CN1323395A - 鉴别网状细胞的试剂组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用光学仪器从血样中其它类型的细胞中鉴别出网状细胞的试剂组合物和方法。特别地是,该试剂组合物包含一种核酸染料和球化试剂。该方法能够鉴别网状血小板和网状红细胞。此外,该方法同时能够测定血样中网状红细胞和成熟红细胞的血红蛋白。

Description

鉴别网状细胞的试剂组合物和方法
本发明涉及一种用光学测量法，从血样中其它类型的细胞中鉴别出网状细胞的试剂组合物和方法。特别是，该试剂组合物包含一种核酸染料和球化试剂。该方法能够鉴别网状血小板和网状红细胞。此外，该方法还提供了通过使用适当的电学和光学测量，同时逐个细胞地测定血样中血红蛋白。
网状细胞被定义为任何含有网状组织的血细胞。网状细胞包括网状红细胞和网状血小板。网状红细胞通常被称为网织红细胞(reticulocytes)。
网状细胞的鉴别集中在网织红细胞的鉴别上。适于自动血液学分析的网织红细胞计数方法的现有技术是以一些试剂为基础的，这些试剂含有吖啶橙(AO)、恶嗪750、噻唑橙(TO)及其衍生物、和coriphosphine-O(CPO)。当与RNA结合时，吖啶橙、噻唑橙和coriphosphine-O都是亮荧光性的。这些染料中的每一种都是细胞膜渗透性的，即它们可以自由通过网状细胞的细胞膜。这使它们在自动血液学的应用中极具吸引力。然而，上述每种试剂均存在各自的分析方法及问题。
使用吖啶橙(AO)的例子见Fan等人的美国专利5,075,556、5,360,739和5,411,891；又见下列出版物：Vander等人，(1993),J,Lab.Clin.Med,62:132；Thaer等人，(1970)，“显微荧光测定法分析哺乳动物外周血中的网状细胞数量”，细胞学自动控制(Cytology Automation),DMD Evans(ed.),E&S Livingstone，爱丁堡(Edinburgh),(1970)，第180-195页；Seligman等人，(1983)，美国血液学杂志(American L,Hematol.),14：第57-66页。
使用恶嗪750的例子见Fan等人的美国专利5,284,771and5,633,167；使用恶嗪750或新亚甲基兰的例子见Colella等人的美国专利5,350,695和5,438,003。
使用噻唑橙(TO)的例子见美国专利Nos.4,883,867和4,957,870；又见出版物：L.G.Lee等人，血细胞计数(Cytometry),(1986),7:508；VanHove等人，(1990)，临床实验血液学(Clin.Lab.Hemat.),12:287-299；Carter等人，(1989)，临床实验血液学(Clin.Lab.Haemat.),11:267-271。
使用coriphosphine-O(CPO)的例子见Shenkin的美国专利No.5,639,666。
此外，还开发出其它用于分析网状细胞的试剂和自动检测方法。Kuroda等人的美国专利No.4,985,174公开了一种含有金胺O(auramine-O)的试剂用于全血样品中网状细胞的荧光染色，以便用流式细胞仪分析网状细胞。Kim等人的美国专利5,773,299和5,691,204公开了一种不对称的花青染料。
另一种形式的网状细胞是网状血小板。网状血小板在巨核细胞破裂后释放入外周血。新形成的血小板虽然无核，但含有粗面内质网和信使RNA(mRNA)，也能合成少量蛋白。由于mRNA不稳定、在动物模型中24小时内会发生降解，新形成血小板的测定具有相当大的临床用途，用以监测血栓形成及血小板更新。
基于噻唑橙分析网状血小板的现有技术见Robinson等人的文章，(1998)，“网状血小板的流式细胞计数分析：用荧光染料染色大部分非特异性标记的密集颗粒的证据”，英国血液学杂志(British Journal ofHaematology),100，第351-357页。以及Richards等人的文章，(1996)，“外周血祖细胞及骨髓移植后网状血小板的测量：骨髓再生和使用血栓形成素的启示”，骨髓移植(Bone Marrow Transplantation),17，第1029-1033页。此外，金胺O的使用见Watanabe等人的文章，(1995)，“在检测血小板生成过程中的网状血小板自动测量”，欧洲血液学杂志(Eur.J,Haematol),54，第163-171页。这两种染料都是荧光性的核酸染料，在488nm可以被激发，并适于在标准的流式细胞仪中进行氩激光分析。
在本发明公开以前，检测网状血小板的现有技术没有任何标准化的结果或者一套方法。基本上，每个实验室设定自己的操作标准和检测系统。一些但并非全部实验室从以往分析中得出的结论是网状血小板约占正常血小板数量的2％至20％。
因此，需要一种特异性的试剂组合物和一种方法，使得能够在60秒内对网状细胞进行准确定量。此外，这种试剂和方法特别适用于网状血小板的自动检测。
综上所述，本发明的目的是提供一种试剂组合物和方法，以便通过光学测量从血样中其它类型的细胞中鉴别出网状细胞。
根据本发明的一个方面，提供了一种鉴定网状细胞亚类的试剂组合物，该试剂组合物含有coriphosphine-O，一种球化试剂和一种缓冲液。
根据本发明的另一个方面，提供了一种在自动血液分析仪上，从含有网状细胞和非网状细胞的血样中鉴定出网状细胞的方法。该方法包括将含有网状细胞的血样与含有异染染料和球化试剂的试剂组合物相混合，形成细胞悬液；用少于60秒的时间温育细胞悬液，使试剂组合物将包含在血细胞中的单链和双链核酸染色；用光的激发波长激发所述样品；相对于出现的由光散射、直流电、无线电频率和荧光中至少一个参数控制的第二种荧光信号，检测细胞悬液中出现的第一种荧光信号，所述至少一个参数用于鉴定白细胞、红细胞、血小板；根据上述测量确定样品中网状细胞的数目。
正如从下文对优选实施例的详细描述中可以更好理解的，本发明与现有技术相比，其优点体现在提供了一种在60秒内鉴定网状细胞的新方法，特别是在鉴别网状血小板方面更具优势。
本发明及其各种优点可以从下文对优选实施例的详述中得到更好理解，附图作为参照，其中不同字符代表不同部分。
图1A-1C是实施例1鉴定网状红细胞的三张柱状图。
图2A-2C是实施例2用每个细胞的血红蛋白鉴定网状红细胞的三张柱状图。
图3A-3B是实施例3鉴定网状血小板的柱状图和曲线图。
图4是流式细胞仪的光学示意图，该仪器可用于实现本发明的方法。
图5是实施例4中血小板数量的平均荧光强度随温育时间变化的曲线图。
本发明涉及一种区分网状细胞的试剂组合物和方法，还涉及同时逐个细胞地测定血样中血红蛋白浓度的方法。特别地是，该方法可以鉴定网状血小板。在第一个实施例中，本发明的试剂组合物包含coriphosphine-O，一种球化试剂和一种缓冲液。
已经发现coriphosphine-O是用于网状细胞染色的有效染料。coriphosphine-O是一种荧光染料，它不会引起网状红细胞或网状血小板细胞内的核糖核酸发生沉淀。coriphosphine-O(CPO)又被称为基本的七种黄色染料，可从Pfaltz&Bauer公司在康涅狄格州(Connecticut)沃特伯里市(Waterbury)的分公司(Division of Aceto Corporation)得到。
在流式细胞仪中使用荧光和光散射，染料具有指示网状细胞的作用。此外，本发明可以将这些类型的细胞快速染色，以便在装备有荧光和其它可测量形式的仪器中进行分析，可测量形式包括光散射、直流电(DC volume)和无线电频率(RF)。
通过使用含有染料coriphosphine-O和球化试剂的试剂组合物，可以快速检测并计算出全血样品中的网状细胞。此外，该试剂组合物还具有分别染色网状细胞、减少样品对分析干扰的优点，如减少细胞颗粒、有核红细胞和豪厄尔-若利小体(Howell-jolly)的影响。此外，该试剂组合物还可以检测并计量全血样中的网状血小板。
试剂组合物中coriphosphine-O染料的浓度范围约从0.05μg/ml至50μg/ml，试剂组合物中染料的优选范围从0.5μg/ml至30μg/ml，最佳浓度范围从1μg/ml至15μg/ml。如果染料浓度超过50μg/ml，背景荧光会干扰网状细胞的测量，如果染料浓度低于0.05μg/ml，则细胞不能达到准确测量需要的足量染色。
此外，该试剂组合物含有一种球化试剂，球化试剂以引起网状细胞(如网状血小板、网状红细胞、红细胞)等体积球化的有效剂量使用，以消除网状细胞分析中人为造成的定向。理想地，球化试剂是一种可以使红细胞和网状细胞等体积球化的两性离子表面活性剂。优选的两性离子表面活性剂是烷基酰胺甜菜碱或烷基甜菜碱，如月桂基氨基丙基三甲胺乙内酯，柯卡氨基丙基三甲胺乙内酯(cocoamidopropylbetaine)，柯卡氨基磺酸三甲胺乙内酯(cocoamidosulfobetaine)。其它的球化试剂有N-十四烷基-N-,N-二甲基-3-氨-1-丙烷磺酸酯，N-十二烷基-N-,N-二甲基-3-氨-1-丙烷磺酸酯，n-十二烷基-D-麦芽苷，聚氧丙烯-聚氧乙烯块状共聚物(“Pluronic F127”),n-十四烷基-D-麦芽苷，十二烷基-N-甲基-葡萄糖苷，n-十二烷基-D-吡喃葡糖苷和n-癸基-D-吡喃葡糖苷。目前使用的优选球化试剂是十二烷基-β-D-麦芽苷，该物质宜以溶液形式与一种缓冲液如磷酸盐缓冲液共同使用。
为使血样内的网状细胞和红细胞有效地等体积球化，本试剂组合物中球化试剂的浓度范围约为3μg/ml至40μg/ml，优选范围约为10μg/ml至30μg/ml，最优选的范围约为15μg/ml至25μg/ml。为了达到有效的等体积球化，本试剂组合物的同渗重摩(重量摩尔渗透压浓度)范围是从250毫渗摩尔(mOsm)至350毫渗摩尔(mOsm)。本领域技术人员通过使用盐类和其它同渗重摩活化试剂可以调节同渗重摩。适宜的同渗重摩试剂包括一价或二价碱盐，它们不会引起试剂组合物中的染料发生沉淀或者逆反应。
试剂组合物还含有其它组份，如缓冲液、防腐剂等。合适的缓冲液包括能够那些能够保持组合物pH约6至9的缓冲液，优选6.5至7.7。合适的缓冲液的例子包括磷酸缓冲液或等渗盐液，如ISOTONⅡ(美国专利3,962,125，库尔特有限公司，迈阿密，佛罗里达州)等。应选择不含蛋白质或固定剂的缓冲液。已发现蛋白缓冲液会干扰逐个细胞的血红蛋白测定。此外，含有固定剂的缓冲液会干扰网状细胞的测定。
本发明的第二个实施例提供了一种在自动血液分析仪上，在含有网状细胞和非网状细胞的血样中鉴定网状细胞的方法。方法包括将含有网状细胞的血样与包含异染性染料和球化试剂的试剂组合物相混合，以形成细胞悬液；用少于60秒的时间温育细胞悬液，使得试剂组合物将血细胞中的单链和双链核酸染色；用光的激发波长激发所述样品；相对于出现的由光散射、直流电、无线电频率和荧光中至少一个参数控制的第二种荧光信号，检测悬液中出现的第一种荧光信号，所述至少一个参数用于鉴定白细胞、红细胞、血小板；通过上述测量鉴定样品中网状细胞的数目。
在本发明的方法中，通过将血样与试剂组合物相混合，含有网状细胞和非网状细胞的血样可以被含有coriphosphine-O的试剂组合物染色。血样可以是全血，也可以是成份血。血样和所用试剂组合物的体积应保证足够的细胞浓度以通过仪器。因此，用试剂组合物将血样稀释至1∶100-1∶10,000，优选1∶500-1∶5,000，最优选1∶1,000-1∶2,000。然后在室温温育样品和试剂组合物，不超过60秒，使得试剂组合物将血细胞中的单链和双链核酸染色。优选地，温育时间不超过30秒。更优选地，温育时间不超过15秒。最优选的，温育时间是5至10秒。然后将稀释并染色的血样通过流式细胞仪或其它类似的血液分析仪。已经发现coriphosphine-O对染色十分重要，而固定剂则是不需要的。
coriphosphine-O是一种异染性染料。当coriphosphine-O从核糖核酸(RNA)解离时，受到激发后它极少或不产生红色荧光，在490nm处显示出很强的吸收峰。当coriphosphine-O与网状细胞中的RNA结合时，其光学性质发生非常大的改变。尤其是，当coriphosphine-O与网状细胞中的RNA结合并受到激发时，它发出强烈的红色荧光。最大激发值约在490nm处，最大发射值约在630至700nm处，产生约160nm的斯托克斯(Stokes)位移。由于结合的coriphosphine-O在约490nm处受到激发，光源可以是在约532nm处发出绿光的氩离子激光或倍频的二极管激光。优选地，本发明的方法使用绿光发射激光，因为与在约488nm处使用氩离子激光相比，结合RNA后从激发到发射的比率增强了。尽管用其它波长激发也有效果，但经coriphosphine-O染色的网状细胞优选地用约450nm-540nm的波长激发，更优选用约525-535nm的波长。还发现用540nm以上的波长激发，结合RNA的coriphosphine-O不足以产生检测所需的足量激发。
当coriphosphine-O不与非网状细胞(如白细胞)中的脱氧核糖核酸(DNA)结合时，被激发后极少或不产生绿色荧光。然而，当coriphosphine-O与白细胞中的DNA结合并受到激发时，细胞发出很强的绿色荧光。不与核酸结合的coriphosphine-O缺乏荧光提供了很低的荧光背景，并使操作者可以选择荧光的下限(或“门槛”)用于自动流式细胞分析仪。
而且，当coriphosphine-O被结合时，绿色荧光的量或强度与背景或非特异性染色的量是成比例的，因为coriphosphine-O与其它细胞结构结合。这些其它细胞结构或元素包括异常DNA和亚细胞囊泡，如溶酶体、内涵体和颗粒。这些元素分别与coriphosphine-O结合，产生出不同量的荧光。然而，仅有单链RNA与coriphosphine-O结合，并在特定的培养期内发出红色荧光。
已经证实网状血小板和成熟血小板含有可以被核酸染料染色的二磷酸腺苷(ADP)颗粒。染色后，这些颗粒在红色波段内发出荧光。已发现RNA的染色动力学比包含ADP颗粒的非特异性染色更易进行。还发现用少于60秒的快速染色，网状血小板的RNA比包含在所有血小板内的ADP颗粒更易染色。
在实施本发明方法的过程中，我们将成熟红细胞群的绿色荧光最高值确定为红细胞和网状细胞的下限。对网状血小板而言，使用了比成熟红细胞限值更高的下限，因为网状血小板包含许多细胞结构，导致产生的背景荧光水平比红细胞中观察到的背景荧光水平高。在高于用于DNA的下限时，所有其它的细胞都发出绿色荧光。绿色荧光强度的差别提供了分别染色细胞的优点，使人们能够挑选出非特异细胞，如白细胞。
试剂组合物在测得的单个网状细胞的荧光信号和细胞内核酸含量之间提供了一种近线性关系。在临床上，这给医生提供了除网状细胞数量之外的其它信息，因为RNA含量可用于判断网状细胞的年龄。相应地，通过使用本发明的试剂组合物，临床医生能够得知网状细胞的年龄、网状红细胞和网状血小板的数量。
用本发明试剂组合物染色的网状细胞优选地在自动流式细胞仪上计数，但也可以用手动程序或自动显微镜计数。
流式细胞仪的基本概念实质上是断续通过特定识别区的细胞。利用流体力学的聚焦作用，单个细胞通过识别带，识别带由聚焦的激光光源和测量散射光、荧光及电子性质的检测系统组成。自动流式细胞仪是本领域公知的，本发明不限于使用任何特殊的流式细胞仪。
本发明使用的自动流式细胞仪的具体光路图见图4。图4的光路图用于流式细胞仪，用来测量前散射光、右角散射光、红色荧光(FL2)和绿色荧光(FL1)。该光路图大致由10所示，激光12作光源，它在约530nm的波长处工作。由激光12发出的光被柱状透镜16汇聚，再照射以常规方式流经贯流分析池14的血样。
当样品中染色的血细胞被激光激发后，它们产生散射光和荧光。右角散射光和荧光(FL1和FL2)被聚光透镜18汇聚，从孔20通过，落到分光镜22上。分光镜22反射右角散射光24，传输荧光26。从分光镜22反射的右角散射光24在光电倍增管或光电二极管28中被检测。前射光可以用光电倍增管或光电二极管(图中未显示)中适宜的传感器检测。在通过分光镜22的荧光26中，绿色荧光32被分光镜30反射，红色荧光38透过该分光镜。被反射的绿色荧光32穿过有涂膜的光学滤镜34，在光电倍增管36被检测。被传输的红色荧光38透过有涂膜的光学滤镜40，在光电倍增管42被检测。
这样，经本发明试剂组合物染色的网状细胞可以用佛罗里达州迈阿密市库尔特有限公司销售的COULTERXLTM流式细胞仪进行检测和计数。在自动流式细胞仪的使用中，成熟血细胞的荧光分布用于确定网状细胞计数的荧光下限。
用自动流式细胞仪检测和计数用本发明试剂组合物染色的网状红细胞，得到的结果与用已知标准网状红细胞计数方法得到的结果相关性极高，标准方法使用了新亚甲兰或吖啶橙或噻唑橙。
然而，以往网状血小板测量法的误差高达50％。以往用核酸染料的测量法假定所有被染色的血小板都是网状的。但根据本发明，已经发现染色的血小板来自特异性和非特异性与核酸染料结合的血小板。因此，本发明的试剂组合物和方法提供了鉴别特异性染色的网状血小板和非特异性染色的网状血小板的可能。
此外，本发明的方法提供了一种用合适的光学和电子测量法，同时逐个细胞地测定血样中血红蛋白的方法。网状细胞的鉴定是用光散射和荧光测定在一个聚焦的带有外鞘液的贯流分析池完成的。光散射的测量结合细胞体积的信息，可以在单个细胞的基础上确定一个红细胞内血红蛋白的浓度，提供逐个细胞的血红蛋白浓度测定。
用本发明的方法分析血样，人们能够得到每个细胞的血红蛋白信息，因为该试剂组合物不会干扰数据收集。适当地控制网状红细胞的量，用最初控制细胞群测量中所使用的同样的光散射和体积测量法，能够实现网状红细胞逐个细胞的血红蛋白测定。
参照下列实施例可以更好地理解本发明。但是，本发明并不限于所描述的实施例。
实施例1
网状细胞的鉴定
将患者的血样收集到三磷酸EDTA(K3EDTA)中。将0.002ml患者血样加入2.0ml试剂组合物中。将样品混合，在室温温育约25秒。然后在流式细胞仪上488nm处分析血样。
测量前散射光(FS)，侧散射光(SS)和两个荧光(FL)参数以分析网状细胞。在限制细胞大小和颗粒鉴别出细胞类型(如白细胞、血小板和红细胞等)之后，用红色荧光对出现的绿色荧光作图，区别出网状细胞和非网状细胞。
图1A-1C的三个散布图说明了确定网状细胞群的分析。图1A是光散射柱状图的例子，表明控制红细胞(RBC)、白细胞和血小板的数目。图中血小板leukocyte用thrombocyte表示。图1B是红色荧光(FL2)相对于绿色荧光(FL1)的点图，红细胞的控制由图1A确定。红色荧光的参数表明网状红细胞和非网状红细胞的区别。绿色荧光的参数表示消除了非红细胞。图1C显示了血小板的荧光分布，表明成熟血小板和网状血小板(其控制由图1A确定)之间的差别。
实施例2
用每个细胞的血红蛋白鉴定网状红细胞
收集第二个患者的血样到三磷酸EDTA(K3EDTA)中。将0.002ml患者血样加入2.0ml本试剂组合物中。将样品混合，室温温育约25秒。然后在532nm处用流式细胞仪分析血样。
在网状细胞和非网状细胞分析中，测定前散射光(LS)，直流电(DC)和荧光参数。如图2B所示，用DC对FL2作图，区别网状和非网状细胞。如图2A所示，用光散射(LS)对DC作图，进一步区分网状和非网状细胞。用由图2A获得的LS和DC的信息，并控制图2B中网状细胞和非网状细胞，可以测定成熟红细胞和网状红细胞每个细胞的血红蛋白，见图2C。
实施例3
网状细胞试验的特性
收集第三个患者的血样到三磷酸EDTA(K3EDTA)中。将0.002ml患者血样加入2.0ml本试剂组合物中。将样品混合，在室温温育约25秒。然后在532nm处用流式细胞仪分析血样。
测定前散射光(FS)，侧散射光(SS)和红色荧光(FL)参数以分析网状细胞。图3A表明温育时间从25秒减至约5.5秒，可以得到类似的网状细胞计数。记录重复分析的结果，样品1和2表示血细胞样品1和2的网状细胞数异常偏高，样品3表示来自正常供者的血细胞样品中正常的网状细胞数。
图3B显示了用本发明试剂组合物的网状细胞分析与不含球化试剂的网状细胞分析的比较。得到的数据与作为参照的、用噻唑橙的网状细胞分析呈线性关系。试剂组合物的斜率基本上是1，表明与参照方法的相关性。
相应地，该图表明本发明的方法可以在25秒内完成，并与参照方法具有同样的准确度。
实施例4
网状血小板和成熟血小板的分析方法
图5是用coriphosphine-O的染色动力学测定。在一个分析中，将一种脱粒剂加入全血样中，使在网状血小板和成熟血小板包含的密集颗粒中发现的ADP脱颗粒。第二个分中不用脱粒剂。本实施例中的脱粒剂是凝血酶受体激活蛋白(TRAP)。
已知网状血小板含有RNA，而成熟血小板不含RNA。因此，用血小板群的平均荧光强度对温育时间作图，可以确定ADP染色在全部染色中的分布。这能够区分网状血小板和成熟血小板。
以上参照一些特别优选的实施例描述了本发明。然而应当理解，在不脱离本发明精神实质的前提下可以作出多种改变，这样的改变在本发明权利要求的范围之内。

Claims (18)

1．一种鉴定网状细胞亚类的试剂组合物，该组合物含有coriphosphine-O、一种球化试剂和一种缓冲液。
2．权利要求1的试剂组合物，其中coriphosphine-O的浓度约为0.05μg/ml至50μg/ml。
3．权利要求2的试剂组合物，其中coriphosphine-O的浓度约为0.5μg/ml至30μg/ml。
4．权利要求1的试剂组合物，其中球化试剂选自由烷基酰胺甜菜碱、烷基甜菜碱、N-十四烷基-N-,N-二甲基-3-氨-1-丙烷磺酸酯、N-十二烷基-N-,N-二甲基-3-氨-1-丙烷磺酸酯、n-十二烷基-D-麦芽苷、n-十四烷基-D-麦芽苷、十二烷基-N-甲基-葡萄糖苷、n-十二烷基-D-吡喃葡糖苷和n-癸基-D-吡喃葡糖苷组成的组。
5．权利要求4的试剂组合物，其中的球化试剂是十二烷基-β-D-麦芽苷。
6．权利要求4的试剂组合物，其同渗重摩约为250至350mOsm。
7．权利要求1的试剂组合物，其中pH值约为6至9。
8．权利要求1的试剂组合物，其中所述试剂组合物不包含蛋白质或固定剂。
9．一种用自动血液分析仪在包含网状细胞和非网状细胞的血细胞样品中鉴别出网状细胞的方法，方法包括：
a．将包含网状细胞的血细胞样品与含有异染性染料和球化试剂的试剂组合物相混合，以形成细胞悬液；
b．用少于60秒的时间温育细胞悬液，使得试剂组合物将血细胞中的单链和双链核酸染色；
c．用光的激发波长激发所述细胞悬液；
d．相对于出现的由光散射、直流电、无线电频率和荧光中至少一个参数控制的第二种荧光信号，检测细胞悬液中出现的第一种荧光信号，所述至少一个参数用于鉴定白细胞、红细胞、血小板；而且
e．通过所述检测确定样品中网状细胞的数量。
10．权利要求9的方法，其中网状细胞包括网状血小板。
11．权利要求9的方法，其中网状细胞包括网织红细胞。
12．权利要求9的方法，其中所述至少一种用于鉴定白细胞、红细胞和血小板的参数包括光散射。
13．权利要求9的方法，其中染料包括coriphosphine-O。
14．权利要求9的方法，其中球化试剂包括一种烷基酰胺甜菜碱、一种烷基甜菜碱、N-十四烷基-N-,N-二甲基-3-氨-1-丙烷磺酸酯、N-十二烷基-N-,N-二甲基-3-氨-1-丙烷磺酸酯、n-十二烷基-D-麦芽苷、n-十四烷基-D-麦芽苷、十二烷基-N-甲基-葡萄糖苷、n-十二烷基-D-吡喃葡糖苷或n-癸基-D-吡喃葡糖苷。
15．权利要求14的方法，其中球化试剂包括十二烷基-β-D-麦芽苷。
16．权利要求9的方法，其中用流式细胞仪激发样品并测量荧光，其中所述温育过的血样通过自动分析仪的识别区。
17．权利要求9的方法，其中的血样是全血。
18．权利要求9的方法，该方法还包括逐个细胞地检测样品中包含的血细胞的血红蛋白浓度。
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Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102016576A (zh) * 2008-05-02 2011-04-13 爱科来株式会社 白细胞的分析方法及其使用的分析试剂
CN104075981A (zh) * 2013-03-29 2014-10-01 希森美康株式会社 血细胞分析装置及血细胞分析方法
CN104903699A (zh) * 2012-12-31 2015-09-09 贝克曼考尔特公司 未成熟血小板的计数系统和方法
CN108012553A (zh) * 2015-09-18 2018-05-08 索尼公司 信息处理设备、信息处理方法和信息处理系统
CN108291864A (zh) * 2015-11-04 2018-07-17 西门子医学诊断产品有限责任公司 用于探测中性粒细胞胞外陷阱的方法
CN108956431A (zh) * 2018-08-09 2018-12-07 苏州叠代生物科技有限公司 一种单采血小板制品中残留细胞的检测方法
CN109946218A (zh) * 2019-04-01 2019-06-28 北京工业大学 一种利用sybr green i单染色技术检测污水处理活性污泥中聚糖菌的方法
CN111656188A (zh) * 2018-04-28 2020-09-11 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 试剂、分析血小板的方法及血液细胞分析仪
CN111801568A (zh) * 2018-04-28 2020-10-20 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 测定血小板浓度的方法及系统

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6271035B1 (en) * 1998-10-20 2001-08-07 Coulter International Corp. Methods and compositions for rapid staining of nucleic acids in whole cells
US6228652B1 (en) * 1999-02-16 2001-05-08 Coulter International Corp. Method and apparatus for analyzing cells in a whole blood sample
AU775260B2 (en) * 1999-03-31 2004-07-29 Bayer Corporation Single channel, single dilution detection method
US6200500B1 (en) * 1999-08-20 2001-03-13 Streck Laboratories, Inc. Hematology control and system for multi-parameter hematology measurements
US6723563B2 (en) 2001-12-03 2004-04-20 Streck Laboratories Inc. Hematology reference control
US6653137B2 (en) 2001-12-03 2003-11-25 Streck Laboratories Inc. Hematology reference control
US6955872B2 (en) * 2003-03-20 2005-10-18 Coulter International Corp. Dye compositions which provide enhanced differential fluorescence and light scatter characteristics
US7390662B2 (en) * 2005-11-09 2008-06-24 Beckman Coulter, Inc. Method and apparatus for performing platelet measurement
US7541190B2 (en) * 2005-02-07 2009-06-02 Beckman Coulter, Inc. Method of measurement of cellular hemoglobin
US7678578B2 (en) * 2005-02-07 2010-03-16 Beckman Coulter, Inc. Cell permeabilization and stabilization reagent and method of use
US7354767B2 (en) * 2006-03-16 2008-04-08 Beckman Coulter, Inc. Reference control composition containing a nucleated red blood cell component made of non-nucleated blood cells
WO2008061073A2 (en) 2006-11-14 2008-05-22 Beckman Coulter, Inc. Hematology linearity control composition system and method of use
US7618821B2 (en) 2007-04-13 2009-11-17 Streck, Inc. Simulated blood components and methods
CN101349644B (zh) * 2007-07-20 2012-06-27 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 一种白细胞分类试剂和其使用方法
US8102161B2 (en) * 2007-09-25 2012-01-24 Tdk Corporation Stable output in a switching power supply by smoothing the output of the secondary coil
JP2011502264A (ja) * 2007-10-29 2011-01-20 ベックマン コールター， インコーポレイテッド 血小板集団の迅速な抗体ベースの分析のための方法
CN101475754A (zh) * 2008-01-04 2009-07-08 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 不对称菁类荧光染料,组合物及在生物样品染色中的用途
CN101602762B (zh) * 2008-06-10 2013-10-16 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 不对称菁类化合物、其制备方法及应用
US8603773B2 (en) 2008-09-19 2013-12-10 Beckman Coulter Method and system for analyzing a blood sample
US8512977B2 (en) * 2008-09-19 2013-08-20 Beckman Coulter, Inc. Analyzing reticulocytes
US20100086962A1 (en) 2008-10-08 2010-04-08 Streck, Inc. Hematology controls and methods
CN101726579B (zh) * 2008-10-17 2014-06-18 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 血液检测试剂和方法
US8367358B2 (en) * 2008-12-17 2013-02-05 Shenzhen Mindray Bio-Medical Electronics Co., Ltd. Reagent, kit and method for differentiating and counting leukocytes
CN101988082B (zh) * 2009-07-31 2015-04-08 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 白细胞分类计数试剂、试剂盒及其制备方法和白细胞分类计数的方法
US9097704B2 (en) * 2010-05-05 2015-08-04 Abbott Laboratories Method for hematology analysis
EP4365570A1 (en) * 2022-11-04 2024-05-08 Horiba, Ltd. Measurement method, measurement system, and test reagent kit

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3962125A (en) * 1975-01-13 1976-06-08 Coulter Diagnostics, Inc. Multi-purpose diluent for use in blood analysis by electronic instrumentation of the coulter type
JPS6179163A (ja) * 1984-09-26 1986-04-22 Toa Medical Electronics Co Ltd 血球測定用試薬
JPS61280565A (ja) * 1985-06-06 1986-12-11 Toa Medical Electronics Co Ltd フロ−サイトメトリ−用網状血球測定試薬
US4883867A (en) * 1985-11-01 1989-11-28 Becton, Dickinson And Company Detection of reticulocytes, RNA or DNA
US4957870A (en) * 1985-11-01 1990-09-18 Becton, Dickinson And Company Detection of Reticulocytes, RNA and DNA
US5075556A (en) * 1989-12-01 1991-12-24 Technicon Instruments Corporation Acridine orange derivatives and their use in the quantitation of reticulocytes in whole blood
US5360739A (en) * 1991-12-05 1994-11-01 Miles Inc. Methods for the identification and characterization of reticulocytes in whole blood
US5284771A (en) * 1991-12-05 1994-02-08 Miles Inc. Reagent compositions and their use in sphering cells
US5350695A (en) * 1991-12-05 1994-09-27 Miles Inc. Methods for the identification and characterization of reticulocytes in whole blood
IL113805A0 (en) * 1994-05-23 1995-08-31 Coulter Corp Detection of reticulocytes
US5691204A (en) * 1995-04-21 1997-11-25 Abbott Laboratories Compositions and methods for the rapid analysis of reticulocytes
US5733784A (en) * 1995-11-20 1998-03-31 Abbott Laboratories Reagent system and method for the differentiation and identification of reticulocytes
US5686309A (en) * 1996-01-19 1997-11-11 Coulter International Corp. Method and apparatus for determination of hemoglobin content of individual red blood cells
FR2759166B1 (fr) * 1997-01-31 1999-04-23 Abx Sa Reactif de coloration pour la determination de cellules sanguines
US6114173A (en) * 1997-04-03 2000-09-05 Bayer Corporation Fully automated method and reagent composition therefor for rapid identification and characterization of reticulocytes erythrocytes and platelets in whole blood
JPH10307135A (ja) * 1997-05-02 1998-11-17 Toa Medical Electronics Co Ltd 赤血球形態異常の検出方法
US6228652B1 (en) * 1999-02-16 2001-05-08 Coulter International Corp. Method and apparatus for analyzing cells in a whole blood sample

Cited By (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102016576A (zh) * 2008-05-02 2011-04-13 爱科来株式会社 白细胞的分析方法及其使用的分析试剂
CN104903699A (zh) * 2012-12-31 2015-09-09 贝克曼考尔特公司 未成熟血小板的计数系统和方法
US9939453B2 (en) 2012-12-31 2018-04-10 Beckman Coulter, Inc. Immature platelet enumeration systems and methods
CN104075981A (zh) * 2013-03-29 2014-10-01 希森美康株式会社 血细胞分析装置及血细胞分析方法
CN108012553A (zh) * 2015-09-18 2018-05-08 索尼公司 信息处理设备、信息处理方法和信息处理系统
CN108291864A (zh) * 2015-11-04 2018-07-17 西门子医学诊断产品有限责任公司 用于探测中性粒细胞胞外陷阱的方法
CN111656188A (zh) * 2018-04-28 2020-09-11 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 试剂、分析血小板的方法及血液细胞分析仪
CN111801568A (zh) * 2018-04-28 2020-10-20 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 测定血小板浓度的方法及系统
CN111801568B (zh) * 2018-04-28 2024-05-24 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司 测定血小板浓度的方法及系统
CN108956431A (zh) * 2018-08-09 2018-12-07 苏州叠代生物科技有限公司 一种单采血小板制品中残留细胞的检测方法
CN109946218A (zh) * 2019-04-01 2019-06-28 北京工业大学 一种利用sybr green i单染色技术检测污水处理活性污泥中聚糖菌的方法
CN109946218B (zh) * 2019-04-01 2021-10-15 北京工业大学 一种利用sybr green i单染色技术检测污水处理活性污泥中聚糖菌的方法

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Publication number Publication date
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JP4968805B2 (ja) 2012-07-04
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DE69940321D1 (de) 2009-03-05
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