JP5268989B2 - 核酸分析反応セルおよび核酸分析装置 - Google Patents
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Description
本発明は、核酸断片の配列情報を決定するときに用いる、核酸分析反応セルおよび核酸分析装置に関する。
ＤＮＡやＲＮＡの塩基配列を決定する新しい技術が開発されてきている。
現在、通常用いられている電気泳動を利用した方法においては、予め配列決定用のＤＮＡ断片又はＲＮＡ試料から逆転写反応を行い合成したｃＤＮＡ断片試料を調製し、周知のサンガー法によるジデオキシ反応を実行した後、電気泳動を行い、分子量分離展開パターンを計測して解析する。
これに対し、近年、基板に試料となるＤＮＡ断片を数多く固定して、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法が提案されている。
非特許文献１では、ＤＮＡ断片を担持する媒体として微粒子を用い、微粒子上でＰＣＲを行う。その後、微粒子のサイズに穴径を合わせた数多くの穴を設けたプレートに、ＰＣＲ増幅されたＤＮＡ断片を担持した微粒子を入れてパイロシーケンス方式で読み出している。
また、非特許文献２では、ＤＮＡ断片を担持する媒体として微粒子を用い、微粒子上でＰＣＲを行う。その後、微粒子をガラス基板上にばら撒いて固定し、ガラス基板上で酵素反応（ライゲーション）を行い、蛍光色素付き基質を取り込ませて蛍光検出を行うことにより各断片の配列情報を得ている。
さらに、非特許文献３では、平滑基板上に、同一配列を有する多数のＤＮＡプローブを固定しておく。また、ＤＮＡ試料を切断後、ＤＮＡプローブ配列と相補鎖のアダプター配列を各ＤＮＡ試料断片の端に付加させる。これらを基板上でハイブリダイゼーションさせることにより、基板上にランダムに一分子ずつ試料ＤＮＡ断片を固定化させている。この場合、基板上でＤＮＡ伸長反応を行い、蛍光色素付き基質を取り込ませた後、未反応基質の洗浄，蛍光検出を行い、試料ＤＮＡの配列情報を得ている。
以上のように、平滑基板上に、核酸断片試料を数多く固定することにより、パラレルに数多くの断片の配列情報を決定する方法が開発され、実用化されつつある。
これらのシステムに用いられる核酸分析反応セルとしては、試料ＤＮＡまたは試料ＤＮＡを担持させた微粒子を固着させる検出領域は、より広い方が望ましい。また、シーケンス反応に必要な試料ＤＮＡ量と反応試薬量を低減するために、フローセル内の容量は、より少ない方が望ましい。さらに、検出領域外のデッドボリュームを低減するためには、試薬の流入口を狭める必要がある。
また、これらの方法に伴う化学的反応は、一般的に異なる試薬を用いた数多くのステップから成り立っており、ステップ毎に異なる試薬を含む溶液を供給する必要がある。前ステップで用いた試薬は、次ステップでの反応阻害要因や誤検出の原因となることも多く、ステップ間に洗浄工程を行い、前ステップで用いた試薬を完全に除去する必要がある。
特許文献１には、生化学反応カセットの幅が広くなった部分に断面積を減少させる、柱状部材を開示している。
Nature 2005, Vol. 437, pp. 376-380
Science 2005, Vol. 309, pp.1728-1732
Science 2008, Vol. 320, pp. 106-109
P.N.A.S. 2006, vol. 103, pp 19635-19640
しかしながら、特許文献１では、柱状部材に溶液が到達する前に、中央部は流速が早く、端部は流速が遅くなる。それゆえ、均一な流速を実現するのが難しいという問題がある。流速が遅い部分が存在すると、試薬除去のための洗浄時間が長くなってしまう。
本発明は、上記問題点を解決するものであり、その目的は、均一な流速を実現することにより、流速が遅い箇所を無くし、試薬除去のための洗浄時間の短縮を図る、核酸分析反応セル、及び核酸分析装置を提供することを目的とする。
本発明の核酸分析反応セルは、少なくとも流入口側の、端に近づくにつれて幅が狭くなる領域（検出外領域）に、分岐部材を備えている。
分岐部材を用いて均一な流速を実現することにより、流速が遅い箇所を無くし、試薬除去のための洗浄時間の短縮を図る、核酸分析反応セル、及び核酸分析装置を提供することができる。
本発明の実施例について、図１を使って説明する。本発明の核酸分析反応セルは、無機もしくは有機の平滑板１０１が、無機もしくは有機の平滑板１０２と張り合わされて形成されている。平滑板１０２には、図１に示すように溝が設けられているため、平滑板１０１と平滑板１０２を張り合わせることにより、両板の間には流路１０３が形成される。
図１では、平滑板１０１と平滑板１０２を互いに分離した状態の斜視図を示している。平滑板１０１，１０２は、それぞれ平面形状が長方形である。平滑板１０２には、長手方向に沿って、深さが均一な溝が設けられており、この溝が流路１０３を形成する。この溝は、長手方向の両端の形状は、端に近づくにつれて幅が狭くなる、テーパ形状である。
平滑板１０２の流路１０３部分には、無機もしくは有機のガイド（分岐部材）１０４が立っており、平滑板１０１、および平滑板１０２に接合されている。つまり、このガイド１０４は、平滑板１０１と平滑板１０２を張り合わせた際に、平滑板１０１に達する高さであることが好ましい。ガイド１０４は、流路１０３の長手方向に沿って延びている。また、ガイド１０４は、流路１０３の長手方向と垂直方向にほぼ等間隔に複数設けられている。
流路１０３には流入口１０５と排出口（流出口）１０６が面しており、各種の試料，試薬はここから注入，排出される。
平滑板１０１および平滑板１０２のいずれか一方は、光学検出，解析を行うため、透明であることが必須となる。例えば、下記の検証実験においては平滑板１０１にはガラスを使用し、平滑板１０２にはシリコンウェハにプラズマエッチングを行い、流路１０３とガイド１０４を形成したものを使用するが、その他、例えば他にポリエチレン（ＰＥ），ポリプロピレン（ＰＰ），ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ），アクリル樹脂（ＰＭＭＡ），ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などの熱可塑性樹脂，エポキシ樹脂（ＥＰ），不飽和ポリエステル樹脂（ＵＰ）などの熱硬化性樹脂などが考えられる。
平滑板１０１、および平滑板１０２の張り合わせ方法に関しては、陽極接合の他にも例えば溶着，接着が考えられる。溶着には熱溶着，振動溶着，超音波溶着，レーザー溶着などが例として挙げられる。また、接着にはイオン結合，共有結合，水素結合を用いる化学接着，ファンデルワールス力を用いる分散接着，静電力を用いる静電接着，溶解，焼結などに代表される拡散接着などが例として挙げられる。
流路１０３は長手方向と垂直方向に幅が均一な検出領域１０８と、長手方向の端に近づくにつれて幅が狭くなったテーパ形状の検出外領域１０７に分けることができる。検出領域１０８の一面には測定対象のＤＮＡ、または測定対象のＤＮＡを固定化するための固定層が設けられているが、検出外領域１０７においては、目的とする機能が得られる範囲で、その限りではない。
図２から図５に本発明のガイド１０４の形状を具体的に示すが、本発明は勿論これらの形状に限定されるものではない。
図２は本発明のガイド１０４の形態における好ましい実施例のひとつである。図２はガイド１０４間の距離をより均一に保ち、各流路内における流速を一様となるようにガイドを製作した形態の一つである。流入口１０５から流路１０３内に流れ込む流体をガイド１０４によって分流している。ここで重要な点は、検出外領域にガイド１０４を設けている点である。図３は、図２の変形例であり、流路の外周に沿ってガイド１０４を設けた例である。つまり、テーパ形状の流路と同じ形状になるように検出外領域のガイド１０４を形成している。図２，図３に代表される形状においては、検出領域１０８および検出外領域１０７にガイド１０４を製作しており、これにより、流速を均一にすることができると共に、次に説明する図４，図５の形態に比べ、核酸分析反応セルのたわみを低減する効果が高い。
図４は検出外領域にのみガイド１０４を製作し、検出領域内には製作しない本発明の別の実施形態のひとつである。検出領域にガイド１０４がある場合には、ガイド１０４分だけ検出領域が狭まることとなるため、図４に示すようにガイド１０４を検出外領域にのみに配置することで、解析のスループットを挙げることができる。
図５は、検出領域外から、検出領域内の一部の領域までガイド１０４を作成する例である。この例によれば、核酸分析基板のたわみを図４の構成よりも低減することができ、検出領域を図２，図３の構成よりも大きくすることができる。
なお、図１〜図５に示す核酸分析反応セルでは、平滑板１０１にガラスと、平滑板１０２にシリコンを使用し、陽極接合にて接合した例である。
図１〜図５に示すような核酸分析反応セルを用いることにより、流路内の流速を端部と中央部で均一にすることができる。つまり、流速が遅い部分を無くすことができ、試薬除去のための洗浄時間の短縮を図ることができる。特に、テーパ形状部分において流速の均一化を図る必要があり、本実施例では検出外領域にガイドを設けている。さらに換言すれば、検出領域のみにガイドを設けた場合には、既に検出外領域で不均一となった流速がそのまま分岐されるだけであり、流速を一定にするという本願の課題を達成することができない。
本実施例によれば、検出領域外において流速が均一になるので、流速が遅い箇所を無くすことができ、試薬除去のための洗浄時間を短縮することができる。さらに、気泡除去のための必要サンプル量と試薬量を低減でき、かつ流体チャネルの上面と下面のたわみを低減し得る構造を見出し、本発明を完成させた。
本発明の核酸分析反応セルは、１つ、または複数の流体チャネルを形成するためのフローセルを有する固体基材，フローセルに液体を供給するため液体供給ユニット，照射光源，検出ユニットからなり、前記流体チャネル内に液体を分岐するためのガイドを有していると言い換えることもできる。これにより、流体チャネルに流体を注ぐ流入口からの流体の流れを制御し、流体チャネル外周部の流速を高めることができる。このため、試薬除去のための洗浄時間を短縮し、さらに気泡除去のための必要サンプル量と試薬量，気泡除去時間をも低減することができる。
また、フローセルを構成する固体基材の少なくとも一面が透明であって、流体チャネルに接触する固体基材の一面にのみ測定対象のＤＮＡ、または測定対象のＤＮＡを固定化するための固定層がある。これにより、測定対象のＤＮＡを流体チャネル内の一面にのみ固定化することができる。このため、解析に必要な試薬およびＤＮＡ量を低減することができる。
また、前記ガイドが、流体チャネルの上面、ならびに下面に接合している。これにより、流体チャネル上面と下面のたわみを低減できる。このため、上面と下面の接触を抑制し、またたわみによる流体チャネル内部容量の変化，焦点ずれによる検出率の低下，温度調節ユニットへの接触不良による温度調節率の低下などを低減することができる。
さらに、一般的にフローセルは、検出領域はより広く、反応試薬量はより少なくする事が望ましいため、流路幅は広く、流路の高さは狭まっていく方向にある。結果として流路高さと流路幅の比は大きくなっていくこととなり、これにより流路の材質によっては流体チャネルの上面や下面がたわみ、これらが接触してしまう構造上の問題がある。特開２００７−４０９６９号公報では流路内上下面のたわみに関しては構造上解決できず、接触に関しては問題を加速してしまうという課題がある。
また、流路の材質によっては、流体が流体チャネルに流れたとき、流体チャネル上面や下面を内部より押し上げてしまうことで、流体チャネルの上下面がたわみ、流体チャネル内部の容量が変化する、検出ユニットの焦点が定まらず検出率が低下する、温度調節ユニットにフローセルが密着できず温度調節率が低下する、などの構造上の問題点がある。
本実施例によれば、試薬除去のための洗浄時間を低減するとともに、気泡除去のために必要なサンプル量や試薬量を低減することで解析のスループットを高め、さらには流体チャネルの上下面の接触や、検出率，温度制御率の低下などを低減することができる。
核酸分析フローセルの好ましい構成の一例について図６を参照しながら説明する。温調ユニット７０５の上に、流路１０３が複数搭載された反応チャンバ７０４が置かれている。流路１０３の配置の間隔は、解析しようとする核酸試料，蛍光検出装置の仕様によって適切に設定できる。図６に示すように、反応チャンバ７０４を温調ユニット７０５の上に設置し、クランプ７０３で固定して、送液できる条件下で使用する。
これらを具体的に述べると、核酸試料，反応酵素，バッファー，ヌクレオチド基質等を保存・温度管理する温調ユニット７０５，反応液を送り出す分注ユニット７０６，液の流れを流路１０３毎に制御するバルブ７０７，廃液タンク７０８から構成される。バルブ７０７は、流路１０３毎に、かつ、流路の上流側と下流側に設けられている。必要に応じ、温調機を配置し、温度制御を行う。反応終了時には、洗浄液が流路１０３を通じて供給され、廃液タンク７０８に収納される。分注ユニット７０６と流路１０３の間には注入ノズル７０１が、流路１０３と廃液タンク７０８の間には廃液ホース７０２が繋がれている。
核酸分析装置の好ましい構成について図７を用いて説明する。本実施例では、核酸分析反応セルに対して、ヌクレオチド，蛍光色素を有するヌクレオチド，核酸合成酵素，プライマー及び核酸試料からなる１種類以上の生体分子を供給する手段と、前記核酸分析反応セルに光を照射する手段と、前記核酸分析反応セル上において前記ヌクレオチド、前記核酸合成酵素、及び前記核酸試料が共存することにより起きる核酸伸長反応により核酸鎖中に取り込まれた蛍光色素の蛍光を測定する蛍光検出手段とを備える。より具体的には、Ｘｅランプモジュール８０１から発せられたレーザー光８０２は、コールドミラー８０３とコンデンサーレンズ８０４，励起フィルタ８０５を通過し、ダイクロイックミラー８０６にて反射される。反射した後、ステージ８０７の上に位置する核酸反応デバイス８０８中の流路にあたり、蛍光物質を発光させる。発行した光は対物レンズ８０９を通し、発光フィルタ８１０，鏡筒レンズ８１１を通過し、ＣＣＤカメラ８１２へと収まる。
逐次反応方式の場合には、蛍光色素付きヌクレオチドとして、非特許文献４に開示されているような、リボースの３′ＯＨの位置に３′−Ｏ−アリル基を保護基として入れ、また、ピリミジンの５位の位置にあるいはプリンの７位の位置にアリル基を介して蛍光色素と結びつけたものが使用できる。アリル基は光照射あるいはパラジウムと接触することで切断されるため、色素の消光と伸長反応の制御を同時に達成することができる。逐次反応でも、未反応のヌクレオチドを洗浄で除去する必要はない。
本発明は上述の実施例に限定されるものではなく、特許請求の範囲に記載された発明の範囲にて様々な変更が可能であることは当業者に容易に理解されよう。
１０１，１０２ 平滑板
１０３ 流路
１０４ ガイド
１０５ 流入口
１０６ 排出口
７０１ 注入ノズル
７０２ 廃液ホース
７０３ クランプ
７０４ 反応チャンバ
７０５ 温調ユニット
７０６ 分注ユニット
７０７ バルブ
７０８ 廃液タンク
８０１ Ｘｅランプモジュール
８０２ レーザー光
８０３ コールドミラー
８０４ コンデンサーレンズ
８０５ 励起フィルタ
８０６ ダイクロイックミラー
８０７ ステージ
８０８ 核酸反応デバイス
８０９ 対物レンズ
８１０ 発光フィルタ
８１１ 鏡筒レンズ
８１２ ＣＣＤカメラ
１０３ 流路
１０４ ガイド
１０５ 流入口
１０６ 排出口
７０１ 注入ノズル
７０２ 廃液ホース
７０３ クランプ
７０４ 反応チャンバ
７０５ 温調ユニット
７０６ 分注ユニット
７０７ バルブ
７０８ 廃液タンク
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８０２ レーザー光
８０３ コールドミラー
８０４ コンデンサーレンズ
８０５ 励起フィルタ
８０６ ダイクロイックミラー
８０７ ステージ
８０８ 核酸反応デバイス
８０９ 対物レンズ
８１０ 発光フィルタ
８１１ 鏡筒レンズ
８１２ ＣＣＤカメラ
Claims (5)
- 核酸断片の配列情報を検出する検出領域、及び検出領域の両端に配置された検出外領域を備えた流路を有する核酸分析反応セルであって、
前記流路には、測定対象の核酸を固定するための固定層を、前記検出領域および前記検出外領域の双方に有し、
一方の検出外領域には流入口が設けられ、他方の検出外領域には流出口が設けられ、
前記検出領域は、液体が流れる方向と垂直方向の幅が均一な領域であり、
前記検出領域の両端に配置された検出外領域は、端に近づくにつれて幅が狭くなる領域であり、
流入口が設けられた検出外領域のみに液体を分岐するための分岐部材を設け、前記検出領域及び流出口が設けられた検出外領域には液体を分岐するための分岐部材を設けず、かつ、前記分岐部材は液体が流れる方向と垂直方向にほぼ等間隔に複数設けられていることを特徴とする核酸分析反応セル。 - 請求項１において、
前記各分岐部材は、流路の上面から下面まで配設されていることを特徴とする核酸分析反応セル。 - 請求項１において、
前記各分岐部材は、流路の上面及び下面に接合していることを特徴とする核酸分析反応セル。 - 請求項１において、
基板を貼り合わせて形成されていることを特徴とする核酸分析反応セル。 - 核酸断片の配列情報を検出する検出領域、及び検出領域の両端に配置された検出外領域を備えた流路を有する核酸分析反応セルと、
液体を供給するため液体供給ユニットと、
照射光源と、
検出ユニットを備えた核酸分析装置であって、
前記流路には、測定対象の核酸を固定するための固定層を、前記検出領域および前記検出外領域の双方に有し、
一方の検出外領域には流入口が設けられ、他方の検出外領域には流出口が設けられ、
前記検出領域は、液体が流れる方向と垂直方向の幅が均一な領域であり、
前記検出領域の両端に配置された検出外領域は、端に近づくにつれて幅が狭くなる領域であり、
流入口が設けられた検出外領域のみに液体を分岐するための分岐部材を設け、前記検出領域及び流出口が設けられた検出外領域には液体を分岐するための分岐部材を設けず、かつ、前記分岐部材は液体が流れる方向と垂直方向にほぼ等間隔に複数設けられていることを特徴とする核酸分析装置。
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