JP5248394B2 - 被検体物質の固定化方法およびマイクロ分析装置 - Google Patents

Description

本発明は、被検体物質の固定化方法およびマイクロ分析装置に関するものである。特に、検出物質に含まれている特定の物質であるアレルゲン、アディポネクチン、サイトカイン、免疫抗体などの検体を検出するため、該検体と結合可能な被検体物質を固定化する被検体物質の固定化方法、および該固定化方法を用いたマイクロ分析装置に関するものである。

抗原抗体反応を用いた免疫分析法は、医療や生化学分野、アレルゲン等の測定分野などにおける分析・計測方法として有用である。しかし、従来の免疫分析法は、分析に長時間を要すると共に操作が煩雑であるという等の問題を有している。

そのような状況の中、近年、半導体の微細加工技術などを応用したマイクロ化技術（Ｍｉｃｒｏ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍ、ＭＥＭＳ）が開発され、タンパク質、遺伝子などの生化学分野における分析においては、抗原抗体反応を用いるマイクロ化技術（Ｍｉｃｒｏ Ｔｏｔａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍ、μ−ＴＡＳ）が急速に発展している。

例えば特許文献１には、基板にマイクロオーダーのチャネル（以下、「マイクロチャネル」ともいう）を形成し、このマイクロチャネルに抗体等を固定化することにより、抗原などの検体を分析する分析時間の短縮化や分析操作の簡略化を図るマイクロチャネルデバイス技術が提案されている。

具体的に、特許文献１には、マイクロチャネル内に、リガンド固定部、およびそのリガンド固定部に固定された抗体または人工抗体などのリガンドを備えるマイクロチャネルデバイスに関する技術が開示されている。

図１３は、特許文献１に開示されたマイクロチャネルデバイスの構造を示す。図１３に示すように、このマイクロチャネルデバイスは、ガラスまたはプラスチックなどの透光性を有する材料からなる基板２００の表面に、マイクロチャネル１０１、注入孔１０２、液溜め部１０３および排出孔１０４が形成されている。さらに、マイクロチャネル１０１には、リガンド固定部１０５が形成されている。リガンド固定部１０５には、検体と特異的に反応するリガンドが、物理吸着や、リガンドが有するアミノ基との共有結合を用いた固定などの周知の固定方法で固定化されている。ここで、リガンドとは、検体とする物質に対して特異的に親和性を持つ化学物質を意味し、被検体物質とも称する。

図１４は、図１３に示すマイクロチャネルデバイスを使用した検体の検出方法を説明するための図面である。図１４に示すように、まず、検体１２０を含む液体と、標識抗体１２３を含む液体とを混合して反応させる。ここで、標識抗体１２３は、光学的に検出可能な標識物質１２１と、検体１２０に結合可能な抗体１２２とが結合して形成されるものである。この標識抗体１２３と検体１２０とが反応して、免疫複合体１２４（標識抗体と検体との反応結合物）が形成される。

次いで、上記免疫複合体１２４を含む混合液を、図１３に示す注入孔１０２から外部ポンプを用いて注入し、マイクロチャネルに流通させて、図１４に示すように、免疫複合体１２４とリガンド固定部１０５に固定された抗体１２５とを反応させる。これにより、リガンド固定部１０５に、抗体１２５−検体１２０−標識抗体１２３からなる複合体１２６が形成される。

この後、リガンド固定部１０５に結合した免疫複合体１２４の標識物質１２１を、標識物質の種類に応じて、紫外可視分光分析、蛍光分析、化学発光分析または熱レンズ分析などの所定の分析機器を用いて、標識物質の光吸収、蛍光または発光等を検出する。これにより、検出物質中の検体１２０の量などを測定することができる。

上述した特許文献１の技術によると、反応場（リガンド固定部）を小さくすることができ、かつ反応表面積を大きくすることができるので、装置の小型化、チップ構造の簡便化とともに、反応に要する時間を大幅に短縮することができる。

しかし、特許文献１では、１つのマイクロチャネル内で１つの検体を検出しているが、１つのマイクロチャネル内で複数の検体を検出したい場合、１つのマイクロチャネル内に複数のリガンドを固定化する必要がある。

ここで、マイクロスポッターを用いれば、１つのチャネル内に複数のリガンドを固定化することが可能であるが、この場合、リガンドの固定化を、マイクロチップを貼り合わせる前に行うことになる。しかし、マイクロチップを貼り合わせる前に固定化を行うと、貼り合わせるときの熱圧着や有機溶剤による接着などが、固定化後のリガンドにとって悪条件になってしまうため、リガンドの固定化が難しくなり、正確な測定を行うことができなくなってしまう。そのため、リガンドの固定化は、分析装置などの貼り合わせ工程の後に行う必要がある。

特許文献２ないし５には、リガンドの固定化後に上記のような貼り合わせ工程を施す必要がなく、マイクロチャネル内の任意の部位のみにリガンドを固定化することができる技術が開示されている。具体的には、これらの特許文献に開示されている分析装置または方法を用いれば、複数のリガンドを１つずつチャネル内に導入して固定化を繰り返すことで、複数のリガンドを１つのチャネル内に固定化することができるとも考えられる。

国際公開第２００６／０５４６８９号パンフレット（２００６年５月２６日公開） 特開２００３−３２９６８２号公報（平成１５年１１月１９日公開） 国際公開第２００４／０８８３１９号パンフレット（２００４年１０月１４日公開） 特開２００４−３０１５１５号公報（平成１６年１０月２８日公開） 特開２００７−３０９７２５号公報（平成１９年１１月２９日公開）

しかしながら、特許文献２ないし５の技術により、複数のリガンドを１つのチャネル内に固定化する場合、以下のような問題が生じる。

一番目の問題として、リガンドの非特異吸着による問題が挙げられる。具体的には、リガンドを１つずつ固定化する際、チャネル内にリガンドを導入し規定の位置のみにそれぞれの方法を用いて固定化を行う必要がある。しかしながら、リガンドはチャネル内の任意の部位以外にも非特異的に吸着してしまうため、結果的に規定の部位以外に複数のリガンドがランダムに固定化されてしまう可能性がある。これにより、検出物質中の検体の量を正確に測定することができなくなるという問題がある。

二番目の問題として、特許文献２ないし５による方法は、広く使用されているマイクロタイタープレートでの検出に使用される固定化リガンド溶液の濃度（１０μｇ／ｍｌ以下）と比較して、非常に高い濃度が必要とされる。例えば、特許文献２ではＨＳＡ５００μg／ｍｌ、特許文献３では２．５ｍｇ／ｍｌ、特許文献４では１０μｇ／ｍｌ、特許文献５では１．２５ｍｇ／ｍｌと記載されている。高い濃度の固定化リガンド溶液を添加してもその一部のみが固定化され、大部分が固定化されず廃液と化すため、非常に生産性が悪くなる。また、リガンド溶液の濃度が高ければ高いほど、マイクロチャネル内の非特異吸着が増加する。非特異吸着が増加すると、リガンドはチャネル内の任意の部位以外にも非特異的に吸着してしまい、上述した問題が生じる。

本発明は、上記の問題点に鑑みてなされたものであり、その目的は、被検体物質の非特異的な吸着を抑えるとともに、マイクロチャネル内の規定の部位のみに固定化を行って、検体の分析を正確に行うことができる被検体物質の固定化方法および該固定化方法を用いたマイクロ分析装置を提供することにある。特に、マイクロチャネル内に複数の異なる被検体物質を固定化する際に、１つのチャネルで複数の被検体物質を規定の位置に確実に固定化することができ、微量の検出物質で複数の検体を検出できる被検体物質の固定化方法および該固定化方法を用いたマイクロ分析装置を提供することにある。

本発明に係る被検体物質の固定化方法は、上記課題を解決するために、検体と結合可能な被検体物質をマイクロ分析装置におけるマイクロチャネルに固定化する被検体物質の固定化方法であって、前記マイクロチャネルには、固定化用電極と対向電極とが備えられており、前記マイクロチャネルに非特異吸着防止処理剤を接触させ、前記マイクロチャネルの中および固定化用電極に対して非特異吸着防止処理を行う非特異吸着防止工程、前記被検体物質を含む溶液のｐＨを調整して前記被検体物質を帯電させ、ｐＨ調整後の溶液に、前記非特異吸着防止処理剤と反応可能な官能基および前記被検体物質と反応可能な官能基を有する架橋剤を混合して、混合液を作製する混合液作製工程、並びに、前記混合液を前記マイクロチャネルに接触させ、前記マイクロチャネルの中に設けられた前記固定化用電極と前記対向電極との間に電流を流し且つ前記固定化用電極に前記被検体物質が帯電した電位と極性が反対の電位を供給するような可変電圧を印加し、さらに前記固定化用電極に活性化エネルギーを付与して、前記被検体物質を、非特異吸着防止処理が施された前記固定化用電極に、前記非特異吸着防止処理剤と架橋させて固定化する固定化工程を含むことを特徴としている。

上記の構成によれば、被検体物質を含む混合液をマイクロチャネル内に接触させて被検体物質を電気的に固定化用電極に誘引し、且つ被検体物質を架橋剤により固定化する前に、マイクロチャネルに対し非特異吸着防止処理を行うため、被検体物質がマイクロチャネル内に非特異的に吸着されることを防ぐことができる。電気的に固定化用電極に誘引した被検体物質は、架橋剤を介して結合するため、任意の場所にのみ被検体物質を固定化することが可能となる。これにより、検体の分析を正確に行うことができる。特に、本発明の固定化処理を繰り返すことにより、複数の異なる被検体物質をマイクロチャネル内の任意の場所に固定化することが可能となる。これにより、マイクロチャネル内に複数の被検体物質を固定化する際に、１つのチャネルで複数の被検体物質を規定の位置に確実に固定化することができ、検出物質中の複数の異なる検体をより正確に分析することができる。

本発明に係る被検体物質の固定化方法は、前記架橋剤は、光架橋剤であり、前記非特異吸着防止処理剤と反応可能な官能基は、光反応性置換基であり、前記被検体物質と反応可能な官能基は、光反応性置換基を有しており、かつ前記活性化エネルギーは、光エネルギーであることが好ましい。

上記の構成によれば、光架橋剤を活性化する光を照射するという簡単な操作により、被検体物質を固定化することができるという更なる効果を奏する。

本発明に係る被検体物質の固定化方法は、前記非特異吸着防止処理を行う前に、前記固定化用電極の少なくとも一部を合成高分子の層で被覆することが好ましい。

上記の構成によれば、固定化用電極上に固定化可能な領域が立体的に構築されるため、被検体物質をより高密度に固定化することができる。これにより、検体をより高感度に検出することができるという更なる効果を奏する。

本発明に係る被検体物質の固定化方法では、前記固定化用電極と前記対向電極との間に印加する可変電圧は、１Ｖ以上であることが好ましい。

上記の構成によれば、より効率的に電極間に存在する被検体物質を前記固定化用電極に誘引することができる。

本発明に係る被検体物質の固定化方法では、前記ｐＨ調整後の溶液における被検体物質の濃度は、０．０１μｇ／ｍｌ以上、１０μｇ／ｍｌ以下であることが好ましい。

上記の構成によれば、被検体物質の濃度が十分に低いため、被検体物質の非特異的吸着をより抑制することができるという更なる効果を奏する。

本発明に係るマイクロ分析装置は、上記課題を解決するために、マイクロチャネルを備え、検体と結合可能な被検体物質が前記マイクロチャネルに固定化されたマイクロ分析装置であって、前記マイクロチャネルには、固定化用電極と対向電極とが備えられており、前記マイクロチャネルの固定化用電極は非特異吸着防止処理剤で被覆されており、前記被検体物質は、非特異吸着防止処理が施された前記固定化用電極に、前記非特異吸着防止処理剤と反応可能な官能基および前記被検体物質と反応可能な官能基を有する架橋剤により、前記非特異吸着防止処理剤と架橋して固定化されていることを特徴としている。

上記の構成によれば、固定化用電極上に非特異吸着防止処理剤が被覆して形成された非特異吸着防止層が配置されているため、被検体物質が非特異的に吸着されることを防ぐことができる。これにより、検体の分析を正確に行うことができる。また、上記の構成によれば、固定化用電極上に非特異吸着防止処理剤で被覆されているが、架橋剤を介することで、非特異吸着防止処理剤と被検体物質とを結合させることができる。

本発明に係るマイクロ分析装置では、前記架橋剤は、光架橋剤であり、前記非特異吸着防止処理剤と反応可能な官能基は、光反応性置換基であり、前記被検体物質と反応可能な官能基は、光反応性置換基を有していることが好ましい。

上記の構成によれば、光架橋剤を活性化する光を照射するという簡単な操作により、被検体物質を固定化することができるという更なる効果を奏する。

本発明に係るマイクロ分析装置では、固定化用電極の少なくとも一部は、合成高分子の層で被覆されており、前記合成高分子の層は、前記非特異吸着防止処理剤で被覆されていることが好ましい。

上記の構成によれば、前記固定化用電極と前記非特異吸着防止層との間に、合成高分子層が配置されているため、固定化用電極上に固定化可能な領域が立体的に構築されるため、被検体物質をより高密度に固定化することができる。これにより、検体をより高感度に検出することができるという更なる効果を奏する。

本発明に係るマイクロ分析装置では、前記マイクロチャネルには、２つ以上の前記固定化用電極が設けられ、前記２つ以上の固定化用電極の下流側または上流側には、対向電極が設けられていることが好ましい。

上記の構成によれば、マイクロチャネル内に２つ以上の固定化用電極が設けられることで、複数の異なる被検体物質を固定化することが可能となり、１つのマイクロチャネルで複数の異なる検体を分析することができるという更なる効果を奏する。

本発明に係るマイクロ分析装置では、前記マイクロチャネルに液体を接触させるための１つの注入孔および液体を排出するための１つの排出孔を更に備えており、前記注入孔と前記排出孔とは、１本の前記マイクロチャネルにより接続されていることが好ましい。

上記の構成によれば、マイクロチャネルに注入孔および排出孔が設けられているため、溶液の注入（接触）および排出が容易であるという更なる効果を奏する。

本発明に係るマイクロ分析装置では、前記マイクロチャネルに液体を接触させるための１つの注入孔および液体を排出するための２つ以上の排出孔を更に備えており、前記１つの注入孔と前記２つ以上の排出孔とを接続する前記マイクロチャネルは、前記１つの注入孔からの経路が分岐点で分岐した構造を有し、前記分岐点より下流側の前記マイクロチャネル内で、分岐されたマイクロチャネルの分岐路ごとに前記固定化用電極が設けられており、前記分岐点より上流側の前記マイクロチャネル内で、前記対向電極が設けられていることが好ましい。

上記の構成によれば、１つの検出物質のサンプルが注入孔から注入されて、マイクロチャネル内の分岐点で分岐した後、それぞれの分岐路に設けられた固定化用電極上で検出されることになり、１つの検出物質のサンプルで複数の性質（複数の検体）を分析できるという更なる効果を奏する。例えば、酵素基質反応により基質が変化する反応を検出しようとする際、非常に有効である。

本発明に係るマイクロ分析装置では、前記固定化用電極の下流側に、電気化学的に活性な物質を検出するための検出用電極が設けられていることが好ましい。

上記の構成によれば、検体が電気化学的に活性を持つ物質に変化する場合、その下流側にある検出用電極で変化後の物質を検出することが可能となり、より迅速かつ簡単に検体の検出を行うことができるという更なる効果を奏する。例えば、酵素基質反応により基質が電気化学的に活性を持つ物質に変化する場合に、非常に有効である。

本発明に係る被検体物質の固定化方法は、上記課題を解決するために、マイクロチャネルを備え、検体と結合可能な被検体物質が前記マイクロチャネルに固定化されるマイクロ分析装置であって、前記マイクロチャネルに、該マイクロチャネルに沿う長尺状の固定化可能領域が設けられ、前記マイクロチャネルの両端には、前記マイクロチャネルに液体を接触させるための１つの注入孔および液体を排出するための１つの排出孔がそれぞれ設けられており、前記注入孔の付近に誘引用電極が設けられかつ前記排出孔の付近に対向電極が設けられているか、あるいは、前記排出孔の付近に誘引用電極が設けられかつ前記注入孔の付近に対向電極が設けられており、前記被検体物質を前記マイクロチャネルに固定化する場合、非特異吸着防止処理剤により非特異吸着防止処理が施された前記固定化可能領域において、前記被検体物質と光架橋剤とを含む液体を前記注入孔から注入して前記排出孔に電気的に誘引する途中で、フォトマスクを使用して前記固定化可能領域の任意の複数の位置のみに光を照射して、前記非特異吸着防止処理剤と反応可能な官能基および前記被検体物質と反応可能な官能基を有する前記光架橋剤が活性化されることにより、前記被検体物質が前記非特異吸着防止処理剤と架橋して前記固定化可能領域の任意の複数の位置に固定化されることを特徴としている。

上記の構成によれば、被検体物質を含む混合液をマイクロチャネル内に接触させて被検体物質を排出孔に電気的に誘引し、且つ被検体物質を架橋剤により固定化する前に、マイクロチャネルに対し非特異吸着防止処理を行うため、被検体物質がマイクロチャネル内に非特異的に吸着されることを防ぐことができる。電気的に固定化用電極に誘引した被検体物質は、架橋剤を介して結合するため、任意の場所にのみ被検体物質を固定化することが可能となる。これにより、検体の分析を正確に行うことができる。特に、フォトマスクを使用して前記固定化可能領域の任意の複数の位置のみに光を照射することにより、複数の異なる被検体物質をマイクロチャネル内の任意の場所に固定化することが可能となる。これにより、マイクロチャネル内に複数の被検体物質を固定化する際に、１つのチャネルで複数の被検体物質を規定の位置に確実に固定化することができ、検出物質中の複数の異なる検体をより正確に分析することができる。

本発明に係るマイクロ分析装置では、前記非特異吸着防止処理剤がタンパク質、合成高分子、または合成高分子とタンパク質の混合物質であることが好ましい。

タンパク質の非特異吸着防止処理剤を用いる場合、タンパク質が非常に容易に入手することができ、且つ非特異吸着防止能が高いため、コストを減少し、非特異吸着防止をより確実に行うことができる。また、合成高分子の非特異吸着防止処理剤を用いる場合、タンパク質と比較して保存による劣化が非常に少ないという優位性がある。また、合成高分子とタンパク質との混合物質の非特異吸着防止処理剤を用いる場合、合成高分子およびタンパク質の両方の効果を共に奏することができる。

本発明に係るマイクロ分析装置では、前記合成高分子は非特異吸着防止処理剤の機能を有していることが好ましい。

これにより、合成高分子は非特異吸着防止処理剤の機能を有しているため、非特異吸着をより一層防止することができる。

本発明に係るマイクロ分析装置では、上記タンパク質が、ウシ血清アルブミン、カゼイン、またはゼラチンであることが好ましい。

これらのタンパク質は、入手容易性の観点から好ましい。

本発明に係るマイクロ分析装置では、前記合成高分子が電気的に中性であることが好ましい。また、該合成高分子としてホスホリルコリン基を有する合成高分子であることが好ましい。

これらの合成高分子は、タンパク質と比べ保存による劣化が非常に少ないというの観点から好ましい。更に、合成高分子により被検体物質固定化場が３次元的に形成されるため、よりたくさんの被検体物質を固定化することができる。結果として検体の検出感度が高くなる効果が期待できる。

本発明に係るマイクロ分析装置では、前記架橋剤が、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸コハク酸イミドエステル、または、ビス−［（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィド｛Ｂｉｓ−[（４−Ａｚｉｄｏｓａｌｉｃｙｌａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ]ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ｝であることが好ましい。

これらの架橋剤は、入手容易性の観点から好ましい。

本発明に係るマイクロ分析装置では、前記被検体物質は、抗体または人工抗体であることが好ましい。

上記の構成によれば、抗体または人工抗体は検体との特異性が非常に高く、耐久性にも優れているという更なる効果を奏する。

本発明に係るマイクロ分析装置では、前記人工抗体は、合成ペプチド、アプタマー、または分子インプリンティングポリマーであることが好ましい。

上記の構成によれば、合成ペプチド、アプタマー、または分子インプリンティングポリマーは周知の技術にて容易に作製することができるという更なる効果を奏する。

本発明に係るマイクロ分析装置では、前記検体は、血液内成分であることが好ましい。

上記の構成によれば、血液検査で本発明のマイクロ分析装置を用いれば、短時間で複数検体（項目）を検出することが可能となる。

本発明に係るマイクロ分析装置では、前記血液内成分が、アディポネクチン、レプチン、レジスチンおよびＴＮＦ−αの中の少なくとも１つを含むことが好ましい。

これにより、脂質代謝異常の指標とすることが可能になる。

本発明に係るマイクロ分析装置では、前記注入孔にポンプが接続されていることが好ましい。

これにより、ポンプで送液しながら固定化を行えば、前記被検体物質は電気だけの誘引力だけでなく、ポンプによる拡散速度の影響も受けるため、より効果的に固定化することが可能となる。

本発明に係る被検体物質の固定化方法は、前記マイクロチャネルには、固定化用電極と対向電極とが備えられており、前記マイクロチャネルに非特異吸着防止処理剤を接触させ、前記マイクロチャネルの中および固定化用電極に対して非特異吸着防止処理を行う非特異吸着防止工程、前記被検体物質を含む溶液のｐＨを調整して前記被検体物質を帯電させ、ｐＨ調整後の溶液に、前記非特異吸着防止処理剤と反応可能な官能基および前記被検体物質と反応可能な官能基を有する架橋剤を混合して、混合液を作製する混合液作製工程、並びに、前記混合液を前記マイクロチャネルに接触させ、前記マイクロチャネルの中に設けられた前記固定化用電極と前記対向電極との間に電流を流し且つ前記固定化用電極に前記被検体物質が帯電した電位と極性が反対の電位を供給するような可変電圧を印加し、さらに前記固定化用電極に活性化エネルギーを付与して、前記被検体物質を、非特異吸着防止処理が施された前記固定化用電極に、前記非特異吸着防止処理剤と架橋させて固定化する固定化工程を含むことを特徴としている。

本発明に係るマイクロ分析装置は、前記マイクロチャネルには、固定化用電極と対向電極とが備えられており、前記マイクロチャネルの固定化用電極は非特異吸着防止処理剤で被覆されており、前記被検体物質は、非特異吸着防止処理が施された前記固定化用電極に、前記非特異吸着防止処理剤と反応可能な官能基および前記被検体物質と反応可能な官能基を有する架橋剤により、前記非特異吸着防止処理剤と架橋して固定化されていることを特徴としている。

それゆえ、本発明における被検体物質の固定化方法および該固定化方法を用いたマイクロ分析装置は、被検体物質の非特異的な吸着を抑えるとともに、マイクロチャネル内の規定の部位のみに固定化を行って、検体の分析を正確に行うことができるという効果を奏する。

つまり、本発明によれば、微量な１サンプルから複数項目を誤認識なく、それぞれ独立して検出することができる。

本発明の一実施形態におけるマイクロ分析装置を示す平面図である。 本発明の一実施形態におけるマイクロ分析装置の固定化用電極を示す断面図である。 本発明の他の実施形態におけるマイクロ分析装置の固定化用電極を示す断面図である。 本発明の他の実施形態におけるマイクロ分析装置を示す平面図である。 本発明のさらに他の実施形態におけるマイクロ分析装置を示す平面図である。 本発明のさらに他の実施形態におけるマイクロ分析装置を示す平面図である。 本発明のさらに他の実施形態におけるマイクロ分析装置を示す平面図である。 本発明のさらに他の実施形態におけるマイクロ分析装置を示す平面図である。 実施例１および比較例１、２で使用したマイクロ分析装置を示す平面図である。 実施例１における被検体物質を固定化した後の固定化用電極の蛍光像を示す図である。 比較例１における被検体物質を固定化した後の固定化用電極の蛍光像を示す図である。 比較例２における被検体物質を固定化した後の固定化用電極の蛍光像を示す図である。 従来技術におけるマイクロ分析装置の構造を示す概略図である。 従来技術におけるマイクロ分析装置の固定化部分での反応を示す概略図である。

以下、本発明に係る被検体物質の固定化方法およびマイクロ分析装置の実施形態について、図面を参照しながら説明する。

〔実施の形態１〕
以下、図１〜３に基づいて、本発明の実施の形態１について説明する。図１は、本発明の実施の形態１におけるマイクロ分析装置の平面図であり、図２は、該マイクロ分析装置の固定化用電極の断面図である。また、図３は、本発明の実施の形態１における他のマイクロ分析装置の固定化用電極の断面図である。

＜マイクロ分析装置の本体＞
本発明の実施の形態１にかかるマイクロ分析装置（マイクロチャネルチップ）は、図１に示すような基板１００および該基板１００を接着して封する図示しない蓋基板を備えている。基板１００と蓋基板とは接着されている構造である。基板１００には、注入孔１、排出孔７、および注入孔１と排出孔７とを接続する凹面のマイクロチャネル２が形成されている。

基板１００として、絶縁性を有する基板を用いることができる。絶縁性を有する基板としては、例えば、表面に酸化膜などの絶縁性材料が形成されたシリコン基板、石英基板、酸化アルミニウム基板、ガラス基板又はプラスチック基板などを用いることができる。また、検出する時の化学発光を用いるのであれば、例えば、特開２００３−１４９２５２号公報に開示されている自発蛍光が小さく且つ透明性のあるプラスチック材料を用いることもできる。

基板１００の厚みは０．１〜５ｍｍ程度が好ましい。また、マイクロチャネル２の深さは０．１〜１０００μｍ程度、幅は０．１〜１０００μｍ程度が好ましい。

マイクロチャネル２の断面形状は、矩形または台形形状とすることができる。また、流路の底は円の一部のように丸くなっていてもよい。

注入孔１および排出孔７は、直径が１０μｍ以上である。また、注入孔１および排出孔７は、液体を注入および排出するため、基板１００および蓋基板のいずれか一方に貫通孔として形成されている。

基板１００の凹凸を形成する方法は、例えば、直接加工する方法として機械加工による方法、レーザー加工による方法、金型を用いた射出成型、プレス成型、および鋳造による方法などが挙げられる。その中で、金型を用いる方法は、量産性が良く、且つ形状の再現性が高いため好ましい。

また、基板１００の材料がシリコンまたはガラス等である場合、基板１００上のマイクロチャネル２のパターンは、従来一般的に提案されているフォトリソグラフィ法またはエッチング法により形成することができる。

＜固定化用電極、対向電極および参照電極＞
図１に示すように、マイクロチャネル２内には、複数のリガンドを固定化するための複数の固定化用電極３、４、５が配置されている。固定化用電極３、４、５は、直線状のマイクロチャネル２に沿って、直線状に配置されている。

上述したように、リガンド（被検体物質）とは、検体とする物質に対して特異的に親和性を持つ化学物質を意味する。

固定化用電極３、４、５の上流側における注入孔１の近傍には、その対向電極６が配置されている。ここで、上流側または下流側とは、注入孔１から排出孔７までの流れに準じたものである。

マイクロチャネル２には、さらに参照電極を設け、固定化用電極、対向電極および参照電極の３極からなる構成としてもよい。

各電極は、従来のフォトリソグラフィ技術を利用した微細加工技術によって形成することができる。電極の導電性材料としては、例えば金、白金、銀、クロム、チタン、イリジウム、銅またはカーボンなどを用いることができる。

固定化用電極３、４、５およびその対向電極６の幅は、１μｍから３０００μｍの範囲であり、チャネル幅と等しく設定されることがより好ましい。また、各電極の形状は、図１に示すような矩形を含む多角形であってもよいし、円状であってもよい。

固定化用電極３、４、５のチャネル内の配置場所は、対向電極６と固定化用電極３との間隔距離が、固定化用電極３と４との間隔距離および固定化用電極４と固定化用電極５との間隔距離の１０倍以上になるように配置されることが好ましい。対向電極６は、図１に示すように注入孔１の付近に配置されていてもよいし、排出孔７の付近に配置されていてもよい。

対向電極６と固定化用電極３との間隔距離を、固定化用電極３と固定化用電極４との間隔距離および固定化用電極４と固定化用電極５との間隔距離の１０倍以上にする構成により、以下の効果が得られる。すなわち、被検体物質を含む液体をマイクロチャンネル２に入れて、固定化用電極３、４、５のそれぞれと対向電極６との間に電圧を印加した際、電圧を印加した電極間のリガンドが泳動して電極上に濃縮されることになる。しかし、固定化用電極３、４、５の互いの間隔に比べ、固定化用電極３、４、５のいずれかと対向電極６との間の間隔が十分に大きいため、固定化用電極３、４、５に濃縮されて固定される被検体物質の量は、各固定化用電極３、４、５においての不均一が少なくなる。換言すれば、複数の被検体物質を固定化する際、固定化される被検体物質の量の不均一を少なくすることができる。

＜非特異吸着防止処理剤＞
本発明の被検体物質の固定化方法およびマイクロ分析装置において、被検体物質を含む液体をマイクロチャンネル２に流す前に、マイクロチャンネル２に非特異吸着防止処理剤を接触させて、マイクロチャンネル２に非特異吸着防止処理剤層１２（図２を参照）を設ける。ここで、「非特異吸着防止処理剤」とは、非特異的に吸着することを防止するものをいう。

該非特異吸着防止処理剤として、タンパク質、合成高分子、または合成高分子とタンパク質との混合物質が挙げられる。

タンパク質の非特異吸着防止処理剤を用いる場合、タンパク質が非常に容易に入手することができ、且つ非特異吸着防止能が高いため、コストを減少し、非特異吸着防止をより確実に行うことができる。また、合成高分子の非特異吸着防止処理剤を用いる場合、タンパク質と比較して保存による劣化が非常に少ないという効果がある。合成高分子とタンパク質との混合物質を用いる場合、両方の効果を共に奏することができる。

前記タンパク質として、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、ゼラチン等を用いることができる。

前記合成高分子として、電気的に中性なポリマーやホスホリルコリン基を有するポリマーなど市販品の非特異吸着防止処理剤を用いることができる。

＜リガンド（被検体物質）＞
リガンド溶液中のリガンドとして抗体や人工抗体が好ましい。これは、抗体または人工抗体は非常に検体との特異性が高く、耐久性にも優れているためである。また、人工抗体は合成ペプチド、アプタマー、または分子インプリンティングポリマーを用いることができる。合成ペプチド作製、アプタマー作製、分子インプリンティング作製技術は周知の技術にて作製することが容易である。

リガンド溶液は、ｐＫａや等電点からリガンドが正負いずれかに帯電するようなｐＨに調製される。ここで、リガンド溶液のｐＨは、酸性の場合３〜６、アルカリ性の場合８〜１１に調整されることが好ましい。また、ｐＨ調整後のリガンド溶液の最終濃度は好ましくは０．０１μｇ／ｍｌ以上、１０μｇ／ｍｌ以下に調製される。これは、０．０１μｇ／ｍｌ未満の場合、本特許による固定化法で固定化を行っても、固定化電極に十分量を固定化することができなくなり、１０μｇ／ｍｌを超える場合、非特異的吸着防止剤に対してもリガンドが非特異的に吸着する恐れがあるため、好ましくない。

＜架橋剤＞
架橋剤としては、前記特許文献４に記載された光架橋剤が好ましい。本実施の形態１では、光架橋剤を使用している。光架橋剤としては、光反応性置換基を２つ以上有する物質、または光反応性置換基と活性物質置換基とを有する物質を用いることができる。

光架橋剤は、その光反応性置換基がマイクロチャネルの表面に吸着された非特異吸着防止処理剤と反応し、かつ光反応性置換基または活性物質置換基がリガンドと反応することにより、活性物質と非特異吸着防止処理剤との間で橋架け結合を形成する役割を果たすものである。

光反応性置換基は、光反応により非特異吸着防止処理剤と反応して結合するものであればよく、例えば、アジド基、ベンゾフェノン基等が挙げられ、特にアジド基が好ましい。活性物質置換基は、リガンドと反応して結合を形成するものであればよい。例えば、リガンドがタンパク質や酵素である場合には、それらが有するアミノ基、カルボキシ基、チオール基等に対して反応性を有する置換基であることが好ましい。このような置換基としては、アミノ基、カルボキシ基、カルボン酸の活性化エステル、イソチオシアナート基、チオール基、スルフォニルクロリド等が挙げられる。このような光架橋剤としては、例えば、アジド基およびカルボン酸の活性エステルを有する化合物、アジド基およびカルボキシ基を有する化合物、アジド基およびアジド基を有する化合物等が挙げられる。具体的には、例えば、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸コハク酸イミドエステル（以下、「ＡＴＦＢ−ＳＥ」という。）、Ｂｉｓ−（４−Ａｚｉｄｏｓａｌｉｃｙｌａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ等が好ましく、特にＡＴＦＢ−ＳＥが反応性、および入手容易性の観点から好ましい。

また、架橋剤としては、熱架橋剤などのほかの架橋剤を用いることができる。架橋剤が有する官能基としても、上記の光反応性置換基または活性物質置換基に限られず、非特異吸着防止処理剤と反応可能な官能基およびリガンド（被検体物質）と反応可能な官能基を有し、熱などの活性化エネルギーの付与により、リガンドと非特異吸着防止処理剤とを架橋剤により架橋することができるものであればよい。

＜固定化方法＞
以下、実施の形態１おけるリガンドの固定化方法について説明する。

図１のマイクロチャンネル２に非特異吸着防止処理剤を接触させて、マイクロチャンネル２に非特異吸着防止処理剤層１２（図２を参照）を形成した後、ｐＨ調整後のリガンド溶液と光架橋剤との混合液を、注入孔１からマイクロチャネル２内が十分満たされる程度の量を接触させる。

次に、固定化したい固定化用電極（ここでは固定化用電極５とする）と対向電極６との間に電圧を印加する。この際、一定の電流が流れるように可変電圧を印加する。上記一定の電流の値は、絶対値で１００μＡ以下とする。好ましくは、１μＡ以上、１００μＡ以下の範囲であり、より好ましくは、１μＡ以上、１０μＡ以下の範囲で設定される。

ここで、固定化用電極５に印加する電圧は、帯電されたリガンドの極性とは反対の電位を与える必要がある。固定化用電極５にこのような電圧を印加することで、帯電したリガンドが固定化用電極５へ誘引され、濃縮される。

また、電圧の印加と同時に、固定化用電極５上に光エネルギーを与える。これにより、混合液の中の光架橋剤が活性化され、固定化用電極５上に誘引濃縮されたリガンドは非特異吸着防止処理剤と光架橋剤とにより架橋される（熱架橋剤を使用する場合は、熱エネルギーを与えることになる）。光エネルギーが与えられていない部分については、光架橋剤が活性化されないため、非特異吸着防止処理剤と架橋することはない。固定化後、緩衝溶液などの洗浄溶液でマイクロチャネル内を洗浄する。これにより、固定化用電極５上の光エネルギーを与えた（固定化用電極５上の）任意の部位のみにリガンドが固定化された状態になる。

上述した固定化方法によれば、予めマイクロチャネルに非特異吸着防止処理を行っているため、固定化用電極５の光エネルギーを与えていない部位以外のマイクロチャネル２内にはリガンドが固定化されない。

固定化用電極４および固定化用電極３に対して固定化用電極５と同様な操作を繰り返すことで、それぞれのリガンドを混入や、規定の部位以外のマイクロチャネル内での非特異吸着なく、固定化用電極４および固定化用電極３上に固定化することが可能となる。図２は、このような固定化後のマイクロ分析装置の固定化用電極を示す断面図である。図２に示すように、固定化用電極１３上に、非特異吸着防止処理剤が塗布されて非特異吸着防止処理剤層１２が形成されており、光架橋剤１１でリガンド１０と非特異吸着防止処理剤層１２の間が架橋されて、リガンド１０が固定化された構造になっている。

以下、本実施の形態１におけるリガンドの固定化方法の他の構成について説明する。

本発明の実施の形態１におけるマイクロ分析装置において、図３に示したように、非特異吸着防止処理剤を塗布する前に、固定化用電極上２９に合成高分子をコーティング（被覆）して、マイクロチャネルに、合成高分子層２８を固定化用電極２９の少なくとも一部を被覆するように配置することができる。

このような処理を施すことで、固定化用電極２９上に固定化できる領域を立体的に構築することが可能となる。同じ面積の固定化用電極上にリガンドを固定化する際、高分子をコーティングした方が、コーティングしない場合と比較して、２倍以上の固定化量を確保することができる。このように、高密度にリガンドを固定化したマイクロチャネルチップを用いた場合、検体の検出感度を向上させることができる。

さらに、この合成高分子は非特異吸着防止処理剤の機能を有していてもよい。この場合、非特異吸着をより一層防止することができる。また、合成高分子層と非特異吸着防止処理剤層とを１つの層として形成することもでき、構造がより簡略化できる。

＜検出物質と検体＞
本発明のマイクロ分析装置の分析対象としては、検出物質中の検体である。検出物質として、例えば血液または血液を含む溶液が挙げられる。

検体としては、血液内成分が挙げられる。該血液内成分として、アディポネクチン、レプチン、レジスチンおよびＴＮＦ（Tumor Necrosis Factor）−αの中のいずれかを含むことができる。すなわち、検出物質が血液である場合、本発明のマイクロ分析装置を用いて、血液の１つのサンプルで、アディポネクチン、レプチン、レジスチンおよびＴＮＦ−αの中のいずれか１つまたは複数を検出することができる。

〔実施の形態２〕
図４は、本発明の実施の形態２にかかるマイクロ分析装置の構造を示す。図４に示すように、実施の形態２にかかるマイクロ分析装置（マイクロチャネルチップ）は、基板１００および該基板１００を接着して封する図示しない蓋基板を備えている。基板１００と蓋基板とは接着されている構造である。基板１００には、注入孔３０、排出孔３６、および注入孔３０と排出孔３６接続するマイクロチャネル３１が形成されている。また、実施の形態１（図１を参照）と同様に、マイクロチャネル３１内に３つの固定化用電極３２、３３、３４が配置されている。また、注入孔３０の付近に、対向電極３５が配置されていることも実施の形態１と同様である。

また、実施の形態１と同様に、マイクロチャンネル３１に非特異吸着防止処理剤を接触させた後、ｐＨ調整後のリガンド溶液と光架橋剤との混合液を、注入孔３０からマイクロチャネル３１内に接触させる。

本実施の形態２における実施の形態１との異なる点は、排出孔３６の付近にも対向電極３７が配置されていることである。

実施の形態１の場合、マイクロチャネル３１内の固定化用電極と対向電極の間に電圧を印加すると、電極間に存在するリガンドが固定化用電極に誘引され、濃縮される。したがって、実施の形態１における図１の構成では、マイクロチャネル２内のすべてのリガンドを固定化用電極３、４、５に誘引することは難しい。また、固定化用電極３と対向電極６との間、固定化用電極４と対向電極６との間、および固定化用電極５と対向電極６との間の距離がそれぞれ異なるため、誘引されたリガンド量がどうしても異なってしまう。

これに対し、本実施の形態２では、排出孔３６の付近にも対向電極３７が配置されているため、対向電極３５および対向電極３７と、固定化したい固定化用電極（ここでは、固定化用電極３３とする）との間で同時に電圧を印加することができる。これにより、マイクロチャネル３１内に存在するリガンドを、対向電極３５および対向電極３７から同時に両側から固定化用電極３３に誘引することが可能となる。

そのため、マイクロチャネル３１内に存在するリガンドをより多く固定化用電極３３に誘引することができ、かつ、リガンドを固定化用電極３３の両側から誘引するため、誘引されたリガンドの量を均一にすることが可能となる。

なお、本実施の形態２において、リガンド溶液の調整法や光架橋剤、非特異吸着防止処理剤を含む電気誘引固定化法は実施の形態１と同様である。

〔実施の形態３〕
図５は、本発明の実施の形態３にかかるマイクロ分析装置の構造を示す。図５に示すように、実施の形態３にかかるマイクロ分析装置は、基板１００および該基板１００を接着して封する図示しない蓋基板を備えている。基板１００と蓋基板は接着されている構造である。基板１００には、注入孔４０、排出孔４４、排出孔４７、排出孔５０、および注入孔４０と排出孔４４、４７、５０とを接続するマイクロチャネル４１が形成されている。

マイクロチャネル４１は、注入孔４０からのマイクロチャンネルの経路が固定化用電極の数だけ複数個（図５では３つである）に分岐した構造であり、図５のように１つの分岐点から分岐した構造であってもよいし、それぞれ違う点から分岐した構造であってもよい。

排出孔４４、４７、５０のそれぞれに対応して分岐されたマイクロチャネル４１内の３つの分岐路に、固定化用電極４２と検出用電極部４３、固定化用電極４５と検出用電極部４６、および固定化用電極４８と検出用電極部４９がそれぞれ配置され、それらの対向電極５１は注入孔４０付近に配置されている。

検出用電極部４３、４６、４９は、それぞれ電気化学的に活性な物質を検出する作用電極とその対向電極との２極から構成されてもよいし、対向電極と作用電極と参照電極との３極から構成されてもよい。ここで、電気化学的に活性な物質としては、例えば、フェロセン、パラアミノフェノール（ＰＡＰ）、フェリシアン化カリウム等が挙げられる。

なお、本実施の形態３において、リガンド溶液の調整法や光架橋剤、非特異吸着防止処理剤を含む電気誘引固定化法は実施の形態１と同様である。

本発明の実施の形態３による分岐構造は、電気化学的に検体を検出する際に非常に有効である。電気化学的に検体を検出する場合、検体がリガンドに捕捉された信号を電気化学的な信号に変換し、検出用電極部で検出するといったプロセスとなる。

例えば、酵素基質反応により基質が変化する反応を検出する場合、検体を捕捉した後、２次抗体による反応で酵素標識し、次いで酵素基質反応により電気化学的に活性のある物質を生成させ、検出用電極部でその濃度を検出する。

これに対し、図１，４のように直線状のマイクロチャネル内に固定化用電極並びに検出用電極部を配置したとすると、上流側で反応し、生成した電気化学的活性のある物質が下流側の他の検出用電極部で誤認識してしまう問題が生じる。しかしながら、図５のように、固定化用電極と検出用電極部とを一式ずつ分岐後のマイクロチャネル内に配置することで、それぞれ独立して検出用電極部にて検出することができる。

〔実施の形態４〕
図６は、本発明の実施の形態４にかかるマイクロ分析装置の構造を示す。図６に示すように、実施の形態４にかかるマイクロ分析装置は、基板１００および該基板１００を接着して封する図示しない蓋基板を備えている。基板１００と蓋基板は接着されている構造である。基板１００には、注入孔６０、排出孔６４、排出孔６８、排出孔７２、および注入孔６０と排出孔６４、６８、７２とを接続する１本のマイクロチャネル６１が形成されている。

マイクロチャネル６１は、注入孔６０からのマイクロチャンネルの経路が固定化用電極の数だけ複数個（図６では３つである）に分岐した構造であり、図６のように１つの分岐点から分岐した構造であってもよいし、それぞれ違う点から分岐した構造であってもよい。

排出孔６４、６８、７２のそれぞれに対応して分岐されたマイクロチャネル６１内の３つの分岐路に、固定化用電極６２と検出用電極部６３、固定化用電極６６と検出用電極部６７、および固定化用電極７０と検出用電極部７１がそれぞれ配置され、それらの対向電極７４は注入孔６０付近に配置されている。これらの構造は、図５に示す実施の形態３の構造と同様である。

本実施の形態４における実施の形態３との異なる点は、排出孔６４付近に対向電極６５が、排出孔６８付近に対向電極６９が、排出孔７２付近に対向電極７３がそれぞれ配置されていることである。

該構造によると、固定化する際に１つの固定化用電極に対し４つの対向電極とすることで、より多くのリガンドを固定化用電極に誘引し固定化することが可能となる。

なお、リガンド溶液の調整法や光架橋剤、非特異吸着防止処理剤を含む電気誘引固定化法は実施の形態１と同様である。

〔実施の形態５〕
図７は、本発明の実施の形態５にかかるマイクロ分析装置の構造を示す。図７に示すように、実施の形態５にかかるマイクロ分析装置は、基板１００および該基板１００を接着して封する図示しない蓋基板を備えている。基板１００と蓋基板は接着されている構造である。基板１００には、注入孔８０、排出孔８４、および注入孔８０と排出孔８４を接続する１本のマイクロチャネル８２が形成されている。

排出孔８４の付近にリガンド誘引用電極８５が配置され、注入孔８０の付近に対向電極８１が配置されている。ここで、逆に、排出孔８４の付近に対向電極８１が配置され、注入孔８０の付近にリガンド誘引用電極８５が配置されていてもよい。

実施の形態５では、前記注入孔８０と排出孔８４との間のマイクロチャネルに、該マイクロチャネル８２に沿う長い（長尺状）固定化可能領域８３が設けられている。該構造により、実施の形態５による方法では、一対の電極のみを利用し複数のリガンドを固定化することができる。

すなわち、リガンドと光架橋剤の混合液からリガンドを電気で誘引させる際、実施の形態１ないし４では、固定化用電極まで誘引させた後に光固定化を行うが、実施の形態５では、該マイクロチャネル８２に沿う固定化可能領域８３を有するため、電気的に誘引している途中の固定化可能領域８３で、フォトマスクを使用し固定化可能領域８３内の任意の点のみに光を照射する。

これにより、光が照射した時点で光架橋剤は活性化され、その場でリガンドと非特異吸着防止処理剤とが架橋される。これを繰り返すことで、一対の電極のみで複数のリガンドをマイクロチャネル８２の任意の場所に固定化することが可能となる。

なお、リガンド溶液の調整法や光架橋剤、非特異吸着防止処理剤などは実施の形態１と同様である。

〔実施の形態６〕
図８は、本発明の実施の形態６にかかるマイクロ分析装置の構造を示す。図８に示すように、実施の形態６にかかるマイクロ分析装置は、マイクロ分析装置９３のマイクロチャネル９２に接続するようにポンプ９０を設置する構造とする。ポンプ９０は、例えば、注入孔または排出孔に接続することができるが、本実施の形態では注入孔に接続する。

ポンプ９０と注入孔は、チューブ９１で連接される。チューブ９１は実質的には必要ないが、接続するために必要であれば設置する。

マイクロ分析装置９３としては、実施の形態１ないし５のマイクロ分析装置を用いることができる。ポンプで送液しながら固定化を行えば、リガンドは電気だけの誘引力だけではなく、ポンプによる拡散速度も速くなるため、より効果的に固定化することが可能となる。

なお、リガンド溶液の調整法や光架橋剤、非特異吸着防止処理剤などは実施の形態１と同様である。

次に、実施例１および比較例１、２により本発明の構造による効果を説明する。

実施例１および比較例１、２では、図９に示すマイクロチャネルチップを作製した。実施例１および比較例１、２におけるマイクロ分析装置のマイクロチャネルの構造は、ＰＤＭＳ（Polydimethylsiloxane、東レダウコーニング社製）を用いて作製した。固定化用電極２０３、２０４と対向電極２０５とをともに石英基板にフォトリソグラフィ法によりレジストパターンを形成し、チタン次いで金をスパッタリングし金電極を作製した。

マイクロチャネル２０２の幅は５００μｍ、高さは５０μｍで作製した。固定化用電極２０３、２０４は２００μｍ×５００μｍ、対向電極２０５は６００μｍ×５００μｍとした。ＰＤＭＳチャネル基板と電極基板を貼りあわせて、マイクロチャネル構造を作製した。マイクロチャネル内はＢＳＡとホスホリルコリン基を含むＭＰＣ（Methacryloyloxyethylphosphorylcholine）ポリマー（第一器業社製）で非特異吸着防止処理を施した。

（実施例１）
Ｈｉｌｙｔｅ５５５（同仁化学社製）で修飾したアディポネクチン抗体（Ｒ＆Ｄシステム社製）とＦＩＴＣ（Fluoresceinisothiocyanate、同仁化学社製）で修飾したレジスチン抗体をそれぞれｐＨ３．５に調製し、最終濃度を１μｇ／ｍｌに調製した。それぞれの抗体溶液には光架橋剤ＡＴＦＢ−ＳＥ（Thermo Fisher Scientific社製）を、抗体に対する光架橋剤のモル比が５００になるよう混合した。注入孔２０１からＦＩＴＣ修飾レジスチン抗体混合溶液を接触させ、固定化用電極２０３に光を照射しながら電流が−４μＡになるよう電圧を印加し電気誘引光固定化を行った。次に、ツイーン２０（キシダ化学社製）入りのＰＢＳ（phosphate buffer saline、和光純薬工業社製）で十分洗浄した。さらに、注入孔２０１からＨｉｌｙｔｅ５５５修飾アディポネクチン抗体混合溶液を接触させ、固定化用電極２０４に光を照射しながら電流が−４μＡになるよう電圧を印加して電気誘引光固定化を行った。最後に、ツイーン２０入りのＰＢＳで十分洗浄した。

（比較例１）
Ｈｉｌｙｔｅ５５５修飾アディポネクチン抗体とＦＩＴＣ修飾レジスチン抗体をそれぞれｐＨ３．５に調製し、最終濃度を１μｇ／ｍｌに調製した。それぞれの抗体溶液には光架橋剤ＡＴＦＢ−ＳＥを混合しなかった。注入孔２０１からＦＩＴＣ修飾レジスチン抗体溶液を接触させ、固定化用電極２０３に光を照射しながら電流が−４μＡになるよう電圧を印加して電気誘引光固定化を行った。次に、ツイーン２０入りのＰＢＳで十分洗浄した。さらに注入孔２０１からＨｉｌｙｔｅ５５５修飾アディポネクチン抗体溶液を接触させ、固定化用電極２０４に光を照射しながら電流が−４μＡになるよう電圧を印加して電気誘引光固定化を行った。最後に、ツイーン２０入りのＰＢＳで十分洗浄した。

（比較例２）
Ｈｉｌｙｔｅ５５５修飾アディポネクチン抗体とＦＩＴＣ修飾レジスチン抗体をそれぞれｐＨ３．５に調製し、最終濃度を１μｇ／ｍｌに調製した。それぞれの抗体溶液には光架橋剤ＡＴＦＢ−ＳＥを、抗体に対する光架橋剤のモル比が５００になるよう混合した。注入孔２０１からＦＩＴＣ修飾レジスチン抗体混合溶液を接触させ、固定化用電極２０３に光を照射しながら電圧を印加せずに電気誘引光固定化を行った。次に、ツイーン２０入りのＰＢＳで十分洗浄した。さらに注入孔２０１からＨｉｌｙｔｅ５５５修飾アディポネクチン抗体混合溶液を接触させ、固定化用電極２０４に光を照射しながら電圧を印加せずに電気誘引光固定化を行った。最後に、ツイーン２０入りのＰＢＳで十分洗浄した。

（実施例１と比較例１、２との比較）
それぞれの固定化用電極２０４を蛍光観察した。抗体に蛍光を修飾しているため、蛍光が観察された場合、マイクロチャネル内に抗体が固定化されていることを示す。

実施例１の場合、固定化用電極上の光を当てた部位のみきれいに蛍光が観察された（図１０）。光架橋剤を入れなかった比較例１の場合には、蛍光がほぼ観察されなかった（図１１）。電圧を印加しなかった比較例２の場合にも、蛍光がほぼ観察されなかった（図１２）。

これにより、本発明のマイクロ分析装置の構造で、光架橋剤を入れ且つ電圧を印加することにより、リガンドが固定化用電極に確実に固定化されることができることがわかる。

本発明は上述した各実施形態、実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。

今回開示された実施の形態および実施例はすべての点で例示であって制限的なものではないと考えられる。本発明の範囲は上述した説明ではなく特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味および範囲内でのすべての変更が含まれることが意図される。

尚、以上説明した本発明は、以下のように言い換えることもできる。即ち、
（１）多項目を同時に検出するマイクロ分析装置の被検体物質の固定化方法であって、被検体物質は帯電性を有するｐＨに調製し、該溶液には光反応性置換基をもつ光架橋剤を混合し、被検体物質を固定化する前に非特異吸着防止処理を施したマイクロチャネル内に、前記溶液を注入し、マイクロチャネル内に設置された固定化用電極およびその対向電極との間に一定の電流が流れるように可変電圧を印加させ、さらに該固定化用電極に活性化エネルギーを与える光を照射することによる光反応によって、前記被検体物質を固定化することを特徴とする被検体物質の固定化方法。

（２）上記（１）に記載の被検体物質の固定化方法において、前記マイクロ分析装置のマイクロチャネルにおいて、非特異吸着防止処理を施す前に、高分子により前記固定化用電極の少なくとも一部を被覆する被検体物質の固定化方法。

（３）上記（１）または（２）に記載の被検体物質の固定化方法において、マイクロチャネル内に設置された固定化用電極およびその対向電極との間に印加する電圧は１Ｖ以上とする被検体物質の固定化方法。

（４）上記（１）または（２）に記載の被検体物質の固定化方法において、被検体物質の最終濃度は１０μｇ／ｍｌ以下とする被検体物質の固定化方法。

（５）多項目を同時に検出するマイクロ分析装置であって、固定化用電極上に非特異吸着防止処理剤が被覆され、さらに被検体物質が光反応性置換基をもつ光架橋剤により非特異吸着防止処理との間を架橋した構造を特徴とするマイクロ分析装置。

（６）上記（５）に記載のマイクロ分析装置において、固定化用電極上の少なくとも一部を高分子で被覆され、その上に非特異吸着防止処理剤が被覆され、さらに被検体物質が光反応性置換基をもつ光架橋剤により非特異吸着防止処理との間を架橋した構造を特徴とするマイクロ分析装置。

（７）上記（５）または（６）に記載のマイクロ分析装置において、マイクロチャネル内に２つ以上の固定化用電極を設け、その下流または上流側に（１つの）対向電極を設けるマイクロ分析装置。

（８）上記（７）に記載のマイクロ分析装置において、前記マイクロチャネルが、溶液を注入する注入孔１つと溶液を排出する排出孔１つを接続する１本のマイクロチャネルで構成された構造を特徴とするマイクロ分析装置。

（９）上記（７）に記載のマイクロ分析装置において、前記マイクロチャネルが、溶液を注入する注入孔１つと溶液を排出する２つ以上の排出孔に接続するため途中で分岐した構造であり、分岐点より下流側のマイクロチャネル内に固定化用電極を分岐したチャネル分設け、分岐点より上流側のマイクロチャネル内に対向電極１つ設けるマイクロ分析装置。

（１０）上記（９）に記載のマイクロ分析装置において、固定化用電極の下流側に電気化学的に活性な物質を検出する検出用電極を設けるマイクロ分析装置。

（１１）上記（５）〜（１０）の何れか１項に記載のマイクロ分析装置において、前記非特異吸着防止処理剤がタンパク質であるマイクロ分析装置。

（１２）上記（５）〜（１０）の何れか１項に記載のマイクロ分析装置において、前記非特異吸着防止処理剤が合成高分子であるマイクロ分析装置。

（１３）上記（５）〜（１０）の何れか１項に記載のマイクロ分析装置において、前記非特異吸着防止処理剤が合成高分子とタンパク質の混合物質であるマイクロ分析装置。

（１４）上記（１１）または（１３）に記載のマイクロ分析装置において、上記タンパク質は、ウシ血清アルブミン、カゼイン、且つまたはゼラチンであるマイクロ分析装置。

（１５）上記（１２）または（１３）に記載のマイクロ分析装置において、前記合成高分子が電気的に中性であるマイクロ分析装置。

（１６）上記（１５）に記載のマイクロ分析装置において、前記非特異吸着防止処理剤がホスホリルコリン基を有する合成高分子であるマイクロ分析装置。

（１７）上記（５）〜（１６）の何れか１項に記載のマイクロ分析装置において、前記光反応性基を有する光架橋剤が、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸コハク酸イミドエステル、Ｂｉｓ−（４−Ａｚｉｄｏｓａｌｉｃｙｌａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］ｄｉｓｕｌｆｉｄｅであるマイクロ分析装置。

（１８）上記（５）〜（１７）の何れか１項に記載のマイクロ分析装置において、前記被検体物質が、抗体または人工抗体であるマイクロ分析装置。

（１９）上記（１８）に記載のマイクロ分析装置において、前記人工抗体は合成ペプチド、アプタマー、または分子インプリンティングポリマーであるマイクロ分析装置。

（２０）上記（５）〜（１９）の何れか１項に記載のマイクロ分析装置において、検出物質が、血液内成分であるマイクロ分析装置。

（２１）上記（２０）に記載のマイクロ分析装置において、前記血液成分が、アディポネクチン、レプチン、レジスチン、ＴＮＦ−αのいずれかを含むマイクロ分析装置。

（２２）上記（５）〜（２１）の何れか１項に記載のマイクロ分析装置において、注入孔にポンプを接続するマイクロ分析装置。

本発明の被検体物質の固定化方法およびマイクロ分析装置によると、微量なサンプル量で、迅速かつ高感度な測定を複数同時に行うことができる。これにより、本発明は、微小な化学物質等を検出するために用いるマイクロチャネルチップ、マイクロリアクター等の化学マイクロデバイスやアレルゲンセンサーをはじめとするバイオセンサーなど、μ−ＴＡＳ技術を用いたマイクロチャネルチップを利用する分野に適用することができる。

１、３０、４０、６０、８０、１０２、２０１ 注入孔
２、３１、４１、６１、８２、９２、１０１、２０２ マイクロチャネル
３、４、５、１３、２９、３２、３３、３４、４２、４５、４８、６２、６６、７０、２０３、２０４ 固定化用電極
６、３５、３７、５１、６５、６９、７３、７４、８１、２０５ 対向電極
７、３６、４４、４７、５０、６４、６８、７２、８４、１０４、２０６ 排出孔
１０、２５ リガンド（被検体物質）
１１、２６ 光架橋剤（架橋剤）
１２、２７ 非特異吸着防止処理剤層
２８ 合成高分子層
４３、４６、４９、６３、６７、７１ 検出用電極部
８３ 固定化可能領域
８５ リガンド誘引電極
９０ ポンプ
９１ チューブ
９３ マイクロ分析装置
１００ 基板
１０３ 液だめ部
１０５ リガンド固定部
１２０ 被検体物質
１２１ 標識物質
１２２、１２５ 抗体
１２３ 標識抗体
１２４ 免疫複合体
１２６ 複合体

Claims (25)

1. 検体と結合可能な被検体物質をマイクロ分析装置におけるマイクロチャネルに固定化する被検体物質の固定化方法であって、
   前記マイクロチャネルには、固定化用電極と対向電極とが備えられており、
   前記マイクロチャネルに非特異吸着防止処理剤を接触させ、前記マイクロチャネルの中および固定化用電極に対して非特異吸着防止処理を行う非特異吸着防止工程、
   前記被検体物質を含む溶液のｐＨを調整して前記被検体物質を帯電させ、ｐＨ調整後の溶液に、前記非特異吸着防止処理剤と反応可能な官能基および前記被検体物質と反応可能な官能基を有する架橋剤を混合して、混合液を作製する混合液作製工程、並びに、
   前記混合液を前記マイクロチャネルに接触させ、前記マイクロチャネルの中に設けられた前記固定化用電極と前記対向電極との間に電流を流し且つ前記固定化用電極に前記被検体物質が帯電した電位と極性が反対の電位を供給するような可変電圧を印加し、前記被検体物質を電気的に前記固定化用電極に誘引して、さらに前記固定化用電極に活性化エネルギーを付与して、前記被検体物質を、非特異吸着防止処理が施された前記固定化用電極に、前記非特異吸着防止処理剤と架橋させて固定化する固定化工程
   を含むことを特徴とする被検体物質の固定化方法。
2. 前記架橋剤は、光架橋剤であり、前記非特異吸着防止処理剤と反応可能な官能基は、光反応性置換基であり、前記被検体物質と反応可能な官能基は、光反応性置換基を有しており、かつ前記活性化エネルギーは、光エネルギーであることを特徴とする請求項１に記載の被検体物質の固定化方法。
3. 前記非特異吸着防止処理を行う前に、前記固定化用電極の少なくとも一部を合成高分子の層で被覆することを特徴とする請求項１または２に記載の被検体物質の固定化方法。
4. 前記固定化用電極と前記対向電極との間に印加する可変電圧は、１Ｖ以上であることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の被検体物質の固定化方法。
5. 前記ｐＨ調整後の溶液における被検体物質の濃度は、０．０１μｇ／ｍｌ以上、１０μｇ／ｍｌ以下の範囲内であることを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の被検体物質の固定化方法。
6. マイクロチャネルを備え、検体と結合可能な被検体物質が前記マイクロチャネルに固定化されたマイクロ分析装置であって、
   前記マイクロチャネルには、固定化用電極と対向電極とが備えられており、
   前記マイクロチャネルの固定化用電極は非特異吸着防止処理剤で被覆されており、
   前記固定化用電極は、前記被検体物質を電気的に当該固定化用電極に誘引する電極であり、
   前記被検体物質は、非特異吸着防止処理が施された前記固定化用電極に、前記非特異吸着防止処理剤と反応可能な官能基および前記被検体物質と反応可能な官能基を有する架橋剤により、前記非特異吸着防止処理剤と架橋して固定化されていることを特徴とするマイクロ分析装置。
7. 前記架橋剤は、光架橋剤であり、前記非特異吸着防止処理剤と反応可能な官能基は、光反応性置換基であり、かつ前記被検体物質と反応可能な官能基は、光反応性置換基を有していることを特徴とする請求項６に記載のマイクロ分析装置。
8. 固定化用電極の少なくとも一部は、合成高分子の層で被覆されており、
   前記合成高分子の層は、前記非特異吸着防止処理剤で被覆されていることを特徴とする請求項６または７に記載のマイクロ分析装置。
9. 前記マイクロチャネルには、２つ以上の前記固定化用電極が設けられ、
   前記２つ以上の固定化用電極の下流側または上流側には、対向電極が設けられていることを特徴とする請求項６〜８のいずれか１項に記載のマイクロ分析装置。
10. 前記マイクロチャネルに液体を接触させるための１つの注入孔および液体を排出するための１つの排出孔を更に備えており、
    前記注入孔と前記排出孔とは、１本の前記マイクロチャネルにより接続されていることを特徴とする請求項６〜９のいずれか１項に記載のマイクロ分析装置。
11. 前記マイクロチャネルに液体を接触させるための１つの注入孔および液体を排出するための２つ以上の排出孔を更に備えており、
    前記１つの注入孔と前記２つ以上の排出孔とを接続する前記マイクロチャネルは、前記１つの注入孔からの経路が分岐点で分岐した構造を有し、
    前記分岐点より下流側の前記マイクロチャネルの中には、分岐されたマイクロチャネルの分岐路ごとに前記固定化用電極が設けられており、
    前記分岐点より上流側の前記マイクロチャネルの中には、前記対向電極が設けられていることを特徴とする請求項６〜９のいずれか１項に記載のマイクロ分析装置。
12. 前記固定化用電極の下流側に、電気化学的に活性な物質を検出するための検出用電極が設けられていることを特徴とする請求項６〜１１のいずれか１項に記載のマイクロ分析装置。
13. 前記非特異吸着防止処理剤が、タンパク質であることを特徴とする請求項６〜１２のいずれか１項に記載のマイクロ分析装置。
14. 前記非特異吸着防止処理剤が、合成高分子であることを特徴とする請求項６〜１３のいずれか１項に記載のマイクロ分析装置。
15. 前記合成高分子は、非特異吸着防止処理剤の機能を有していることを特徴とする請求項１４に記載のマイクロ分析装置。
16. 前記非特異吸着防止処理剤が、合成高分子とタンパク質との混合物質であることを特徴とする請求項６〜１３のいずれか１項に記載のマイクロ分析装置。
17. 上記タンパク質が、ウシ血清アルブミン、カゼイン、またはゼラチンであることを特徴とする請求項１３または１６に記載のマイクロ分析装置。
18. 前記合成高分子が、電気的に中性であることを特徴とする請求項１４に記載のマイクロ分析装置。
19. 前記非特異吸着防止処理剤が、ホスホリルコリン基を有する合成高分子であることを特徴とする請求項１８に記載のマイクロ分析装置。
20. 前記光架橋剤が、４−アジド−２，３，５，６−テトラフルオロ安息香酸コハク酸イミドエステル、または、ビス−［（４−アジドサリチルアミド）エチル］ジスルフィドであることを特徴とする請求項６〜１９のいずれか１項に記載のマイクロ分析装置。
21. 前記被検体物質は、抗体または人工抗体であることを特徴とする請求項６〜２０のいずれか１項に記載のマイクロ分析装置。
22. 前記人工抗体は、合成ペプチド、アプタマー、または分子インプリンティングポリマーであることを特徴とする請求項２１に記載のマイクロ分析装置。
23. 前記検体は、血液内成分であることを特徴とする請求項６〜２２のいずれか１項に記載のマイクロ分析装置。
24. 前記血液内成分は、アディポネクチン、レプチン、レジスチンおよびＴＮＦ−αのうちの少なくとも１つを含んでいることを特徴とする請求項２３に記載のマイクロ分析装置。
25. 前記注入孔にポンプが接続されていることを特徴とする請求項６〜２４のいずれか１項に記載のマイクロ分析装置。