CN108291864A - 用于探测中性粒细胞胞外陷阱的方法 - Google Patents

Abstract

一种用于探测生物流体的样品(4)中的中性粒细胞胞外陷阱的方法，其中，对生物流体的样品(4)添加对于核酸具有选择性的染料，其中，在样品(4)中染色以后在染料的吸收区内确定多个光学的与颗粒相关的测量值分别作为由第一光学特征的和第二光学特征的测量值组成的元组，其中，在第一光学特征的所有所测量值的部分范围(6)内选择第一光学特征的测量值并且在第二光学特征的所有所测量的值的部分范围(7)内选择第二光学特征的测量值，并且其中，为了探测中性粒细胞胞外陷阱将所选择的测量值的数量与预定的界限值进行比较。

Description

用于探测中性粒细胞胞外陷阱的方法

技术领域

本发明涉及一种用于尤其全自动地探测生物流体样品中、尤其是血样中的中性粒细胞胞外陷阱的方法。本发明此外还涉及一种用于尤其是全自动化地执行所述方法的分析系统。

背景技术

中性粒细胞具有不同的机制，利用这些机制可以用来消灭外周血液中的细菌。其中包括吞噬，此时，中性粒细胞吸纳并吞噬细菌。此外中性粒细胞还可以释放杀菌毒素，从而杀死细菌。中性粒细胞用于消灭细菌的另一个机制是形成并且释放由具有蛋白质的DNA线构成的网，它们构成细胞胞外的、纤维状的基质，这种基质被称为中性粒细胞胞外陷阱或者也被称为胞中性粒细胞外网(NETs)并且用于捕获细菌。然后借助由中性粒细胞释放到中性粒细胞胞外陷阱中的杀菌毒素杀死这些捕获的细菌。中性粒细胞胞外陷阱在杀死细菌之后再次分解并被清除。中性粒细胞胞外陷阱的不完全清除与不同的自身免疫病症相关联。此外认为，中性粒细胞胞外陷阱也是血栓风险在传染时增高的一个原因，因为血小板也可被捕获到中性粒细胞胞外陷阱中从而可使血栓风险升高。此外，中性粒细胞胞外陷阱还与传染性的、炎症性的、自身免疫的和血栓疾病相关联，像例如败血症、妊娠毒血症、疟疾和红斑狼疮。

可以借助电子显微镜或者光学显微镜的分析方法探测中性粒细胞胞外陷阱。此外还可以借助基于抗体的探测方法探测它的存在，例如利用酵素免疫分析法(ELISA)或者借助荧光流式细胞计数法，参见例如2015年出版的《美国血液学杂志》中Gavillet、Mathilde等人发表的文章《用于血样中的中性粒细胞胞外陷阱的直接定量的流式细胞计数法》。然而后者的缺点是，为此需要特殊的抗体。

对中性粒细胞胞外陷阱的探测例如可以帮助在伴随着中性粒细胞胞外陷阱的浓度变化例如升高的自身免疫病症中做出相应的诊断。此外，对中性粒细胞胞外陷阱的探测尤其可以帮助实现例如在存在传染时改进的对血栓风险的评估。另外，在肺部疾病和肿瘤转移的癌症中，中性粒细胞胞外陷阱也可有着重要的作用。应该尽可能全自动化地实现对生物流体中、尤其是血样中的中性粒细胞胞外陷阱的探测。目前只有利用高耗费的、基于抗体的探测方法才有可能。

发明内容

本发明的任务是，提供一种简化的用于探测生物流体样品中的中性粒细胞胞外陷阱的方法，这种方法同样也可以自动地利用光学分析系统进行并且为此不需要抗体。

所述目的根据本发明通过以下方式得以实现，即，为生物流体的样品添加对于核酸具有选择性的染料，其在此为DNA(脱氧核酸)染色，其中，在为样品染色以后在染料的吸收范围内将多个光学的颗粒有关的测量值分别确定为由折射率和吸收度组成的元组，其中，选择具有在所有的所测量的吸收度值的一个部分范围内的吸收度以及具有在所有所测量的折射率的值的一个部分范围内的测量值，并且其中，将所选择的测量值的数量被用于探测中性粒细胞胞外陷阱。

本发明在此从以下考虑出发，即，利用例如以流量几何来执行细胞计数法，此时在细胞表中对比由吸收度和相应的折射率构成的二维测量值时，中性粒细胞胞外陷阱能够比较简单地与网织血小板、成熟的血小板和其他的微粒、例如红细胞和红细胞碎片，在相应的折射率范围内分开。

因为中性粒细胞胞外陷阱包含非常多的核酸，所以在选择性染色以后，其吸收度与包含少量核酸的成熟血小板不同。就此而言，可以在由吸收度和折射率构成的细胞表中为具有较高吸收度的部分范围分配源自于中性粒细胞胞外陷阱的测量值。中性粒细胞胞外陷阱中包含的核酸是DNA。在成熟的血小板中包含的核酸是RNA。

另一方面，红细胞和红细胞碎片由于其血红细胞微粒而显示出相对于中性粒细胞胞外陷阱的更高的折射率，从而可以给较低折射率的部分范围分配源自于中性粒细胞胞外陷阱的测量值。此外，仍然包含比较多的核酸的网织血小板同样也显示出相比中性粒细胞胞外陷阱更高的折射率。包含在网织血小板中的核酸是RNA。

就此而言，通过用细胞计数法获取吸收度和折射率，可以将测量值的部分范围分配给中性粒细胞胞外陷阱。相应选择的测量值的数量被用于确定中性粒细胞胞外陷阱的浓度。在此已经显示，这种相对于小的血细胞、像例如较小的红细胞和细胞碎片的测量，基本上不受干扰。

尤其地，对光学的、颗粒相关的特征的二维细胞计数测量属于对生物流体的自动化光学分析系统的标准方法。然而，借助染料对核酸进行染色迄今主要是用于确定网织红细胞的数量或者比例。然而本发明与之不同。

本发明的主题据此尤其是一种用于探测生物流体样品中的、尤其是血样中的中性粒细胞胞外陷阱的方法，其中，为生物流体的样品添加对于核酸选择性的染料，其中，在染色以后，在样品中染料的吸收范围内将多个光学的、颗粒有关的测量值分别确定为由第一光学特征的测量值组成的元组和第二光学特征的测量值组成的元组，其中，在所有的所测量的第一光学特征的值的部分范围内选择第一光学特征的测量值并且在所有所测量的的第二光学特征的部分范围内选择第二光学特征的测量值，并且其中，将所选择的测量值的数量与一个预设的界限值进行比较从而探测中性粒细胞胞外陷阱。

如果所选择的测量值的数量大于或者等于预设的界限值，那么就在生物流体的样品中探测出了中性粒细胞胞外陷阱。如果所选择的测量值的数量小于预设的界限值，那么就没有在样品中探测出中性粒细胞胞外陷阱。

预设的界限值例如通过相应地测量多个包含不同的已知的浓度的中性粒细胞胞外陷阱的样品来测定。有利地，这些浓度在此处于对于中性粒细胞胞外陷阱与医疗相关的浓度范围中。大部分的样品在此有利的还包括不包含中性粒细胞胞外陷阱和/或仅包含非常少量的中性粒细胞胞外陷阱的样品。

优选地，根据本发明的方法是一种流式细胞计数法。

第一光学特征和第二光学特征例如是颗粒相关的散射光强度、折射率、光强度衰退、吸收度、透射度、荧光度或者反射度。

在一种优选的设计方案中，第一光学特征是散射光强度并且/或者第二光学特征是光强度衰减、优选地是吸收度。

在另一种优选的设计方案中，散射光强度是以从5度到15度、优选地从5度到8度的夹角范围内的角度偏转穿过样品的光的强度。

在另一种优选的设计方案中，借助散射光强度测定折射率，或者将散射光强度用作折射率的度量，其中，所述折射率是第一光学特征。

如果在本发明的设计方案中参考一种散射光强度或者多种散射光强度，那么由此得到本发明的更多如下的实施方式，即，以一个折射率取代一种散射光强度或者以多个折射率取代多种散射光强度。

在另一种有利的设计方案中，散射光强度的部分范围的上限尤其在吸收度上变化地以如下方式选择，即，使得中性粒细胞胞外陷阱的散射光强度与网织血小板和红细胞及红细胞碎片的散射光强度分开，从而排除或者至少最小化干扰。通常一方面红细胞和网织血小板的散射光强度与另一方面中性粒细胞胞外陷阱的散射光强度相互之间差别足够大，以至于能够轻松地通过观察相应的散射光强度来确定相应的界限。这种散射光强度在自动化的分析系统中可以从相应的输出通道提取。

在另一有利的设计方案中，散射光强度的部分范围的下限尤其是在吸收度上变化地以如下方式选择，即，使得中性粒细胞胞外陷阱的光强度衰减与血小板的光强度衰减分开，从而排除或者至少最小化干扰。通常，一方面成熟血小板的光强度衰减与另一方面的中性粒细胞胞外陷阱的光强度衰减相互之间区别足够大，以至于能够轻松地通过观察相应的光强度衰减来确定相应的界限。这种光强度衰减可以在自动化的分析系统中从相应的输出通道提取。优选地，所述光强度衰减是吸收度。

本发明此外还相对于其他通常存在于外围血液中的微粒实现了最大程度无干扰的对中性粒细胞胞外陷阱的获取，该其他的微粒具有或者说引起与中性粒细胞胞外陷阱可比较的光强度衰减、优选地可比较的吸收度、或者可比较的散射光强度、优选地可比较的折射率。这显示了，这些微粒显示出相对于中性粒细胞胞外陷阱更高的折射率和/或者其吸收度具有另一种分布模式，或者相应地显示出更高的散射光强度和/或具有关于光强度衰减的另一种分布模式。

优选地，尤其在光强度衰减或者吸收度上可变的散射光强度的部分范围的下限以如下方式选择，即，使得源自于中性粒细胞胞外陷阱的测量值的至少80％、优选地至少90％、特别优选地至少95％具有相比界限在其上延伸的那些散射光强度更大的散射光强度。优选地，散射光强度的部分范围的下限在此通过其检测界限构成。

优选地，限尤其在散射光强度或者折射率上可变的光强度衰减的或者吸收度的部分范围的上以如下方式选择，即，使得源自于中性粒细胞胞外陷阱的测量值的至少80％、优选地至少90％、特别优选地至少95％具有相比界限在其上延伸的那些光强度衰减或吸收度更小的光强度衰减或更小的吸收度。优选地，光强度衰减或吸收度的部分范围的上限在此通过最大可测量的光强度衰减或者通过最大可测量的吸收度确定。

在另一种有利的设计方案中，光强度衰减的部分范围的界限尤其在散射光强度、以及散射光强度的部分范围的界限上可变地、尤其在光强度衰减可变地以如下方式选择，即，使得源自于中性粒细胞胞外陷阱的测量值的至少80％、优选地至少90％、特别优选地至少95％都在通过所选择的界限确定的部分范围内。优选地，光强度衰减是吸收度，并且/或者散射光强度是折射率。

为了测定分别包含由光强度衰减和散射光强度构成的元组的测量值，例如在流体几何特征中时间分辨地检测分别通过处于测量体积量中的颗粒引起的光束或激光束的散射、反射和/或透射。从在不同的测量几何特征中测得的光学参数中，然后作为测量值分别测定由各个光学特征、尤其还有折射率和吸收度的构成的元组，它们允许推导出以分散相包含在生物流体中的颗粒。所谓的流式细胞计数在此是一种用于分析生物流体的现代光学分析系统的常见的测量方法，正如其例如用于全自动地制作血象图或者诸如此类。优选地因此前述的方法、尤其是全自动化地在用于对在生物流体中的样品进行光学分析的分析系统中执行。优选地使用恶嗪750作为合适的染料。恶嗪750经常被用于核酸的染色，并且在这里用于对中性粒细胞胞外陷阱的DNA染色。其他的对于核酸有选择性的染料例如有亚甲蓝、溴化乙锭和吖啶橙。优选地，光强度衰减是吸收度，并且/或者散射光强度是折射率。

优选地，在添加到生物流体的样品中的对于核酸选择性的染料是一种不与抗体相关的染料。特别优选地，这种染料是一种不与抗体化合的染料。

低色素红细胞(即血红蛋白含量相对较少的红细胞)、网织血小板和成熟的血小板却有可能分别在吸收度的范围内显示接近中性粒细胞胞外陷阱的散射光强度的折射率。出于这个原因，在一种有利的变体方案中，测定所测量的散射光强度的频数分布，并且在其中辨识出在较高的散射光强度范围内的红细胞、网织血小板或成熟血小板的总量，以及辨识在较低的散射光强度范围内的中性粒细胞胞外陷阱的总量。就从这两个相应的总量之间的范围内选择一个散射光强度作为散射光强度的部分范围的上限。以这种方式确保了，最大程度上避免了中性粒细胞胞外陷阱的测量值和红细胞、网织血小板或成熟血小板的测量值之间可能的干扰。类似地可以在关于中性粒细胞的和其他颗粒的散射光强度选择的界限方面来执行。类似地同样可以在关于通过中性粒细胞胞外陷阱和其他的颗粒、例如红细胞、网织血小板和/或成熟血小板决定的光强度衰减的界限方面的选择来执行，从而在较大程度上避免样品中的各种的其他颗粒对中性粒细胞胞外陷阱的测量值的可能的干扰。优选地，光强度衰减是吸收度，并且/或散射光强度是折射率。

在所述方法的另一种优选的设计方案中，在生物流体的样品中，尤其自动化地测量出网织血小板、成熟血小板和/或红细胞的吸收度和/或折射率、或源自于这些细胞的光强度衰减和/或散射光强度。这有以下优点，即，使得除了探测中性粒细胞胞外陷阱以外还可以关于其他颗粒地描述样品特征。

在所述方法的另一种优选的设计方案中，所选择的测量值的数量用于定性和/或定量地探测中性粒细胞胞外陷阱。这有以下优点，即，能够关于包含在其中的中性粒细胞胞外陷阱地更加准确地描述样品的特征。

在所述方法的另一种优选的设计方案中，所选择的测量值的数量被用于确定中性粒细胞胞外陷阱的浓度。中性粒细胞胞外陷阱的浓度例如可以以每毫升生物流体样品中中性粒细胞胞外陷阱的数量为单位给出。中性粒细胞胞外陷阱的数量的提供在此例如可以以任意的分配中性粒细胞胞外陷阱的、与颗粒相关的测量值的数量直接成比例的单位实现。例如，用来给出中性粒细胞胞外陷阱的数量的单位可以借助合适的包含预定数量的中性粒细胞胞外陷阱的样品进行校准。这有以下优点，即，能够关于包含在其中的中性粒细胞胞外陷阱地特别准确地表述样品特征。

在所述方法的优选实施方式中，样品在探测中性粒细胞胞外陷阱时不包含添加给样品的抗体。

在所述方法的优选实施方式中，样品包含中性粒细胞胞外陷阱。

在所述方法的另一种优选实施方式中，探测中性粒细胞胞外陷阱有助于对传染性、炎症的、自身免疫的和/或血栓的疾病的诊断。优选地，这些疾病是败血症、血栓风险增高的疾病和/或各种自身免疫疾病。

在所述方法的另一种优选的实施方式中，探测中性粒细胞胞外陷阱被用来诊断传染性、炎症的、自身免疫的和/或血栓的疾病。优选地，这些疾病是败血症、血栓风险增高的疾病和/或各种自身免疫疾病。

本发明此胞外还涉及一种用于对生物流体样品、尤其是血样进行光学分析的分析系统，它设置并且设计用于尤其全自动地执行前面所述类型的方法。

在优选的实施方案中，分析系统包括流式细胞仪。

“生物流体”这个概念描述的是一种人类的或者动物的、可以包含中性粒细胞胞外陷阱的体液，尤其是血液。

“探测中性粒细胞胞外陷阱”是指所有形式的、对中性粒细胞胞外陷阱的存在在质量或数量上的探测。这尤其是也可以包括明确地和/或粗略地确定中性粒细胞胞外陷阱的浓度。

进行定量的探测时，测量被分析物的、在这里就是中性粒细胞胞外陷阱的量、浓度和/或活性。“定量的探测”这个概念也包括半定量的方法，这些方法仅仅获取样品中被分析物的大致的量、浓度和/或活性，或者只能用于提供相对数量、浓度或活性。在质量上探测要理解为探测在样品中确实存在分析物，或者显示样品中分析物的量、浓度或活性在某个特定的或者多个特定的阈值以下或以上。

附图说明

借助附图更详尽地阐述本发明的各个实施例。图中示出：

图1示意性地示出了一种用于对生物流体的样品的自动化光学分析系统，

图2示意性地示出了光学分析系统的构造的细节，

图3、4和5分别示出了一个细胞计数表，其中，描绘了散射光强度(B)相对于吸收度(A)。

具体实施方式

在图1中示意性地示出了一种用于执行对生物流体的样品的自动化分析的光学分析系统1。分析系统1在此包括透射样品体积的光源2，尤其是激光器。通过观察穿透样品体积的激光以散射、反射、透射几何特征等等的形式来检测出许多的光学特征、像尤其是与颗粒相关的散射光强度、折射率、光强度衰减、吸收度、透射度、反射度等等。此外给分析系统1分配有输出单元3。经由这个输出单元3可以经由多个输出通道输出、显示或者进一步评估每次测定的光学特征。经由输出单元3尤其可能的是，将完整的血象图以表格形式输出，该血象图具有所有相关数据还包括网织血小板的部分。为了进行分析，将生物流体的样品4、尤其是血样相应地输送给分析系统1。紧接着的评估全自动地实现，并包括可能的辅助材料、染色材料的添加。

在图2中示出了光学分析系统1的构造的细节。光源2的光被引导到样品4上，该光源构造成半导体激光器并且射出波长为670nm的光。样品4处于设计成流式毛细管的毛细管18中。在毛细管18中有不同的微粒，它们显示为具有不同半径的圆或显示为网，其中，该网象征了中性粒细胞胞外陷阱。样品体积量被透射并且光与样品相互作用。光的一部分在不改变方向的情况下投落到第二探测器9上，光的另一部分以从5度到15度的夹角偏转穿过样品并且射到第一探测器8上。借助第二探测器9的信号测定样品4中各个微粒的吸收度。借助第一探测器8的信号测定源自于样品4中的各个微粒的散射光强度。

在图3、图4和图5中分别示出了一个细胞计数表，其中描绘了散射光强度(B)相对于吸收度(A)。所检测的与颗粒相关的分别包括由散射光强度(B)和吸收度(A)构成的元组的测量值作为自动化分析法的结果被输入。从所选择的测量值的区域5内可以获取中性粒细胞胞外陷阱的数量。这个区域包括所测量的吸收度的部分范围6和所测量的散射光强度的部分范围7。范围5在此尤其是通过散射光强度的上限10相对于红细胞和网织血小板的测量值分隔开的，并且通过吸收度的下限11相对于成熟血小板分隔开。此外，这个区域5由散射光强度的下限12和吸收度的上限13包围。通过绘出的界限可以最大程度上不受干扰地确定出中性粒细胞胞外陷阱的数量。

为了确定中性粒细胞胞外陷阱的浓度，用中性粒细胞胞外陷阱的已确定的数量除以在其中确定了数量的生物流体样品的体积。中性粒细胞胞外陷阱的浓度以每毫升生物流体样品4含中性粒细胞胞外陷阱的数量为单位给出。中性粒细胞胞外陷阱的数量在此以任意的与对应中性粒细胞胞外陷阱的与颗粒相关的测量值的数量直接成比例的单位给出。

能够明显地识别并且区分的是，在细胞计数表中待识别并区分的各个微粒的不同的总量，尤其是较多的红细胞14总量、更少的网织血小板15总量、成熟血小板16的总量和中性粒细胞胞外陷阱17的总量。

借助所测量的散射光强度的频数分布测定界限10，并且在此辨识出在较高散射光强度范围内的红细胞、网织血小板或成熟血小板的总量和在较低散射光强度范围内的中性粒细胞胞外陷阱的总量。就从两个相应的总量之间的范围内选出散射光强度作为散射光强度的部分范围的上限10。

借助所测量的吸收度的频数分布来测定界限11，并且在此辨识出在较低吸收度的范围内的红细胞、网织血小板或成熟血小板的总量，以及在较高吸收度的范围内的中性粒细胞胞外陷阱的总量。就从两个相应的总量间的范围中选择吸收度作为吸收度的部分范围的下限11.

界限12如下地选择，即，使得源自于中性粒细胞胞外陷阱的测量值的至少80％、优选地至少90％、特别是优选地至少95％具有相比界限12在其上延伸的那些散射光强度更大的散射光强度。

界限13如下地选择，即，使得源自于中性粒细胞胞外陷阱的测量值的至少80％、优选地至少90％、特别是优选地至少95％、具有相比界限13在其上延伸的那些吸收度更小的吸收度。

在图3和图4中，中性粒细胞胞外陷阱17的总量相对较大，并且各自所属的样品具有高浓度的中性粒细胞胞外陷阱。在图5中，中性粒细胞胞外陷阱17的总量相对较小，并且所属的样品具有浓度很低的中性粒细胞胞外陷阱。对应图3、4和5的样品是三种相互不同的人类血样。

附图标记列表

1 分析系统

2 光源

3 输出仪器

4 生物流体样品(血样)

5 选择的测量值范围

6 吸收度部分范围

7 折射率部分范围

8 第一探测器

9 第二探测器

10 折射率部分范围上限

11 吸收度部分范围下限

12 折射率部分范围下限

13 吸收度部分范围上限

14 红细胞总量

15 网织血小板总量

16 成熟血小板总量

17 中性粒细胞胞外陷阱总量

18 毛细管

A 吸收度

B 散射光强度。

Claims (15)

1.一种用于探测生物流体的样品(4)中的中性粒细胞胞外陷阱的方法，其中，对所述生物流体的所述样品(4)添加对于核酸具有选择性的染料，其中，在染色以后在所述样品(4)中在所述染料的吸收区内确定多个光学的颗粒有关的测量值分别作为由第一光学特征的测量值和第二光学特征的测量值组成的元组，其中，在所述第一光学特征的所有所测量的值的部分范围(6)内选择第一光学特征的测量值并且在所述第二光学特征的所有所测量的值的部分范围(7)内选择所述第二光学特征的测量值，并且其中，将所选择的测量值的数量与预定的界限值进行比较来探测所述中性粒细胞胞外陷阱。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第一光学特征是散射光强度，并且/或者所述第二光学特征是光强度衰减、优选地是吸收度。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述散射光强度是以从5度到15度、优选地从5度到8度的夹角范围内的角度偏转穿过所述样品的光的强度。

4.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中，借助所述散射光强度来测定折射率，或者将所述散射光强度用作折射率的度量，并且其中，所述折射率是所述第一光学特征。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，为了对生物流体的所述样品(4)进行光学分析而在所述分析系统(1)中尤其全自动地执行所述方法。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述分析系统(1)包括流式细胞仪。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，对尤其在吸收度上可变的所述散射光强度的部分范围的上限(10)进行选择，使得中性粒细胞胞外陷阱的散射光强度与网织血小板散射光强度、成熟血小板散射光强度和红细胞散射光强度分开。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，尤其在散射光强度上可变的所述吸收度的部分范围的下限(11)选择为，以使得中性粒细胞胞外陷阱的吸收度与网织血小板吸收度分开。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在所述生物流体的所述样品(4)中测量网织血小板吸收度、成熟血小板吸收度和/或红细胞吸收度。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，在所述生物流体的所述样品(4)中测量网织血小板折射率、成熟血小板折射率和/或红细胞折射率。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所选择的测量值的数量用于定性和/或定量地探测中性粒细胞胞外陷阱。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所选择的测量值的数量用于确定所述中性粒细胞胞外陷阱的浓度。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述对于核酸具有选择性的染料是恶嗪750。

14.一种用于对生物流体的样品(4)、尤其是血样进行光学分析的分析系统(1)，所述分析系统设置和设计用于尤其全自动地执行具有权利要求1至13中任一项的特征的方法。

15.根据权利要求14所述的分析系统(1)，其中，所述分析系统(1)包括流式细胞仪。