CN101236158B - 网织红细胞检测方法及检测装置 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种快速、廉价的检测样本中网织红细胞的方法以及利用该方法对网织红细胞进行检测的装置。本发明的方法可以在利用流式细胞技术的全自动血液分析仪上检测网织红细胞。该方法采用一种红色荧光染料，利用红色激光作为激发光源，可以在60秒钟内完成网织红细胞的自动检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞检测方法及装置，特别是涉及一种网织红细胞的检测方法及检测装置。
背景技术
网织红细胞(reticulocyte)是介于晚幼红细胞和成熟红细胞之间的尚未完全成熟的红细胞。网织红细胞计数是评价骨髓造血功能和红细胞生成活力的重要指标。
在正常生理情况下骨髓从原始细胞到网织红细胞需4天，然后网织红细胞在骨髓中成熟48小时进入外围血液，血液中的网织红细胞继续成熟48小时变成成熟的红细胞。外周血中网织红细胞数量，对于评价骨髓红系造血及网织红细胞从骨髓到外周血的转送速率有重要意义
计数网织红细胞是血液学诊断中评估红细胞生成能力的基础性实验，是贫血的诊断、分型和疗效监测的基础，能够确认骨髓的化疗和移植疗效，监测EPO(促红细胞生成素)的疗效等。
网织红细胞是从骨髓最新被释放到外周血的成熟红细胞的前体细胞，同成熟红细胞相比，其细胞内仍残存少量的RNA。因此，测定网织红细胞的基本原理就是用某种染料与细胞内RNA结合，再通过显微镜镜检或采用流式细胞术(FCM)等方法检测被染色的网织红细胞。
目前，网织红细胞的镜检方法是1949年建立的利用新亚甲蓝(NewMethylene Blue，NMB)活体染色方法。用新亚甲蓝这种染料进行的活体染色被认为是确定网织红细胞的参考方法。
传统采用RNA染料(如新亚甲蓝)镜检法可以直接观察细胞的形态，又不需要昂贵设备，是诊治贫血的基本实验方法。这种方法，需要在显微镜下人工统计大量的细胞数目(例如500到1000)，计数精确性差，而且缓慢、繁琐，受人为因素的干扰较大。而且，临床上用网织红细胞的指标只有网织红细胞百分比计数及其派生的网织红细胞绝对值和生成指数。
目前用于多用途FCM分析网织红细胞最通用的一种染料是EP0226272提出的噻唑橙(thiazole orange，TO)。该荧光染料的一个缺点是他们通常需要很长孵育时间，不能满足自动检测仪器的需要。噻唑橙在室温下需要30-60分钟的孵育时间。US5994138提供了一种改进的试剂体系，将噻唑橙染色的孵育时间从数十分钟减少到数十秒钟。但是，噻唑橙染色需要昂贵的氩离子激光(488nm)作为激发光源。
吖啶橙染色与镜检法相关性较好，染色时间也短，无需细胞固定。但是，吖啶橙能沉淀RNA；这就由于潜在的猝灭而阻碍了对RNA含量的定量测定。此外，吖啶橙不会导致被染色细胞的扩散荧光分布。细胞的年龄分布(依据与荧光成正比的RNA含量)就是不可靠的。吖啶橙对流式细胞仪中的塑料管有很大的亲和力，这将导致背景增加，并且延长从流式细胞仪管道清除染料的过程。
US5773299提供了一种利用非对称花青(unsymmetrical cyanine dye)测量网织红细胞的方法。但是，这种方法同样需要价格高而且体积大的氩离子激光器，所以装置本身价格高且体积大。
WO9532424提供了一种利用Coriphosphine O染色测定网织红细胞的方法。该方法可以在60秒内完成对网织红细胞的染色。但是，这种方法需要采用波长为450nm-540nm的激发光源，优选较少见的绿色激发光源，成本较高。
目前，作为网织红细胞检验金标准的流式细胞仪和大部分的全自动网织红检测仪均采用了昂贵的氩离子激光(488nm)作为光源。仅仅检测器光源就需要数万元的成本。而且生物自身的自发荧光也在这个范围之内，产生一定的干扰。
另外，作为流式细胞仪的常规荧光染料的染色速度慢，通常需要机外人工对样本进行预处理。为了满足自动血液分析仪的检测速度，需要在60秒内完成对网状红细胞的测试。
因此，为了适应全自动血液分析仪进行网织红细胞检测的需要，目前迫切需要开发一种新的可迅速准确检测网织红细胞的方法，该方法必须满足在数十秒钟内自动完成网织红细胞的测量，同时，还要求这种检测方法的实现成本比较低廉。
发明内容
本发明的目的就是针对现有技术的上述问题，提供一种能够在短时间内完成网织红细胞检测且成本低廉的网织红细胞检测方法。
本发明的另一目的在于提供采用上述方法进行网织红细胞检测的装置。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
本发明公开一种网织红细胞检测方法，所述方法包括步骤：
A、将网织红细胞检测试剂与待测全血混匀，制备成测定用试样；
B、将测定用试样导入具有激光光源的检测装置中，检测细胞样本经激光照射的前向低角度散射光强度及荧光强度；
所述网织红细胞检测试剂包括具有如下式(I)或(II)所示的结构的红色激发荧光染料，
其中，R1、R2、R2’、R3、R4、R5、R5’、R6可以相同或不相同，表示氢原子、低级烷基、酰基、低级烷氧基或带苯环的低级烷基，其中R6还可以是苯环；R7为氢原子或氯原子；n为1或2；X-为阴离子。
所述红色激发荧光染料优选具有如下式(III)、(IV)或(V)所示的结构，
所述步骤A中，网织红细胞检测试剂与待测全血混合后于25℃～50℃温度下反应10秒～1分钟。
所述步骤A中，网织红细胞检测试剂与待测全血的混合比例为250∶1～1000∶1。
步骤B中，所述激光光源发射红色区域激光，包括氦氖激光或红色半导体激光。
所述激光光源发射的红色区域激光的波长为600～680nm。
步骤B中，所述前向低角度散射光的散射角度为1～6度。
所述方法进一步包括步骤，绘制前向低角度散射光强度与荧光强度的二维散点图，根据细胞在散点图上的位置确定网织红细胞区域。
本发明还公开了一种网织红细胞检测装置，用于根据上述的方法检测网织红细胞，所述装置包括：
一个流动室，在该流动室中，网织红细胞检测试剂与待测全血混匀后形成的测定用试样呈单细胞通过；
一个用于照射从流动室喷出的细胞样本的激光光源；
一个用于检测细胞被激光光源照射后的前向低角度散射光强度的第一检测器；
一个用于检测细胞被激光光源照射后的荧光强度的第二检测器。
优选的，所述装置还包括一个信号处理单元，所述信号处理单元收集第一检测器的前向低角度散射光强度信号及第二检测器的荧光强度信号，并绘制前向低角度散射光强度--荧光强度的二维散点图，由二维散点图确定网织红细胞的分布。
所述第一检测器优选为光电二极管，所述第二检测器优选为光电倍增管。
由于采用了以上的技术方案，使本发明具备的有益效果在于：
本发明提供了一种快速、廉价的检测样本中网织红细胞的方法。本发明通过采用特定的红色荧光染料，能够在短时间内(60秒内)完成网织红细胞的检测，并且无需人工预处理样本，可在利用流式细胞技术的全自动血液分析仪检测网织红细胞，从而能够实现网织红细胞的自动检测；本发明还可以采用价格低廉的红色激光作为激发光源，极大降低了检测成本。采用本发明的方法及装置利用临床血液样本进行测试，并与手工镜检对照，一致性较好。
附图说明
图1是本发明的一种网织红细胞检测装置的光学检测系统原理框图。FSC-前向散射光，FL-荧光，SSC-侧向散射光。
图2是实施例1中采用本发明的方法及装置对正常血液样本进行检测的散点图。FSC-前向散射光，FL-荧光，RBC-红细胞，RET-网织红细胞，PLT-血小板。
图3是实施例2中采用本发明的方法及装置对异常血液样本进行检测的散点图。FSC-前向散射光，FL-荧光，RBC-红细胞，RET-网织红细胞，PLT-血小板。
图4是实施例3中采用本发明的方法及装置对网织红细胞提纯样本进行检测的散点图。FSC-前向散射光，FL-荧光，RBC-红细胞，RET-网织红细胞，PLT-血小板。
图5是实施例4中采用本发明的方法及装置对血液样本进行检测的散点图。
图6是实施例5中采用本发明的方法及装置对血液样本进行检测的散点图。
具体实施方式
本发明采用一种特定的红色荧光染料对网织红细胞进行染色，染色过程能够在短时间内(60秒内)完成，染色后的细胞采用流式细胞术测定细胞的前向低角度散射光强度和侧向荧光强度，并根据荧光强度的差异来区分血液中的成熟红细胞与网织红细胞。
本发明方法采用一种新型的红色激发荧光染料，为菁类阳离子荧光染料，能够被红色半导体激光器等提供红色区域激光的器件发出的红色激光所激发；该荧光染料能够特异结合细胞内核酸(RNA、DNA)，可以标记网织红细胞内残留的核酸物质。本发明采用红色激发荧光染料具有如下式(I)或(II)所示的结构，
其中，R1、R2、R2’、R3、R4、R5、R5’、R6可以相同或不相同，表示氢原子、低级烷基、酰基、低级烷氧基或带苯环的低级烷基，其中R6还可以是苯环；R7为氢原子或氯原子；n为1或2；X-为阴离子。
本发明中，所述低级烷基通常是指具有1～30个碳原子数的烷基。
本发明优选具有如下式(III)、(IV)或(V)所示的结构的红色激发荧光染料，
本发明采用的红色荧光染料染色速度快，通常孵育10s～40s即可完成染色。荧光染料可渗透到网织红细胞膜内，将细胞质内的RNA加以染色，细胞质内含有RNA的网织红细胞将被染色，且依照RNA含量的多寡反应染色的程度。
本发明中，血液样本为经过抗凝剂处理的待测全血，血液样本不需经过预先固定即可与网织红细胞检测试剂相混合。本发明的方法中，网织红细胞检测试剂与血液样本的混合比例为250∶1～1000∶1，优选为500∶1。混合后在孵育池中进行孵育。孵育温度优选25～50℃，更优选35℃。反应时间将因试剂中含有的色素不同，以及浓度的不同而有差异，优选10秒～1分钟，更优选20秒～40秒，最优选30秒。
随后网织红细胞检测试剂与血液样本混合形成的测定用试样导入具有激光光源的检测装置中进行检测。本发明采用发射红色区域激光光源，所使用红色波长的光源，能够发出所用色素的激发波长附近的红色波长的光，例如600～680nm左右的光，则没有特殊的限制，例如可以使用He-Ne激光器、红色区域的半导体激光器等。本发明优选采用633nm的半导体激光管作为光源，有效降低了光源成本。检测装置可以为利用流式细胞技术的全自动血液分析仪，从而能够实现网织红细胞的自动检测。
待测细胞被制备成单个细胞的悬液，被染色的细胞在注射器或气泵的压力下进入流动室(Flow Cell)。流动室内充满鞘液，在鞘液的约束下，细胞排成单列，由流动室的喷嘴喷出，成为细胞液柱。液柱与入射的光束垂直相交，相交点称为测量区。通过测量区的细胞被激发后，产生荧光和散射光，通过光学系统(透镜、光阑、滤片和检测器等)收集光信号。荧光FL信号强度与细胞结合的荧光染料浓度相关，散射光信号与细胞的大小、形状、质膜和细胞内部的折射率有关。其中，前向散射光FSC与细胞的尺寸相关，可以用来分辨细胞的大小。散射角度小于10的光线称为低角度散射光FSC，该信号与细胞的体积和内容物密切相关。本发明中具体采用了1～6度的前向低角度散射光线。
分别将荧光信号FL与散射光FSC为X和Y两个变量构成一个二维图像。其中，FL与荧光染色程度相关，FSC与细胞的大小有关，由此划分网织红细胞、成熟红细胞、血小板及白细胞的分布，再根据网织红细胞特异性染料的染色，精确地计数网织红细胞和计算网织红细胞的其它参数。
具体而言，由于RNA含量的不同，所以可以将红细胞和网织红细胞区分出来，幼稚的网织红细胞显示最强的荧光，反之成熟红细胞极少或没有荧光。由于DNA和RNA含量的不同，可以将网织红细胞和白细胞区分出来。另外，血小板也被染色，根据荧光强度和体积将其区分出来。
根据荧光强度，将网织红细胞分成低荧光强度网织红细胞、中荧光强度网织红细胞和高荧光强度网织红细胞三部分。
本发明还公开了采用上述方法检测网织红细胞的装置，主要包括：
一个流动室，在该流动室中，网织红细胞检测试剂与待测全血混匀后形成的测定用试样呈单细胞通过；
一个用于照射从流动室喷出的细胞样本的激光光源；
一个用于检测细胞被激光光源照射后的前向低角度散射光强度的第一检测器；
一个用于检测细胞被激光光源照射后的荧光强度的第二检测器。
以及一个信号处理单元，用于收集第一检测器的前向低角度散射光强度信号及第二检测器的荧光强度信号，并绘制前向低角度散射光强度--荧光强度的二维散点图，由二维散点图确定网织红细胞的分布。
图1列出了本发明的检测网织红细胞装置的具体光学检测系统原理框图。其中，光源12为红色激光器，可以为氦氖激光或半导体激光器；光源发出的激光被透镜16准直后照射到流动室14的检测区上；细胞在鞘流的作用下逐个穿过检测区。当血液细胞穿过流动室时，照射到细胞的激光会向四周散射。每一种细胞都有不同的散射特性，可以用来区分不同的细胞。散射角度小于10的光线称为低角度散射光FSC，该信号与细胞的体积和内容物密切相关。这里具体采用了1～6度的前向低角度散射光线，被检测的前向散射光角度是通过光阑30来控制。低角度散射光线经过透镜32整理后被检测器34转化为电信号。前向散射光FSC的检测器34是光电二极管。
在与入射光线垂直的90度方向，检测两个信号：侧向散射光SSC和荧光信号FL。他们都是通过收集透镜18进行收集，经过光栅20后到达二色镜22；其中，侧向散射光SSC被二色镜折射到检测器28。荧光FL透过二色镜通道后，经过滤色片40进一步滤掉激光光源，被检测器42探测到。
侧向散射光检测器28可以是光电倍增管或者光电二极管。
荧光检测器42为光电倍增管。
该装置还包括一个信号处理单元。在网织红细胞检测中，信号处理单元收集前向散射光(FSC)和荧光(FL)通道的信号。荧光信号和散射光信号经过模拟数字转换，分别被划分成4096级。根据这两种信号的强度分布绘制二维散点图，散点图的y轴为前向散射光FSC，x轴为荧光。
网织红细胞(RET)中含有可以被荧光染料染色的核酸，荧光信号比较强。而成熟红细胞(RBC)的荧光强度较弱，故比较靠近y轴。血小板(PLT)的体积较小，而且只能被非特异性染色，荧光强度和前向散射光信号都比较弱，集中在靠近原点的区域。
利用荧光强度的差别辨别成熟红细胞(RBC)和网织红细胞(RET)。并且根据荧光的强度将散点图中RET分为3个区，荧光强度越高，网织红细胞越幼稚。
以下通过具体的实施例对本发明做进一步详细的描述。
以下实施例通过采用本发明的方法及装置利用临床血液样本进行测试，并与手工镜检对照，一致性较好。另外，正常情况下，网织红细胞在血液中的含量很少。我们还进行了提纯后高浓度网织红细胞的测试，进一步验证了散点图上网织红细胞的位置。
实施例1
配置如下组成的网织红细胞测定用试剂。
荧光染料(III) 7mg
NaH2PO4.H2O 53.8mg
Na2HPO4.7H2O 163.4mg
椰油甜菜碱 100mg
精致水 1L
(调整pH为7)
在1毫升的试剂中加入经过抗凝剂处理的血液4微升，在40℃下的孵育池中孵育30秒，形成测定用试样。
测定用试样采用本发明的方法及本发明的带红色半导体激光器的检测装置进行检测，红色半导体激光器的激发波长为633nm～635nm，功率为5mW。通过测定前向低角度散射光FSC强度及荧光FL强度，得到如图2所示的散射图。测量结果显示，该样本中网织红细胞(RET)在总红细胞中所占的比例为1.25％。
另外，将相同血样采用传统手工镜检方法检测，结果网织红细胞(RET)在总红细胞中所占的比例为1.17％。
采用上述网织红细胞检测试剂处理后经仪器检测的结果与手工镜检结果一致性好。
实施例2：
配置如下组成的网织红细胞测定用试剂。
荧光染料(III) 7mg
NaH2PO4.H2O 53.8mg
Na2HPO4.7H2O 163.4mg
椰油甜菜碱 100mg
精致水 1L
(调整pH为7)
在1毫升试剂中加入经过抗凝剂处理的血液4微升，在40℃下恒温放置30秒后，或孵育池中孵育30秒，形成测试用试样。
测定用试样采用本发明方法及本发明的带红色半导体激光器的检测装置进行检测，红色半导体激光器的激发波长为633nm～635nm，功率为5mW。通过测定前向低角度散射光FSC强度及荧光FL强度，得到如图3所示的散射图。
本实施例与实施例1不同之处在于所测定血液样本不同，实施例1所测为正常人血液样本，本实施例所测异常血液样本，含有较高的网织红细胞。测量结果显示，该样本中网织红细胞(RET)在总红细胞中所占的比例为5.08％。传统手工镜检结果为5.22％，两者一致性好。
实施例3：
为了证明网织红细胞在散点图上的位置，我们从血液中提纯了网织红细胞。配置如下组成的网织红细胞测定用试剂。
荧光染料(III) 7mg
NaH2PO4.H2O 53.8mg
Na2HPO4.7H2O 163.4mg
椰油甜菜碱 100mg
精致水 1L
(调整pH为7)
采用与实施例1相同的方法进行检测，结果如图4所示，图4为从全血中提纯分离后的网织红细胞检测散点图。从图中可以很清楚地看到较高浓度的网织红细胞在散点图上的位置分布。
实施例4：
配制如下组成的网织红细胞测定用试剂。
荧光染料(IV) 7mg
磷酸氢二钠 53.8mg
磷酸二氢钠 163.4mg
椰油甜菜碱 100mg
精致水 1L
(调整pH为7)
在1毫升试剂中加入经过抗凝剂处理的血液4微升，在40℃下恒温放置30秒后，或孵育池中孵育30秒，形成测试用试样。
测定用试样采用本发明方法及本发明的带红色半导体激光器的检测装置进行检测，激发波长为633nm～635nm，功率为5mW。通过测定前方低角度散射光强度及荧光强度，得到如图5所示的散射图。其中网织红细胞(RET)在总红细胞中所占的比例为5.35％。
另外，将相同血样采用传统手工镜检方法检测，结果网织红细胞(RET)在总红细胞中所占的比例为5.22％。
采用上述网织红细胞检测试剂处理后经仪器检测的结果与手工镜检结果一致性好。
本样本为异常血液，网织红细胞含量较高。
实施例5：
配制如下组成的网织红细胞测定用试剂。
荧光染料(V) 7mg
磷酸氢二钠 53.8mg
磷酸二氢钠 163.4mg
椰油甜菜碱 100mg
精致水 1L
(调整pH为7)
在1毫升试剂中加入经过抗凝剂处理的血液4微升，在40℃下恒温放置30秒后，或孵育池中孵育30秒，形成测试用试样。
测定用试样采用本发明方法及本发明的带红色半导体激光器的检测装置进行检测，激发波长为633nm～635nm，功率为5mW。通过测定前方低角度散射光强度及荧光强度，得到如图6所示的散射图。其中网织红细胞(RET)在总红细胞中所占的比例为5.35％。
另外，将相同血样采用传统手工镜检方法检测，结果网织红细胞(RET)在总红细胞中所占的比例为5.22％。
采用上述网织红细胞检测试剂处理后经仪器检测的结果与手工镜检结果一致性好。
本样本为异常血液，网织红细胞含量较高。
Claims (12)
1.一种网织红细胞检测方法，所述方法包括步骤：
A、将网织红细胞检测试剂与待测全血混匀，制备成测定用试样；
B、将测定用试样导入具有激光光源的检测装置中，检测细胞样本经激光照射的前向低角度散射光强度及荧光强度；
所述网织红细胞检测试剂包括具有如下式(I)、(II)或(V)所示的结构的红色激发荧光染料，
其中，R1、R2、R2’、R3、R4、R5、R5’、R6可以相同或不相同，表示氢原子、低级烷基、低级烷氧基或带苯环的低级烷基，其中R6还可以是苯 环，所述低级烷基或烷氧基是指具有1～30个碳原子数的烷基或烷氧基；
R7为氢原子或氯原子；n为1或2；X-为阴离子。
2.根据权利要求1所述的一种网织红细胞检测方法，其特征在于：所述红色激发荧光染料具有如下式(III)或(IV)所示的结构，
3.根据权利要求1或2所述的一种网织红细胞检测方法，其特征在于：所述步骤A中，网织红细胞检测试剂与待测全血混合后于25℃～50℃温度下反应10秒～1分钟。
4.根据权利要求3所述的一种网织红细胞检测方法，其特征在于：所述步骤A中，网织红细胞检测试剂与待测全血的混合比例为250∶1～1000∶1。
5.根据权利要求1或2所述的一种网织红细胞检测方法，其特征在于：步骤B中，所述激光光源发射红色区域激光，包括氦氖激光或红色半导体激光。
6.根据权利要求5所述的一种网织红细胞检测方法，其特征在于：所述激光光源发射的红色区域激光的波长为600～680nm。
7.根据权利要求1或2所述的一种网织红细胞检测方法，其特征在于：步骤B中，所述前向低角度散射光的散射角度为1～6度。
8.根据权利要求1或2所述的一种网织红细胞检测方法，其特征在于：所述检测装置为流式细胞检测仪。
9.根据权利要求1或2所述的一种网织红细胞检测方法，其特征在于： 所述方法进一步包括步骤，绘制前向低角度散射光强度与荧光强度的二维散点图，根据细胞在散点图上的位置确定网织红细胞区域。
10.一种网织红细胞检测装置，用于根据权利要求1所述的方法检测网织红细胞，所述装置包括：
一个流动室，在该流动室中，网织红细胞检测试剂与待测全血混匀后形成的测定用试样呈单细胞通过；
一个用于照射从流动室喷出的细胞样本的激光光源；
一个用于检测细胞被激光光源照射后的前向低角度散射光强度的第一检测器；
一个用于检测细胞被激光光源照射后的荧光强度的第二检测器。
11.根据权利要求10所述的一种网织红细胞检测装置，其特征在于：所述装置还包括一个信号处理单元，所述信号处理单元收集第一检测器的前向低角度散射光强度信号及第二检测器的荧光强度信号，并绘制前向低角度散射光强度--荧光强度的二维散点图，由二维散点图确定网织红细胞的分布。
12.根据权利要求10或11所述的一种网织红细胞检测装置，其特征在于：所述第一检测器为光电二极管，所述第二检测器为光电倍增管。
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