。

具体实施方式

以下实例将结合附图对本发明作进一步说明。本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

如图1-2所示，为本发明一实施例涉及的制备与富集单个微纳米珠连接带荧光标记的单根多聚物分子的装置，该装置包括一内部有溶液通道的流室1，所述流室溶液通道上游设有进样口2和电泳缓冲液填充口3；所述流室1溶液通道下游设有目的复合物收集口4和空微纳米珠出口5，两者的位置分别对应于流室溶液通道上游的电泳缓冲液填充口3添加的电泳缓冲液和进样口2添加的样品溶液进入流室溶液通道时的位置；连接复合物收集口4的目的复合物收集容器安装电源正极，与目的复合物收集容器相对的流室溶液通道另一处（如图1或其他位置如图2）安装电源负极。

该装置中，电泳缓冲液流采用侧流方式，从进样口2进入的溶液完全从对应的空纳米珠出口5流出，目的复合物从复合物收集口4进入收集容器。目的复合物收集口4与空纳米珠出口5分叉处，安装用于控制正极和负极间的电压的高灵敏成像系统装备的光学显微镜，待进样控制器启动时，利用外加电场使目的复合物进入收集口，观察并记载目的复合物进入收集口的过程。

如图3-4所示，为本发明另一实施例涉及的装置，该装置中连接复合物收集口4的目的复合物收集容器安装电源正极，与目的复合物收集容器相对的流室溶液通道另一处（如图3或者其他位置如图4）安装电源负极。该装置中，电泳缓冲液流采用侧流方式，位于收集口的容器中事先加满电泳缓冲液，流室1通道的溶液不进入目的复合物收集口容器，只允许电拉动的目的复合物进入。其他特征与图1、2所示结构的装置相同。

上述装置用于制备与富集单个微纳米珠携带单根多聚物分子时，将连接单根带荧光标记的多聚物分子的微纳米珠（目的复合物）和空微纳米珠的混合物，通过进样口注入流室，同时将电泳缓冲液通过电泳缓冲液填充口注入流室，流室溶液通道下游分叉后分别经目的复合物收集口和空微纳米珠出口连接目的复合物收集容器和空微纳米珠收集容器。样品在通过流室溶液通道时，目的复合物因携带负电荷，在电场作用下被拉向与其电性质相反的收集容器，实现分离和收集目的复合物，空微纳米珠进入空微纳米珠出口。目的复合物收集口与空微纳米珠出口的分叉处，安装高灵敏成像系统装备的光学显微镜，待进样控制器启动时，利用外加电场使目的复合物进入收集口，观察并记载目的复合物进入收集口的过程。

如图5所示，为本发明另一实施例示意图，电泳缓冲液流采用鞘流方式，进样口2和电泳缓冲液填充口3分别设有注射泵和鞘流泵控制进样速度；其他结构和操作与实施例1相同。

上述实施例中，所述的多聚物分子，是核酸、核酸与蛋白质以及核酸与人工合成的肽核酸多聚物连接后的嵌合体。先将多聚物分子一端用活性基团标记，另一端或侧链用荧光分子标记，微纳米珠包被可与多聚物活性基团连接的活性基团，多聚物分子数与微纳米珠数以1：大于或等于10的比例混合，通过连接反应将多聚物分子连接到微纳米珠上；然后利用上述的流室装置，将混合物和填充电泳缓冲液分别加入连接进样口和电泳缓冲液填充口的进样控制器，打开进样控制器，在光学系统（高灵敏成像系统装备的光学显微镜）辅助下，利用外加电场使目的复合物进入目的复合物收集口，并记载分离过程。本发明可获得纯度90%以上的目的复合物。

对于在中性溶液中携带负电荷的核酸分子，可直接按上述操作实施，对蛋白质和肽核酸等多聚物分子，则事先连接一段核酸作为电分离的介体，形成多聚物嵌合体，然后再按照上述的操作实施。

上述实施例中，所述的荧光标记是用于观察目的复合物的一类荧光分子标记。

本发明实施例中，所述的电泳缓冲液，是用于将溶液的pH值维持在近中性范围以分离目的复合物的溶液，可以是Good缓冲液，如25mM Hepes（pH7.5），1M KCl，或其他电泳缓冲液，如Tris-TAE、Tris-TPE、Tris-TBE或碱性缓冲液等。填充电泳缓冲液，起到屏蔽微纳米珠因布朗运动和扩散而进入目的复合物收集口的作用。所述电泳缓冲液流的设置方式可以是侧流方式，也可以是鞘流方式。

本发明实施例中，所述的微纳米珠，是单分子多聚物运载工具，其材质可以是硅、磁性材料或多聚物等，其直径在纳米至微米量级。

本发明实施例中，所述的活性基团是可用于实现连接多聚物与微纳米珠的活性基团对，凡是能够实现该目的的活性基团对均可，包括但不限于生物素-抗生物素蛋白、地高辛-抗地高辛抗体、氨基-环氧基、氨基-羧基（包括羧基的活化形式如琥珀酰亚胺碳酸酯等）、氨基-羰基、巯基-马来酰亚胺、巯基-环氧基、巯基-巯基、巯基-羰基、羧基-酰肼基、羰基-酰肼基等，其中一种标记多聚物，另一种包被微纳米珠，有些情况下二者可以成对互换。包被微纳米珠表面的活性基团，可以是中性、酸性或碱性，在后两种情况下，完成连接后，用能与之中和的试剂钝化微纳米珠表面，使之不携带电荷，然后再进行分离与富集。

本发明实施例中，与目的复合物收集容器对应的流室溶液通道另一处的电源负极，可以设置在图1所示处，也可以设置在其他位置（如图2），凡是可以实现本发明效果的任何一处均可。

本发明实施例中，在各种条件（包括温度、装置内各通道的尺寸、形状、电泳缓冲液组分、混合物样品和填充电泳缓冲液进样速度以及电极间距）确定后，经计算或显微镜观察下自小到大调节电压，可以得出将目的复合物牵引至目的复合物收集容器所需的最小电压阈值V_min，只要外加电压V≥V_min，后续就可不再借助光学手段（即用荧光分子标记核酸及使用显微镜）而进行直接分离。

应当理解的是，本发明实施例中的装置形状也并不局限于附图中所示的形状，还可以是其他形状，只要能够达到本发明上述分离的目的即可。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到，上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (7)

1.一种制备与富集单个微纳米珠携带单根多聚物分子的装置，其特征在于，该装置包括一内部有溶液通道的流室，所述流室溶液通道上游设有进样口和电泳缓冲液填充口；所述流室溶液通道下游设有单个微纳米珠携带单根多聚物分子的目的复合物收集口和空微纳米珠出口；所述目的复合物收集口和空微纳米珠出口分别连接收集容器，其中连接目的复合物收集口的目的复合物收集容器连接电源正极，与所述复合物收集容器相对的流室溶液通道另一处连接电源负极；

所述的多聚物分子，是核酸、核酸与蛋白质以及核酸与人工合成的肽核酸多聚物连接后的嵌合体中的一种；所述的多聚物分子，一端用活性基团标记，另一端或侧链用荧光分子标记；

所述的微纳米珠，表面包被能够与多聚物携带的活性基团发生连接反应的活性基团；包被微纳米珠表面的活性基团是中性、酸性或碱性，在后两种情况下，完成连接的产物在分离与富集目的复合物之前，用能与之中和的试剂钝化微纳米珠表面，使之不携带电荷，纯化并悬浮于电泳缓冲液；

所述多聚物分子数与微纳米珠数以1：大于或等于10的比例混合，通过连接反应将多聚物分子连接到微纳米珠上；

将连接单根带荧光标记的多聚物分子的微纳米珠和空微纳米珠的混合物，通过进样口注入流室，同时将电泳缓冲液通过电泳缓冲液填充口注入流室，流室溶液通道下游分叉后分别经目的复合物收集口和空微纳米珠出口连接目的复合物收集容器和空微纳米珠收集容器。

2.根据权利要求1所述的制备与富集单个微纳米珠携带单根多聚物分子的装置，其特征是，所述进样口和电泳缓冲液填充口设有用于控制进样速度的进样控制器，所述电泳缓冲液流的设置方式为侧流或鞘流方式；设置为测流时，目的复合物收集口及空微纳米珠出口分别对应于流室溶液通道上游的填充电泳缓冲液和样品溶液进入流室溶液通道时的位置，设置为鞘流时，目的复合物收集口与空微纳米珠出口分叉设置。

3.根据权利要求1所述的制备与富集单个微纳米珠携带单根多聚物分子的装置，其特征是，所述目的复合物收集口与空微纳米珠出口的分叉处，安装用于帮助控制正极和负极间的电压的高灵敏成像系统装备的光学显微镜。

4.根据权利要求1或3所述的制备与富集单个微纳米珠携带单根多聚物分子的装置，其特征是，所述的微纳米珠是单分子多聚物运载工具，其材质是硅、磁性材料或多聚物，其直径在纳米至微米量级。

5.根据权利要求1所述的制备与富集单个微纳米珠携带单根多聚物分子的装置，其特征是，所述流室溶液通道的溶液进入或者不进入目的复合物收集容器，当不进入目的复合物收集容器时，所述目的复合物收集容器中事先充满电泳缓冲液。

6.根据权利要求1所述的制备与富集单个微纳米珠携带单根多聚物分子的装置，其特征是，所述正极和负极间的外加电压提供电力驱动，使目的复合物离开溶液通道中的样品溶液流，进入目的复合物收集口，空微纳米珠在填充缓冲液屏蔽下，全部进入空微纳米珠出口。

7.根据权利要求1或6所述的制备与富集单个微纳米珠携带单根多聚物分子的装置，其特征是，所述的正极和负极间的外加电压，在各种条件确定后，将目的复合物牵引至目的复合物收集容器所需的最小电压阈值V_min，通过计算得到，或通过显微镜观察得到，在外加电压V≥V_min条件下，分离和富集目的复合物。