TW316948B

TW316948B -

Info

Publication number: TW316948B
Application number: TW082103032A
Authority: TW
Inventors: Ornstein Leonard
Original assignee: Miles Inc; Sinai School Medicine
Priority date: 1991-12-05
Filing date: 1993-04-20
Publication date: 1997-10-01
Also published as: US5360739A; DE69223931D1; IL103055A; JPH06180315A; CA2077789A1; DK0545315T3; US5411891A; ES2111600T3; ATE161953T1; DE69223931T2; JPH0827277B2; KR100258394B1; IL103055A0; AU2816792A; EP0545315A1; EP0545315B1; CA2077789C

Description

316948 A6 B6 五'發明説明（1) 發明背# 發明節圃本發徽化细螢光的球；Μ 積，血先前坊明係關胞|而流式细及（Π) 紅素湄 1說明對所，其中细胞（ 9¾的蛋之痕量週邊二姐：作用與外，血紅血之後。核Μ及有高等懸浮著白血球白質，物質。血液（紅血球免疫系液邐含球成熟這些年分裂或於試劑姐合物及其用於全血檢體中鑑定與特且較特別的試劑姐合物可藉光散射Μ及發出胞計數器技術在全血檢體中（i)鑑定網織紅血同時測出多數單一網織紅血球和紅血球的體度和血紅素成份。動物而言，血液由本溶液部份（血漿）姐成多種血球：紅血球细胞（紅血球），白血球 )Μ及血小板。血漿成份含大約9 0 %的水， 0.9¾的鹽類和如糖，尿素，尿酸及其類似物例骨越Μ外的血液）的细胞或血球可區分成，其主要目的是運送氧氣而白血球，其主要統和破壞侵入體内的外來物有關。除此兩姐有所謂的血小板其對_止血很重要。末期發生在由骨髓釋放出而循環於周邊血液輕紅血球，或〃網織紅血球〃已失去其细胞合成核Μ核酸（RNA)的能力。雖這些功能已 η 先閲讀 •背面之事項再塡寫本頁

U 装訂經濟部中央標準局員工消費合作杜印製白需分陰蛋所區中成態球球合狀血血夠量紅紅能能熟織且含成網並富與與用持易其作維容液的及極溶上 Μ常的謝，通料代質胞染有基细子仍血些離球成這陽血合。具紅來應於織質反露網鐵謝暴但收代其 - 吸要使止，重藉停質的，本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81.10.20,000

第82103032號專利申請案說明害倏TF苜（以玍K曰）五、發明説明（）離子性RNA反應並於網織紅血球中沈澱出微细狀或粗粒狀經染色網狀體，這就是網織紅血球其名字的由來。雖網織紅血球正常含所有紅血球總族群約〇 . 5到2百分比，然此百分比在不正常情形下有著戲剌性變化。例如，網織紅血球的計數曾被當作診斷惡血質與紅血球因出血而再生時的指數已多年’亦可用于某些惡性疾病化學治療初期毒性的偵測。核酸（核醣核酸和去氧核醣核酸）是聚陰離子，可實際用任何陽離子染料染色，網織紅血球中的核醣核酸只可被少數陽離子染料染色[包括亮甲苯基藍（BCG),新亞甲藍（MMB )，金胺Ο(ΑϋΟ),吖啶橙（A0)，噻唑橙（TO)和焦寧丫（p 丫 )]。這些染料之中，只有一亞型可快速地穿透细胞（因而染色）。此亞型含新亞甲藍和吖啶橙。染網織紅血球的速度和程度視血球外染料濃度，染料穿過網織紅血球膜之穿透速度，Μ及陽離子染料與網織紅血球OA的特異结合常數的強度而定。後兩特性對每一染料而言，皆有所不同，並且是不易預測的，所以嘗試錯誤對發覺有效的網謙紅血球染色是重要的。並非所有陽離子物質都能夠穿透完整紅血球（和網織紅血球）膜，且陰離子之性質必定伴隨陽離子，可影響陽離子物質是杏快速地，緩慢地或根本不穿透。厭水性分子通常比親水性分子更快速穿透紅血球，而且小分子通常比大分子更快速穿透膜。只有一亞型的鹽類或緩衝液與這些陽離子染料混合後才使得快速染色網織紅血球 ;即·’正確（r ί g h t) ”染料與”相反（w r 〇 n g ) ”緩衝液可"永久’’ 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣、-'0 經濟部中央標準局員工消费合作社印製經濟部中央標準局R工消费合作社印髮 A6 _______B6_ 五、發明説明（3 ) 染網織紅血球。再一次，必須嘗試錯誤才能發現染網織紅血球混合物的有效調配物。因此，不管那一方法當做指南目前尚無法預測，但最重要偽在何種狀態下，任何特殊陽離子染料是否能夠快速穿透並染網織紅血球。流式细胞計數器的基礎基本觀念是單一時間將细胞經過特殊感應區。典型地，藉流體力學聚焦的方式，使單一细胞經過由聚光光源偵測散射光，吸收光或螢光的偵測糸统所姐成的感應區。有多種方式測得粒子截斷光的效應。一般而言，粒子折射指數與粒子懸浮的介質折射指數不同。因而經過角度範圍照射會發出散射光，且依靠折射指數的不同，粒子大小，其形狀和折射指數内在變異以及粒子構造及依靠照射光的波長而有不同強度。對均質球狀體而言，米（Mie)散射理論完整描敘散射光分佈及強度。粒子通常可吸收一些入射光。在後者的情況中，粒子所吸收的光部份可如螢光形式再被射出，特點為波長比吸收的光波長較長些。這些與其他效應可被安置于測量各種角距間的散射光，非散射光Μ螢光的光偵測器所偵測到。當粒子小如细胞般（典型地直徑小於I5微米），照明光束中光子數目受光子高速通過的影響（一般而言每秒有數百到數千廣範圍细胞），特別是與每秒落在聚浮液流發光部位的光子數目相比較· 〔Μ及與吸收偵测器（甚至於螢光偵測器）的背景發光比較〕顯得微不足道。因此，偵測粒子間小顆粒差異的敏感度界限須嚴格依光子流通量（至本坼張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81.10.20,000 (諳先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) .丨裝訂第82103032號專利申請案 d7 五、發明説明（）少依靠光源.本質的〃亮度〃）和多少光子流通量之微擾是由大小不等粒子造成而設定。吸收，散射以及螢光流式细胞計數器信號主要干擾之雜 --------<”衣----.--17· (請先閔讀背面之注意事項再填寫本頁) 訊來源可能因每一種信號而有所不同。Μ第一階近似值而言，由被染细胞或未被染细胞的螢光信號大小，可看出所生信號幾乎不受細胞形狀或位向的影響，然而，散射和吸收信號則受形狀和位向的強烈影響。於極端地例子，人類紅血球之原本雙凹狀對產生的吸收和散射信號有相當深奥影響；影響比一般典型被染網織紅血球所產生小吸收信號更大。這就孝為何先前描述于美國共同專利申請案序列編號 07/802, 593 ,1991年12月5日申請，現今為美國專利5,350, 6 9 5, 1 994年9月27日頒佈定名為”用于鑑定與特徵化全血中網織紅血球之方法與試劑姐合物”與本案一起申請並將本案共同讓與受讓人，吸收流式细胞計數器方法未能用于網織紅血球計數或一般细胞中測量低澹度吸收分子的主要原因。另一方面，细胞中微弱螢光物質（例如，未结合螢光染料）或圍繞介質中微弱螢光物質實際上未對吸收或散射信號有影響。經濟部中央標準局員工消費合作社印製雖然螢光流式细胞計數器，在光源足夠強烈，且漫射光及系統螢光已減到最小，但由未被染血球中辨認具選擇性已染血球之敏感度界限仍由未被染血球中成份的顯著〃背景螢光〃之相對大小和/或檢體流中被染與未被染细胞周圍介質的螢光量而定。對網織紅血球染色而言，圍繞细胞之檢體流中常有一些含相同濃度染料的溶液。對已知網狀體RNA結合程度而言，外界染料與網狀體結合染料的比值會在染料對RN Α的特異結合係數增加時會減少。因此，結本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）第82103032號專利申讅案說明害倏不苜r q、 A7 B7

經濟部中央標準局Ί貝工消f合作社印製五、發明説明（）合係數愈高•對外界染料濃度需求愈低，背景信號愈低κ 及雜訊愈高。同理’如果未结合染料的螢光效率比網狀结合染料之螢光效率低，則可改善雜訊，事賁上，使用金胺〇，噻唑橙和硫黃素T的方法，視其结合與未结合螢光效率的差異而定。然而下文所述較好的方法，主要靠高雜訊，高特異结合係數及（在一案例中）于較長波長（紅色）未被染血球的較低非特異性螢光而定。一些半自動方法可用于計算抗凝固全血檢體中網織紅血球百分比。目前每一方法中，含一種有機陽離子染料，如吖啶橙，金胺0或噻唑橙之稀釋液，可染網織紅血球中 RNA 。染料穿透血球膜並结合到RNA上而通常于每一網織紅血球中沈澱成〃網狀體# 。由被染RNA得到的信號量大致與RNA成份或正比。經過適當的染色後，螢光流式細胞計數器，備置著適當激發光源（典型地氬離子雷射在488 毫微米放光），以及放射光偵測糸统可用來決定流出物中網織紅血球的百分比。使用螢光染料及流式细胞計數法對鑑別全血檢體中網織紅血球的說明描寫于專利文獻中。例如，美國專利編號3, 68 4, 377，亞丹斯（Adams)和卡門斯基（kamentsky)揭示用來鑑別含有吖陡橙水溶液之血液分析染料姐合物，其具人類血液正常生理範圍内的酸鹼係數和滲透壓。該染料組合物可用於紅血球散射信號測得螢光信號存在與否來計算網織紅血球。美國專利編號3 , 8 8 3 , 2 47亞丹斯揭示與亞丹斯和卡門斯本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） --------1#----.--ΪΤ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（6 ) 基類似的方法，其係使用含吖啶橙染枓姐合物*濃度介於每毫升1 0 _ β和1 0 _ 5克間。美國專利編號4,336,029那他歐（Natale)揭示試劑姐合物，其含染料吖啶橙，檸檬酸鹽離子和三聚甲醛，酸酴度約7.4且具等滲透的水溶液。各種不同成份的濃度選自網織紅血球與血小板的染料最大吸收*並且混合血檢體與試劑姐合物須於2 — 5分鐘内完成染料吸收為條件。使用-那他歐試劑測定血小板和網織紅血球的自動化方法揭示于美國專利編號4,325,706傑士邁（〇6「3^3。等人。揭示美國專利編號 4,707,451沙基（Sage), Jr的試劑而言，網織紅血球是K硫黃素T (thioflavin T)或柯苯胺 (chrysaniline)染色。發現全血·檢體M25微升等張食.¾水溶液（0.2毫克/毫升）的染料和1Q微升含抗凝血劑的全血混合液|並且培養混合液約7分鐘可有效地被染色。美國專利編號4,883,867李（Lee)，等人揭示染RNA的染料姐合物。染料姐合物含噻唑橙當作是較好的染料化合物。網織紅血球至少需要30分鐘才能被染色。美國專利編號4,971,917庫洛達Ikuroda)描述的流式细胞計數法的網織紅血球計算所使用的試劑包含碳酸鹽來減少成热紅血球引起的非特異性被染•如金胺0 ，可避免當螢光流式细胞計數器分析時，將成热紅血球誤計為網織紅血球。美國專利編號4,981,803描述計算網織紅血球試劑含兩種溶液，即染色用儲備溶液其中金胺0染料溶于非水溶液本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公；¢) 81.10.20,000 ----------------< -------装------# (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _J_ ------ - : .............. 316948 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（7) 溶劑和緩衝液中滿足最適宜的染色條件。另外一種螢光流式姻胞計數法中網織紅血球染色試劑（含金胺0 )，揭示於美國專利編號4,985,176庫洛達等人。此參考資料教授試劑與檢體之培養時間介於3Q秒和20分鐘間。如上所述·只有少量亞型的陽離子染料可選擇性地染網織紅血球，而且只有更少亞型.的染料可快速穿透網織紅血球。本發明的陽離子染料化合物在5分鐘之内染出網織紅血球，於是流式细胞計數器分析網織紅血球可在將血檢體和試劑驵合物混合一起後在短時間内表現出，因此使得本發明易採用于自動化程序。由於四級化吖啶橙衍生物對網織紅血球定量描述于共同申請中的美國專利申請案系列編號07/444,255在12月12 日，1989 由Fan和Fischer申請並定名為"化合物與試劑姐合物及其使用于全血網狀血球的定量測定〃，併於本文作為參考。Fan等人其試劑含每毫升1〇-β克的吖啶橙衍生物於三聚甲醛和草酸鉀姐成的緩衝液中。此試劑組合物染網織紅血球使得能夠Μ螢光流式_细胞計數器定量分析血檢體中的網織紅血球。此試劑和Μ上談到的任何試劑皆未含使球狀劑用來防止如以下所討論的方位上之雑訊問題，並且也無法同時测得其他診斷上具意義的參數如逐一细胞的網織紅血球和紅血球的體積與血紅素濃度。沙比洛（shapiro)和史提芬（stevens)在流式细胞計數器测RHA含量使用噚畊750或在633毫微米可激發的有闞 ----------------ί -------裝—-----訂 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS>甲4規格（210 X 2卯公釐） 81.10.20,000 第82103032號專利申請案由寸湓昍軎修芷苜（85年5 3) A7 . B7 雷射染料，细胞計數器，vol.7，pp. 107-110 (1986), 揭示使用噚畊750在流式细胞計數器測定RNA含童。细胞 Κ 10微莫耳到30微莫耳濃度的噚畊750染色，並加入乙醇固定Μ测得D Ν Α 。沙比洛和史提芬申請專利範圍中並未將噚哄750染细胞中RNA 。此外，這種噚畊750的記錄是無法計算網織紅血球或同時測定其他診斷上有意義的紅血球參數如逐一细胞的體積和血紅素濃度。如上所述*人類與很多其他哺乳類紅血球具有雙凹圓盤形}。此種不對稱紅血球具有不同细胞位向能散射光量。所Μ兩個相同紅血球當它們經過感應區時，除非他們的位向在感應區中是相同的*否則它們會產生完全不同的散射光信號。兩相同紅血球，除了其中一個有少量經染色網狀體存在之外，一般在散射光偵測器上會因它們的位向不同而產生很大的信號差異。經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 --------<扣衣------II (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 美國專利編號4,575,490和4,412,0041(丨111和0「〇516丨11教授一種於流式細胞計數器測得紅血球的體積。並除去位向雜訊之方法。他們的方法包含未被染色紅血球的等容球狀來消除细胞間任何位向上的差異，使測定細胞體積能夠更準確和精密。每一紅血球藉界面活性球狀劑可將雙凹形轉變為完整球狀。一種〃緩衝〃蛋白和/或一種醛固定劑可用於球狀劑以防止紅血球的溶解。K U和0 r n s t e i η描述陰離子界面活性劑無法染色網織紅血球，因為彼等頃發現會與用來染色和沈澱網織體的陽離子染料快速反應並且沈澱美國專利編號4,735,504 Tycko掲示一種流式细胞計數 -10 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐）第32103032號專利申請荼中女給B日害修7F苜年5月）五、發明説明（器 Technicon 藉K测定抗凝 K及單一和平紅血球在2微提過的K i m和養期後，這些槽内的發光測離的角間距而擇係重要的。放光*兩散射全自動化方法體積（MCV)，在此方法中，，然後使用剛。經過2 0秒培分析儀紅血球由進人2個分測定角度之選在633毫微米 _3 ^ )权及5 度被每一間隔 Μ ί e散射原理和血紅素澹度完成後* & 體積（V)和表皆使用這g 紅血球榷 Η 1系統的全血檢體均紅血球升等量全 0 r n s t e i η 血球須在定區。這測得。在當光源為光收集角 15。）。種提供中單一和平均紅血球 (MCHC) 〇先被稀釋 --------< 裝------訂-----一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製到15度（5 所認知，估計值比 (HC)被貯 T y c k 〇所 HC之分佈計算而得以上方前述和實診斷上有以流式是難Μ區雜訊。被流式细胞血紅素澹度血檢體中首的方法達到單位時間逐些血球的散此申請案中一種氦氖雷間距為2到只要细胞散則此血球的體積與血紅素較而測定出。存于記憶體中述之已知技藝细胞圖Μ及體每一细胞的，一旦檢體計算出MCV 積和H C的頻法無法區分網際方法也無法意義的參數如细胞計數器來分網織紅血球染的RNA股大計數器來偵測繩紅血球與用來各別測逐一细胞的偵測網織紅偵測信號，量存在于年時會產生相 -11 - 等容球狀一地通過射光大小光·源Μ及射光，其 3 度（20 射光的程濃度可與體積（V ) 測定循環及 MCHC ° 率分佈圖非網織紅血球，並且在定網織紅血球及紅血球體積和血紅素濃度。血球數目上的另〜困難成熟紅血球信號和糸统輕網織紅血球中，當w 當大的信號。然而本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇X：297公釐） 316948 Α6 Β6 五、發明説明（10 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 成熟细胞含較少被染的RNA ，會因流式细胞計數器測定糸統的雜訊所遮蔽而產生較小信號。在此需要一種方法及試劑，藉光散'射和吸收或螢光流式细胞計数技術鑑定網織紅血球並同時分別測定全血檢體中網織紅血球以及紅血球的體積，血紅素濃度和血紅素含量 Ο 吾等期先利用各種已知技藝中的陽離子染料染網狀體。吾等亦關注能夠使用螢光來測定網雜紅血球之流式细胞計數方法。吾等亦希望使用等容球狀劑和前述過的Tycko螢光方法，吾等將能夠使用具選擇性的染網織紅血球試劑， Μ逐一细胞方式同時測定網織紅血球和成热紅血球體積和血紅素。（註，若球狀完全，並非等容，但已知等張性因子X ，則使用于Tycko’s方法體積乘1/Χ Μ及蛋白質乘X 來校正，例如血紅素，濃度，原始值均可計算出。）使用Tycko ’s方法，需一個發射單色光使血紅素變得非常透明的區域；典型光源如紅氦氖（HeNe)雷射光，或波長更長的雷射光。此意味若波長被用做吸收測定，則此染枓需為強力吸收紅光的藍色染料。~ 經濟部中央標準局員工消费合作社印製如因同樣染料被用于發出螢光，它必須有適宜高量子效率和Stoke’s位移，高結合係數，使它可用于夠低濃度因而螢光流不會不接受降低螢光信號成雜訊比例。頃發現嗶畊750不但滿足吸收/散射方法的需要，而且對螢光/散射方法测定網織紅血球RNA濃度，血球計數和成热Μ及網織紅血球逐一细胞的體稹和血紅素成份亦符合。相反地， -12 - 81.10.20,000 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐）第82103032號專利申請案生女論昍害修7F百U5年5月） A7 B7 _ 五、發明説明（） γ < (>. 5 Λ: - ,, .fTV内〜..·. 新亞甲藍具有非常低的螢光效率，無法使用于螢光/散射方法中。換包話說，增加成本和複雜度來使用一種染料來染網織紅血球，此染料κ藍光激發而發出綠到紅的螢光，如吖啶橙，3,6-雙甲胺基-10-2-羥乙基吖啶碘化物（Α0Ε0Η),噻唑橙，金胺0,藉加入一種氬離子或鎘化氦（HeCd)雷射在488 毫微米或441毫微米放光，並且Μ紅雷射光共軸地照射流動细胞，使此方法可同時測定網織紅血球的RNA濃度《血球計數和成热及網織紅血球逐一细胞體積和血紅素成份。我們探査非離子的，陽離子的和兩性離子的界面活性劑與陽離子染料的相容性，就如KU和Omstein所教授紅血球球狀劑。在Kim和Ornstein方法中，我們使用蛋白質 (典型牛血清蛋白）來〃緩衝"界面活性劑濃度使紅血球溶解能降低。大多界面活性劑（例如，Tr ί ton X 100和月桂醯胺丙基甜菜鹼）可令人滿意地作用。然後吾等偶然地發現月桂醯胺丙基甜菜鹼和一些其他兩性離子界面活性劑 (如，DAPS和TDAPS)不需要蛋白質媛衝劑來遲緩紅血球溶解*而且為Kim和Ornstein方法中所有血球的理想替換球狀劑。因為它們不需要蛋白質緩衝劑，就可成為穩定和更簡便的試劑。（Kim和Ornstein的固定步驟不再是必需的；即含有蛋白質的試劑中细菌生長的問題亦可避免。）此發明為同在申請中美國申請案系列編號07/802,674， 1991年12月5日申請，今為美國專利5,284,771號命名為試劑組合物與其用于球化细胞之用途”，與本案同時申 -13 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） --------，裝------訂------紙 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印装 A6 B6 五、發明説明（12 ) 謫並讓與本發明的受讓人。發明摘里根據本發明主要目搮係提供一種改良試劑姐合物和κ螢光流式细胞計數器由血檢髏其他血球中區別網織紅血球的方法。本發明的另一目標係提供試劑姐合物和如上方法以螢光流式细胞計數器來計算全血檢體中網纗紅血球。本發明進一步的目標係提供一種試劑姐合物和如上方法來同時使紅血球和網織紅血球圼球狀並且染網織紅血球。本發明更進一步的目標係提供一種試劑組合物和如上的方法以螢光和散射光流式细胞計數器來同時測定網織紅血球和紅血球在全血檢體中的體積，血紅素湄度、血紅素成份。本發明再進一步的目標係提供一種試劑姐合物和如上方法同時辨別和計算在血檢體中每一紅血球和網織紅血球，並且由逐一细胞測量中決定毎類血球的體積，血紅素成份，血紅素濃度*平均單一血球體積和平均單一血紅素濃度〇本發明再進一步的目標係提供一種試劑姐合物和如上方法同時辨別和計算在血檢體中每一紅血球和網織紅血球，並且使用單一紅色雷射光源由逐一细胞測量中決定每類血球的體積，血紅素成份，血紅素濃度，平均單一血球體積和平均單一血紅素濃度。根據本發明的一種具體實施例，試劑姐合物含有染網織 -14- 本纸張又度適用中酉國家標準（CNS〉甲4 %格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) I裝_ 訂. 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 8L10.20,000

A6 B6 五、發明説明（U) 紅狀血球的有機陽離子染科，和維，持酸鹼度在大約6到大約9的緩衝液。此染枓可為激發紅色螢光染料之噚畊750 ci〇~ 或·激發藍色螢光染料吖啶橙和四鈒吖啶橙衍生物，其其下列通式结構： (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁)

.裏. 訂· I濟部中央標準局貝工消費合作杜印製其中：Y是陰離子；R分別為甲基或乙基；旦X是羥乙基，或一種叭基于鄰位取代和/或〖2基于對位取代的苯甲基，其中Ri是一個氫原子或氟，以及R2是一涸氫原子，氟或三氟甲基。 .較佳地，Y.是陰離子；R是甲基；X是羥甲基或對位被取代的笨甲基。更佳地，γ是溴化物或碘化物，而X是羥乙基。

製造四级化盯啶橙衍生物的合成步驟描述於藤毯—美掘利申請案序列編號07/444,255 Fan等人，噚畊750烤P -15 - 本紙張尺度通用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公;^ ) 81.10.20,000 A6 B6 五、發明説明（14 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

Exciton，Inc. of Dayton，Ohio 。本發明較好的可激發藍色染枓化合物為3,6 -雙（二甲胺基）10-苄基吖啶溴化物，3,6-雙（二甲胺基）10-(2 -氟）-苄基吖啶溴化物，3,6-雙（二甲胺基）10-(4 -氟）-苄基吖啶溴化物Μ及3,6-雙（二甲胺基）10 -(4-三氟甲基）-苄基吖啶溴化物Μ及3,6-雙（二甲胺基）10-2 -羥乙基吖啶碘化物。較佳地，可激發藍色染料化合物為3,6 -雙（二甲胺基）-10-2 -羥乙基吖啶碘化物 U0E0H)因為其羥基具親水的特性。本發明試劑姐合物中含藍色染料化合物，其量約3微克 /毫升至約12微克/毫升（為可激發藍色螢光染色的四级化吖啶橙衍生物），或約0.2微克/毫升至約1.2微克/毫升的晖畊750(為可激發紅色螢光染色）。較佳染料化合物含約6微克/毫升至約9微克/毫升（的Α0Ε0Η),或由約0.4微克/毫升至約0.6微克/毫升（噚哄750)。試劑姐合物的緩衝系统含適當緩衝液來維持試劑姐合物約6至約9間的酸鐮度。此溶液中可含有一或多種下列註有湄度的成份，由氛化鉀或氯化納調整最終滲透壓約250 毫滲透壓至約330毫滲透壓：經濟部中央標準局β: Η消費合作社印製 -16- 81.10.20,000 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公釐） A6 B6 五、發明説明（l5) 經濟部中央標準局員工消费合作社印製成份通麻（奉 m 耳溝 /T ) K/NaHC03 5 - 50 MgC U 0 - 88 KC 1 4 - 104 Na3PCU 0 - 1.5 CaC 1 2 0 - 0.4 最好能調配溶液以維持試劑姐合物的酸驗度約 7 至約 8 較佳 •且可含一或多種下列濃度範画内的成份 9 維持滲透壓約 280毫漆透壓到 300 奄灌透壓：成份灌度（奉箅耳濃 ff ) T r i s 0 - 150 Κ2〇χ 0 - 121 巴比特魯 0 - 155 頃發現試劑姐合物必須含某些陰離子和陽離子 Μ 使染料穿透紅血球膜 0 此種陰離子可包括碳酸氫鹽，氛化納 » 硼酸鹽，巴比特魯 P 草酸鹽 ( 0X) 或乙二胺三醋酸 ( EDTA) 〇但發現不是全部陰離子可有效促進染料穿透细胞膜〇例如 f 當一或多種下列陰雄子 * 蘋果酸鹽 t 酒石酸鹽 * 碳酸鹽 t 皆存在于試劑姐合物中當做主要陰離子，即使少量也能夠區別出網織紅血球與紅血球 °陽離子可能包括鉀 * 納 » 二羥甲氨基甲烷 ( Tr 1 S ) ，或三乙酵胺 (TEA) 〇試劑姐合物可用散射 / 螢光流式细胞計數器技術來鑑別全血檢體中網織紅血球〇其廣範圍應用包括等量全血與上試劑組合物之一混合 0 經過相當的培養期，然後檢賭 / -17 - (請先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 裝· 訂本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81.10.20,000 SI 6948 A6 _______B6_ 五、發明説明（16 ) 試劑混合物Μ每單位時間逐一细胞通過流式细胞計數器特定的感應區。藉液體動力學聚集作用，每一血球經過感應區，均被具有適當照光波長的聚光源照射。Μ逐一细胞方式測量至少一個散射光信號和至少一涸螢光信號•於是由紅血球區分出網織紅血球。根據本發明較佳之具體實施例，上述試劑姐合物另含有使紅血球和網織紅血球等容球狀化的兩性離子界面活性劑。兩性離子球狀劑最好是烷基醢胺甜菜埯或烷基甜菜筠如月桂醢胺丙基甜菜驗（LAB)。為使血液檢體中的網織紅血球及紅血球有效地等容球狀化，試劑姐合物中球狀劑濃度約12微克/毫升至約87.5微克/毫升的月桂醯胺丙基甜菜鲦。當全血/試劑姐合物混合液經過流式细胞計數器的感應區時，光散射經2個角間距而测得每一細胞發出的螢光，紅血球可與網織紅血球區分並測出每個網織紅血球或紅血球的體積和血紅素濃度。網織紅血球以及紅血球的數目，和血紅素成份，平均血球腊積，平均單一血球血紅素濃度和網織紅血球或紅血球的平均血球血紅素可由测量逐一细胞體積和血紅素濃度而計算出。經濟部中央標準居β：工消费合作社印製 (請先閲讀背面之注意ί項再填寫本頁) 訂. 吾等發現上述的緩衝系統中，試劑姐合物中噚畊7 50或 Α0Ε0Η的滬度用於染RNA的需要量很低*例，啤畊750其範圍為約0.2微克/毫升至約1.2微克/毫升，且Α0Ε0Η約 3.0至約12微克/毫升，緩衝液促進染料穿透使在少於5分鐘内染料便染上網織紅血球中的RNA 。如此低濃度的染料 -18 ~ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81.10.20,000 第82103032號專利申請案 |說明害修正苜隹F日）A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝五、發明説明（） A 於、>，.. 可使成热紅血球即非網織紅血球的染色減至最低且分出來自背景雜訊Μ引出較佳信號的螢光流。此種快速染色造成試劑姐合物高度配合自動化方法。用此本發明包含下文中描述組合物和方法，本發明的範圍將在申請專利範圍中閫明。圔形瓶诫閑信藉以下詳细敘述與附圖可明瞭本發明上述及其它目標和顯著優點。圖1Α到ίΕ分別為實現本發明的原理散射/螢光流式细胞計數器的照明透鏡、偵測透鏡和偵測信號處理糸統的圖解模型。圖2Α(1)和2Β(1)為散射光對螢光的细胞圖，圖2Α(2) 和2 Β (2)依照實例1分別以AO Ε Ο Η和曙哄7 5 0對含網織紅血球全血檢體染色的紅光低角度散射對紅光高角度散射的細胞圖，圖2C為血紅素濃度對體積的細胞圖，其中以"+ 〃為網織紅血球且以"II"代表紅血球。圖3 Α和3 Β表示依照實例2中N C C L S參考法，分別Μ Α0Ε0Η和啤哄750試劑偵測全血檢體中網織紅血球百分比之比較。圖4Α和4Β表示依照實例3 ΜΑ0Ε0Η試劑和TECHNIC0N Η 1 J r .參考方法染網織紅血球並得到MC V和MC H C值之間的相關性。圖5 Α和5 Β表示依照賁例4 Μ含噚畊7 5 0試劑和 TECHNICON Hi Jr.參考方法染網織紅球並得到MCV和 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂

.U 本紙張尺度適用中國國家標準（CMS ) A4規格（210X297公楚） A6 經濟部中央標準局S工消費合作社印製 _ B6 __ 五、發明説明（18 ) M C H C值之間的相關性；Μ及圖6Α和6Β描敘得至實例5數據的细胞圖。較佳亘髁g細例敘诚參照圖1 A至IE，Μ顯示實現本發明原理之流式细胞計數裝置其表現，功能及構造的代表部份。事實上，該裝置係描述商品名為TechniconHl(賣給其受讓人），經修飾之特殊系统，其可由市售購得。該装置结合了流式细胞計數器分析血球的原理，並包括细胞對特殊照明反應出散射光和螢光的敏感能力。只有本發明最闞注的那些元件才會顯示。因此，圖形不說明所有櫬械上和電子元件•即馬達、電導管、啷筒、閥，感應器和需要驅動K及控制不同部份之装置。所有這些元件可能係Μ已知，昔知的形式|其可輕易地被精於下文知識的任一技藝人士了解，並且依本發明處理檢體之所欲方法使流式细胞計數器擁有理想操棋式的各不同部份。流式细胞計數器最常描敘項目係覆鞘流動式之流式光電管（sheath-stream flow cell)及傳送經製備细胞至偵測點之支持液壓器。细胞被局限於圓柱狀容積内，而該圓柱容積係正中對著流式光電管之正方形横切部的流動路徑。除了一項例外，流式光電管構造與用在Tec hni con H1系統中的流式光電管構造係一樣。流式光電管係由合成之融合二氧化矽（非玻璃）所製成以將流式光電管的背景螢光減至最低。液壓系統相當簡單，只由2個蟠動啷茼和其相關配管姐成。鞘覆啷简與傳遞配管鞘覆速率在1.6 X 10~7 ---------------J --------裝------訂-----% (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -20 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81.10.20,000 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A6 _B6_ 五、發明説明（l9 ) 米3 /秒；檢體被傳遞的速率為3.5 X 10-1。m3/sec;流式光電管中流動路徑是250微米乘250微米。所得圓柱狀檢體流具7微米直徑和2 . 5米/秒的速度。主要目的係提供一種光學糸統，其除有Technicon H1糸統為分析紅血球所須要2個紅血球散射管。至少要有一單色螢光測量裝置。將討論的光學糸統中將使用特別染料（如激發藍色或激發紅色）染细胞。散射/螢光流式细胞計數器的光學糸統一般可分為2個小糸統：a)照明透鏡（圖 1A或1D);和b)集光透鏡（圖1B或1E)。首先參照圖1A,藍色激發染料的照明透鏡一般以參考值 10代表，並且结合了 2個光源。一種氦氖（HeNe)雷射光12於633nm及2mW放光Μ供紅血球散射裝置測定體積和血紅素濃度。一種氬離子雷射光 14其可在4δ8毫微米和20毫瓦特放光，Κ供螢光激發三個績光鏡16a，16b，16c和雙色分光儀1δ必需要適當安置於照明糸統。來自雷射光的光束須與分光儀18同一直線，而分光儀可傳遞來自氬離子雷射14的藍光並且反射來自氦氖雷射12的紅光。造成光束經一對交-叉的圓柱形透鏡22而在長方形孔徑（Α-1) 20處圼橢圓形。與Α-1孔徑極相近圓筒狀透鏡22a焦距為150毫米。此透鏡的中軸平行於孔徑的長徑。第二個圓筒狀透鏡22b具300毫米的焦距。長方形孔徑有89毫微米高653毫微米寬，Μ繞射有限的消色差透鏡26圼像于流式光電管24來定出測得的體積。全部放大倍數大概是0.25。孔徑在長徑未填足而在短徑上填滿。主體 -21 - 本紙張尺渡適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公梦） 81.10.20,000 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) -丨裝— 訂

經濟部中央標準局貝工消費合作社印W A6 B6__ 五、發明説明（2〇 ) 在此將加強照明強度並且影象的短徑維持均匀強度分佈以儘可能減低由细胞間強度不同造成的誤差。測量體積本質上為椭圓形，且在l/e2點時高20毫微米，寬65毫微米。橢圓形之短袖與垂直于地平線之流動相互平行。經過測定體積之细胞會散射入射辐射。被染色细胞亦會吸收人射辐射。被染色细胞亦發出螢光即放出比其吸收時遇低頻率的能量。圖1B描敘在捕捉透鏡中偵測及捕捉這些光信號。细胞在經過測量容積處所產生散射光及螢光由集光鏡 28成為平行光，然後分成4個管道。集光鏡的孔徑值為 0. 34 °在分光鏡30處低於500奄微米波長的光會被反射。經488毫微米窄光譜帶干擾濾鏡32再過滤此光。環形暗場光圈3 4僅用來傳输藍光散射成5到1 5度角間距。然後散射光由偵測透鏡36聚集至矽光電兩極體38K產生電子信號。其餘的光在'分光鏡40處亦相等地分成2束光。一半能量被反射到紅色散射路徑，另一半傳输到紅螢光路徑。（此分光鏡40可被適當的二色性分光鏡取代來改菩在螢光管中信號產生雜訊比例）。被反射光朝向紅光散射路徑且用 633毫微米窄光譜帶干擾滅鏡42過濾，然後由50/50 ( 50¾反射，50X透射）的分光鏡44分為2束光。暗光圈 46和48用于2個紅光散射路徑以收集測定细胞體積和血紅素濃度所需2個角間距之光。在每一路徑中的散射光由偵測透鏡54和56個別對焦2個矽光電兩極體50和52Μ產生信號。中性密度濾鏡58, 59和60用于各個紅色和藍色散射路 -22 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81.10.20.000 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) i裝· 訂 316948 A6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（21 ) 徑中，K簡便調整信號之動態範圍而無須修改前置放大器電路。分光鏡40傳输的光在62處過®後只讓螢光能量通過•然後光由偵測鏡64經1毫米直徑針孔射至光電放大管66處定焦點，其中電子信號與所產生入射能量大小成比例。針孔的存在可減低外來光引起的散雜訊（Shot noise)。2毫米寬的阻礙棒67位于偵測鏡前以截斷主要光束而進一步減低背景光的雜訊。在此管徑中有似三明治结構的4僩濾鏡 68，包括633凹口滹鏡（x2)68a, Schott 0G515有色玻片 68b, Schott 0G5 3.0 有色玻 j=i68C,和 Schott RG645 有色玻片 68d ° 此濾鏡姐合的淨效懕會阻擋所有低於645毫微米的光。凹口和00濾鏡683, 68b和68c是由於RG645滤鏡68d無法有效完全地阻擋在633毫微米和48 8.毫微米的散射光而所需。每一散射路徑中，選用前置放大器電路和中性密度濾鏡的光學密度Κ便分析Technicon (TCN)光學測試物質 <0TM TCH T03-1704〉時每一管徑输出都能產生近似2伏特的平均脈衝信號程度。0ΤΜ包括球體狀和強固定的紅血球。此物質可由受讓者商業化利用，並適合用于 Technicon H1系统。然後容許在後信號偵測處理硬體中用可變的增效放大器微细調整每一路徑之整體效益。由調整高電壓供應的光電放大管來控制螢光路徑中整髏效益。後偵測信號處理系統之作用的塊狀圖示於圖lc。此系統 -23 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 8L10.20,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) —裝. 訂 A6 B6 經濟部中央標準局員工消費合作社印製五、發明説明（22) 含前置放大器67,可變增效放大器68，脈衝高度分析儀 70，類比與數位的轉換器72，Μ及獲取數據的硬體（電腦 )7 4和軟體。可變增效放大器68含四個電路，其容許多至4個输入信號的轉換和振幅。脈衝高度分析儀70 ,類比與數位轉換器72和獲得數據的軟體為4 Cyte系統的所有配件，其可由Howard Shapiro, H.D. Cambridge P.C., Mass購買。脈衝高度分析儀為4 Cyte Model FE Front End.此配件產生擁有波Μ表示高達 4個输人信號的脈衝高度。並容許設定〃有效"的脈衝高度闞值階段。4 Cyte Model I界面卡可用來連接多達4個输人信號的類比與數位轉換而與4 Cyte軟體，並捕獲這些在主電腦RAM記憶中的數值。数字信號貯存於所列模式中。每個细胞佔5個8位元訊息，其中四個為測量參數而一個用做標記。這些實驗之主電腦為IBM PC/XT纯糸，其配備有彩色螢幂以及數學共同運算器。可用任何IBM相容電腦進行數據轉換。翻至圖1D，可激發紅色染料的照-明光學糸統一般地可由參考值110鑑定，並结合故出2毫瓦特光束（於633nm)的氦氖雷射光112 。用來調節雷射光位置的2個反射鏡114 和116而使光束交叠。調節使得光束軸與照明光學的物理光軸一致。然後光束因一對圓茼狀透鏡118和120而呈 192x77微米橢圓形狀的光束（在1/e2)。192微米長係由 150毫米焦距圓筒狀透鏡118造成，且它照明A-1孔徑 -24 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4规格（210 X 297公發） 81.10.20,000 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) - .丨裝· 訂. 經濟部中央標準局員工消费合作社印製 A6 B6 五、發明説明（23 ) 122(其與圖1D頁所呈平面相平行）之長軸。77微米寬係由 60毫米焦距圓茼吠透鏡120造成。且它照明A-1孔徑之短軸。A-1孔徑為653x89微米。照明雙重透鏡123在流式光電管124處產生橢圓形，37.4 X 12.6微米的高斯強度分析。橢圓的短軸平行于流動方向，其垂直於126箭號指方向。經過容積測量之所有细胞均會散射及吸收入射光。散射光及發出的螢光被圖式1E的偵測透鏡捕獲及測量。散射光及發出的螢光由高孔徑值的透鏡128收集並使光成平行。集光透鏡的孔徑值為0.34毫微米。光束由容許波長小於 670毫微米的光通過的二色性分光鏡130分成2部份。光束132經過濾後反射在光電放大管且用來進行螢光測量。同時透射光束134由50/50 (50%反射，50¾透射）分光儀 136再分成2個散射路徑。被反射散射路徑138具5 -15°暗光圈140，而被透射散射路徑142具2 - 3。暗光圈144 。光經過每一暗光圏140, 1 44再經透鏡146和148 分別對焦至光電兩極體150和152。中性密度濾鏡154和 156用來減低每個光電兩極體的光·範圍至標準偵測器以及前置放大器範圍合適的範圍。被分光鏡130反射之光經由透鏡158，窄光譜帶（690毫微米）濾鏡159,及1毫米直徑的針孔對焦至光電放大管 160,其中電子信號與入射能量產生大小成比例。位于偵測透鏡158之前的2毫米寬的阻礙棒157截斷並減低背景光雜訊。經由光電兩極體150，152與光電放大管160所產生 -25 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公货） 81.10.20,000 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 丨裝· 訂 A6 B6 316948 五、發明説明（24 ) 信號由相似於圖1C所示由後偵測信號處埋糸統處理。然而，在此情況，只有3個信號，如紅色低角度散射，紅色高角度散射和紅色螢光被處理（而不是在圖1C中所討論過的 4個信號）。 K下的實例係闞試劑姐合物及合併該姐合物Μ鑑定網織紅血球，及用螢光流式细胞計數器技術使網織紅血球Μ及紅血球特徴化之方法。標準商業上採用的試劑級物質均可能使用。热悉該項調配物及程序人士，只要依照描敘的目的，其他成份，比率與程序均可用來揭示本發明。 g 例 1 : _ 使用含有兩性離子界面活性劑的試劑姐合物區分血檢體中網織紅血球和紅血球之散色光與螢光測量。染料3.6 -雙（二甲胺基）-10-2 -羥乙基吖啶碘化物（ Α0Ε0Η)存於1毫克N.N -二甲基甲醯胺/毫升的儲備液中。加人染料儲備液以產生最终濃度為6微克/毫升到12微克 /毫升之操作試劑。月桂釀胺丙基甜菜狳最终濃度為12微克/毫升到S7.5微克/毫升，緩衝溶液含下列註明湄度的成份： — 氛化鈣 0.4毫莫耳濃度氯化鉀 4.0奄莫耳濃度氛化鎂 40.0毫莫耳濃度磷酸納（Tribasic) 0.5毫莫耳濃度碳酸氫納 20.0毫莫耳濃度用於研究之操作試劑最終滲透壓及酸鹼度分別為272毫 -26 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再堉寫本頁) .裝· 訂. 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 81.10.20,000 經濟部中央標準局貝工消費合作社印製 A6 B6 五、發明説明（乃）舆耳/公斤和8 . 1。檢體Μ手工混合如模做自動化Techn i c〇η H1紅血球檢體處理系統。玻璃試管裝滿5毫升的搡作試劑。然後將5微升血檢體加入渦動搜拌器上攪拌的試劑中。接著將1: 1000稀釋血液迅速注入前述圖1Α和1Β流式细胞計數器及光學糸統中的檢體路線。約2分鐘内，檢體經過流式光電管而暴荛于分析紅血球和網織紅血球的氬離子雷射光源。若檢體容積許可則每一檢體重覆測定。當經顯微鏡觀察*在準備好的檢體中發現成熟紅血球及網織紅呈球狀，網1¾紅血球在藍光激發下發出紅色螢光。

分析完成時· 色散射光對紅色螢光细胞圖，圖2A (1)的形式顯示出粗略數據，其中縱座標表示前面散射光的相對強度，而橫座標表示紅色螢光的相對強度。细胞圖上的每一點代表一個细胞。基於细胞特異的散射光和螢光信號可清楚地觀察明顯的细胞族群。成热紅血球族群位于縱座標與垂直線X之間的A區。這些细胞顯現高散射信號及低细胞螢光信號。網織紅血球族群位于X的右邊β區。這些细胞因來自它們Α0Ε0Η染的RHA之高螢光信號而與成热紅血球區分出。血小板族群位于Υ線下方C區。血小板與網織紅血球相較下有較低散射信號。基於螢光區分成热紅血球與網織紅血球，病人檢體中網織紅血球計數可由電子”視窗”來鑑定，該視窗定義區別網織紅血球和成熟紅血球的散射光和螢光範圍。測得網狀血球和成熟紅血球的數目位于”視窗”内，故可得知所有细胞 -27 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)甲4規格（210 X 297公釐) 81.10.20,000 ---------------4 -------裝------訂 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 五、發明説明（26 ) 經濟部中央標準局w工消費合作社印製族群中網織紅血球和紅血球”視窗”由B區測得得。圖2 A ( 2 )及Μ下所線格子覆蓋處，表示依體積和不變折射指數。在每一檢體中網織紅標準委員（NCCLS)推舉中，少量檢體完全地被形抹片製備’檢體中網得。顯微鏡配有100Χ油體至少計算1000個血球上來增進計算的準確度個藍色顆粒物質就標為病人檢體的網織紅血為1.7¾。同樣血液檢體球數為1 . 7¾。第二個實驗用來證明述螢光流式细胞計數器球和紅血球族群間有高毫克Ν,Ν-二甲基甲醯胺 0 . 2微克/毫升到1 . 2微劑和緩衝液中產生操作依上述檢體製備步驟有噚畊750的試劑染色血球百分比。圖2Α(1)中，網織紅，而成热紅血球”視窗，，則由Α區簡有散射/散射细胞圖中顯示，非直上述Tycko方法中完整球體的不變

血球參考百的手工顯微新亞甲藍染織紅血球百浸接物鏡Μ ° M i 1 1 e r‘ 計。任何紅血網織紅血球球計數Μ流亦 M NCCLS 分比係由國際臨床實鏡方法測得。在此方色。然後一般的乾性分比在顯微鏡輔助下及10Χ接目鏡。每〜數片加于顯微鏡接球經染色後含2個驗法楔 m 檢目鏡或多〇式细胞計數器方法測得方法分析结果網織紅血當细胞Μ嗶畊750染色並>乂先前所和圖1D與1Ε的光學系統對網織紅血度辨別能力。哄750染料存于1 /毫升儲備溶液中。加入最終濃為克/毫升的染料儲備液至上述球狀試劑。。圖2BU)顯示正常人血檢體Μ含後螢光對低角度散射光的细胞圖。 28 - ---------------J -------裝------，玎 f請先閱讀背面之注意事項再場寫本頁} 本紙張尺度適用t國國家標準（CNS)甲4規格（210_ X 297公釐） 81.10.20,000 316948 經濟部中央標準屬員工消费合作社印製 A6 ______B6_ 五、發明説明（27 ) 依螢光來區分紅血球與網縑紅血球則檢體中網織紅血球計數測得為2 . 1 %。當以M C C L S方法分析得到2 . 1 X的網織紅血球計數。圖2 C顯示Μ ” ”表示重疊於成热紅血球及網織紅血球與圖2Α和2 Β有著相似的數據。 ML_2_ :本發明使用試劑姐合物和方法與NCCLS方法的關聯性研究。本一研究指示當AO.EOH使用試劑組合物于前述營光流式细胞計數器和圖1A和1B的光學糸統和NCCLS手工方法的表現性比較功效。血檢Si來自39位Technicon員工和23位酱院病人。酱院病人檢體含3個鐮狀细胞性血球· 1個地中海型貧血Μ及10個新生兒血檢骽。62個血液檢體皆利用實例1所述的試劑姐合物染色，並分析它們網織紅血球含量。同樣血檢體中網織紅血球也使用H CCLS方法計算。檢體的製備和分析步驟皆依照實例1的描述。由這2種方法得到的網織血球百分比比較于圖3Α。試劑姐合物中含濃度6微克Α0Ε0Η/毫升，顯示試劑姐合物和由前述螢光流式細胞計數器和圖1Α及】Β的光學糸統測量與由 NCCLS參考方法測量之間有著極相近的相闞性。測得相闞係數為0.95。第二個實驗指示當噚畊750使用于前述過螢光流式細胞計數器和圖1D和1E的光學糸統中的NCCLA方法的表現性比較之功效。檢體製備和分析步驟皆依照實例1 。血檢體皆 Μ試劑組合物染色且分析它們網織紅血球含量。同樣血檢髏中網織紅血球也使甩NCCLS方法計算。由這2種方法得 ---------------ί --------裝------訂-----線 (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) -29 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210 X 297公釐） 81.10.20,000 經濟部中央標準局員工消#合作社印製 A6 _ B6 __ 五、發明説明（28 ) 到的網織紅血球百分比比較于圖3 B。測得相關係數為 0.93° 管例 3 :使用含Α0Ε0Η本發明試劑姐合物和Technicon HI Jr.參考方法相關性研究。實例2的同樣檢體使用Technicon Hi Jr.糸統再測紅血球指數。Technicon HI Jr.自動糸統為流式细胞計數器並可同時地測各別等容球狀紅血球的血球體積和血紅素澴度 Ο 指數MCV和MCHC皆各別在Technicon HI Jr.分析儀上測得，並與使用本發明含Α0Ε0Η試劑姐合物測得的值相比較。圖4A和4B分別顯示所有紅血球指數，MCV和MCHC的相關性數據。測得相關係數分別為0.9 1和0.97。實例 4 :本發明含噚哄750試劑組合物和Technicon HI 參考方法的相關性研究。紅血球與網織紅血球指數，MC V和MCHC皆各別測得，並且與使用本發明聘畊750試劑姐合物所測值相比較。圖 5A和5B顯示所有紅血球MCV和MCHC备別地相關性數據。相關係數各別測得為0.93和0.92。實-例5.:使用實例2含Α0Ε0Η試劑組合物及緩衝液（其無法區分血液中網織紅血球）區分血液檢體中網織紅血球和紅血球之散射光及螢光測量。並非全部緩衝液皆可使用于同時染色和球化網織紅血球 « 。此實例顯示'當使用Α0Ε0Η染色和酸鹼度8.0的隣酸緩衝液及滲透壓290毫滲透壓，無法完美地區分網織紅血球和 (請先«讀背面之注意事項再塡寫本頁) .裝，訂. -3 0 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS)甲4規格（210_ X 297公釐） 81.10.20,000

第82103032號專利申請案中寸說昍婁榇TF苜（8 5年‘R月）A7 B7 五、發明説明（）紅血球（參照圖6A)。比較之下，當使用巴比特魯緩衝液 (12微克/毫升LAB界面活性劑）酸鹼度8.0和渗自@ 290毫滲透壓則可漬楚地觀察到網織紅血球和紅血球的完美區分（參照圖6B)。本發明的一些優點可由前述含試劑組合物和用來鑑定全血中網織紅血球的方法獲得證實，並且使用螢光流式妞胞計數器技術同時定量分析網織紅血球和紅血球體積，血紅素含量和血紅素濃度。由上觀之，將可見到數個本發明目的已達到，而且也得到其他有利结果。 Μ上结構和方法在沒有脫離本發明的範圍下可Μ有各種的變化，亦即包括Μ下描述的所有本體•或顯示之附圖，僅用來說明而非限制。例如，部份血液檢體可Κ類似的方法處理。 --------f 裝------訂-----~ 綵 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標孪局員工消費合作社印製 -31 - 本纸張尺度適用中國國家標隼（CNS ) A4規格（210X29"/公釐）

Claims

1片21.03032號專利由請案 3imi 請專利範圍修正本ί85年1〗月） Α8 Β8 C8 D8

六、申請專利範圍一種使用流式细朐計數器來鑑定血液檢體中所關注次類润抱之方法，其包含如下步驟： ®琨合該等份之血檢體液和試劑姐合物溶液K形成懸浮液，其中含染料化合物之試劑姐合物由可染色所關注次頷细胞的核餹核酸，维持酸鹼度6到9的緩衝液和球狀劑； (b】該步驟⑶的懸浮液實質上每單位時間以一個细胞經過聚光照明區； ια偵測每一妞胞散射光和螢光；且 ό至少Μ該散射光和螢光部份為依據來區分翮注的該次類的該细胞。 2. 根據申請專利範圍第1項之方法，其中該次類的细胞為網織紅血球。 3. 根撺由請專利範圍第1項之方法，其中步驟（b)的該光照明具有激發紅色光譜區之波長。 4 . 根撺由請專利範圍第1項之方法，其中步驟（b)的該光照明具有激發Μ色光譜區之波長。 5 · 根撺申請專利範圍第1項之方法，其中球狀劑為兩性離子的界面活性劑。經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 6 · 根撺申請專利範圍第〗項之方法，其中染料化合物為具卜式之嗎哄（Ο X a z i n e ) 7 5 0 : 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210K29V公釐）六、申請專利範圍 A8 Βδ C8 D8

或染料化合物為3 , 6 -雙（二甲胺基）-1 0 - 2 -羥乙基吖錠換化物（A Ο Ε Ο Η )。經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 7 · 根撺申請專利範圍第5項之方法，其中界面活性劑為月梓睹胺丙基甜菜狳。 S · —種使用流式细胞計數器來特徵化全血檢體中網缴紅血球和紅血球之方法，其包含如下步驟： ⑸渴合該血檢體液和含一種有機陽離子染料化合物，一種球状劑和一種緩衝液W形成懸浮液，其中該染料化合物可染網織紅血球的核酵核酸；該步驟（a)的懸浮液實質上每單位時間以一個细胞經過聚光照明區；〇偵測每一细胞散射光和螢光； (d) W該散射光和螢光為依撺來鑑定經染色妞胞和未涇染色妞胞；且 ⑹K該散射光和螢光為依據來決定網織紅血球或紅血球的數目，體積，血紅素漘度，和R N A濃度。根撺申請專利範圍第8項之方法，其中試劑组合物含染料噚阱750.濃度範圍0. 2微克/¾升至1 . 2微克/毫升。 1 〇 .根撺申請專利範圍第8項之方法，其中試劑姐合物的酸鲔度介於6和9之間。 1 1 .根埤由_專.利範圍第8項之方法 > 其中_衝液含一個或 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -* 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨〇7：2必公釐）經濟部中央標準局員工消費合作社印製 ^16948 会8 C8 D8六、申請專利範圍多屆：K/NaHC〇3濃度5毫莫耳濃度至50毫莫耳濃度； MgCU，濃度0毫莫耳瀠度至88毫莫耳濃度；KC1,濃度4 毫莫耳濃度至104毫莫耳濃度；Na3PCU,濃度在0毫莫互濟度至0.4毫莫耳濞度；試劑姐合物的最终滲透壓 270毫滲透壓至310毫滲透壓。 12. 根捸申請專利範圍第8項之方法，其中媛衝液含一個或多個：TM s濃度0毫莫耳濃度至1 5 0毫莫耳濃度； K 2 (〕X / E rT T A ,溥度0毫莫S濃度至1 2 1毫箅耳濃度；K及巴比特魯潢度0毫莫耳濃度至155毫Μ耳濃度；試劑姐合物的最终滲透壓280毫滲透壓至3 〇〇毫滲透壓。 13. 根撺由請專利範圍第8項之方法*其中界面活性劑為烷轅胺基甜菜狳。 14·根撺由請專利範圍第8項之方法，其中界面活性劑為月桂醯胺丙基甜菜筠。 15.根撺申請專利範圍第8項之方法，其中界面活性劑含量 12微克/毫升至87.5微克/毫升。 1 6 .根棟申請專利範圍第8項之方法，其中試劑姐合物含 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) SK 試 ϋ , 6-種所酸 3’ I 中核

。體 _ I.檢核 ΟΗ血的 ΟΕ全球 (Α定血本紙張尺度逋用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X2的公釐） A8 B8 C8 D8六、申請專利範圍經濟部中央標隼局員工消費合作社印製或染料化合物為3，6 -雙（二甲胺基）-1 Ο - 2 -羥乙基吖錠碘化物（Α Ο Ε Ο Η ); Κ及緩衝溶液來維持酸鹼度（5至9。 1 8 .根據申請專利範圍第1 7項之試劑姐合物，其中緩衝液含一個或多個：K/NaHC03濃度5毫莫耳湄度至50毫莫耳濃度；MgCU,濃度0毫莫耳湄度至88毫莫耳濟度；KC1,濃度4毫箅耳濃度至104毫莫耳濃度；Ha3PCU,濃度在0 毫箅互濃度至1.5毫莫耳濃度；以及CaCU濃度0毫莫 Η濃度至0.4毫莫耳濟度；試劑姐合物的最终滲透壓 2 7 0毫滲透壓至3 1 0毫滲透壓。 1 9 .根撺申請專利範圍第1 7項之試劑组合物*其中緩衝液含一涸或多個：T r i s潢度0毫莫Η潢度至1 5 0毫莫且濃度 ;K2〇X/EDTA,濃度0毫莫耳濃度至121毫莫耳濃度；Κ 及巴比特魯濃度0毫箅耳濃度至1 5 5毫莫瓦濃度；試劑組合物的最终湊透壓280毫滲透壓至300毫滲透壓。 2 0.根撺串請專利範圍第17項之試劑姐合物，其中含染料晖阱750, 濟度0.2微克/毫升至1.2微克/毫升。 2 1 . —種試劑姐合物，係藉流式细胞計數器來特徵化全血檢體中網缴紅血球其含一種有效量的染料化合物來染網識紅血球中的核糖核酸，其中該染料化合物為具下式之喟 0# 7 5 0 ： '

本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4说格（210Χ2泠公釐） (請先Μ讀背面之注意事項再填寫本頁) 、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印策 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍或染料化合物為3,6 -雙（二甲胺基）-10-2 -羥乙基吖錠捵化物（AO E0 Η) ·,—種兩性離子的界面活性劑，其量可有效地使網織紅血球及紅血球等容球狀化，及維持酸鹼度 6至9之緩衝液。 22.根據申請專利範圍第21項之試劑组合物，其中緩衝液含一個或多個：K/NaHC03濃度5毫莫耳濃度至50毫莫耳濃度；Mi?CU,瀠度0毫濃度至88毫莫互濃度；KC1,湄度4毫濃度至104毫莫耳濃度；Na3PCU,濃度在0 毫莫Η濃度至1 . 5毫箅耳濃度；K及C a C丨2濃度0毫莫互濃度至0 . 4毫莫百濃度；試劑姐合物的最终湊透壓 270毫滲透壓至310毫滲透壓。 2 3 .根搏申請專利範圍第2 1項之試劑姐合物，其中緩衝液含一個或多個：Tris濟度0毫莫耳濃度至150毫箅耳潢度 ;K2〇X/EDTA,濟度0毫莫耳濃度至12丨毫K耳濃度；以及巴比特魯潢度0鼍莫耳濃度至155毫莫耳濃度；試劑姐合物的最终滲透壓280毫滲透壓至3 00毫滲透颸。 2 4.根據申請專利範圍第21項之試劑组合物，其中含染料晖哄750濃度0.2微克/毫升至1.2微克/毫升。 2 5 ·根撺申請專利範圍第2 1項之試劑姐合物，其含每毫升 12微克的界面活性劑到每毫升87.5微克該界面活性劑。 26. 根據由請專利範圍第21項之_試劑姐合物，其中界面活性劑為一種烷賭胺基甜菜狳。 27. 根撺由請專利範圍第21項之試劑姐合物，其中界面活性本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4见格（210X2S&公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)

S16948 A8 B8 C8 D8 申請專利範圍菜甜基丙醯桂月為劑 Ί (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂. 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X2??公瘦）