JP2017528715A - 細胞齢を決定するシステムと方法 - Google Patents

Abstract

ＨｂＡ１ｃの割合を決定することによって、血液サンプル中の各赤血球の細胞ヘモグロビンの年齢を決定するシステムと方法が提供される。実施形態において、方法は、個々の赤血球の側方散乱及び蛍光を測定する工程と、この側方散乱と蛍光の測定から、未熟の赤血球及び成熟した赤血球を識別する工程とを含む。実施形態においては、取集されるデータには、赤血球の厳密な数、蛍光と側方散乱単位の分画限界、蛍光と側方散乱単位の各分画の平均値、任意の単位の分画ごとの平均ＦＬ１値、及び任意の単位の分画ごとの平均側方散乱値が含まれる。実施形態において、方法は更に、個々の赤血球の測定された平均蛍光からＨｂＡ１ｃ含有量を導出する工程と、赤血球のＨｂＡ１ｃ含有量及びヘモグロビン含有量から、ＨｂＡ１ｃの割合を決定する工程を含む。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１５年９月１１日にＰＣＴ国際特許出願として出願されており、２０１４年１０月３日に出願された米国特許出願第６２／０５９，６８４号に基づく優先権を主張し、更に、２０１４年９月１２日に出願された米国特許出願第６２／０４９，９７０号に基づく優先権をも主張するものであり、それらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。

（発明の分野）
本開示は、細胞内の細胞ヘモグロビンの年齢及び／又は赤血球の平均年齢を決定するシステムと方法に関する。

赤血球の寿命は、ｉｎ ｖｉｖｏでのクロム５１標識赤血球のクリアランスの測定から導き出されてきた（Ｇｒａｙ、Ｓ．Ｊ．及びＳｔｉｒｌｉｎｇ、Ｋ、１９５０年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２９：１６０４〜１６１３；Ｄａｃｉｅ及びＬｅｗｉｓ；Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、第９版、２００１年、Ｅｄ．；Ｓ．Ｍ．Ｌｅｗｉｓ、Ｂ．Ｊ．Ｂａｉｎ及びＩ．Ｂａｔｅｓ、Ｐｕｂｌ、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ）。この方法は、侵襲的で扱いにくく、広く使用されていない。赤血球の寿命を測定するための他の技術が、呼気中の一酸化炭素の測定（Ｍ．Ａ．Ｖｉｒｔｕｅ等、２００４年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ；ｖｏｌ．２７、Ｎｏ ４、９３１〜９３５頁）、赤血球の密度遠心分離（Ｂｏｒｕｎ ＥＲ等、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ３６：６７６、１９５７年）、並びに、赤血球の細胞表面上のＣＤ３５のフローサイトメトリ測定（Ｌａｃｈ−Ｔｒｉｆｉｌｉｅｆｆ等、１９９９年、Ｊｏｕｒｎａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２、（１２）：７５４９）を含む、赤血球寿命を非侵襲的に測定するために開発されてきた。だが、こうした技術はどれも、赤血球の寿命又は平均年齢を矛盾なく決定できることが示されていない。

Ｇｒａｙ、Ｓ．Ｊ．及びＳｔｉｒｌｉｎｇ、Ｋ、１９５０年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２９：１６０４〜１６１３ Ｄａｃｉｅ及びＬｅｗｉｓ；Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ、第９版、２００１年、Ｅｄ． Ｓ．Ｍ．Ｌｅｗｉｓ、Ｂ．Ｊ．Ｂａｉｎ及びＩ．Ｂａｔｅｓ、Ｐｕｂｌ、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｍ．Ａ．Ｖｉｒｔｕｅ等、２００４年、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ；ｖｏｌ．２７、Ｎｏ ４、９３１〜９３５頁 Ｂｏｒｕｎ ＥＲ等、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ３６：６７６、１９５７年 Ｌａｃｈ−Ｔｒｉｆｉｌｉｅｆｆ等、１９９９年、Ｊｏｕｒｎａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６２、（１２）：７５４９

（発明の要旨）
それ故、細胞ヘモグロビンの年齢及び／又は赤血球の平均年齢を決定するシステムと方法を開発することが望まれる。
本明細書で述べるシステム、方法、キット、及び組成物は、細胞ごとにＨｂＡ１ｃの割合を決定する能力を提供し、赤血球集団又は亜集団の年齢構成（プロフィール）の決定を可能とし、赤血球の平均年齢の決定を可能とし、赤血球の寿命の決定を可能とし、更に推定されるグルコース含有量の決定も可能とする。単一血液サンプルの分析からは、過去１００から約１２０日までの情報を得ることができる。細胞の集団又は亜集団の年齢構成の決定は、糖尿病や血糖が関与する他の疾患を監視する上で有用である。細胞の集団又は亜集団の年齢構成の決定は、貧血や赤血球のヘモグロビン含有量が関与する他の疾患を監視する上で有用である。実施形態では、過去１００から約１２０日までに実施した輸血を検出できる。図１３を参照のこと。

１態様において、本開示は、ＨｂＡ１ｃの割合を決定することによって、血液サンプル中の各赤血球の細胞ヘモグロビンの年齢を決定するためのシステムと方法に関する。他の態様は、サンプル中の赤血球の平均年齢を決定することを含む。本発明の方法とシステムは、被験体における糖尿病や貧血、輸血の存在、及び／又は出血性イベントの存在を監視する方法において有用である。更に、本発明のシステムと方法は、糖尿病や貧血の進行又は改善を監視する上でも有用である。

１態様において、本開示は、サンプル中の赤血球の年齢を決定するためのキットと試薬を提供する。実施形態において、サンプル中の赤血球集団の年齢構成を決定するキットは、ａ）ＨｂＡ１Ｃ又はその変種と特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと、ｂ）ＲＮＡと特異的に結合する色素と、ｃ）赤血球基準対照サンプルとを、含む。幾つかの実施形態において、赤血球基準対照細胞は、既知の割合のＨｂＡ１Ｃを含む。別の実施形態では、基準対照細胞は、糖尿病や貧血に罹っていない被験体からなどの標準的な対照サンプルである。別の実施形態において、基準対照細胞は、ＨｂＡ１Ｃ値が分かっている糖尿病被験体からのものである。実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、検出可能に標識化される。実施形態において、ＲＮＡと特異的に結合する色素は、アクリジン・オレンジである。実施形態において、更に、キットは赤血球を透過する試薬も含むことが可能である。他の実施形態では、キットは、更に、本明細書で記載されるとおり、サンプル内の赤血球の年齢及び／又は密度を決定するための命令を含むコンピュータ可読媒体も含む。

別の態様において、本開示は、サンプル中の赤血球の年齢及び／又は密度を決定するシステムを提供する。実施形態において、赤血球集団の年齢を決定するシステムは、個々の赤血球の側方散乱及び蛍光の検出器と、個々の赤血球の少なくとも１つの波長での測定された蛍光及び測定された側方散乱からのＨｂＡ１ｃ含有量割合の計算器と、網状赤血球のＨｂＡ１ｃの平均割合を使用する、赤血球集団の複数の分画への分割器であって、各分画は、実質的に等しい数の赤血球を含む分割器と、各サンプルの寿命係数の計算器と、サンプルの分画の年齢の計算器とを含む。他の実施形態において、更に、本発明のシステムは、サンプルの平均年齢の計算器も含み、このサンプルの平均年齢を正常対照サンプルの平均年齢と比較する。更に別の実施形態において、本発明のシステムは、更に、特定の年齢の細胞の平均細胞ヘモグロビンの計算器も含み、この平均細胞ヘモグロビンが、細胞の年齢に応じて変化するか否かを判定する。

別の実施形態において、本開示は、方法の工程を実施する命令を含む非一時的コンピュータ可読媒体を備えるシステムを提供し、この方法は、サンプル中の個々の赤血球それぞれのヘモグロビン、ＨｂＡ１ｃ、及びＲＮＡ含有量を決定する工程と、個々の赤血球それぞれのＨｂＡ１ｃ含有量及びヘモグロビン含有量から個々の細胞それぞれにおけるＨｂＡ１ｃの割合を決定する工程と、個々の細胞におけるＨｂＡ１ｃの割合とサンプルの基準細胞分画のＨｂＡ１ｃの平均割合とを比較することによって、赤血球集団を複数の分画に分画する工程であって、各分画は、実質的に等しい数の赤血球を含む工程と、各分画におけるＨｂＡ１ｃの平均割合を決定し、ＨｂＡ１ｃの平均割合を基準対照細胞又は基準対照分画に関するＨｂＡ１ｃの平均割合と比較することによって、分画における赤血球の年齢を識別する工程とを含む。実施形態において、更に、本発明のシステムは、基準対照細胞の同じ分画と比較したとき、特定のＨｂＡ１ｃ割合の分画に属するサンプル中の赤血球の密度を決定する工程も含む。実施形態において、基準対照細胞は、平均年齢が少なくとも２８日である。

本開示の別の態様は、サンプル中の赤血球の年齢及び／又は密度を決定する方法を提供する。実施形態において、血液サンプルにおける赤血球集団の年齢構成を決定する方法は、この集団における個々の赤血球それぞれのヘモグロビンとＨｂＡ１ｃ含有量を測定する工程と、個々の赤血球それぞれのＨｂＡ１ｃ含有量及びヘモグロビン含有量からの個々の細胞それぞれにおけるＨｂＡ１ｃの割合を決定する工程と、個々の細胞におけるＨｂＡ１ｃの割合と基準細胞分画のＨｂＡ１ｃの平均割合とを比較することにより、赤血球集団を複数の分画に分画する工程であって、各分画は、実質的に等しい数の赤血球を含む工程と、各分画におけるＨｂＡ１ｃの平均割合を決定し、ＨｂＡ１ｃの平均割合を基準対照分画又は基準対照細胞に関するＨｂＡ１ｃの平均割合と比較することによって、分画における赤血球の年齢を識別する工程とを含む。

更に別の実施形態において、更に、本発明の方法は、基準対照細胞の同じ分画と比較したとき、特定のＨｂＡ１ｃ割合の分画に属するサンプル中の赤血球の密度を決定する工程も含む。更に別の実施形態において、本発明の方法は、更に、データを各分画から収集する工程も含み、このデータは、赤血球の厳密な数、網状赤血球分画の平均ＨｂＡ１ｃ、及びサンプル中の個々の赤血球のそれぞれに関する蛍光と側方散乱単位での各分画の値を含む。

実施形態において、本明細書で述べる方法では、各赤血球のヘモグロビンを、側方散乱により測定する。実施形態において、ＨｂＡ１ｃ又はその変種に特異的な検知可能に標識化された抗体を使用して、ＨｂＡ１ｃを測定する。例えば、標識は蛍光部分である。実施形態において、本発明の方法は、更に、個々の細胞のＲＮＡ含有量を測定する工程も含み、ＲＮＡが存在すると、細胞が網状赤血球として識別される。一実施形態において、ＲＮＡは、アクリジン・オレンジなどの色素を結合することで測定される。実施形態において、基準細胞分画又は対照細胞は、ＨｂＡ１ｃの割合が分かっている網状赤血球など細胞である。実施形態において、基準対照分画は、分析されるサンプル内の内部細胞タイプである。実施形態において、基準対照細胞は、平均年齢が少なくとも２８日である。

別の実施形態において、本発明の方法は、更に、赤血球集団の年齢構成が、基準細胞集団の年齢構成と比べたとき、より大きい数の古い細胞を多く含むか否かを、疾患状態又は疾患状態の状況を示すものとして判定する工程も含む。一実施形態において、疾患状態は糖尿病である。実施形態において、本発明の方法は、更に、サンプル中の細胞の平均年齢を決定し、この平均年齢と正常対照サンプルの平均年齢とを比較する工程も含み、平均年齢の差は疾患状態を示す。一実施形態において、疾患状態は糖尿病である。

更に別の実施形態において、本発明の方法は、更に、特定の年齢を有するサンプルの分画の平均細胞ヘモグロビン含有量を決定する工程と、異なる年齢の分画において平均細胞ヘモグロビン含有量に差があるか否かを判定する工程も含む。実施形態において、この差は、貧血、出血、又は輸血を示す。

健康な被験体の人間の血液サンプルから得られたフローサイトメトリデータの図表記を示す。ＦＬ４（６７５ｎｍ）蛍光常数スケール対ＦＬ１（５２５ｎｍ）蛍光対数スケール領域Ａ；対照細胞。領域Ｂ；赤血球網状赤血球。領域Ｃ；成熟した赤血球。赤血球を、Ｆｌｕｏｒ Ａｌｅｘａ ６４７共役抗ＨｂＡ１ｃ抗体及びアクリジン・オレンジで標識化する。カルボキシ・フルオレセイン・スクシンイミジル・エステルで標識化済みの対照細胞を、アッセイに含めた。対照細胞は、糖尿病患者からである。ＦＣ５００サイトメーターにおいて、蛍光ＦＬ１（５２５ｎｍ）、ＦＬ４（６７５ｎｍ）を測定した。 図１Ａの領域Ｃで示す解析で得られたデータの表記である。細胞の事象を横座標上にプロットし、ＦＬ４／ＳＳ又はＨｂＡ１ｃ割合の任意の値を表記している。プログラムを使用して、略等しい量の細胞を含む１０分画に、細胞集団を分割した。ＨｂＡ１ｃ割合軸上には、分画の平均値を示した。 図１Ａの領域Ｂで得られた網状赤血球集団の解析の表記である。網状赤血球は、ＦＬ４図で示されている。ＨｂＡ１ｃレベルが比較的高い細胞については、集団から除外した。 異なる血液ライセートにより浸透赤血球に結合する抗ＨｂＡ１ｃ抗体の阻害率の図表記である。 サイトメトリＨｂＡ１ｃ割合決定の標準曲線であり、ＨｂＡ１ｃ割合とＦＬ４／ＳＳ値との相関を示す。横座標；１２０サンプルからの見込みＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合値；縦座標；同じ１２０サンプルのサイトメトリＦＬ４／ＳＳ値。バックグラウンドと補償用に、ＦＬ４値を訂正し、側方散乱で除算した。内部対照値を使用して、ＦＬ４／ＳＳ値を正規化した。 式Ｉによるデータ変換後のサイトメトリＨｂＡ１ｃ割合決定の標準曲線である。実施例２で述べるとおりに、式Ｉを用いて、正規化後のＦＬ４／ＳＳ値を変換した。１２０サンプルの変換後のデータは、図２Ｂで示されている。 分画ごとのＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合の図表記である。実施例３で述べるとおりに、健康な人間の被験体からのＦＬ４／ＳＳ分画を取得し、図１で見られるように解析した。分画は、表１で示すとおりであり、１〜１０の値及び網状赤血球を表すＲが付与されている。表１で見られるように、分画ごとに、平均ＦＬ４／ＳＳ値を、ＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合値に変換した。 時間軸上のＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合の変化に関する図表記である。分画限界値の時間への変換を、表１で示す。 年齢軸上のＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合に関する図表記である。年齢は、負値の日付で示している。 微分されたＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合値対年齢の図表記である。図３Ｃの微分によって、定数値がもたらされる（表１を参照）。この値を、基準サンプルの測定された平均ＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合に正規化した。 分画ごとの分画サイズの図表記である。表１で見られるように、ＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合単位で表される分画サイズを計算した。 年齢軸上における血液循環中に表れる細胞の割合に関する図表記である。割合の計算を、表１で示す。 Ａ〜Ｃは、別様に、正常な被験体の血糖濃度の一時的な上昇の影響のシミュレーションに関する図表記を提供する。（Ａ）；図３Ｂで表示され、かつ実施例３と表１で決定される正常な被験体のＨｂＡ１ｃ曲線；（Ｂ）；（Ａ）と同様であるが、血糖濃度が一時的に上昇する。（Ｃ）；（Ｂ）と同様であるが、実施例５及び表３で述べるように決定される。 サンプル収集前の３０日の期間にわたる平均ＨｂＡ１ｃ割合値と平均グルコース濃度の関係の散布図表記である。実施例４の記載のとおりに、データを得た。 患者サンプルにおける分画の微分後のＨｂＡ１ｃ割合値及び該当する分画の年齢期間中に測定された平均グルコース濃度の関係の散布図表記である。実施例４の記載のとおりに、データを得た。実施例９の記載のとおりに、平均グルコース値及び微分後のＨｂＡ１ｃ割合値を並べた。 自己測定及び決定されたＨｂＡ１ｃ割合により得られた平均日間グルコース濃度値を含む２６人の糖尿病疾患被験体からの２６の異なる時間／年齢図の図表記を示す。実施例４で記載のとおりに、縦座標上の平均日間グルコース濃度値を得た。横座標上の時間データを、自己測定データのカレンダーから導出した。縦座標上の微分後のＨｂＡ１ｃ割合値を、実施例５と表２Ｃ（ｔ列）で示すように計算し、更に、実施例７で記載のとおりに正規化した。横座標上の年齢データを、実施例６及び表２Ｄのａｄ列で示すように算出した。 自己測定及び決定されたＨｂＡ１ｃ割合により得られた平均日間グルコース濃度値を含む２６人の糖尿病疾患被験体からの２６の異なる時間／年齢図の図表記を示す。実施例４で記載のとおりに、縦座標上の平均日間グルコース濃度値を得た。横座標上の時間データを、自己測定データのカレンダーから導出した。縦座標上の微分後のＨｂＡ１ｃ割合値を、実施例５と表２Ｃ（ｔ列）で示すように計算し、更に、実施例７で記載のとおりに正規化した。横座標上の年齢データを、実施例６及び表２Ｄのａｄ列で示すように算出した。 自己測定及び決定されたＨｂＡ１ｃ割合により得られた平均日間グルコース濃度値を含む２６人の糖尿病疾患被験体からの２６の異なる時間／年齢図の図表記を示す。実施例４で記載のとおりに、縦座標上の平均日間グルコース濃度値を得た。横座標上の時間データを、自己測定データのカレンダーから導出した。縦座標上の微分後のＨｂＡ１ｃ割合値を、実施例５と表２Ｃ（ｔ列）で示すように計算し、更に、実施例７で記載のとおりに正規化した。横座標上の年齢データを、実施例６及び表２Ｄのａｄ列で示すように算出した。 自己測定及び決定されたＨｂＡ１ｃ割合により得られた平均日間グルコース濃度値を含む２６人の糖尿病疾患被験体からの２６の異なる時間／年齢図の図表記を示す。実施例４で記載のとおりに、縦座標上の平均日間グルコース濃度値を得た。横座標上の時間データを、自己測定データのカレンダーから導出した。縦座標上の微分後のＨｂＡ１ｃ割合値を、実施例５と表２Ｃ（ｔ列）で示すように計算し、更に、実施例７で記載のとおりに正規化した。横座標上の年齢データを、実施例６及び表２Ｄのａｄ列で示すように算出した。 寿命係数の関係の図表記である。縦座標；決定されたＨｂＡ１ｃ割合の構成（プロフィール）と血糖の構成との間の最適な一致から決定された寿命係数。横座標；網状赤血球ヘモグロビン含有量とＲＮＡ含有量とから導出された寿命係数。網状赤血球のヘモグロビンとＲＮＡ含有量からの寿命係数の決定を、実施例７及び表２で示している。 ２６人の異なる糖尿病疾患被験体及び６人の健康被験体の血液の年齢分画における表記細胞の割合を含む時間図の図表記を示す。実施例９の記載のとおりに、割合値を計算した。実施例１０に記載の外挿によって、ゼロパーセント点を決定した。 ２６人の異なる糖尿病疾患被験体及び６人の健康被験体の血液の年齢分画における表記細胞の割合を含む時間図の図表記を示す。実施例９の記載のとおりに、割合値を計算した。実施例１０に記載の外挿によって、ゼロパーセント点を決定した。 ２６人の異なる糖尿病疾患被験体及び６人の健康被験体の血液の年齢分画における表記細胞の割合を含む時間図の図表記を示す。実施例９の記載のとおりに、割合値を計算した。実施例１０に記載の外挿によって、ゼロパーセント点を決定した。 ２６人の異なる糖尿病疾患被験体及び６人の健康被験体の血液の年齢分画における表記細胞の割合を含む時間図の図表記を示す。実施例９の記載のとおりに、割合値を計算した。実施例１０に記載の外挿によって、ゼロパーセント点を決定した。 ２６人の糖尿病疾患被験体及び６人の健康被験体における異なる年齢分画での細胞の平均細胞ヘモグロビン含有量（ＭＣＨ）を含む時間図の図表記を示す。内部対照細胞を使用して、ＭＣＨを決定した。分画の年齢を、実施例６及び表２Ｄのａｄ列で示すように決定した。 ２６人の糖尿病疾患被験体及び６人の健康被験体における異なる年齢分画での細胞の平均細胞ヘモグロビン含有量（ＭＣＨ）を含む時間図の図表記を示す。内部対照細胞を使用して、ＭＣＨを決定した。分画の年齢を、実施例６及び表２Ｄのａｄ列で示すように決定した。 ２６人の糖尿病疾患被験体及び６人の健康被験体における異なる年齢分画での細胞の平均細胞ヘモグロビン含有量（ＭＣＨ）を含む時間図の図表記を示す。内部対照細胞を使用して、ＭＣＨを決定した。分画の年齢を、実施例６及び表２Ｄのａｄ列で示すように決定した。 ２６人の糖尿病疾患被験体及び６人の健康被験体における異なる年齢分画での細胞の平均細胞ヘモグロビン含有量（ＭＣＨ）を含む時間図の図表記を示す。内部対照細胞を使用して、ＭＣＨを決定した。分画の年齢を、実施例６及び表２Ｄのａｄ列で示すように決定した。 フローサイトメーターの例を示す概略ブロック図である。 選別フローサイトメーターの態様を実装するために使用可能なコンピュータ装置の例示的アーキテクチャーを示す。 Ｔｏｓｏｈ、Ｐｒｉｍｕｓ、及びＲｏｃｈｅ試験法を含む他の３試験を使用した１２０の血液サンプルの％ＨｂＡ１Ｃ測定を示す。 Ｔｏｓｏｈ、Ｐｒｉｍｕｓ、及びＲｏｃｈｅ試験法を含む他の３試験を使用した１２０の血液サンプルの％ＨｂＡ１Ｃ測定を示す。 Ｔｏｓｏｈ、Ｐｒｉｍｕｓ、及びＲｏｃｈｅ試験法を含む他の３試験を使用した１２０の血液サンプルの％ＨｂＡ１Ｃ測定を示す。 図１３のＡ−Ｅは、赤血球集団の年齢ごとのＨｂＡ１ｃ割合、赤血球年齢ごとの推定グルコース、細胞年齢ごとの平均細胞ヘモグロビン、サンプル中の特定の年齢の細胞の割合を含む単一血液サンプルから得られる情報を示す。 図１３のＡ−Ｅは、赤血球集団の年齢ごとのＨｂＡ１ｃ割合、赤血球年齢ごとの推定グルコース、細胞年齢ごとの平均細胞ヘモグロビン、サンプル中の特定の年齢の細胞の割合を含む単一血液サンプルから得られる情報を示す。 赤血球集団の年齢ごとのＨｂＡ１ｃ割合、赤血球年齢ごとの推定グルコース、細胞年齢ごとの平均細胞ヘモグロビン、サンプル中のある年齢の細胞の割合を含む単一血液サンプルから得られる情報を示す。 赤血球集団の年齢ごとのＨｂＡ１ｃ割合、赤血球年齢ごとの推定グルコース、細胞年齢ごとの平均細胞ヘモグロビン、サンプル中のある年齢の細胞の割合を含む単一血液サンプルから得られる情報を示す。 赤血球集団の年齢ごとのＨｂＡ１ｃ割合、赤血球年齢ごとの推定グルコース、細胞年齢ごとの平均細胞ヘモグロビン、サンプル中のある年齢の細胞の割合を含む単一血液サンプルから得られる情報を示す。 ２８人の糖尿病患者の平均ＨｂＡ１ｃ及び最大分画ＨｂＡ１ｃの比較を示す。 サンプル中の赤血球の年齢を決定するための本明細書で記載の例示的方法の流れ図を示す。

定義
別途規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術科学用語は、本開示が関連する当業者によって一般に理解される同じ意味を有する。

測定値を参照する際に本明細書で使用する「約」は、所定値から±２０％、あるいは、±１０％、望ましくは、±５％、より望ましくは±１％、更に、望ましくは、±０．１％の変動を含むことを意味する。

血液分析器において、血液サンプルの「平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）」は、赤血球ごとのヘモグロビンの平均質量であり、血液サンプルの赤血球数（ＲＢＣ）及び総ヘモグロビン（Ｈｇｂ）から導出される。後者は、溶解血液サンプルのヘモグロビン濃度の吸光分光測定から得られる。ＭＣＨは、全ての赤血球の平均測定値である。これは、個々の赤血球のヘモグロビン含有量を表さない。これは、ヘモグロビンの総質量を血液量中の赤血球数で除算することで算出される。
ＭＣＨ＝（Ｈｇｂ^＊１０）／ＲＢＣ。

フローサイトメーターにおいて、器具を校正する際、「基準対照」が一般に使用される。基準対照は、主として、既知のヘモグロビン濃度又はヘモグロビン同等物濃度、既知の側方散乱と蛍光強度を有する蛍光粒子から作られる。これは、一般に、合成粒子、人間又は動物の血液細胞、及び処理済みの人間又は動物の血液細胞を含むが、これらに限定されない。校正時、細胞ＨｂＡ１ｃの定量測定、つまり個々の赤血球におけるこのヘモグロビン変種の絶対量は、フローサイトメーターにおいて達成可能である。

本明細書で使用される「基準細胞分画」という語句は、赤血球の他の分画とは異なる特性を有する血液サンプルの細胞の分画について言及する。実施形態において、これらの特性には、ＲＮＡの存在及びより低いＨｂＡ１ｃ含有量が含まれる。実施形態において、基準細胞分画は、網状赤血球分画である。

「正常細胞対照」という語句は、疾患、あるいは、病気がないことが明らかとされた被験体から抽出された細胞について言及する。実施形態において、正常細胞対照は、非糖尿病性、あるいは、非貧血性の個体からのものである。実施形態において、正常細胞対照を使用して、例えば、赤血球の平均年齢を糖尿病被験体の赤血球の平均年齢と比較する。

フローサイトメトリで知られる「側方散乱」という語句は、フローセルの開口を通過する粒子、又は、血液細胞により生成される入射から約９０°、又は、直角での光散乱信号について言及する。前方散乱信号は、入射光から１０°未満で測定された光散乱信号について言及する。側方散乱測定は、光学検出器による側方散乱信号の測定について言及する。市販のフローサイトメーターには全て、前方散乱と側方散乱信号を測定可能とする検出システムが備えられる。

本明細書で使用される「ＨｂＡ１ｃ」という語句は、ヘモグロビンの糖化形態について言及する。赤血球で見られるこの糖化ヘモグロビンは、血漿グルコースとヘモグロビンとの反応生成物である。ＨｂＡ１ｃの量は、血漿グルコースに応じて増加する。

本明細書で使用される「網状赤血球」という語句は、リボソームＲＮＡの網状ネットワークを有する未熟血球について言及する。

「分画における表れた細胞の割合」という語句は、１／（ＨｂＡ１ｃ割合スケール上で表れた時間）に等しい。

式
本開示は、本明細書で記載の方法とシステムで有用となる幾つかの式を含む。本明細書に含まれる式は、以下のとおりである。
（Ｉ）ｙ＝ｃ^＊ｅ^{０．１５７＊ｘ}、式中、ｃは定数、ｙはＨｂＡ１ｃ基準値、ｘはサイトメトリＦＬ４／ＳＳ値である。
（ＩＩ）ｙ＝ｃ^＊（ｅ^ａ＊ｘ−ｅ^ｂ＊ｘ）^＊（ｄ＋ｅ^−ｆ＊ｘ）、式中、定数値は、以下で示すグルコース値との比較によって実験的に決まる。ａ＝０．０３、ｂ＝−０．０１、ｃ＝１５．１、ｄ＝１．８、ｅ＝２．７１８２８（オイラーの定数）、ｆ＝１．８、ｘ、ｙは式Ｉ内である通りである。
（ＩＩＩ）ｙ＝１５．１^＊（ｅ^{０．０３＊ｘ}−ｅ^{−０．０１＊ｘ}）^＊（１．８＋ｅ^{−１．８＊ｘ}）、式中、ｘ、ｙは、式Ｉ内である通りである。
（ＩＶ）ｙ＝ｃ_１ ^＊ｘ^１．３、式中、ｘは、以前の年齢値、ｙは、新規年齢値である。１１５日の最終分画の年齢を維持するよう、定数ｃ１を所定の値に維持する。
（Ｖ）平均値（ｍ）は、

によって得られ、式中、ａ、ｂは、それぞれのカットオフ値である。
（ＶＩ）ＬＯＧ１０（ｃ_１ ^＊ＲＮＡ）^＊ＬＯＧ１０（ｃ_２ ^＊２９．８^＊Ｈｂ）、式中、ｃ_１は、値が３．３３の定数であり、ｃ_２は、値が０．０２８の定数である。
（ＶＩＩ）抗体結合速度論；

リバース；ｙ＝ｃ１^＊（ｅ^ｘ＊ｃ２−１）
式中、ｙは、参考検査室により与えられたＩＦＣＣ単位のＨｂＡ１ｃ割合、ｘは、内部基準が存在する際に決定されたサイトメトリＨｂＡ１ｃ割合、ｃ_１とｃ_２は、定数である。
（ＶＩＩＩ）（ｄ）＝４．５４^＊（ｅ^{０．１５７＊（ｃ）}−１）、式中、分画限界値は、表１におけるＩＦＣＣ割合ＨｂＡ１ｃとして表記される。ｄ（ｄ）列の値は、式（ＶＩＩＩ）を使用して、ｃ列の値から得た。

（Ｘ）ＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合＝４．５４^＊（ｅ^{０．１５７＊ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｒｂｉｔｒａｒｙ ＨｂＡ１ｃ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ}−１）
（ＸＩ）ｗ＝ｅ^{０．１５７＊（ｖ）}−１

システム
実施形態において、赤血球集団の年齢を決定するシステムが提供されており、このシステムは、個々の赤血球の側方散乱及び蛍光の検出器と、個々の赤血球の少なくとも１つの波長での測定された蛍光及び測定された側方散乱からのＨｂＡ１ｃ含有量割合の計算器と、基準細胞分画のＨｂＡ１ｃの平均割合を使用する、赤血球集団の複数の分画への分割器であって、各分画は、実質的に等しい数の赤血球を含む分割器と、各サンプルの寿命係数の計算器と、サンプルの分画の年齢の計算器とを、含む。実施形態において、基準細胞分画は、網状赤血球分画である。

他の実施形態において、赤血球集団の年齢ごとの平均ヘモグロビン含有量を決定するシステムが提供されており、このシステムは、個々の赤血球の側方散乱及び蛍光の検出器と、個々の赤血球の測定された蛍光及び測定された側方散乱からのＨｂＡ１ｃ含有量割合の計算器と、基準細胞分画のＨｂＡ１ｃの平均割合を使用する、赤血球集団の複数の分画への分割器であって、各分画は、実質的に等しい数の赤血球を含む分割器と、各サンプルの寿命係数の計算器と、サンプルの分画の年齢の計算器と、サンプル中の細胞の年齢ごとの平均細胞ヘモグロビン含有量の計算器と、を含む。実施形態において、基準細胞分画は、網状赤血球分画である。

他の実施形態において、更に、システムは、サンプル中の細胞の平均年齢の計算器も含み、サンプル内の細胞の平均年齢を正常対照サンプル内の細胞の平均年齢と比較し、細胞の平均年齢の差は、糖尿病などの疾患、あるいは、疾患の状態を示す。他の実施形態において、更に、システムは、サンプルにおける異なる年齢の細胞の平均細胞ヘモグロビンの計算器も含み、種々の細胞齢の平均細胞ヘモグロビンを互いに比較して、細胞齢に伴う平均細胞ヘモグロビンの変化を識別し、変化は、貧血などの疾患、あるいは、疾患の状態、又は、出血、あるいは、輸血などのイベントを示す。

実施形態において、サンプルの分画年齢の計算器は、基準対照分画の平均割合ＨｂＡ１ｃの位置と比較して、各分画における平均割合ＨｂＡ１ｃの位置を計算することと、分画内の平均ＨｂＡ１ｃの位置を計算することと、分画ごとの微分されたＮＧＰＳ ＨｂＡ１ｃ割合を計算することと、分画の平均割合を３．４４などの定数（基準サンプルに関するＩＦＣＣ割合ＨｂＡ１ｃの例示的な値）で乗算することによって、分画年齢を計算することとを、含む。そして、表２Ｄで示すように、結果を式ＸＩに入力し：
ｗ＝ｅ^{０．１５７＊（ｖ）}−１、
更に、各分画間の差を計算して、値ｘを提供する。値ｘを分画の平均の位置で除算してから、分画における総イベントの割合で除算する。そして、被除数を寿命係数で乗算して、結果の累積値を決定する。実施形態において、基準対照分画は、網状赤血球分画などの既知の量のＨｂＡ１ｃを含む内部対照である。

必要に応じて、本明細書で述べるシステムのいずれかは、分画の微分後のＨｂＡ１ｃ割合の計算器、本明細書で提供される式を使用するＨｂＡ１ｃのＩＦＣＣ割合の計算器、及び／又はバックグラウンド用に補正された割合ＨｂＡ１ｃの計算器を、含むことが可能である。

実施形態において、本発明のシステムは、データ命令を格納する１つ以上のコンピュータ可読媒体を含み、このデータ命令は、コンピュータ装置によって実行された時、本明細書で記載の方法の工程、機能、あるいは、動作の任意の１つ以上を、コンピュータ装置に実行させる。更に、本発明のシステムは、本明細書で開示される工程、機能、あるいは、動作の１つ以上を実行するよう構成された電子機器も含むことができる。コンピュータ装置及び電子機器は、例えば、ソフトウェア又はファームウェア命令を含められる。更に、電子機器は、本明細書記載の工程、機能、又は動作を実行するよう特別に設計若しくは構成された他の電子ハードウェア装置も含められ、何らかの追加ソフトウェア又はファームウェア命令を使用しなくても良い。本明細書記載のモジュール又は計算器は、本開示の１つ以上の態様を決定するために使用され、ハードウェア（電子ハードウェア装置など）、ハードウェアとソフトウェア（コンピュータ装置など）、ソフトウェア、又は処理装置により実行可能な命令を格納するコンピュータ可読媒体として、実装可能である。

例えば、方法は、集団内の個々の赤血球それぞれのヘモグロビン及びＨｂＡ１ｃを測定する工程と、個々の赤血球それぞれのＨｂＡ１ｃ含有量及びヘモグロビン含有量から個々の細胞それぞれにおけるＨｂＡ１ｃの割合を決定する工程と、個々の細胞におけるＨｂＡ１ｃの割合と基準細胞分画のＨｂＡ１ｃの平均割合とを比較することで、赤血球集団を複数の分画に分画する工程であって、各分画は、実質的に等しい数の赤血球を含む工程と、各分画におけるＨｂＡ１ｃの平均割合を決定し、ＨｂＡ１ｃの平均割合を基準対照細胞分画に関するＨｂＡ１ｃの平均割合と比較することにより、分画における赤血球の年齢を識別する工程とを、含む。

実施形態において、更に、本発明の方法は、対照細胞の同じ分画と比較したとき、特定のＨｂＡ１ｃ割合の分画に属するサンプル中の赤血球の密度を決定する工程も、含む。実施形態において、対照細胞は、平均年齢が少なくとも２８日である。実施形態において、本発明の方法は、更に、サンプル中の個々の細胞におけるＲＮＡを測定する工程も、含む。実施形態において、基準細胞分画は、網状赤血球分画である。実施形態において、基準細胞分画は、参照により全体を援用する米国特許第７，９６８，２７９号で記載される既知のＨｂＡ１ｃ含有量を含む内部対照細胞集団である。

実施形態において、サンプル中の細胞は、抗体及び／又はその抗原結合フラグメントが細胞を浸透可能とする薬剤で透過処理される。実施形態において、ＤＮＡ又はＲＮＡに結合する試薬及び／又は検出可能な試薬で標識化されたＨｂＡ１ｃと特異的に結合する薬剤を用いて、分析される細胞を標識化する。ＤＮＡ／ＲＮＡに結合する試薬によって、細胞を網状赤血球として識別できる。実施形態において、検出可能な試薬は、蛍光標識である。実施形態において、ＨｂＡ１ｃと特異的に結合する薬剤は、ＨｂＡ１ｃ、又は、その変種に特異的な抗体である。実施形態において、ＲＮＡ／ＤＮＡ用の検出可能な試薬は、抗体上の検出可能な標識とは異なる波長で検出される。実施形態において、個々の細胞それぞれの側方散乱を決定する。

検出可能な薬剤（ＦＬ４）の蛍光を側方散乱（ＳＳ）で除算することによって、各細胞のＨｂＡ１ｃの割合を決定する。実施形態において、正規化されたＦＬ４／ＳＳデータを、式（Ｉ）で変換する：
ｙ＝ｃ^＊ｅ^{０．１５７＊ｘ}
式中、ｙは、変換後データ、ｘは、正規化後のＦＬ４／ＳＳデータ、ｃは、定数（例えば、２．７４）である。だが、この関数は、原点を通らない。ＨｂＡ１ｃ割合値の補正のために有用であるが、約０％〜２５％変動する我々の分析において、約５％〜１５％変動させることで、関数を置き換える。関数を置き換える際、（ＩＩ）の汎用型式を選んだ：
ｙ＝ｃ^＊（ｅ^ａ＊ｘ−ｅ^ｂ＊ｘ）^＊（ｄ＋ｅ^−ｆ＊ｘ）

定数値は、以下で示すグルコース値との比較によって実験により決定した。例示的な定数値は、ａ＝０．０３、ｂ＝−０．０１、ｃ＝１５．１、ｄ＝１．８、ｅ＝２．７１８２８（オイラー定数、又は、自然対数の底）、ｆ＝１．８である。置き換えた式の第１部によって、曲線が原点を通るようになる：第２部は、曲線のより低い値部において、僅かな逆Ｓ字形曲線をもたらす。

実施形態において、サンプル内の細胞それぞれからの生データを、分画へと分割する。分画は、細胞イベントの数に基づき、イベントの序列は、健康な非糖尿病サンプルからのサンプルデータに基づく。実施形態において、血流に存在する網状赤血球のＨｂＡ１ｃの平均割合を、分画限界値として採用する。実施形態において、細胞からのデータは、１０分画に分割され、各分画は略同じ数の細胞を含む。最終分画１０の分画限界は、分画８と９との間の分画限界値間の差の半分を最終分画１０の平均蛍光値に加えた値と推定される。バックグラウンド及び蛍光の補償のために、これらの値を補正した。

実施形態において、内部基準対照サンプルと測定されたＨｂＡ１ｃ値との間の線形相関曲線を使用して、ＨｂＡ１ｃの割合をＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合に変換した。実施形態において、以下の式を使用して、割合ＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃを決定した：ＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合＝４．５４^＊（ｅ^{０．１５７＊ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｒｂｉｔｒａｒｙ ＨｂＡ１ｃ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ}−１）（式Ｘ）。

実施形態において、各サンプルの寿命係数を決定した。寿命係数は、網状赤血球ヘモグロビン及びＲＮＡ含有量に関連する。実施形態において、各サンプルの寿命係数を計算した。アクリジン・オレンジＲＮＡ染色；各サンプルの網状赤血球について、ＦＬ１（４８８ｎｍ）蛍光値（側方散乱値）を決定した。網状赤血球のＦＬ１値（ＲＮＡ含有量）の対数及び網状赤血球の側方散乱値（ヘモグロビン含有量）の対数の積により、最適な相関（Ｒ_２＝０．８）が明らかとなった。安定したＲＮＡ値を得るために、網状赤血球のＦＬ１値から第１分画のＦＬ１値を減算し、この差を任意のＲＮＡが含まれない第３分画のＦＬ１値によって除算することで、ＲＮＡの値を決定した。内部対照細胞のヘモグロビン含有量を使用して、網状赤血球（Ｈｂ）の平均ヘモグロビン含有量を決定した。式と定数は、以下のとおりである：
ＬＯＧ１０（ｃ_１ ^＊ＲＮＡ）^＊ＬＯＧ１０（ｃ_２ ^＊２９．８^＊Ｈｂ）
式中、ＲＮＡとＨｂは、上記のとおりであり、ｃ_１は、例えば、３．３３の様な値を有する定数、ｃ_２は、本開示において０．０２８という例示的な値を有する定数である。２９．８値は、内部対照細胞の平均ヘモグロビン含有量の一例である。

実施形態において、被験体サンプルにおける網状赤血球の値から全細胞のアクリジン・オレンジＲＮＡ染色ＦＬ１（４８８ｎｍ）蛍光値を減算して、値ａｆを得ることで、糖尿病などの疾患が疑われる被験体からのサンプルの寿命係数を決定する。全細胞の値からＦＬ１バックグラウンド値（例えば、０．１７）の蛍光値を減算することで、値ａｇを得る。値ａｆを値ａｇで除算し、値ａｈを生成してから、これを１．３で累乗して、値ａｉを得る。側方散乱で決定された網状赤血球のヘモグロビン含有量の値を全細胞の値で除算してから、これを１．７で累乗して、値ａｌを得る。寿命係数値を計算するために、値ａｉを値ａｌで乗算する。

他の実施形態において、最も古い細胞の１０％のＨｂＡ１ｃの割合を全細胞のＨｂＡ１ｃの平均割合で除算することによって、寿命係数を算出できる。

実施形態において、各分画の補正済みＨｂＡ１ｃの割合の平均と比較したある分画における細胞イベントの総数を使用して、分画の年齢を算出する。実施形態において、各分画の分画限界値（ＦＬ４／ＳＳスケール上の分画限界値）を分画平均で除算することで、各分画の細胞年齢を算出する。各分画に関するこの値を、基準サンプルのＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合（例えば、３．４４％）で乗算して、値ｖを得る。式ＸＩで、分画ごとの値ｖを変換する：
ｗ＝ｅ^{０．１５７＊（ｖ）}−１

ｘ＝ｗ_ｎ−ｗ_ｎ−１によって、分画間の差を決定する。基準対照の対応分画の平均の位置に対する分画の平均の位置により、（ｘ）の値を除算して、値ｙをもたらす。各分画の細胞イベントの総数を、１０分画の細胞イベントの数で除算し、そして１０で乗算して、値ａａをもたらす。値ｙを値ａａで乗算する。そして、最適一致により決定されるか、又は表２Ｅで示すように計算された寿命係数で、この値を乗算する。この計算の結果は、値ａｃである。（ａｃ）の累積値をａｃ_ｎ＋ａｃ_ｎ−１によって決定し、分画年齢が日単位で表される。実施形態において、基準対照は、参照により全体を援用する米国特許第７，９６８，２７９号で記載される既知のＨｂＡ１ｃ含有量を含む内部対照細胞集団である。

実施形態では、分析分画において細胞年齢を決定すると、選択の赤血球パラメータに対する時間軸に適用できる。細胞年齢分画の平均細胞ヘモグロビンは、参照により全体を援用する米国特許第７５４１１９０号に記載のとおりに決定される。

実施形態では、更に、赤血球の平均年齢も計算する。幾つかの実施形態において、各分画の細胞数を分画年齢で乗算することで、平均年齢を計算する。これら乗算の総和を、サンプルの赤血球の総数で除算する。

日単位の各分画年齢を使用して、血液サンプルの平均年齢を決定できる。疾患の疑いがあるか、又は疾患が明らかとされた被験体からの血液サンプルの平均年齢は、疾患の無い被験体からの対照サンプルの平均年齢と比較可能である。実施形態において、疾患状態は糖尿病である。サンプルを、初期診断又は治療後に採取して、治療の有効性を観察できる。各分画のＨｂＡ１ｃの割合及び各分画の細胞の割合を決定すると、約１００から約１２０日にわたる被験体の履歴を決定できる（赤血球の寿命）。各サンプルからのデータによって、治療の有効性を判定可能となり、しかも、経時にわたり被験体が報告した書面の記録よりも正確である。図１４を参照のこと。実施形態において、細胞集団の平均年齢の上昇は、糖尿病の状態の存在を示す。

実施形態において、サンプル内の細胞の年齢の関数として平均細胞ヘモグロビン含有量を決定可能である。細胞ヘモグロビン含有量の変化は、貧血などの疾患の存在又は状況を示す。実施形態において、細胞ヘモグロビン含有量の減少は、貧血を示す。他の実施形態において、特定年齢の細胞における細胞ヘモグロビン含有量の変化は、直近１００〜約１２０日内の出血又は輸血イベントを示す。実施形態において、輸血イベントの場合、平均細胞ヘモグロビンは上昇し得る。実施形態において、細胞ヘモグロビン含有量の減少は、出血を示す。

実施形態において、本発明のシステム及び／又はコンピュータ可読媒体は、フローサイトメーター内に格納したり、又は単独の製品とすることが可能である。実施形態において、本発明のシステム及び／又はコンピュータ可読媒体を、細胞サンプルのＨｂＡ１ｃを測定するキットに格納できる。コンピュータ可読媒体は、非一時的媒体であり、一時的信号を含まない。

本明細書に記載の方法を実装するシステムの例示的実施形態として、図１０、１１、１５を参照する。

図１０は、フローサイトメーター１００の例を示す概略ブロック図である。この例では、フローサイトメーターは、サンプル源１０２と、流体源１０４と、流体ノズル１０６と、光源１０８と、検出器１１０（検出器１１０Ａ、１１０Ｂ、及び１１０Ｃなどを含む）と、コンピュータ装置１１８及びサンプル年齢評価エンジン１２０を含む粒子分析器１１２と、容器１２４とを含む。流体ノズル１０６は、粒子１２８を内部に含む流体流１２６を生成し、光源１０８は光線１３０を生成する。放射光１３２は、光線１３０が流体流１２６及び内部に含まれる粒子１２８と交差すると生じる。フローサイトメーター１００の他の実施形態には、図１０で示す例よりも多いか、少ないか、又は異なる構成要素が含まれる。

サンプル源１０２は、分析用にフローサイトメーターに提供されるサンプルの供給源である。サンプルには、光線１３０により照射され、かつ粒子分析器によって分析される、個々の粒子１２８が含まれる。例として、サンプルは血液で良く、粒子は血液細胞とすることが可能である。サンプルは、本明細書記載の手順を実行することで実現された透過赤血球を含む流体などの調製済みサンプルの形態を取り得る。サンプル源１０２には、分析されるべきサンプルを保持する、試験管などの１つ以上の容器が含まれ得る。一部の実施形態では、サンプルを容器から吸引し、サンプルを流体ノズル１０６まで送達するためなどの流体移送システムが提供される。

通常、サンプルは、フローサイトメーター内のシース流体に注入され、このシース流体は、流体源１０４から供給される。シース流体の一例は、生理食塩水である。流体源１０４の例は、生理食塩水を内部に貯蔵した容器であり、流体移送システムは、流体源１０４から流体ノズル１０６までシース流体を送達するように動作可能である。

一部の実施形態において、流体ノズル１０６は、流体流１２６を生成し、サンプルの粒子１２８を流体流に注入するために提供される。流体ノズル１０６の例は、フローセルである。通常、流体ノズル１０６は、サンプル中の対象粒子のサイズよりも少なくとも大きいが、粒子を狭い流れに配置するのに十分小さくなるように選択されるサイズの開口部を備える。理想的には、単一粒子又は少数粒子（例えば、１〜３個）が１度で光線１３０を通過できるように、粒子は、単一列又は略単一列構成で配置される。一部の実施形態では、粒子は、流体力、音響力、又は磁力を用いて集束される。

光源１０８（本明細書で考察するように、１つ以上の光源を含むことができる）は、流体流１２６に向けられた少なくとも１つの光線を生成する。光源１０８の例には、レーザやアーク灯が挙げられる。一部の実施形態では、光線１３０は、光線を流体流１２６に集束させるなどのため、光学アセンブリを通る。一部の実施形態では、光線はレーザ光線である。

光源１０８からの光線１３０は、流体流１２６と交差する。光線１３０内に含まれる粒子１２８は、光線１３０を遮り、放射光１３２を生み出す。放射光１３２の種類やパターンは、粒子１２８の種類及びサイズで決まるが、放射光１３２には、前方散乱光、側方散乱光、後方散乱光、並びに蛍光（光線が粒子に吸収され、再放出された場合に起こり、光線の波長（即ち、色）の対応する変化によって検出できる）が含まれ得る。

放射光１３２を検出するために１つ以上の検出器１１０が提供される。この例では、検出器１１０は、前方散乱と蛍光とを検出するように配置された検出器１１０Ａ、側方散乱と蛍光とを検出するように配置された検出器１１０Ｂ、および後方散乱と蛍光とを検出するように配置された検出器１１０Ｃを含む。検出器１１０の一例は、光電子倍増管である。

粒子分析器１１２は、１つ以上の検出器１１０からの信号を受信して、粒子１２８を特徴付けるための様々な動作を行うよう動作する。幾つかの実施形態において、粒子分析器１１２は、コンピュータ装置１１８及びサンプル年齢評価エンジン１２０を含む。コンピュータ装置の例を、図１１を含め、本明細書で述べる。サンプル年齢評価エンジン１２０は、本明細書で記載されるサンプル中の細胞ヘモグロビンの年齢を決定するよう、動作する。幾つかの実施形態において、粒子分析器１１２は、更に、アナログ・デジタル変換器も含む。

幾つかの実施形態において、フローサイトメーター１００は、選別フローサイトメーターであり、これは粒子分析器１１２により生成された粒子の特性を使用して、粒子１２８を選別するよう動作する。選別フローサイトメーターは、選別コントローラ、少なくとも１つの選別プレート及び複数の容器を備える選別システムを含むことが可能である。選別フローサイトメーターは、粒子の特性（赤血球の成熟度又はヘモグロビン含有量など）を基に、サンプルの粒子を選別するよう動作できる。一例として、選別コントローラは、粒子の特性に基づいて流体流から生成された液滴に、正、負、又は中性の電荷を適用する。幾つかの実施形態において、流体ノズルは、選別コントローラによって制御される、電荷生成電気回路と電気的に接続する。液滴が荷電した選別プレートを通ると、液滴はそれぞれの電荷に基づいて、容器の１つに向かって偏向する。選別フローサイトメーターは、主として、少なくとも２つの容器を有するが、３つよりも多い容器を備えることもできる。典型的に、１つの容器は、不所望な粒子用又は１つ以上の粒子で汚染されたことが見出された流体液滴用の廃棄容器である。

図１１は、フローサイトメーター１００内で使用可能な１つ以上のコンピュータ装置１１８のいずれかを含む、本開示の態様を実現するのに使用可能なコンピュータ装置の例示的アーキテクチャーを示す。図１１で示されるコンピュータ装置を使用して、処理装置１８０と共に、本明細書で記載のオペレーティングシステム、アプリケーションプログラム、及びソフトウェアモジュール（ソフトウェアエンジンを含む）を実行できる。

コンピュータ装置１１８は、幾つかの実施形態において、中央処理装置（ＣＰＵ）などの、少なくとも１つの処理装置１８０を含む。様々な処理装置を、多岐にわたる製造者、例えば、Ｉｎｔｅｌ社又はＡｄｖａｎｃｅｄ Ｍｉｃｒｏ Ｄｅｖｉｃｅｓ社から入手可能である。この例では、更に、コンピュータ装置１１８は、システムメモリ１８２及びシステムメモリ１８２を含む様々なシステム構成要素を処理装置１８０に接続するシステムバス１８４も含む。システムバス１８４は、メモリバス又はメモリコントローラ；周辺バス；及び種々のバスアーキテクチャーのいずれかを使用するローカルバスを含む任意の数の種類の１つである。

コンピュータ装置１１８に適したコンピュータ装置の例には、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、タブレットコンピュータ、携帯型コンピュータ装置（スマートフォン、ｉＰｏｄ（登録商標）、又はｉＰａｄ（登録商標）（Ａｐｐｌｅ Ｉｎｃ社の登録商標）携帯型デジタル装置、若しくは他のモバイル装置など）、又はデジタル命令を処理するよう構成された他の装置がある。

また、図１１で示されるコンピュータ装置も、１つ以上のこのようなコンピュータ装置を含み得るプログラマブル電子機器の一例であり、複数のコンピュータ装置が含まれる場合、本明細書に開示される様々な機能、方法、又は動作を共同して遂行するよう、このようなコンピュータ装置は、適切なデータ通信ネットワークと共に結合可能である。

図１５は、フローサイトメーター１００内で使用可能な１つ以上のコンピュータ装置１１８のいずれかを含む、コンピュータ装置上で実装可能な本開示の方法の例示的な流れ図を示す。実施形態において、コンピュータ装置は、方法を実施するための命令を含み、この方法は、血液サンプルのヘモグロビン、ＨｂＡ１ｃ、及びＲＮＡ含有量を決定する工程（１５０２）と、各細胞のＨＢＡ１ｃ及びヘモグロビン含有量から、各細胞のＨｂＡ１ｃの割合を決定する工程と（１５０４）、赤血球集団を複数の分画へと分画する工程と（１５０６）、各分画におけるＨｂＡ１ｃの平均割合を決定する工程と（１５０８）、各分画における赤血球の年齢を決定する工程（１５１０）とを含む。

方法
本開示の１態様において、網状赤血球に起因する赤血球の寿命、ＲＮＡパラメータ、及びヘモグロビンパラメータ間の関係は、被験体からのサンプルにおける赤血球の年齢の特徴付けをもたらす。網状赤血球の成熟の間、ＲＮＡ成分は徐々に消滅する一方、ヘモグロビン含有量が上昇して最大となる。ＲＮＡ含有量とヘモグロビン含有量との積の関数として、減少するＲＮＡと増加するヘモグロビンは、互いに平衡となり、網状赤血球の成熟の間、この関数の値は一定を保つことになる。だが、ＲＮＡとヘモグロビンが共に低い場合、網状赤血球は、血液サンプルを抽出した時点の正常なヘモグロビンレベルに到達できない。本明細書では、細網内皮系の赤血球の破壊と網状赤血球中のヘモグロビンの合成との間のリンクが立証される。

本開示の１態様では、細胞ごとのフロー分析により、少なくとも１つのマーカーについて、亜集団への細胞の分画が可能となる。実施形態において、マーカーは、ＨｂＡ１ｃ、ヘモグロビン、及び／又はＲＮＡである。赤血球集団は、異なる年齢の亜集団への分画に適している。活性核を含む他の細胞は、それらの成分の増殖又は再生を受ける。だが、赤血球は、その核とＲＮＡを失い、決められた長さの寿命に入る。近年、細胞実体を破壊することなく抗体染色を赤血球内部に適用する技術が開発された。抗ＨｂＡ１ｃ抗体で染色し、細胞ヘモグロビンの量を測定すると、細胞ごとのＨｂＡ１ｃの割合を決定できる。

グルコースは、細胞に自由にアクセスでき、常に、血中に存在し、更に、ＨｂＡ１ｃの形成は不可逆的であるので（Ａｍａｄｏｒｉ Ｍ．、Ａｔｔｉ Ａｃｃａｄ、ｎａｚ．Ｌｉｎｃｅｉ、１９２５年、２、３３７；１９２９年、９、６８、２２６；１９３１年、１３、７２、１９５）、ＨｂＡ１ｃの割合は、常に上昇し、細胞齢の測定として使用できる。ＨｂＡ１ｃを年齢マーカーとして使用する場合、未熟赤血球がヘモグロビンの半分を生成した点として、ゼロ点を規定する。網状赤血球、更には、成熟赤血球まで発達すると、寿命が終わる細胞は、最終的に、肝臓、骨髄、及び脾臓の細網内皮系によって除去される。この赤血球の寿命は、最長細胞年齢と定義される。

本開示の別の態様では、個々の赤血球のＨｂＡ１ｃ割合を測定し、サイトメーター内で得られた赤血球イベントを、ＨｂＡ１ｃ割合スケール上で再編成する。ＨｂＡ１ｃの割合と赤血球の年齢との間の関係により、この様なスケールはまた、細胞の年齢も表す。依然として細胞イベントが見られるスケールの最大値は、最も古い赤血球の寿命と一致する。第１アプローチでは、一般に、人間の赤血球の平均寿命として使用される１２０日の寿命値を適用する。だが、本開示の実施形態の１つでは、未熟循環赤血球（網状赤血球）のヘモグロビン含有量及びＲＮＡ含有量を使用して、寿命係数を測定する。これらのパラメータを使用して、個体の赤血球寿命の測定値が得ら得ることが示される。

細胞ＨｂＡ１ｃ割合又は年齢のスケール上の赤血球イベントにより、カーソルを配置すると、細胞集団を分割できる。カーソル間の細胞イベントは、分画と称される。これらの分画には、規定数の細胞イベントがある。これら分画の限界は、以下の２つの因子として、軸上のイベントの序列及び軸上の細胞イベントの数に応じて設定される。こうして、異なる分画のＨｂＡ１ｃ割合は、独立パラメータであり、分画内の細胞の年齢計算のために使用可能である。赤血球が異なるグルコース濃度に晒される異なる個体の間で、対応する分画が比較できる。

実施形態において、分画は類似の数の細胞を含む。ＨｂＡ１ｃ割合値は、分画限界の位置に基づく。実施形態では、分画の平均値を使用して、年齢値を算出する。分画における細胞の年齢の計算では、死滅率に起因するか、又は固形臓器における固定化に起因する欠損によって、細胞が分画から欠如し得るか否かを最初に決定することは重要である。

本開示の１態様では、分画のＨｂＡ１ｃ割合間の差を、微分されたＨｂＡ１ｃ値をもたらす分画の平均の差で分割する。この様な微分後のＨｂＡ１ｃ割合値は、ある時間周期にわたるＨｂＡ１ｃ割合の割合の変化であり、この様な時間周期中における個体の血糖濃度の測定値である。非糖尿病の個体からの血液サンプルでは、分画の微分後のＨｂＡ１ｃ割合は、一定である。

実施形態において、個々の赤血球又は赤血球群のヘモグロビン年齢、並びに微分されたＨｂＡ１ｃパラメータの測定及び計算は、血液サンプルにおける他の全ての赤血球の測定と計算と関連して実施される。糖尿病の個体からの血液サンプルの場合、この測定と計算は、正常な基準血液サンプルと比較して実施される。

実施形態の他の態様では、平均値と健康な個体からの、及び糖尿病の個体からの対応する分画の限界値との間で比較を実施する。こうすると、糖尿病の個体における分画のＨｂＡ１ｃの微分後の割合を測定できる。異なる年齢の糖尿病被験体の分画における微分後のＨｂＡ１ｃ割合値を同じ被験体について経時にわたり自己測定された血糖濃度と比較すると、２つのパターンに類似性が存在する。経時にわたり糖尿病被験体が登録した血糖濃度を同じ被験体の血液サンプルの年齢分画における微分後のＨｂＡ１ｃ割合と比較すると、分画の年齢測定が確認される。

本開示の別の態様において、各患者からのサンプルにおける赤血球の寿命値を決定し、この寿命値は、経時にわたる血糖濃度及び年齢分画における微分後のＨｂＡ１ｃ値の反映をもたらす。こうした個体の寿命値は、網状赤血球のパラメータ、特に、これら細胞のヘモグロビン含有量及びＲＮＡ含有量の関数との相関を示す。網状赤血球のパラメータの関数として計算された赤血球の寿命及び寿命に対する血液細胞分画の相対年齢の計算を考慮に入れて、血液サンプル内の個々の細胞、又は細胞群の細胞ヘモグロビンの年齢を測定可能である。

別の実施形態において、個体の赤血球の最も古い１０％の分画のＨｂＡ１ｃ割合及びその赤血球全体の平均ＨｂＡ１ｃ割合の商（ｑｕｏｔｉｅｎｔ）を、赤血球の寿命の関数として取り入れることができる。別の実施形態において、最も古い分画のＨｂＡ１ｃ割合が、臨床的に注目を浴びている（Ｚｏｕｎｇａｓ Ｓ等、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．２０１２年、３月；５５（３）：６３６〜４３．ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ００１２５−０１１−２４０４−１．Ｅｐｕｂ ２０１１年１２月２１日）。ＨｂＡ１ｃ割合が最も高い細胞は、血管合併症に関与する。

本開示の別の態様において、個々の赤血球又は赤血球群の算出された年齢を、血液サンプルからのこれら細胞又は細胞群の微分後のＨｂＡ１ｃ割合と組み合わせることが可能であり、組み合わせたデータを使用して、被験体の過去の血糖濃度を時間スケール上で再構成できる。

細胞群の算出された年齢を微分後のＨｂＡ１ｃ割合と、細胞ヘモグロビン含有量と、及び血流における赤血球の表れと組み合わせることの適用の実施例が提供され、他器官における不在に起因するか、又は排出若しくは死滅率に起因して、細胞が血流から欠如しているか否かを判定可能にする。だが、この応用は、これらの実施例に限定されず、そして個々の細胞又は細胞群の算出された年齢と、個々の細胞若しくは細胞群の他のパラメータとの組み合わせは、本開示の統合された部分である。

本開示の異なる実施形態において、サイトメトリデータの処理は、血液サンプルからの個々の赤血球又は赤血球群のヘモグロビンの年齢を帰属させる工程と、個体から赤血球の寿命の長さを決定する工程と、血液サンプルから赤血球の平均年齢を決定する工程と、ＨｂＡ１ｃ割合及び微分後のＨｂＡ１ｃ割合を血液サンプルからの赤血球集団へと帰属させる工程と、細胞ヘモグロビン含有量、又は平均細胞ヘモグロビン含有量を血液サンプルからの１つの赤血球、又は赤血球群に帰属させる工程と、血液循環中のある年齢のヘモグロビンの赤血球集団の表れを、細胞の全表れの割合として決定する工程であって、この細胞の全表れの割合は、血流からの細胞の死滅率、排出又は欠如に起因して、どの細胞も欠如していない場合、かつ赤血球の生成中に時間揺らぎが起こらない場合、又は上記実施形態のいずれかと組み合わせた場合、又は上記実施形態のいずれかと赤血球に関する他の全てのパラメータとを組み合わせた場合、１００％である工程とを実行する方法において、有用である。

赤血球の年齢−時間スケールを決定するシステムと方法は、糖尿病、及び／又は貧血の診断や観察で有用である。このシステムは、かなり急激な血液の変化を検出し、約３〜４カ月にわたり、こうした変化を時間スケール上で記録できる。システムが数カ月前に発生したグルコースの変化を検出すると、このシステムは、ある時間点後の赤血球の密度の変化も検出可能である。同様に、ある時点のヘモグロビン含有量の変化も検出できる。

別の実施形態において、本明細書で記載の方法は、出血又は輸血の検出で有効である。２カ月前に出血イベントが発生した場合、この２カ月時点において、ヘモグロビン含有量の破壊点が存在するはずである。輸血の場合では、提供者の血液と被輸血者の血液との間に、ヘモグロビン含有量の差が存在すれば、輸血された血液を検出可能である。輸血を受ける時点の破壊点を検出できるはずである。

ここで、図１５を参照すると、実施形態として、方法は、個々の赤血球のＨｂＡ１ｃ及びヘモグロビンを測定する工程（操作１５０２）と、個々の赤血球のＨｂＡ１ｃ含有量及びヘモグロビン含有量からＨｂＡ１ｃ割合を決定する工程（操作１５０４）と、基準細胞分画の平均ＨｂＡ１ｃと比較したとき、個々の赤血球それぞれに関するＨｂＡ１ｃの割合を使用して、赤血球集団を複数の分画に分画する工程であって、各分画は、実質的に等しい数の赤血球を含む工程（操作１５０６）と、各分画におけるＨｂＡ１ｃの平均割合を決定する工程と（操作１５０８）と、ＨｂＡ１ｃの平均割合を基準対照分画に関するＨｂＡ１ｃの平均割合と比較することにより、個々の赤血球の年齢を識別する工程（操作１５１０）とを含む。

実施形態として、方法は、個々の赤血球のＨｂＡ１ｃ及びヘモグロビンを測定する工程と、個々の赤血球のＨｂＡ１ｃ含有量及びヘモグロビン含有量からＨｂＡ１ｃ割合を決定する工程と、基準細胞分画の平均ＨｂＡ１ｃと比較したとき、個々の赤血球それぞれに関するＨｂＡ１ｃの割合を使用して、赤血球集団を複数の分画に分画する工程であって、各分画は、実質的に等しい数の赤血球を含む工程と、各分画におけるＨｂＡ１ｃの平均割合を決定する工程と、ＨｂＡ１ｃの平均割合を基準対照分画に関するＨｂＡ１ｃの平均割合と比較することによって、個々の赤血球の年齢を識別する工程とを含む。実施形態において、赤血球のＨｂＡ１ｃ及び／又はヘモグロビンを、フローサイトメーター内で測定する。別の実施形態において、更に、方法は、基準対照細胞の分画と比較したとき、特定のＨｂＡ１ｃ割合の分画に属するサンプル中の赤血球の密度を決定する工程も含む。実施形態において、基準対照細胞は、平均年齢が少なくとも２８日である。

実施形態において、本発明の方法は、更に、サンプル中の個々の細胞におけるＲＮＡ含有量を測定する工程も含む。実施形態において、基準細胞分画は、網状赤血球分画である。実施形態では、アクリジン・オレンジなどのＲＮＡに結合する色素で染色することにより、網状赤血球に相当する細胞の割合を決定する。

実施形態において、ＨｂＡ１ｃ又はその変種に結合する検出可能に標識化された抗体と結合することによって、個々の細胞のＨｂＡ１ｃを決定可能である。実施形態において、検出可能な標識は、側方散乱とは異なる波長で検出可能な蛍光部分及び／又はＲＮＡと結合する色素である。

実施形態において、参照により援用される米国特許第７５４１１９０号で記載されるとおり、細胞ヘモグロビンは、側方散乱によって測定可能である。

実施形態において、ＨｂＡ１ｃ蛍光を側方散乱（例えば、ＦＬ４／ＳＳ）で除算することで、各細胞のＨｂＡ１ｃ割合を決定する。種々の実施形態では、バックグラウンドを考慮に入れるため、ＨｂＡ１ｃ割合に対する補正を実施する。他の実施形態では、式ＩＩを使って、ＨｂＡ１ｃ割合をＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合へと変換する。

実施形態において、各細胞のＨｂＡ１ｃ割合の値を、分画に分画する。実施形態において、網状赤血球分画のＨｂＡ１ｃの平均割合を参照して、分画を決定する。実施形態において、サンプルは、少なくとも１０分画に分割され、各分画は、約同じ数の細胞を含む。

実施形態において、各分画におけるＨｂＡ１ｃの平均割合を決定し、ＨｂＡ１ｃの平均割合を、寿命係数により補正された基準対照分画に関するＨｂＡ１ｃの分画の平均割合と比較することで、分画における血液細胞の年齢を決定する。実施形態において、基準対照分画は、ＨｂＡ１ｃ含有量が分かっている内部対照細胞である。

本開示の１実施形態において、フローサイトメトリにより測定された個々の赤血球におけるＨｂＡ１ｃの割合を、これらの赤血球におけるヘモグロビンの年齢と共に増加させることに関する方法について述べる。個々の細胞におけるＨｂＡ１ｃの割合を増加させるのに必要な時間を測定するのではなく、この方法は、フローサイトメーターにより測定された細胞イベントを、ＨｂＡ１ｃ割合が増加するスケール上で再構成することを提供する。ＨｂＡ１ｃ割合の増加は、時間スケールに関連可能である。実施形態において、時間スケールの全長は、略赤血球の寿命に相当する。実施形態において、寿命は、約１〜２００日、約１０〜２００日、約５０〜２００日、及び約１００〜２００日である。

別の実施形態において、時間が増加するスケール上での細胞イベントの再構成は、これら細胞におけるＨｂＡ１ｃ割合の上昇速度とは独立している。本開示の方法は、各細胞のＨｂＡ１ｃ割合値と時間に依存しない関係として、ＨｂＡ１ｃ割合の増加又は減少に関する表現を提供し、更に、時間の関数とするＨｂＡ１ｃ割合の表現も提供する。ＨｂＡ１ｃ形成又はグルコース濃度の変動からのこの非依存性及び細胞のヘモグロビン含有量の変動からの非依存性は、病変、又は疾患状態の疑いがあるか、若しくは罹っているサンプルの解析を可能とする。

本開示の１実施形態において、糖尿病を検出又は糖尿病の進行を監視する方法を記載しており、この方法は、糖尿病被験体からの個々の赤血球のＨｂＡ１ｃ、ヘモグロビンを、そして必要に応じてＲＮＡを測定する工程と、個々の赤血球のＨｂＡ１ｃ含有量及びヘモグロビン含有量からＨｂＡ１ｃ割合を決定する工程と、網状赤血球分画におけるＨｂＡ１ｃの平均割合と比較したとき、個々の赤血球それぞれに関するＨｂＡ１ｃの割合を使用して、赤血球集団を複数の分画に分画する工程であって、各分画は、実質的に等しい数の赤血球を含む工程と、各分画におけるＨｂＡ１ｃの平均割合を決定する工程と、ＨｂＡ１ｃの平均割合を基準対照分画に関するＨｂＡ１ｃの平均割合と比較することにより、分画における赤血球の年齢を識別する工程と、糖尿病に罹っているか、又は糖尿病の疑いのある被験体から、サンプル内の赤血球の平均年齢を決定する工程と、サンプルの赤血球の平均年齢を健康な被験体からのサンプルの赤血球の平均年齢と比較する工程とを含む。実施形態において、対照細胞集団は、糖尿病がない等の疾患、又は病状のない被験体から得られた赤血球である。実施形態において、基準対照分画は、米国特許第７，９６８，２７９号で記載の様な既知の割合のＨｂＡ１ｃを含む。

本開示の１実施形態において、貧血を検出及び／又は貧血の進行を監視する方法を記載しており、この方法は、貧血被験体からの個々の赤血球のＨｂＡ１ｃ、ヘモグロビンを、そして必要に応じて、ＲＮＡを測定する工程と、個々の赤血球のＨｂＡ１ｃ含有量及びヘモグロビン含有量からＨｂＡ１ｃ割合を決定する工程と、網状赤血球分画におけるＨｂＡ１ｃの平均割合と比較したとき、個々の赤血球それぞれに関するＨｂＡ１ｃの割合を使用して、赤血球集団を複数の分画に分画する工程であって、各分画は、実質的に等しい数の赤血球を含む工程と、各分画におけるＨｂＡ１ｃの平均割合を決定する工程と、ＨｂＡ１ｃの平均割合を基準対照分画に関するＨｂＡ１ｃの平均割合と比較することによって、分画における赤血球の年齢を識別する工程と、貧血被験体からのサンプルの各年齢分画について、平均細胞ヘモグロビンを決定する工程と、種々の年齢分画の平均細胞ヘモグロビンにおいて差があるか否かを判定する工程とを含む。実施形態において、基準対照分画は、米国特許第７，９６８，２７９号で記載の様な既知の割合のＨｂＡ１ｃを含む。

実施形態において、サンプル内の細胞の年齢の関数として平均細胞ヘモグロビン含有量を決定可能である。細胞ヘモグロビン含有量の変化は、貧血などの疾患を示す。実施形態において、細胞ヘモグロビン含有量の減少は貧血を示す。他の実施形態において、特定年齢の細胞における細胞ヘモグロビン含有量の変化は、直近１００〜約１２０日内の出血又は輸血イベントを示す。実施形態において、輸血イベントの場合、平均細胞ヘモグロビンは上昇し得る。実施形態において、細胞ヘモグロビン含有量の減少は、出血を示す。

別の実施形態において、本開示は、赤血球全体に関するフローサイトメトリ法により得られたＨｂＡ１ｃ割合値と参考検査室法との間の相関を提供する関数の改変を含む。改変後の関数は、類似の相関を提供するが、異なるサンプル中の各細胞が示す約０％〜２５％の全血液値に対して適した約５％〜１５％の測定範囲の拡張を示す。

本開示の別の実施形態では、各細胞のＨｂＡ１ｃ割合値を測定するのではなく、全細胞集団における分画の平均ＨｂＡ１ｃ割合値を計算する。細胞のこれら分画又は亜集団を、ＨｂＡ１ｃ割合の上昇に基づいて選択する。本開示は、分画の平均ＨｂＡ１ｃ割合を分画の時間値に転換することを提供する。

別の実施形態では、基本時間スケールを決定するための基準を作成する。この基準には、複数の健康な被験体からの血液サンプルデータを含み、このデータは、安定した血糖レベル及び正常な規則正しいＨｂＡ１ｃ割合の上昇を含むものと仮定し得る。ＨｂＡ１ｃ割合を一定に増加させて、基本時間テンプレートを構築し、これは、他の被験体サンプルからの時間スケールを計算する際の基準として使用可能である。

別の実施形態において、正常サンプルから得た基本時間テンプレートを、被験体からの他のサンプルに適用する。実施形態では、幾つかの補正が必要とされる。この補正には、１）時間スケールにおける細胞の亜集団に関するＨｂＡ１ｃ割合平均値の正確な位置の計算、及び／又は２）網状赤血球の状態、及び／又は赤血球の寿命に基づく補正が含まれる。実施形態において、補正の適用後、他の患者又は健康な被験体に適用できる時間スケールを構築する。

別の実施形態において、時間スケールを構築したら、各分画又は亜集団間のＨｂＡ１ｃ割合の上昇（ＨｂＡ１ｃ割合値の微分）を、曲線上の時間点に対してプロットできる。こうして、ＨｂＡ１ｃの形成速度を可視化する。ｉｎ ｖｉｖｏ状況では、ＨｂＡ１ｃ形成の速度が血糖濃度に依存するので、これらの差分ＨｂＡ１ｃ割合曲線と血糖曲線との間には、関係がある。

別の実施形態において、本開示は、糖尿病被験体の赤血球年齢の決定を含む。血液を引き抜く際、これらの被験体は、１日１回又は数回血糖測定の結果を提示した。数カ月の監視の結果を、グルコース／時間曲線上に表し、更に、同じ被験体の血液サンプルのサイトメトリデータから得られた差分割合ＨｂＡ１ｃ値／時間を表す曲線と比較する。データの比較から、細胞ヘモグロビンの年齢を測定する方法がもたらされる。

本開示の別の実施形態では、時間データを使用して、細胞ヘモグロビン含有量を時間の関数として表記する。本開示の別の実施形態において、本明細書に記載の方法は、被験体の赤血球の平均年齢及び寿命を決定する方法において有用である。本開示の別の実施形態において、血液サンプルに表れる細胞の割合は、自然消滅又は疾患過程によって被験体の器官内で固定化された細胞の不在又は被験体の赤血球の死滅率に関する測定値である。

細胞処理
１実施形態において、本明細書記載の方法に従って、全赤血球を安定化、浸透させてから、ある波長（例えば、６７５ｎｍ、ＦＬ４）で放射する蛍光標識化抗ＨｂＡ１ｃ抗体及び別の波長（例えば、５２５ｎｍ、ＦＬ１）で放射するＲＮＡマーカーで染色した。この細胞を、側方散乱（ＳＳ）増倍管搭載フローサイトメーター内で分析し、更に、例えば、米国特許第７，９６８，２７９号で記載のＨｂＡ１ｃ割合の測定値に相当するＦＬ４／ＳＳ（図１ｂ）を表す軸上で示した。網状赤血球を、ＲＮＡ染色（ＦＬ１）によって、そして低いＨｂＡ１ｃ含有量に基づき分離した。

実施形態では、正確なＨｂＡ１ｃ割合及び細胞ヘモグロビン含有量を算出するため、米国特許第７９６８２７９号での記載のとおりに、ＨｂＡ１ｃ割合値が把握されている基準対照細胞をサンプルに追加した。基準対照は、主として、既知のヘモグロビン濃度又はヘモグロビン相当物濃度、既知の側方散乱と蛍光強度を有する蛍光粒子から作られる。これは、一般に、合成粒子、ヒト又は動物の血液細胞、及び処理済みのヒト又は動物の血液細胞を含むが、これらに限定されない。校正時、細胞ＨｂＡ１ｃの定量測定、つまり、個々の赤血球におけるこのヘモグロビン変種の絶対量は、フローサイトメーターにおいて実施可能である。

アイソタイプ対照抗体を使用して、又はアッセイ内に糖化ＨｂＡ１ｃペプチドを添加し、抗体のＨｂＡ１ｃ反応性を遮断することで、網状赤血球及び成熟赤血球について、ＨｂＡ１ｃ抗体のバックグラウンド値を測定した。ＨｂＡ１ｃに特異的な抗体は、公知であるか、又は市販されている。この様な抗体は、検知可能な標識、特に、フローサイトメトリにより検出可能なこれらの標識を使用して、容易に標識化できる。

実施形態において、細胞は、マーカーを浸透可能である（例えば、ＨｂＡ１ｃ専用に検出可能に標識化された抗体）。血液サンプルを赤血球の細胞膜を浸透可能とする細胞浸透安定化試薬で処理した。これにより、細胞内マーカーが赤血球に浸透して、細胞解析が可能となる。更に、細胞浸透安定化試薬は、細胞膜内の細胞内タンパク質の沈殿及び／又は凝集をもたらすが、細胞内と細胞表面の抗原部位、ＤＮＡとＲＮＡ分子、並びに細胞骨格要素などの細胞成分は維持する。

「細胞成分」という語句は、細胞膜内の細胞構成要素及び細胞表面抗原部位などの細胞膜表面上の細胞構成要素を含む。「細胞内成分」という語句は、細胞膜内の細胞構成要素について言及し、この細胞構成要素には、赤血球内側のヘモグロビンとヘモグロビン変異体変種ヘモグロビンとヘモグロビン変異体などの細胞内タンパク質、細胞骨格要素、及びＤＮＡとＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。細胞骨格要素は、限定されないが、チューブリンやスペクトリンを含む。

実施形態において、細胞浸透安定化試薬は、以下を含む。
以下の分子構造で表されるＮ−アシルサルコシン、又は、その塩：Ｒ_１−ＣＯ−Ｎ（ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＯＯＸ_１：式中、Ｒ_１は、炭素原子を８〜１８個含むアルキル又はアルキレン基であり、Ｘ_１は、Ｈ、Ｎａ^＋、又はＫ^＋である。
試薬のｐＨを７未満に調整するｐＨ調整剤及び水媒体。

遊離酸形態のＮ−アシルサルコシン又はその塩は、市販されている。金属イオンを試薬にもたらさない遊離酸構造を使用することが望ましい。遊離酸構造のＮ−アシルサルコシンは、水溶性ではない。これは、エタノール溶液に予備溶解させてから、水溶液に添加できる。ｐＨ調整剤によって、試薬のｐＨを４〜６の間で調整する際、Ｎ−アシルサルコシンは、溶液中でアニオン構造である。

Ｎ−アシルサルコシンの適切な例には、Ｎ−オレオイルサルコシン、Ｎ−ステアロイルサルコシン、Ｎ−ラウロイルサルコシン、Ｎ−ミリストイルサルコシン、Ｎ−ココイルサルコシン、及びそれらの塩がある。実施形態において、Ｒ_１のアルキル又はアルキレン基は、炭素原子が１２個ある。１推奨実施形態では、Ｎ−ラウロイルサルコシンを使用する。

実施形態において、細胞を標識化したら、特定波長でのゲートを使用して、ＨｂＡ１ｃ及び／又はＲＮＡなどの１つ以上のマーカーが存在するかについて、フローサイトメーター上で、細胞を分析する。

実施形態において、サンプル中の赤血球集団の年齢構成を決定するキットが提供されており、このキットは、ａ）ＨｂＡ１Ｃ又はその変種と特異的に結合する抗体若しくはその抗原結合フラグメントと、ｂ）ＲＮＡと特異的に結合する色素と、ｃ）赤血球基準対照サンプルとを含む。幾つかの実施形態において、赤血球基準対照分画は、既知の割合のＨｂＡ１Ｃを含む。別の実施形態では、基準対照細胞は、糖尿病や貧血に罹っていない被験体からなどの標準的な対照サンプルである。別の実施形態において、基準対照細胞は、ＨｂＡ１Ｃ値が分かっている糖尿病被験体からのものである。実施形態において、抗体又は抗原結合フラグメントは、検出可能に標識化される。実施形態において、ＲＮＡと特異的に結合する色素は、アクリジン・オレンジである。実施形態において、更に、キットは、赤血球を浸透する試薬も含むことが可能である。実施形態では、キットは、更に、サンプル内の赤血球の年齢及び／又は密度の決定を可能とするコンピュータ可読媒体も含む。

データ解析
実施形態において、方法は、フローサイトメーターにより、個々の赤血球の側方散乱及び蛍光を測定する工程と、側方散乱によって、個々の赤血球のヘモグロビン含有量を決定する工程と、個々の赤血球の測定された蛍光からＨｂＡ１ｃ含有量を導出する工程と、赤血球のＨｂＡ１ｃ含有量及びヘモグロビン含有量から、ＨｂＡ１ｃの割合を決定する工程と、基準細胞分画（例えば、網状赤血球）と比較したとき、個々の細胞のＨｂＡ１ｃ割合を使用して、赤血球集団を複数の分画に分画する工程であって、各分画は、実質的に等しい数の赤血球を含む工程と、各分画におけるＨｂＡ１ｃの平均割合を決定する工程と、ＨｂＡ１ｃの平均割合を基準対照分画に関するＨｂＡ１ｃの平均割合と比較することによって、赤血球の年齢を識別する工程とを、含む。

実施形態において、内部対照細胞を使用して、平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）を算出し、この算出は、例えば、以下の工程として、（ａ）血液サンプルのアリコートを浸透試薬と混合して、第１のサンプル混合物を生成し、赤血球の細胞膜を浸透し、かつ細胞内でヘモグロビン凝集をもたらすのに十分な第１の時間にわたり、第１のサンプル混合物をインキュベートする工程と、（ｂ）中和剤を第１のサンプル混合物に添加して、第２のサンプル混合物を生成し、更に、浸透試薬と赤血球とのこれ以上の反応を阻害するのに十分な第２の時間にわたり、第２のサンプル混合物をインキュベートする工程と、（ｃ）フローサイトメーター上で、第２のサンプル混合物における赤血球の側方散乱信号を細胞毎に測定する工程と、（ｄ）この測定から得られた側方散乱信号を使用して、赤血球の細胞ヘモグロビン（Ｈｇｂ_ｃｅｌｌ）を取得する工程とを含む。実施形態において、分析器より報告された赤血球指数から、各血液サンプルにつき、平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）を取得した。血液分析器において、溶解血液サンプルの総ヘモグロビン濃度（Ｈｇｂ、グラム／デシリットル）及び血液サンプルの赤血球数（ＲＢＣ、個／リットル）から、ＭＣＨ（ピコグラム）を計算したことに留意されたい。

実施形態において、双方のサンプルのアリコートから得られた平均側方散乱値と血液分析器上で得られたＭＣＨとの相関を、個別に分析した。細胞ヘモグロビンを取得する際、赤血球数でＨｇｂ_ｃｅｌｌを乗算することで、血液サンプルの総ヘモグロビン濃度を得ることができる。後者は、単独で取得可能であるか、又は計数を支援する流量測定装置がフローサイトメトリ装置に備えられていれば、上記の測定と合わせて取得可能である。

実施形態において、個々の赤血球それぞれのＨｂＡ１ｃ含有量及びヘモグロビン含有量からのＨｂＡ１ｃ割合の決定は、ＨｂＡ１ｃ含有量及びヘモグロビン含有量（例えば、ＦＬ４／ＳＳ）を除算することで、決定される。実施形態において、ＨｂＡ１ｃ割合を補正するために、１つ以上の補正を適用しても良い。実施形態において、式ｙ＝ｃ^＊ｅ^{０．１５７＊ｘ}を使用して、正規化されたＦＬ４／ＳＳデータに変換された。

式中、ｙは変換後データ、ｘは正規化後のＦＬ４／ＳＳデータ、ｃは定数（例えば、２．７４）である。だが、この関数は、原点を通らない。約５％〜１５％で変動するＨｂＡ１ｃ割合値の補正には有用であるが、約０％〜２５％変動する我々の分析における分画の目的にはそれは置き換えられた。置き換える関数には、以下の汎用型式を選んだ：
ｙ＝ｃ^＊（ｅ^ａ＊ｘ−ｅ^ｂ＊ｘ）^＊（ｄ ＋ ｅ^−ｆ＊ｘ）

定数値は、以下で示すグルコース値との比較によって実験により決定した。例示的な定数値は、ａ＝０．０３、ｂ＝−０．０１、ｃ＝１５．１、ｄ＝１．８、ｅ＝２．７１８２８（オイラー定数、又は、自然対数の底）、ｆ＝１．８である。置き換えた式の第１部によって、曲線が原点を通るようになる：第２部は、曲線のより低い値部において、僅かな逆Ｓ字形曲線をもたらす。この種の標準曲線は、固相免疫測定法において、頻繁に観測されてきた（Ｅｋｉｎｓ、Ｒ．Ｐ．Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ＩＡＥＡ、Ｖｉｅｎｎａ、１９７４年、ＳＴＩ／ＰＵＢ／３５０、ｐｐ ９１〜１２１）。代替式（２）は、相関において（１）と同様に補正し、Ｒ２はそれぞれ、０．９５と０．９４である。

実施形態において、血液サンプルにおける各細胞のＨｂＡ１ｃの年齢及び割合を算出するために、実施形態では、以下の因子を把握することが望ましい。
（１）ＨｂＡ１ｃマーカーとＨｂＡ１ｃ分子との結合に関する速度論
（２）細胞の寿命中のグルコース濃度
（３）細胞の寿命の長さ。
（４）ＨｂＡ１ｃ形成に関する速度論。

実施形態では、公開されている指針に従って、基準ＨｂＡ１ｃ割合値を、現ＮＧＰＳ値から新ＩＦＣＣ値まで変換する（Ｄａｖｉｄ Ｂ．Ｓａｃｋｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ＡＤＡ／ＥＡＳＤ／ＩＤＦ ｗｏｒｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｔｈｅ ＨｂＡ１ｃ ａｓｓａｙ；Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００５年；５１：６８１〜６８３．）。この新規ＩＦＣＣ値は、ゼロ値に対する切片を持たないことで、ＮＧＳＰ値とは異なり、それ故、若い細胞の低い値を含める上でより適切である。対数関数に応答する１次反応として抗体の結合を考慮に入れ、逆の指数関数式をサイトメトリデータに適用して、図の原点を通る回帰直線との線形相関を得た。

抗体結合速度論；

リバース；ｙ＝ｃ_１ ^＊（ｅ^ｘ＊ｃ２−１）
式中、ｙは、参考検査室により与えられたＩＦＣＣ単位のＨｂＡ１ｃ割合、ｘは、内部基準が存在する際に決定されたサイトメトリＨｂＡ１ｃ割合、ｃ_１とｃ_２は、定数である。

他の実施形態において、細胞ＨｂＡ１ｃ割合又は年齢のスケール上の赤血球イベントにより、カーソルを配置すると、細胞集団を分割できる。カーソル間の細胞イベントは、分画と称される。分画には、規定数の細胞イベントがある。実施形態において、分画は、類似の数の細胞を含む。ＨｂＡ１ｃ割合値は、分画限界の位置に基づく。実施形態では、分画の平均値を使用して、年齢値を算出する。分画における細胞の年齢の計算では、死滅率又は固形臓器における固定化に起因する不在によって、細胞が分画から欠如し得るか否かを最初に決定することは、最も重要である。

実施形態において、細胞の分画は、分画限界値としてサンプル内に存在する網状赤血球のＨｂＡ１ｃの割合の平均値の使用を含む。実施形態では、細胞を少なくとも１０分画に分割する。１実施形態において、最終分画１０の分画限界は、分画８、９の分画限界値間の差の半分を最終分画１０の平均蛍光値に加えた値と推定された。バックグラウンド及び蛍光の補償のために、値を補正した。

本開示の１態様では、分画のＨｂＡ１ｃ割合間の差を、微分されたＨｂＡ１ｃ値をもたらす分画の平均の差で除する。この様な微分後のＨｂＡ１ｃ割合値は、ある時間周期にわたるＨｂＡ１ｃ割合の割合の変化であり、この様な時間周期中における個体の血糖濃度の測定値である。非糖尿病の個体からの血液サンプルでは、分画の微分後のＨｂＡ１ｃ割合値は、一定である。

幾つかの実施形態において、分画限界値は、表１で見られるように、予備ＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合として表記される。ｂ列内の各分画限界値を、ｂ列の平均値で除算した。得られた値を、サンプルの平均ＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合値３．４４で乗算した。分画限界値を、ＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合で表記した。ｄ列の値は、式（ＶＩＩＩ）を使用して、ｃ列の値から得た；
（ｄ）＝４．５４^＊（ｅ^{０．１５７＊（ｃ）}−１）

ＨｂＡ１ｃ割合内の分画サイズ＝列ｄからの分画（ｎ）−分画（ｎ−１）。

実施形態において、上記係数の確立に基づき、６個の正常な血液サンプルからなる基準を使用して、時間軸を構築した。分画のＨｂＡ１ｃ割合限界値を、任意の年齢又は時間単位として使用し、反応曲線を構築した。分画の反応曲線の微分は、上記の仮定の下で（図３Ｄ）、一定グルコース濃度で予測される一定速度のＨｂＡ１ｃ形成を表す水平線である。図３Ｅから見られるように、時間スケール上の分画のサイズは、不規則であり、互いの間で実質的に異なる。これは、恐らく、ある年齢の赤血球は、様々な理由により、血液循環から欠損しているという事実によるものである。

本開示の１態様で使用される方法は、異なる年齢区間に属する血液サンプルからの赤血球群（分画）を比較して、この様な群の細胞の表れに揺らぎがあるか否かを判定することである。これらの揺らぎは、死滅率、排除、又は骨髄、脾臓等の器官における血液循環からの欠損、又はある期間中に生成された細胞の数の揺らぎによって起こり得る。理想的なモデルにおいて、赤血球は、一定のグルコース濃度の環境に存在し、ＨｂＡ１ｃは、一定の速度で生成され、細胞は、一定の速度で生成され、同じ寿命後、全ての細胞は、破壊され、そして、血液循環外における細胞のこれ以上の死滅率又は隠蔽は起こらない。この様な状況では、分画内の細胞の表れは、１００％と称される。この様な例において、図１Ｂで示されるように分析され、かつ等量の細胞を有する分画は、分画あたりのＨｂＡ１ｃ割合が一定量上昇することを示し、全ての分画は、大きさが一定である。理想モデルに関して、細胞が所与の分画から欠損する場合、分画の大きさは、サンプルからの所与の分画において表れた細胞の割合で除算された理想サンプルからの分画の細胞の１００％に相当する係数で増大する。

上記の式ＶＩＩＩを使用し、かつ一定のグルコース濃度及びＨｂＡ１ｃ生成の線形速度論に関する仮定を維持しつつ、分画において表れる細胞の割合を計算できる。細胞が若い年齢の軸の始めの分画は、大きい。恐らく、それは、細胞が、血流に放出される前に、骨髄又は脾臓の中に隠れているからであろう。軸の終端では、恐らく、古い細胞が排除されることにより、分画は大きい。（図３Ｆ）において、表れた細胞の割合を年齢軸上でプロットする。１００％となるよう、最小分画の値を取得した。このパターンは、少なくとも相当時間の間、赤血球が血流内で十分に表れ、排除を受けていない一般的な予測に応えるものである。

実施形態において、血液サンプル内の細胞の表れを解析するために、このアプローチを取り入れた。これらの条件を使用して、細胞数の揺らぎは、健康な個体において一般に正常と見なされるもののように見られ、選択した条件が正しいものであるという確たる証拠が得られる（実施例３、図３Ｆを参照）。

上記の時間軸の計算では、血液が受ける一定グルコース濃度は、１つの条件であった。糖尿病血液サンプルの場合では、グルコース濃度のばらつきを考慮に入れなければならない。記載のような１０分画への細胞イベントの分割は、グルコース濃度又は細胞ヘモグロビンに依存せず、このため正常サンプル及び糖尿病サンプルからの対応する分画を比較できる。

グルコース濃度の変化又は表れる細胞の割合の変化が発生する場合、分画限界の値が変化し得る。グルコース濃度の変化は、表れる細胞の割合の変化よりも、ＨｂＡ１ｃ割合対時間プロットに異なる影響をもたらすことがある。例えば、実施例３において、記載のように、ＨｂＡ１ｃ割合軸から、時間軸を導出する。

図４、４ｂのシミュレーションで示すように、分画におけるＨｂＡ１ｃ割合又は表れる細胞の割合の変化は共に、類似の影響を生み出す。上記解析から、新たなパラメータを導入しないと、分画限界値の変化は、表われる細胞の割合が変化する場合に実施するべき時間軸又はグルコース濃度が変化する場合に実施するべきＨｂＡ１ｃ割合軸に起因し得るかを判定することができないことが示された。

分画内の平均値の位置は、細胞によって受けられるグルコースの濃度の表示である。分画及び分画内の細胞の序列がグルコース濃度に依存しないので、グルコース濃度が変動すると、グルコース濃度の減少又は増加においてそれぞれ、細胞を分画の下端まで、若しくは分画の上端までシフトさせる。この変動は、分画における細胞イベントの算出された平均ＨｂＡ１ｃ割合値に影響する。平均の位置を考慮して患者分画を基準分画と比較するために、基準分画及びその分画限界値の位置を患者の分画に合わせて適合した（実施例５）。健康な個体のサンプルからのＨｂＡ１ｃ割合軸上の分画のサイズを糖尿病の個体と比較し、更に、平均ＨｂＡ１ｃ値を分画における適合後の基準の平均値と比較すると、微分後のＨｂＡ１ｃ割合、又はグルコース濃度の変動を計算することが可能である。

患者分画平均値を正常基準の対応する分画平均値と比較する場合、それぞれの平均値の割合を表す係数を、患者の全細胞平均ＨｂＡ１ｃ割合で乗算した。異なるＨｂＡ１ｃ割合が年齢計算にもたらす影響を補償するために、分画が表す時間区間を、同じ係数で除算した（実施例６）。この様な２重補正の結果を、図４ｃで示す。健康なサンプルと糖尿病サンプルの分画間における平均値の位置同士の差は、小さい。差分ＨｂＡ１ｃ値を算出する際の関係を、実施例５で示す。

時間／年齢プロット中の平均血糖濃度とＨｂＡ１ｃ割合値を比較するために、適合された平均ＨｂＡ１ｃ割合値を用いてグルコース濃度値の平均を整列するために患者ごとに異なる係数を導入した（実施例７）。ＨｂＡ１ｃ割合／年齢プロットを患者グルコース／実時間プロットと比較すると、類似性が明らかとされた。ＨｂＡ１ｃ割合プロットの時間軸上で全範囲を適合することで、この類似性を一層改善可能である（実施例８、図６）。この適合後の全範囲は、異なる患者に関する赤血球の寿命の長さを表す。

実施形態において、網状赤血球に起因する赤血球の寿命、ＲＮＡパラメータ、及びヘモグロビンパラメータの間の相関が、明らかとされた（実施例８、図７）。最初に、これらのパラメータをサンプルの古い分画内で探した。網状赤血球の成熟中、ＲＮＡ含有量は、徐々に消滅する一方、ヘモグロビン含有量が上昇して、最大となる。ＲＮＡ含有量とヘモグロビン含有量との積の関数として、減少するＲＮＡと増加するヘモグロビンは、互いに平衡となり、網状赤血球の成熟中、この関数の値は、一定を保つ。だが、ＲＮＡとヘモグロビンが共に低いと、網状赤血球は、血液サンプルが引き抜かれた時点の正常なヘモグロビンレベルに到達できない。実施例８の観測から、細網内皮系の赤血球の破壊と網状赤血球中のヘモグロビンの合成との間のリンクが、存在する。更に、鉄の再循環も、この様なフィードバック機構で重要な役割を担い得る。

複数のサンプルで最も古い分画について算出された年齢は、平均値が約１００日であり、この平均値は、クロム標識化法で得られた１２０日よりも短い。ＨｂＡ１ｃ割合スケール上の細胞イベントは、より高い値まで延長し、極めて長い年齢を得る希少な細胞があることが、示された。この超高感度クロム標識化法は、これらの希少なイベントを考慮可能である。実施形態において、クロム標識化法で得られた寿命と匹敵する寿命を推定するために、血液循環中で表れる赤血球の曲線に外挿を適用した。個々のサンプル内の赤血球の平均年齢は、実施例１０で記載のとおりに算出された。

分析分画において細胞年齢を決定すると、選択の赤血球パラメータに時間軸を適用できる。上記分析では、細胞年齢分画の平均細胞ヘモグロビンが、現時点で決定された。図９では、これらの平均細胞ヘモグロビン曲線が示されている。通常、ヘモグロビンは、年齢が５日又は６日の細胞で最大レベルに達する。更に時間が経つと、報告されているように、細胞はヘモグロビンを失う（Ｇｉｆｆｏｒｄ ＳＣ、Ｄｅｒｇａｎｃ Ｊ、Ｓｈｅｖｋｏｐｌｙａｓ ＳＳ、Ｙｏｓｈｉｄａ Ｔ、Ｂｉｔｅｎｓｋｙ ＭＷ．Ｂｒ Ｊ Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００６年１１月；１３５（３）：３９５〜４０４）。

実施形態において、方法は、分画におけるＨｂＡ１ｃの平均割合と、分画におけるＨｂＡ１ｃ平均割合と赤血球の年齢との間の関係を提供する表とを比較することで、赤血球分画の年齢を決定する工程を含む。実施形態において、この方法は、更に、サンプルが、疾患状態を示す基準細胞群よりも古い大きな細胞分画を含むか否かを判定する工程も含む。実施形態において、疾患状態は、糖尿病又は貧血である。

（実施例１）
血液サンプルの細胞ヘモグロビンとＨｂＡ１ｃの割合とを測定するアッセイ、網状赤血球への細胞の分画、及び１０分画の成熟赤血球について述べる。グルコースとヘモグロビンを共に不可逆反応させて、ＨｂＡ１ｃを生成した（アマドリ生成物）。この反応は、時間とグルコース濃度の関数とする連続現象である。ＨｂＡ１ｃの生成は、糖尿病患者の血糖平衡管理における要素である。ＨｂＡ１ｃの正常値：全ヘモグロビンの５％。

材料と方法。
以下の材料をアッセイで使用した。
１．抗凝血剤として０．７ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で処理し、かつ４℃で１０日以内で保存した血液サンプル。
２．球形化試薬；０．１３７Ｍの塩化ナトリウム、０．００５ＭのＨＥＰＥＳ、０．０００５Ｍの（Ｄ＋）トレハロース、０．０８３Ｍのホルムアルデヒド、０．０４ｍＭのｎ−ドデシルベータ−Ｄ−マルトシド、０．５ｍｌ／ｌのプロクリン−３００、０．５ｍｇ／ｌのアクリジン・オレンジ、及びｐＨ７．５を得るための所定量の水酸化ナトリウムからなる水溶液。
３．浸透試薬；２．０３ｍＭのＮ−ラウロイルサルコシン、１０ｍＭのコハク酸、０．２２Ｍのスクロース、０．０１５ｍＭのウシ血清アルブミン、０．５ｍｌ／ｌのプロクリン−３００、及びｐＨを５．４まで調整するためのある量のピロリジンからなる水溶液。
４．中和試薬；４０ｍＭのＨＥＰＥＳ、０．５Ｍの塩化ナトリウム、０．９１ｍＭのウシ血清アルブミン、０．０３Ｍのアジ化ナトリウム、ｐＨを７．２５まで調整するためのある量の水酸化ナトリウム、及び濃度５ｍｇ／ｌで蛍光色素Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）と共有結合的に共役したモノクローン抗ＨｂＡ１ｃ抗体（ＩｇＧ１）からなる水溶液。
５．固定化試薬；０．１５５Ｍの塩化ナトリウム、０．０４Ｍのリン酸ナトリウム、０．１８Ｍのホウ酸、０．０１ＭのＥＧＴＡ、０．０１６μＭの硫酸デキストラン（ＭＷ５００，０００）、０．６２Ｍのホルムアルデヒド、及びｐＨを７．１まで調整するためのある量の水酸化ナトリウム又は塩酸からなる水溶液。
６．標識化基準対照細胞の解凍サンプル。

例示的方法は、血液サンプルを単一試験管に入れることを含む。血液サンプルをアクリジン・オレンジで希釈した。細胞を浸透剤で固定し、そしてインキュベートした。次いで、対照細胞を試験管に追加した。蛍光標識化抗ＨｂＡ１ｃ抗体（米国第７５４１１９０号で記載の抗体）を、試験管に追加した。蛍光抗体／細胞を固定させてから、サイトメトリで測定した。

標識化と分析
容積が４μｌの異なる血液サンプルをそれぞれ、２００μｌの球形化試薬内で懸濁させた。１分間のインキュベート後、この懸濁液を３μｌ、続けて６０μｌの浸透試薬と混合させた。１．５分間のインキュベート後、標識化基準対照細胞を５μｌ、添加、混合させ、更に、１分間のインキュベート後、中和試薬を１００μｌ、添加、混合させた。更に１０分間のインキュベート後、固定化試薬を８０μｌ、添加した。

側方散乱（ＳＳ）測定及び５２５ｎｍ（ＦＬ１）と６７５ｎｍ（ＦＬ４）における蛍光測定により、最終のサンプル混合物を、ＦＣ５００ＭＰＬサイトメーター上で分析した。健康な被験体からの代表サンプルの分析を、図１Ａで示す。側方散乱によって、全細胞ヘモグロビンを測定した。蛍光標識を決定することで、ＨｂＡ１ｃを測定した。蛍光値を側方散乱値で除算し、１００で乗算することで、％ＨｂＡ１ｃを算出した。

結果
側方散乱（ＳＳ）で除算された蛍光（ＦＬ４）のパラメータを供給するアルゴリズム・プログラムを更に使用して、サイトメーターソフトウェアで得られたサンプルリストモードデータを分析した。領域Ａ、Ｂ、Ｃ（図１Ａ）を自動でゲートし、個別に分析した。領域Ａ；糖尿病患者からの対照細胞、領域Ｂ；赤血球網状赤血球、領域Ｃ；赤血球成熟細胞。

ＨｂＡ１ｃ割合軸上の（赤血球集団）マイナス（網状赤血球）を、略等しい数の細胞を含む１０分画に分画した（図１Ａ、Ｂ）。サイトメーター結合コンピュータ・プログラムにより、ＦＬ４と側方散乱について、それぞれの分画の平均値を得た。各チャネルの蛍光のオーバーフローについて、ＦＬ４を補償し、分画のＳＳと全平均ＳＳ（ＦＬ１により決定）との比で乗算することで、上記で決定されたＦＬ４のバックグラウンドを各分画に合わせて適合させ、種々の分画における細胞の側方散乱値と比例するよう、バックグラウンドを取り入れた。

赤血球の側方散乱は、細胞の細胞ヘモグロビン含有量（ＭＣＨ）の尺度である。それ故、サンプルのＭＣＨは、サイトメーターにより測定された平均側方散乱値から導出可能である。サンプルのＨｂＡ１ｃ含有量は、サイトメーターにより測定された６７５ｎｍ（ＦＬ４）における細胞の蛍光の平均から導出できる。バックグラウンド値を減算した。抗ＨｂＡ１ｃ_{ａｎｔｉｂｏｄｙ}が存在せず、かつ蛍光色素Ｆｌｕｏｒ Ａｌｅｘａ ６４７と共有結合的に共役した非特定アイソタイプ対照モノクローナル抗体（ＩｇＧ１）が存在する中で、サンプルを含むアッセイを起動させることにより、バックグラウンド値を得た。ＨｂＡ１ｃ含有量を赤血球又はサンプルのヘモグロビン含有量で除算することで、任意の単位のＨｂＡ１ｃ割合の尺度を得た。第１事例では、簡易な除算により、この様な尺度を得た。ＦＬ４／ＳＳ。

網状赤血球を、個別に分析した。図１Ｃで見られるように、ＦＬ４値が低いＲＮＡ含有細胞（図１Ａ、領域Ｂ）を、ＦＬ４値が高い汚染細胞から分離した。純粋な網状赤血球の分画を測定した。ＦＬ４／ＳＳ単位の分画限界と平均値、任意の単位のＦＬ１値及び任意の単位のＳＳ値を決定した。

（実施例２）
３つの異なる決定法を使用した参考検査室からのＨｂＡ１ｃ割合データ及びフローサイトメトリ法で得られたＨｂＡ１ｃ割合データの相関プロットの比較。
異なる３つのＨｂＡ１ｃ決定法を用いた１２０サンプルに対する参考検査室により、ＨｂＡ１ｃ割合を決定した；（Ｐｒｉｍｕｓ Ｕｌｔｒａ２；親和性クロマトグラフィー、Ｒｏｃｈｅ Ｕｎｉｍａｔｅ；免疫比濁法、及びＴｏｓｏｈ Ｇ７変型；カチオン交換クロマトグラフィー）。ＨｂＡ１ｃの割合が把握されている基準対照細胞が存在する中で、サイトメトリＨｂＡ１ｃ割合値を決定した。本明細書では、任意のＨｂＡ１ｃ割合単位のＨｂＡ１ｃ割合値への変換について述べる。

方法と結果
第１事例として、我々は、蛍光標識抗体によって、固定赤血球内のＨｂＡ１ｃ分子に自由にアクセスできることを示した。赤血球をホルムアルデヒド固定し、水中で溶解させ、更に、洗浄剤の存在下で分解させた。ライセートは、ライセートと透過処理赤血球における等量のＨｂＡ１ｃを含む競合実験において使用した。非飽和状態の抗体を使用して、ライセートは抑制し、ホルムアルデヒド固定され、かつ細胞中のＨｂＡ１ｃと類似のラウロイルサルコシンで処理されたライセートは、５０％において抗体結合を抑制し、抗ＨｂＡ１ｃ抗体が細胞中のＨｂＡ１ｃ分子に自由にアクセスすることを明らかとした（図２Ａ）。サンプルのＨｂＡ１ｃ含有量をサンプルの平均細胞ヘモグロビン含有量で除算することで、サンプルのＨｂＡ１ｃの割合を算出した。サンプルと混合された基準対照細胞のＭＣＨとＨｂＡ１ｃ割合に関する既知の値と比較することで、ＭＨＣとＨｂＡ１ｃ割合を決定できた。参考検査室から、１２０サンプルを得た。各サンプルのうち、参考検査室には、３つの異なるアッセイを用いて測定されたＨｂＡ１ｃ割合値が含まれる。（図１２）

ＮＧＳＰ標準に従って、参考検査室から供給されたＨｂＡ１ｃ割合値を表した。ＮＧＳＰ ＨｂＡ１ｃ割合値、及び患者と健康な個体の平均グルコース濃度値を比較すると、相関曲線の原点との２．１５％の切片が示される。若い細胞分画では、極めて低いＨｂＡ１ｃ割合値が示された。それ故、ＩＦＣＣ標準に準拠するＨｂＡ１ｃ割合値を使用すると、ＨｂＡ１ｃ割合対平均グルコース濃度相関曲線には、切片が示されず、より合理的なＨｂＡ１ｃ割合を反映した。変換式；
ＮＧＳＰ＝（０．９１５^＊ＩＦＣＣ）＋２．１５（式ＩＸ）
が、文献で提供されている（Ｄａｖｉｄ Ｂ．Ｓａｃｋｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ＡＤＡ／ＥＡＳＤ／ＩＤＦ ｗｏｒｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｔｈｅ ＨｂＡ１ｃ ａｓｓａｙ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００５年；５１：６８１〜６８３．）。

内部基準対照細胞のＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合値への変換、及び参考検査室により提供された値の変換後、図２Ｂで示すように、相関曲線を構成した。この曲線の解析から、１次反応で予測される対数関数が明らかとされた。以下の式：
ＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ＝４．５４^＊（ｅ^{０．１５７＊ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ａｒｂｉｔｒａｒｙ ＨｂＡ１ｃ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ}−１）（式Ｘ）を使用して、サイトメトリによる任意のＨｂＡ１ｃ割合値を変換すると、傾きが１、Ｒ^２が０．９、原点を通る線形相関曲線が得られた（図２Ｂ）。血液サンプル又は細胞群について、この式を使って、ＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合値を算出した。

アッセイ内で使用する抗ＨｂＡ１ｃ抗体の結合に関する速度論を、例えば、米国特許第７，９６８，２７９号に記載のこれまでに公開されている相関実験のデータから決定し、この実験では、参考検査室と記載のサイトメトリ分析により、１２０サンプルを同時に分析した。公開されている指針に従って、参考検査室から供給されるこの実験からの基準ＨｂＡ１ｃ割合値を、現ＮＧＰＳ値から新ＩＦＣＣ値まで変換する（Ｄａｖｉｄ Ｂ．Ｓａｃｋｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ＡＤＡ／ＥＡＳＤ／ＩＤＦ ｗｏｒｋｉｎｇ ｇｒｏｕｐ ｏｆ ｔｈｅ ＨｂＡ１ｃ ａｓｓａｙ；Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００５年；５１：６８１〜６８３．）。この新規ＩＦＣＣ値は、ゼロ値に対する切片を持たないことで、ＮＧＰＳ値とは異なり、それ故、若い細胞の低い値を含める我々の調査においてより適切である。最終的な相関を、図２Ｂで示す。

対数関数に応答する１次反応として抗体の結合を考慮に入れ、リバース（ｒｅｖｅｓｅ）である、指数関数式をサイトメトリデータに適用して、図（図２ｃ）の原点を通る回帰直線との線形相関を得た。

抗体結合速度論：

リバース；ｙ＝ｃ_１ ^＊（ｅ^ｘ＊ｃ２−１） （式ＶＩＩ）
式中、ｙは、参考検査室により与えられたＩＦＣＣ単位のＨｂＡ１ｃ割合、ｘは、内部基準対照細胞が存在する際に決定されたサイトメトリＨｂＡ１ｃ割合、ｃ_１とｃ_２は、定数である。抗ＨｂＡ１ｃ抗体の結合速度論を算出し、本調査を通して使用した。

図２Ｃにおいて、正規化されたＦＬ４／ＳＳデータを、式
ｙ＝ｃ^＊ｅ^{０．１５７＊ｘ}（式１）を使って変換する。
式中、ｙは変換後データ、ｘは正規化後のＦＬ４／ＳＳデータ、ｃは定数（例えば、２．７４）である。相関係数Ｒ^２＝０．９４。

（実施例３）
６人の健康な被験体からのデータ；異なる分画におけるＦＬ４／ＳＳ値及び補正後のＦＬ４／ＳＳ値の表記、並びに分画におけるＨｂＡ１ｃ割合の時間への変換。
この実施例は、６人の健康な被験体からのデータ、及び分画限界ＦＬ４／ＳＳ値の時間への変換を提供する。糖尿病の個体からの血液サンプルとの比較のため、第１アプローチとして、一定の血糖濃度を経てきたと見られる非糖尿病の個体に相当する血液サンプルを選択した。正常サンプルから得られたパラメータが一定の血糖濃度を表していることを更に解明するために、正常な６サンプルのパラメータの平均を取った。

実施例１で述べたように、サイトメーターから生成された生データを使用して、等量の細胞を含む分画に成熟細胞集団を分画した。ＨｂＡ１ｃ割合軸（図１Ｂ）上の細胞の構成は、細胞のＨｂＡ１ｃ割合の増加に依存する。この増加が早いか、遅いか、又は不規則であるかは、軸上の細胞イベントの序列に影響を与えない。ゼロ又は負の増加のみが、構成を著しく阻害することになる。しかしながら、グルコースが血中で常に存在していること、更に、アマドリ反応の不可逆性がＨｂＡ１ｃ複合体をもたらすことにより、このことは起こらない。以下で述べるように、ＦＬ４／ＳＳ軸における分画のサイズの計算は、基準サンプルにより供給されるデータに基づく。それ故、他のサンプルについて計算されたＨｂＡ１ｃ割合値を、変更せずに分画へ適用可能である。更に、細胞序列が安定していることで、この技術を、糖尿病被験体、又は血液学的異常のある被験体からのサンプルの分析でも実用可能である。

サイトメトリ分析によって、これらサンプルのＨｂＡ１ｃ割合値を決定した。微分後のＨｂＡ１ｃ割合値は、一定であると想定され、ＨｂＡ１ｃ割合の値をもたらした。

方法と結果
実施例１に従って、６人の健康被験体からの血液サンプルを処理し、分析した。

理想的なモデルにおいて、赤血球は、一定のグルコース濃度の環境に存在し、ＨｂＡ１ｃは、一定の速で生成され、細胞は、一定の速度で形成され、１２０日の同じ寿命後、全ての細胞は、破壊され、そして血液循環外における細胞のこれ以上の死滅率又は隠蔽は起こらない。この様なサンプルにおいて、図１ｂで示されるように分析され、かつ等量の細胞を有する分画は、分画あたりのＨｂＡ１ｃ割合が一定量上昇することを示す。この様なモデルでは、図１ｂにおけるＦＬ４／ＳＳ又はＨｂＡ１ｃ割合軸上の区間は、サイズが同じであるものとする。理想モデルに近づけるよう、健康な被験体（実施例３）から、図１ｂのサンプルを採取した。図１ｂの区間が同じサイズではない理由は、使用されるサンプルの特性と上記で概説した理想サンプルの特性のいずれかとの違いに起因する可能性がある。糖尿病に罹っていない血液学的に正常な被験体からのサンプルを使用して、図１ｂの区間分布は、個々の細胞の異なる寿命及びサンプルを取得した血液外部の細胞の隠蔽に起因するものと推測された。理想モデルに関して、死滅率又は隠蔽による細胞損失は、血流中に表れる細胞の割合として表記され、図１ｂの様に、ＨｂＡ１ｃ割合軸上で分画サイズを増大させる。図１ｂが構築された条件を考慮に入れて、関係は、（分画における表れる細胞の割合）＝１／（ＨｂＡ１ｃ割合スケール上の分画サイズ）である。

我々が使用するモデルにおいて、赤血球のＨｂＡ１ｃ割合は、（分画内において表れる細胞の割合）＝１／（ＨｂＡ１ｃ割合スケールで表れる時間）をもたらす血中の時間で増加するものと仮定する。図３ａでは、未補正ＨｂＡ１ｃ割合対分画数を示した。図３ｂ、ｃにおいて、ＨｂＡ１ｃ割合を補正して、分画サイズを予備時間で交換し、更に、細胞年齢と共にＨｂＡ１ｃ割合の直線的な増加をもたらすよう適合させた。ここで、細胞の表れが少ない高いＨｂＡ１ｃ割合を有する分画には、より多い時間量に割り当てられた。これは、合理的である。何故ならば、理想モデルと比較して、実状況の高いＨｂＡ１ｃ分画は、部分がまだ表れていないか、又は消滅した細胞を表すからである。

６人の健康な被験体からの基準サンプルと仮説モデルとの間の古い分画の違いを解明するために、古い分画における時間軸の補正は、主に細網内皮系による赤血球の除去のために補正するものと仮定した。更に、本モデルは、未熟細胞に割り当てられた年齢の計算を可能とする。この基準サンプルでは、この時間は、成熟細胞の第１分画に割り当てられた時間の約３０％に相当し、年齢の分画は、網状赤血球後に直接従う。１０分画が存在することを考慮に入れると、このことは、未熟細胞の数が、総赤血球数の約３％に相当することを示唆する。我々がアッセイ内で回収した全細胞における網状赤血球の割合は、０．５％のみである。明かなこととして、ヘモグロビンの生成とＲＮＡの消滅との間の成熟段階にある細胞の約８０％は、血流内に存在しない。

時間計算では、ＦＬ４／ＳＳの分画限界値及び分画ごとの細胞数に関するデータを、この実施例で使用した。網状赤血球分画に関する分画限界値は、使用しなかった。実際、未熟な赤血球の大部分は、血液循環に存在しない。結論として、循環中に存在する網状赤血球は、未熟赤血球で最も成熟した部分であり、それ故、網状赤血球の平均ＦＬ４／ＳＳ値も、未熟細胞の分画限界として採用した。

図３（Ａ）は、分画ごとのＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合の図表記である。実施例２で述べるとおりに、健康な人間の被験体からのＦＬ４／ＳＳ分画を取得し、図１で見られるように解析した。分画は、表１で示すとおりであり、１〜１０の値及び網状赤血球を表すＲが付与されている。表１で見られるように、分画ごとに、平均ＦＬ４／ＳＳ値を、ＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合値に変換した。図３Ａでは、（ａ）列と（ｃ）列からの値を使用した。

図３（Ｂ）は、時間軸上のＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合に関する図表記である。

図３（Ｃ）は、年齢軸上のＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合に関する図表記である。年齢は、負値の日付で示している。図３Ｂ、３Ｃでは、表１の（ｄ）列と（ｉ）列からの値を、使用した。

図３（Ｄ）は、微分されたＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合値対年齢の図表記である。図３Ｃの微分によって、定数値がもたらされる（表１を参照）。この値を、基準サンプルの測定された平均ＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合に正規化した。図３Ｄでは、サンプル（３．４４）の平均ＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合値について正規化された（ｉ）列の値及び定数値（ｄ）／（ｉ）を、図１Ｃの差分として使用した。

図３（Ｅ）は、分画ごとの分画サイズの図表記である。表１で見られるように、ＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合単位で表される分画サイズを計算した。

図３（Ｆ）は、年齢軸上における血液循環中に表れる細胞の割合に関する図表記である。割合の計算結果を、表１で示す。図３Ｅでは、（ａ）列と（ｅ）列の値を使用し、更に、図３Ｆでは、（ｈ）列と（ｉ）列からの値を使用した。

図３Ａ−３Ｆで表記される値は、表１で要約されている。

表１
分画ごとのＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合の計算（図３Ａ）、時間ごとの日単位の（図３Ｂ）、又は年齢ごとの日単位の（図３Ｃ）ＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合の計算；及び時間ごとの日単位のＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合の微分の計算（図３Ｄ）。分画ごとの分画サイズ（図３Ｅ）及び日単位の時間の関数とする表れる細胞の計算（図３Ｆ）。

ａ．図１Ｂで示される網状赤血球と分画。
ｂ．図１Ｂで示される分画限界の側方散乱値で除算したＨｂＡ１ｃ蛍光値。血流に存在する網状赤血球の平均値を、分画限界値として採用した。最終分画１０の分画限界は、分画８、９の分画限界値間の差の半分を最終分画１０の平均蛍光値に加えた値と推定された。バックグラウンド及び蛍光の補償のために、値を補正した。
ｃ．予備ＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合で表記される分画限界値。ｂ列内の各分画限界値を、ｂ列の平均値で除算した。得られた値を、サンプルの平均ＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合値３．４４で乗算した。
ｄ．ＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合で表記される分画限界値。ｄ（ｄ）列の値は、式（ＶＩＩＩ）を使用して、ｃ列の値から得た。
（ｄ）＝４．５４^＊（ｅ^{０．１５７＊（ｃ）}−１）
ｅ．ＨｂＡ１ｃ割合内の分画サイズ＝列ｄからの分画（ｎ）−分画（ｎ−１）。
ｆ．逆値；１／式（ＩＩ）に関わるｅ列の値の分画（ｎ）。
ｇ．各分画の細胞イベントの数。
ｈ．ｇ列値で乗算したｆ列の値。ｈ列の最大値を１００％として取得した。他の値を、それに応じて計算した。
ｉ．ｅ列からの分画１０の値を１００日として採用した。ｊ列の他の値を、それに応じて計算した。

上記の式ＶＩＩＩを使用し、かつ一定のグルコース濃度及びＨｂＡ１ｃ生成の線形速度論に関する仮定を維持しつつ、分画において表れる細胞の割合を計算できる。細胞が若い年齢の軸の始めの分画は大きい。恐らく、それは細胞が血流に放出される前に、骨髄又は脾臓の中に隠れているからであろう。軸の終端では、恐らく、古い細胞が排除されることにより、分画は大きい。（図３Ｆ）において、表れた細胞の割合を年齢軸上でプロットする。１００％となるよう、最小分画の値を取得した。このパターンは、少なくとも相当時間の間、赤血球が血流内で十分に表れ、排除を受けていない一般的な予測に応えるものである。

実施形態において、血液サンプル内の細胞の表れを解析するために、このアプローチを取り入れた。これらの条件を使用して、細胞数の揺らぎは、健康な個体において一般に正常と見なされるもののように見られ、選択した条件が正しいものであるという確たる証拠が得られた（図３Ｆ）。

上記の時間軸の計算では、血液が受ける一定グルコース濃度は、１つの条件である。糖尿病血液サンプルの場合では、グルコース濃度のばらつきを考慮に入れなければならない。記載されるような１０分画への細胞イベントの分割は、グルコース濃度又は細胞ヘモグロビンに依存せず、このため、正常サンプル及び糖尿病サンプルからの対応する分画を比較できる。

グルコース濃度の変化又は表れる細胞の割合の変化が発生する場合、分画限界の値が変化し得る。グルコース濃度の変化は、表れる細胞の割合の変化よりも、ＨｂＡ１ｃ割合対時間プロットに異なる変化をもたらすことがある。例えば、実施例３において、記載のとおりに、ＨｂＡ１ｃ割合軸から、時間軸を導出する。

ＨｂＡ１ｃ反応／時間曲線に対する時間軸の補正。
標準曲線から派生された式、及び、実施例３に関わる時間／割合軸の改良軸を使用すると、グルコース値との合理的な一致がもたらされたが、血流からの異なる年齢の細胞の回復については、望ましくない図が得られた。特に、若い年齢群は、過小評価しているように見られた。見かけ上、グルコースとヘモグロビンの反応は、完全には直線ではない時間曲線に従うが、その外観は、飽和曲線のようである。アマドリ反応の第１工程は、不可逆ではないが、飽和現象を起こす可能性がある。また、糖化ヘモグロビンは、終末糖化（ＡＧＥ）産物との更なる反応を受ける（Ｍａｋｉｔａ、Ｚ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９２年、ｖｏｌ．２５８、ｐｐ ６５１〜６５３）。

時間軸に式（ＸＩＩ）：ｙ＝ｘ^１．３を適用
すると、血流からの異なる年齢の細胞の回復割合と良好に一致した（実施例３、図３Ｈ）。最終的な曲線は、時間の関数とする「実ＨｂＡ１ｃ値」を提供する（図３Ｅ）。そして、この曲線の微分は、時間分画の関数とする実ＨｂＡ１ｃ割合生成速度を提供する（図３Ｆ）。所与の年齢分画におけるＨｂＡ１ｃ割合の生成速度が赤血球の寿命を通じた生成速度である場合、本明細書の「ＨｂＡ１ｃ率」は、サンプルの平均ＨｂＡ１ｃ値として定義される。

実ＨｂＡ１ｃ生成速度が時間と共に減少するので、グルコース値と比較する上で、これは実用できない。この目的のため、図３Ｄで示すように経時にわたり一定の値をもたらす微分後のＨｂＡ１ｃ割合値を、新たに構築した時間軸と組み合わせた。標準曲線の適用及び飽和現象の排除によって、グルコース濃度のみに依存するＨｂＡ１ｃ生成速度がもたらされることを仮定して、この改良ＨｂＡ１ｃ生成速度を、「グルコース依存ＨｂＡ１ｃ割合速度」と称する。

時間軸が算出される基準値をテンプレートとして使用し（「時間テンプレート」）、異なるサンプルからの分画における細胞の年齢を計算した。分画のＨｂＡ１ｃ割合限界値を、任意の年齢又は時間単位として使用し、反応曲線を構築した（実施例３、図３Ａ、Ｂ、Ｃ）。反応曲線を微分すると、上記の仮定の下で（図３Ｄ）、一定グルコース濃度で予測される一定割合のＨｂＡ１ｃ生成を表す水平線となるはずである。図３Ｅから見られるように、時間スケール上の分画のサイズは、不規則であり、互いの間で実質的に異なる。これは、恐らく、ある年齢の赤血球は、様々な理由により、血液循環から欠損しているという事実によるものである。

（実施例４）
本実施例では、２６人の糖尿病患者のヘモグロビン分析について述べる。

方法と結果
地方倫理委員会の承認の下で、２６人の糖尿病患者を含む調査を実施した。患者は、糖尿病の種類又は他の病的状態とは関係なく、糖尿病臨床に参画するものから選んだ。１日数回の彼ら自身のキャピラリーグルコース値を測定、管理された患者を選択して、ある期間のグルコース測定を網羅するノートの複製を作成した。ＥＤＴＡ上で血液を抽出して、実施例１記載のとおり、分析した。サイトメトリ手順を使用して、ＨｂＡ１ｃを測定した。血液サンプルを抽出する前の３０日の期間にわたり、患者ごとの平均グルコース値を計算し、この平均値をＲ^２値が０．４５の相関（図５Ａ）を示すサイトメトリ手順のＨｂＡ１ｃ値と比較した。この低い相関は予測されており、文献で報告されている（ＭｃＣａｒｔｅｒ等、Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｃａｒｅ．２００４年；２７：１２５９〜１２６４、Ｈｕｄｓｏｎ等、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９年；ｖｏｌ．３６、４５１〜４５９）。

表２Ａ−２Ｅは、基準に対する患者８の年齢分画におけるＨｂＡ１ｃ割合導関数又はグルコース濃度の計算結果を示す。

ａ．図１Ｂで示される数による分画。
ｂ．図１Ｂ内で示されるＦＬ４／ＳＳスケール上の分画限界値；最終分画１０の分画限界は、分画８、９の分画限界値間の差×０．５を最終分画１０の平均蛍光値に加えた値と推定された。バックグラウンド及び蛍光の補償のために、値を補正しなかった。
ｃ．基準の（ｂ）値により除算したサンプルの（ｂ）値、基準に対する分画限界の位置を示す。
ｄ、ｅ、ｆ．基準の過去の（ｄ）、対応する（ｅ）、及び次の分画（ｆ）それぞれに割り当てられた同じサンプル分画の部分。

ｇ．図１Ｂ内で示されるＦＬ４／ＳＳスケール上の分画限界値。バックグラウンド及び蛍光の補償のために、値を補正した。
ｈ．分画平均値間の差分；ｈ_ｎ＝ｇ_ｎ−ｇ_ｎ−１。網状赤血球値を個別に追加した。
ｉ．分画平均値の差（ｈ）と分画限界との同期（図１Ｂを参照）；ｉ_ｎ＝（ｈ_ｎ＋ｈ_ｎ＋１）／２。分画１において、長さとして半分のｈ_１を２で乗算した。網状赤血球分画を同期しなかった。
ｊ．バックグラウンド及び蛍光の補償のために補正した（ｂ）の分画限界値。網状赤血球の分画限界値として、平均値を取った。
ｋ．分画限界値（分画サイズ）間の差分；ｋ_ｎ＝ｊ_ｎ−ｊ_ｎ−１。網状赤血球の分画サイズを、個別に決定した。
ｌ．同期化後の分画平均値差（ｉ）であり、（ｉ）値の平均で除算して、１の平均を含む値をもたらす。
ｍ．分画平均値差（ｋ）であり、（ｋ）値の平均で除算して、１の平均を含む値をもたらす。
ｎ．分画内の平均値の位置；ｌ／ｍ。

ｏ．サンプル分画に対する基準平均値の位置の計算；（ｄ）、（ｅ）、及び（ｆ）を基準の（ｎ）で乗算して、総和を取った。
ｐ．（ｏ）−１。
ｑ．基準の補正後の位置に対する分画内の平均値の位置の変換；（ｑ）の符号に応じ、（ｑ）の絶対値の平方根を、１又は−１で乗算した。結果を、定数；０．４で乗算した。
ｒ．（ｒ）＋１
ｓ．分画ごとの微分ＮＧＰＳ ＨｂＡ１ｃ割合値であり、サンプルのＮＧＰＳ ＨｂＡ１ｃ割合値で乗算（ｓ）することで得られる。
ｔ．自己監視により決定され、かつｍｇ／１００ｍｌとして表記される分画のグルコースの濃度平均を、分画（ｔ）の微分後のＨｂＡ１ｃ割合値の平均で除算した。生成された係数を（ｔ）の各分画値で乗算して、グルコース濃度値と匹敵する相対的な微分後のＨｂＡ１ｃ割合値を得た。

ｕ．網状赤血球分画を除く（ｊ）列内の分画限界値。この分画から、平均値を取得した。各分画の値（ｊ）を分画の平均で除算した。
ｖ．（ｕ）の値を基準サンプルのＩＦＣＣ ＨｂＡ１ｃ割合（３．４４％）で乗算する。
ｗ．式ＸＩの（ｖ）の値への適用；ｗ＝ｅ^{０．１５７＊（ｖ）}−１
ｘ．ｗの値間の差；ｘ＝ｗ_ｎ−ｗ_ｎ−１。
ｙ．（ｓ）列内の基準の対応分画の平均位置に対する、
分画の平均位置で除算した（ｘ）の値。
ｚ．各分画の細胞イベントの総数。
ａａ．（ｚ）を１０分画の細胞イベントの数で除算し、１０で乗算する。
ａｂ．（ｙ）^＊（ａａ）。
ａｃ．（ａｂ）を最適一致により決定されるか、あるいは、表Ｅで示すように計算された寿命係数で乗算する。このテーブルでは、最適一致で決定された寿命係数を使用した。
ａｄ．（ａｃ）の累積値；ａｃ_ｎ＋ａｃ_ｎ−１、分画年齢が日単位で表される。

ａｅ．アクリジン・オレンジＲＮＡ染色；ＦＬ１（４８８ｎｍ）蛍光値。
ａｆ．網状赤血球（ａｅ）−全細胞（ａｅ）。
ａｇ．全細胞（ａｅ）−ＦＬ１バックグラウンド値（０．１７）。
ａｈ．網状赤血球（ａｆ）を全細胞（ａｇ）で除算。
ａｉ．（ａｈ）の１．３乗。
ａｊ．細胞ヘモグロビン含有量；側方散乱値。
ａｋ．網状赤血球（ａｊ）を全細胞（ａｊ）で除算。
ａｌ．（ａｋ）の１．７乗。
ａｍ．（ａｉ）^＊（ａｌ）を定数値（６．１０）で乗算。（ａｍ）は、寿命係数を表す。

時間軸の基準値を用いた異なるサンプルの時間軸の算出。
一定であると仮定したグルコースＨｂＡ１ｃ割合のレベル、及び、約１２０日の寿命に基づいて、患者サンプルの時間軸を決定した。だが、これらの患者では、グルコース依存ＨｂＡ１ｃ割合が一定でないので、実施例４で述べた患者サンプルの時間軸は、直接計算することができない。患者サンプルから時間軸を算出するために、基準の予備時間軸の計算で使用したことにより、基準のＨｂＡ１ｃ値の差分（時間テンプレート）を使用した。

サンプルのｘ軸を変更するために、患者サンプルの固有の変数を適用した。これらの変数の選択は重要である。何故ならば、これらの変数が、ｘ軸上の時間のみならず、患者サンプルのグルコース依存ＨｂＡ１ｃ割合値にも間接的に影響し、更に、ｘ値がグルコース依存ＨｂＡ１ｃ値用の式；ｄ（ｙ）／ｄ（ｘ）の一部を成すからである。基準サンプルの場合で行ってきた様にｄ（ｙ）からｄ（ｘ）を微分すると、基準サンプルの場合を対象とする平坦な直線がもたらされるはずであるが、これは、患者サンプルの場合を対象としてはいない。ｘ軸上の時間に影響する変数は、１）コンピュータによって与えられる各分画の細胞数、及び２）理想モデル、又は図１Ｂ（式１）で示される元のＦＬ４／ＳＳスケール上における分画の長さの裏返しに対して患者サンプル内に表れ、同様に、コンピュータによって与えられる細胞の数である。

これらの補正を適用すると、上記のような平坦な直線がもたらされない。分画内の平均の位置が分画間のＨｂＡ１ｃ速度レベルの差を厳密に反映するので、この位置は明示的に残されている。実証については、図６を参照のこと。この演算もまた、分画の長さの裏返しについて、サンプル時間テンプレートを補正することなく、分画内の平均の位置について逆の方法で実施可能であり、実施例６で示されるように、幾何平均を使用して計算できる。実施例５及び表２において、補正係数１、２の適用を実証する。新たに構築した時間軸が基準サンプルの時間軸と最適に一致したことを確認するために、軸上の全時間分画を、１１５日の全基準時間軸に戻した。

実施例７で見られるように、ここで、新たに算出した分画ｄ（ｘ）の時間値により、患者サンプルｄ（ｙ）のＨｂＡ１ｃ割合値の差分を除算した。ｄ（ｘ）／ｄ（ｙ）又はグルコース依存ＨｂＡ１ｃ割合値を分画ｄ（ｘ）の時間値の積分（ｘ）に対してプロットすることで、グラフ表示を作成した。

（実施例５）
この実施例では、糖尿病患者からの血液サンプルの分析及び分画内の平均ＨｂＡ１ｃ値の位置について説明する。

方法と結果
実施例１と図１で示すように、非糖尿病と糖尿病の全血液サンプルを調製し、分析した。各成熟赤血球分画のＦＬ４／ＳＳ分画限界値及びＦＬ４／ＳＳ平均値を収集した。非糖尿病基準として、実施例３に記載のような６人の健康な被験体のデータを使用した。年齢の関数とする基準分画の微分後のＨｂＡ１ｃ割合は、平坦となるようにし、一定値の平均ＮＧＳＰ ＨｂＡ１ｃ割合を与えた。

微分後のＨｂＡ１ｃ割合が定数となると見込まれる血液サンプルのみに、実施例３で実証された時間軸へのＦＬ４／ＳＳ軸の変換を適用できる。経時にわたる血糖濃度の変動を受ける糖尿病患者では、このような前提をとることができない。糖尿病患者の場合、ＦＬ４／ＳＳ軸上で測定されたような分画のサイズは、分画により表される年齢区間のみならず、ＨｂＡ１ｃ割合の可能な変動の関数である。

分画において、微分後のＨｂＡ１ｃ割合として表記されるＨｂＡ１ｃ割合の変動は、アルゴリズムによって計算された分画内の平均ＦＬ４／ＳＳ値の位置との関係を有する。

図１Ｂで示すプロットの分画における平均値の位置を、細胞数と細胞のＦＬ４／ＳＳ値との積によって規定する。平均の位置は、これらの積が平均位置を下回り、かつ、平均位置を上回り、これらが等しい場所である。つまり、図１Ｂで示す分画の表面は、２つの均等な部分に分割される。糖尿病患者の細胞が受けた微分後のＨｂＡ１ｃ値が上方又は下方に変化すると、分画内の平均ＦＬ４／ＳＳ値がそれぞれ上方又は下方に移動することになる。平均値を分画サイズで除算することにより、分画における平均値位置のそれぞれのシフトは、細胞年齢に依存しないので、糖尿病患者に関する分画の微分後のＨｂＡ１ｃ割合値を計算するのに使用できる。

患者サンプルの微分後のＨｂＡ１ｃ割合を、基準分画における平均値の位置と比較して、サンプル分画における平均値の位置から直接算出した。正確に計算するには、患者分画が基準分画と同じ大きさではないことを考慮に入れる必要がある。分画平均値がＦＬ４／ＳＳ軸上の分画限界の位置に依存するので、第１工程として、基準分画に対するサンプル分画の重なりを決定した。対応する分画、前の分画、及び次の分画のこれら重なりに関する計算結果を、表２Ａで示す。重ね合わせ後の分画を、値１（ｄ、ｅ、及びｆ列）によって表した。表２Ａで示す重なりを考慮に入れて、サンプル分画の平均の相対位置を計算した。表２Ｂのｎ列で示すように、重なりについての補正後のサンプル位置と基準位置の商を計算した。値１は、２つの位置の同一性を表す（表２Ｃ、ｏ列）。

対応する分画における平均値の相対位置を患者と基準との間で比較するために、１を減算することで、患者分画の平均の偏差を得た（表２Ｃ、ｐ列）。分画に関連する差分ＨｂＡ１ｃ割合又はグルコース濃度との線形関係を得るには、更に２つの補正を適用する必要があった。まず、上記の様に、図１Ｂで示される平均値は、等しい表面の２つの部分に分画を分割する。それ故、平均値の位置は、表面及びＨｂＡ１ｃ割合の増加を決定する関数の積分に依存する。この増加の関数は、知られていないが、この関数は、線形又は線形に近いものとすることを仮定する。この場合、平均の偏差は、微分後のＨｂＡ１ｃ割合又はグルコース濃度の２乗の関数である。逆に、基準に対する平均値の位置の偏差は、差分ＨｂＡ１ｃ値又はグルコース濃度の平方根に関連する（表２Ｃ、ｑ列）。上記の計算から、平均値の偏差と微分後のＨｂＡ１ｃ割合値の変化との間の関係がもたらされ、一定のグルコース濃度を受けたと想定される基準サンプルと糖尿病患者サンプルとを比較する。患者によって管理されたグルコース濃度の変動と微分後のＨｂＡ１ｃ割合の算出された変動との綿密な比較の後、定数（表２Ｃ、ｑ列）を最終計算結果で乗算して、グルコース濃度との最適一致を確認した。

かくして得られた係数は、基準に対するＨｂＡ１ｃ割合の導関数の増加又は減少を示す。サンプルのＨｂＡ１ｃ割合による乗算によって、分画の微分後のＨｂＡ１ｃ割合がもたらされる（表２Ｃ、ｒ列）。

表２Ｄで示すように、分画ごとに厳密な数の細胞について補正した後、時間区分を、実施例３のように１２０日の寿命をもたらす係数で乗算しないが、実施例７及び表２Ｅで概説した寿命係数で乗算した。算出後の時間は、分画の年齢を提供する。これで、分画に関する微分後のＨｂＡ１ｃ割合の時間曲線を構築可能となり、患者の血漿中で監視されたグルコース濃度と比較した（図６）。

以下の検討事項を、微分後のＨｂＡ１ｃ年齢曲線の計算で考慮した。分画限界について、以下の変更を使用した。最終分画Ｎ°１０の領域では、細胞イベントが極めて分散し、更に、汚染イベントも疑われた。このため、平均値及び表２Ｂで示される分画限界に入る前の差分から、この分画限界を推定した。

ＲＮＡ染色によって成熟赤血球とは異なる網状赤血球分画を、個別に分析した。殆どの成熟した網状赤血球の僅かな部分のみが、血中を循環した。それ故、網状赤血球分画の平均値が、実際には、分画限界と同じになる。時間軸を計算する際、平均値を分画限界として使用した。だが、微分後のＨｂＡ１ｃ割合を計算するには、これでは、分画内の平均のばらつきを測定できないはずである。最も高いＨｂＡ１ｃ網状赤血球が遠くまで広がるので、ＨｂＡ１ｃの中で最も高いこれらの網状赤血球の値の分画限界値を選択すると、比較的高い値がもたらされた。だが、この分画限界の選択は、ＨｂＡ１ｃ平均値の相対位置の変動を測定する上で有用であるように見えた（表２ｂ、ｋ列）。

分画内の平均値の相対位置は、分画サイズで除算した平均値であった。分画限界値が分画の平均値と比較して半分画前方であるので、時間スケール上で分画限界値及び分画平均値を同期化するために、分画の平均値を半分画前方にシフトした（表２Ｂ、ｉ列）。

（実施例６）
本実施例は、糖尿病患者サンプルに適用した予備時間スケールの構築を示す。

方法と結果
ＦＬ４／ＳＳ分画限界値を取得し、実施例１及び実施例３、５で記載のとおりに計算した。網状赤血球分画限界値ではなく、網状赤血球平均値を使用した。実施例３、５で概説したように、網状赤血球分画限界値は人為的に高かったので、分画値又はその付近とする。ＦＬ１補償及びバックグラウンドについて、分画限界値を補正した。

６人の健康な被験体の基準編集用の予備時間スケールを図３ｃおよびｄで示し、表１の様に計算した。分画を基準サンプルの分画と同様に導出、算出した糖尿病患者の時間スケールを決定する際のテンプレートとして、この予備時間スケールを使用した。図１ｂを構築するために使用した計算データを、基準サンプルと糖尿病患者サンプルとの間で比較した。比較は：Ａ、患者サンプルの各分画における厳密な細胞数と基準サンプルのそれぞれの分画における厳密な細胞数とを比較した。患者値を基準値で除算し、細胞の割合が時間と逆相関するという原理に従って、テンプレート時間値を得られた係数で除算した（この計算については、表２Ａを参照）。患者サンプルと基準サンプルとの間で、それぞれの分画のＦＬ４／ＳＳ軸上の分画長を比較した。この目的のため、図１ｂで示す隣接カットオフ値間の距離を、減算により測定した（表２Ｂを参照）。各分画につき、患者値を基準値で除算して、得られた係数でテンプレート時間値を乗算した（この計算については、表２Ｃを参照）。

上記の補正係数を網状赤血球分画に適用できないので、個別に分析した。だが、グルコース濃度と網状赤血球のＦＬ４／ＳＳ値とを比較する実験において、網状赤血球に起因する時間と成熟細胞の第１分画の時間との間には、相関があることが観測された。基準サンプルの網状赤血球の時間と基準サンプルの第１分画の時間との比を、患者サンプルに適用した。網状赤血球のヘモグロビン含有量に応じて、第２補正を実施した。低量のヘモグロビンは、時間のかかる網状赤血球の成熟と相関しており、それ故、以下の係数の除算；（基準サンプルの網状赤血球ヘモグロビン／患者サンプルの網状赤血球ヘモグロビン）^０．３によって、余分の時間を追加する必要があった（この計算では、表２Ｄを参照）。

分画年齢を算出するために、実施例３で示す計算と同様の時間計算を適用した。ＨｂＡ１ｃ割合導関数の変動が時間計算にどの様な影響をもたらすかを、図４で示した。上記計算は、ＨｂＡ１ｃ導関数の変動係数を提供し（表２Ｃ、ｒ列）、この係数で時間区分を除算した。基準の平均ＨｂＡ１ｃを使用して、補正後の患者サンプルのＦＬ４／ＳＳ値を正規化し、（表２Ｄ、ｗ列）で示すように、式（Ｉ）で処理した。

図４で概説したように、ＨｂＡ１ｃ割合値の差分の変動について、得られた値を補正した。図４は、他の健康な被験体の血糖濃度の一時的な上昇の影響のシミュレーションに関する図表記を提供する。（Ａ）；図３Ｂで表示され、かつ実施例３と表１で決定される健康な被験体のＨｂＡ１ｃ曲線；（Ｂ）；（Ａ）と同様であるが、血糖濃度が一時的に上昇する。（Ｃ）；（Ｂ）と同様であるが、実施例５及び表３で述べるように決定される。以下の４（ａ）で示すプロットにおいて、時間軸がＨｂＡ１ｃ割合値から導出されるので、％ＨｂＡ１ｃが一時的に上昇すると、％ＨｂＡ１ｃ軸及び時間軸４（ｂ）に影響するはずである。％ＨｂＡ１ｃの独立パラメータが必要とされるので、時間を補正でき、更に、％ＨｂＡ１ｃを個別に決定して、正確な表記４（ｃ）を得ることが可能である。

得られた時間スケールは、１００日の期間を与え、実施例３、図３Ｆで示される約１２０日の寿命を生成する。

（実施例７）
この実施例は、グルコース値及びグルコース依存ＨｂＡ１ｃ割合速度の調整を示す。

方法と結果
患者サンプルの時間軸の構築及びグルコース依存ＨｂＡ１ｃ速度値の計算後、本手順の妥当性を試験するための統計データを得た。患者サンプルのサイトメトリ処理の時間点を、各患者の自己監視グロコース測定のカレンダー上に示した。

図５では、ＦＬ４／ＳＳ軸及び「計数」軸上における分画の平均値の挙動が示されている。図５Ａでは、「計数」値が累積的であるので、領域Ａの表面は、領域Ｂの表面と等しい。分画のＦＬ４／ＳＳ軸の中間に値１が付与されていれば、平均値（ｍ）の投入は、

で与えられる。；式中、ａとｂは、図で示されるそれぞれのカットオフ値である。図５Ｂでは、ＦＬ４／ＳＳ値は、累積的ではない。図で見られるように、曲線が指数関数的に上昇又は下降する場合のみ、「計数」軸上の平均値（ｍ）を投入する。分画の「計数」軸の中間に値１が付与されていれば、平均値（ｍ）の投入は、１＋（逆正接（分画の平均ＦＬ４／ＳＳ値の第２導関数））／３．１４によって与えられる。

この実施例では、各事例の分画における平均値の位置は、グルコース依存ＨｂＡ１ｃ割合速度と一致して上昇及び下降することを示している。コンピュータは、平均値を数値計算し、幾何学的手段を用いて上記で計算したのと同様の方法で、平均値を分画に投入する。患者サンプルのＦＬ４／ＳＳ分画の長さについて基本テンプレートを補正すると、分画内の平均値の位置が元のままとなり、グルコース依存ＨｂＡ１ｃ速度と相関する値が生成される。基準と患者サンプル間の差が比較的小さいことにより、基準と患者サンプルのある分画における平均値の各位置間の線形関係を仮定することで、計算を簡略化した。

図３ｄでは、予備時間スケール上のグルコース依存ＨｂＡ１ｃ速度に関する図表記が示されている。値の計算は、表２Ａ、Ｂで図示され、表２Ｂのｋ列とｌ列で示されている。予備時間スケール（表１；ｋ列）を、表１；ｊ列から算出した。表１；ｊ列とｋ列は、「時間テンプレート」と予備時間スケールとして表２で示されている。実施例５で記載の各サンプルにつき、分画ごとの厳密な細胞数及び実施例５で記載の各分画により表される時間量の補正後、予備時間スケールを構築した。基準サンプルについては、各サンプルにおける分画の全時間量を、１１５日に維持した。

表１；ｉ列は、基準サンプルにおける分画のＨｂＡ１ｃ割合値の差分を示す（時間テンプレート）。基準サンプルと同様、各患者サンプルについて、これらの差分を計算した。ある患者サンプルに関する表２Ｅで示されるように、ＨｂＡ１ｃ割合値の差分の補正後予備時間スケールによる除算及び同じサンプルに関する全ＨｂＡ１ｃ割合値の補正によって、予備時間スケール上のグルコース依存ＨｂＡ１ｃ速度値がもたらされる。図３ｅで示すようにグルコース依存ＨｂＡ１ｃ速度を時間スケール上で表示するため、実施例３で記載の式を使用して、分画の時間値を変換した（この計算については、表２Ｆを参照）。患者サンプルが、更なる補正処理を必要とする寿命の重要な変動を示すことが明らかとされたことにより、患者サンプルでは、「実時間スケール」という語句をなお使用できない。

だが、全ての患者のグルコース及びグルコース依存ＨｂＡ１ｃ速度値の直接比較は、実施例４及び図５Ａで見られるグルコースとＨｂＡ１ｃ間の低い相関を受ける。正しく比較するために、患者の全平均グルコース値をサイトメトリアッセイから明らかとされた全ＨｂＡ１ｃ値で除算した（表２Ｃ、ｔ列）。更に、サンプルに起因する１２０日寿命に関する補正も、必要とされた。微分後のＨｂＡ１ｃ割合分布とグルコース監視分布との間の最適一致に基づいて、表２Ｄのａｄ列で適用された寿命係数を決定した。得られた個々の寿命は、患者間のばらつきを示した。これら２つの適合を適用した後、各時点付近の平均グルコース値と対応する時間点の微分後のＨｂＡ１ｃ割合との間の比較を行うことができる。得られた相関は、Ｒ^２が０．８であった（図５Ｂ）。個々の比較を、図６で示した。

結果の統計分析
図６で見られるように、グルコース依存ＨｂＡ１ｃ速度と患者の自己監視のグルコース値との間には、経時にわたる良好な一致がある。長期にわたる調査の後、比較により明らかとされた寿命係数は、網状赤血球に起因するパラメータと相関するように見られ、赤血球の破壊と赤血球形成との間のフィードバック機構を示唆している。この寿命係数は、網状赤血球のヘモグロビン含有量とＲＮＡ含有量との積に相当する。

しかし、実施例９で見られるように、２種類のデータを並べた後でのみ、データを統計的に解析できた。グルコースレベルとＨｂＡ１ｃ形成との不一致は、依然として議論の対象である（Ｈｕｄｓｏｎ等、Ａｎｎ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９年；ｖｏｌ．３６、４５１〜４５９）。図５で示すデータは、グルコースレベルの時間パターンとＨｂＡ１ｃ形成との間で見込まれる相関を、明瞭に示している。絶対レベルの相関だけは、不十分である。ＨｂＡ１ｃ反応／時間曲線が個体間で実質的に異なることが、理由であり得る。Ｍａｋｉｔａ、Ｚ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９２年、ｖｏｌ．２５８、ｐｐ６５１〜６５３で述べられるように、血中の酸化状態が、終末糖化産物の形成速度の変動を及ぼす可能性がある。

上記計算では、時間軸に適用した規定式
ｙ＝ｘ^１．２
を使用した。個々の場合において、指数値を変えると、グルコースレベルのパターンと経時にわたるグルコース依存ＨｂＡ１ｃ速度のパターンとの比較における更なる改善をもたらした。より高い値の指数を用いたパターンフィッティングによって、ＨｂＡ１ｃ割合値であれば平均グルコースレベルよりも低くなることが、示されるはずである。

平均細胞ヘモグロビン時間曲線。
分析分画において細胞年齢を決定すると、選択の赤血球パラメータに時間軸を適用できる。上記分析において、細胞年齢分画の平均細胞ヘモグロビンが決定された。図９では、これらの平均細胞ヘモグロビン曲線が示されている。通常、ヘモグロビンは、年齢が５日又は６日の細胞で最大レベルに達する。更に時間が経つと、報告の様に、細胞がヘモグロビンを遊離する（Ｇｉｆｆｏｒｄ等、Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．２００６年１１月；１３５（３）：３９５〜４０４）。患者サンプルでは、幾つかの異常なパターンが明らかとされた（患者７、及び、患者１０）。明らかなこととして、これらの異常なパターンは、高いレベルのＨｂＡ１ｃと関連していた。

血中に表れた細胞の割合。
図８で示すパターンから、元々形成されていた細胞がどれだけ血中に表れているかに関する感覚が得られる。この種の図は、分画で表され、かつ表れた細胞の割合の裏返しである時間量の関係の結果である。この種の曲線では、表れた細胞に関する１００％の値を規定する基準がない。それ故、曲線の最も高い点に、１００％の値を任意で割り当てた。

曲線の形状は、時間軸上の時間点の値に極めて依存する。これらの時間軸は、
時間軸ですでに適用されてきたＨｂＡ１ｃ反応／時間式：
ｙ＝ｘ^１．３
を使用して、構築した。この指数が以前に述べた患者間のばらつきを受ける可能性があるので、これらの曲線のパターンは、この様な指数の変動に従って僅かに異なる場合がある。

全ての場合において、この曲線は、曲線の最終部では、細胞死を示し、更に、曲線の最初の部分では、血中で新たに形成された赤血球のゆっくりとした出現を示す。成熟中、赤血球が骨髄から脾臓を通り、その後、血中に放出されることが一般に知られている。しかし、これに要する時間に関する情報が無い。我々の分析及び図８から、個体間における血中の赤血球の放出には、高いばらつきがあるように見える。

（実施例８）
本実施例は、患者サンプルの寿命係数の計算を示す。

方法と結果
実施例６で述べ、かつ表２で算出されたグルコース依存ＨｂＡ１ｃ割合速度と時間スケールに関する図表記を、実施例４の患者の自己監視により測定された登録済みグルコース値の図表記と比較した。グルコース値に関連するカレンダーを使用して、自己監視されたグルコース値の時間スケールを作成した。時間スケール上のグルコース分布及び算出された時間スケール上のグルコース依存ＨｂＡ１ｃ値を検証することで、２種類の測定値間には大きな一致があることが明らかとされた。２種類のパターン間の違いは、明らかに、患者サンプルの寿命のばらつきに起因している。実施例７で見られるように、患者ごとに、２種類のパターン間の最適な一致が得られるまで変動させた係数で、算出された時間スケール値を乗算した。各患者について、異なる係数が得られ、これら係数及び分かる限りの患者に関する種々のパラメータの間で、相関を求めた。

網状赤血球のＦＬ１値（ＲＮＡ含有量）の関数と側方散乱値（ヘモグロビン含有量）の関数の積を使って、最適な相関（図７；Ｒ^２＝０．９）が、明らかとされた（表２Ｅを参照）。

患者の赤血球寿命の算出
実施例８で記載のシミュレーション実験から、赤血球の寿命と網状赤血球に起因するパラメータとの間の相関が示された。最初に、これらのパラメータをサンプルの古い分画内で探したが、何も発見されなかった。網状赤血球の成熟中、ＲＮＡ成分は、徐々に消滅する一方、ヘモグロビン含有量が上昇して、最大となる。実施例８で示されるＲＮＡ含有量とヘモグロビン含有量との積の関数において、減少するＲＮＡと上昇するヘモグロビンは、互いに平衡となり、網状赤血球の成熟中、この関数の値は、一定を保つことになる。だが、ＲＮＡとヘモグロビンが共に低い場合、網状赤血球は、血液サンプルを抽出した時点の正常なヘモグロビンレベルに到達できない。実施例８の観測から、細網内皮系の赤血球の破壊と網状赤血球中のヘモグロビンの合成との間の関係が存在するものと、結論付けられ得る。鉄の再循環も、この様なフィードバック機構で重要な役割を担い得る。

（実施例９）
本実施例は、血中で表れた細胞の時間曲線を示す。

方法と結果
患者サンプルの時間軸の構築、グルコース依存ＨｂＡ１ｃ割合速度値の計算及び患者の赤血球の寿命値の適用を行った後、本手順の妥当性を検証するための統計データを取得した。患者サンプルのサイトメトリ処理の時間点を、各患者の自己監視グロコース測定のカレンダー上に示した。時間点について、過去の時間点までの時間の半分及び次の時間点までの時間の半分のグルコース測定値を収集して、その平均値を求めた。こうすることで、サイトメトリアッセイを用いて明らかとなった各患者の時間点ごとに、グルコース依存ＨｂＡ１ｃ割合速度と血糖濃度との間の比較が可能なった。しかし、患者カレンダーの時間を超えるような時間点及び利用できる計数値がない場合を、除いた。だが、全ての患者のグルコース及びグルコース依存ＨｂＡ１ｃ速度値の直接比較は（図５Ａ）、実施例４及び図４で見られるグルコースとＨｂＡ１ｃ間の低い相関を受ける。より適切に比較するために、患者の全平均グルコース値をサイトメトリアッセイから明らかとされた全ＨｂＡ１ｃ値で除算した。得られた係数を、各分析時間点のグルコース依存ＨｂＡ１ｃ割合速度で乗算し、これにより、より適切な比較が可能となった。得られた相関は、Ｒ^２が０．８であった（図５Ｂ）。個々の比較を、図６で示した。

式ＶＩＩＩから、各分画における細胞数（表２Ｄのｚ列）で乗算した年齢分画のサイズ（表２Ｄのａｃ列）の裏返しを取ることにより、細胞が短時間で血中に発現し、同時に、厳密に全ての細胞が死滅する理想モデル中の細胞数と比較して、どれだけの細胞を血中で回復できるかを導出可能である。経時にわたる細胞の割合を示す各患者に関する図が、図８で示されている。各系列で最も高い値を、１００％の基準点として採用した。

（実施例１０）
本実施例は、寿命、及び、平均年齢の推定を示す。

方法と結果
図８で示す循環中の細胞の表記によって、曲線をゼロ値まで外挿できる。このゼロ値の時間軸上の点は、血液中で最も古い細胞の年齢及び赤血球の寿命を反映する。図８で示す外挿は、分画１０の値の後の曲線の延長である。延長線が時間軸となす角度は、第９、第１０分画間の区間が時間軸となす角度の半分を取る。各分画の細胞数を分画年齢で乗算することで、平均年齢を計算する。これら乗算の総和を分析の赤血球の総数で除算する。表３は、図８、９で記載の基準サンプルと患者サンプルの推定寿命及び平均年齢をまとめている。

（実施例１１）
本実施例は、平均細胞ヘモグロビン含有量の時間曲線を示す。

方法と結果
患者血液の年齢曲線の時間点を使用して、グルコース依存ＨｂＡ１ｃ速度アッセイにおけるこれら時間点を確認した後、平均細胞ヘモグロビン時間曲線を構築できた。本調査の患者時間曲線を、図９で示す。

上記は本開示の例示であり、その限定として構成するものではない。本開示は、以下の特許請求の範囲により規定され、請求項の同等物も開示に含める。本明細書で参照される全ての参考文献及び文書を、参照により本明細書で援用する。

Claims (28)

1. 血液サンプルにおける赤血球集団の年齢構成を決定する方法であって、
   前記集団内の個々の赤血球それぞれのヘモグロビン及びＨｂＡ１ｃ含有量を測定する工程と、
   前記個々の赤血球それぞれの前記ＨｂＡ１ｃ含有量及び前記ヘモグロビン含有量から個々の細胞それぞれにおけるＨｂＡ１ｃの割合を決定する工程と、
   前記個々の細胞におけるＨｂＡ１ｃの前記割合と基準細胞分画のＨｂＡ１ｃの平均割合とを比較することによって、前記赤血球集団を複数の分画に分画する工程であって、各分画は実質的に等しい数の赤血球を含む工程と、
   各分画におけるＨｂＡ１ｃの平均割合を決定し、ＨｂＡ１ｃの前記平均割合を基準対照分画に関するＨｂＡ１ｃの平均割合と比較することによって、前記分画における前記赤血球の前記年齢を特定する工程と、を含む、方法。
2. 前記基準対照細胞の前記分画と比較して、特定のＨｂＡ１ｃ割合の分画に属する前記サンプル中の前記赤血球の密度を決定する工程を更に含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記基準対照細胞は平均年齢が少なくとも２８日である、請求項３に記載の方法。
4. 個々の赤血球それぞれの前記ヘモグロビンを側方散乱により測定する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. ＨｂＡ１ｃはＨｂＡ１ｃ又はその変種に特異的な検知可能に標識化された抗体を使用して測定される、請求項４に記載の方法。
6. 前記抗体は蛍光部分で標識化される、請求項５に記載の方法。
7. 前記個々の細胞のＲＮＡ含有量を測定する工程を更に含み、ＲＮＡの存在は前記細胞を網状赤血球として識別する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. ＲＮＡは色素に結合することで測定される、請求項７に記載の方法。
9. 前記色素はアクリジン・オレンジである、請求項８に記載の方法。
10. 前記基準細胞分画は既知の割合のＨｂＡ１ｃを有する細胞を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. データを各分画から収集する工程を更に含み、前記データは赤血球の厳密な数、前記網状赤血球分画の平均ＨｂＡ１ｃ、及び前記サンプル中の個々の赤血球それぞれに関する蛍光と側方散乱単位での各分画の値を含む、請求項１０に記載の方法。
12. 個々の細胞それぞれに関するＨｂＡ１ｃの前記割合は前記ＨｂＡ１ｃ含有量を前記細胞ヘモグロビン含有量で除算することで決定される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記赤血球集団の前記年齢構成が基準細胞集団の年齢構成と比べたとき、より大きい数の細胞を多く含むか否かを、疾患状態を示すとして判定する工程を更に含む、請求項１２に記載の方法。
14. 前記サンプル中の細胞の平均年齢を決定し、前記平均年齢と正常対照サンプルの平均年齢とを比較する工程を更に含み、前記平均年齢の差は疾患又は疾患の状態を示す、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記疾患は糖尿病である、請求項１４に記載の方法。
16. 特定の年齢を有する前記サンプルの分画の平均細胞ヘモグロビン含有量を決定する工程と、異なる年齢の分画において前記平均細胞ヘモグロビン含有量に差があるか否かを判定する工程とを更に含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記差は貧血、出血、又は輸血を示す、請求項１６に記載の方法。
18. 赤血球集団の年齢を決定するシステムであって、個々の赤血球の側方散乱及び蛍光の検出器と、前記個々の赤血球の少なくとも１つの波長での前記測定された蛍光及び前記測定された側方散乱からのＨｂＡ１ｃ含有量割合の計算器と、基準対照分画のＨｂＡ１ｃの平均割合を使用する、前記赤血球集団の複数の分画への分割器であって、各分画は実質的に等しい数の赤血球を含む分割器と、各サンプルの寿命係数の計算器と、前記サンプルの前記分画の年齢の計算器と、を含む、システム。
19. 前記サンプルの平均年齢の計算器を更に含み、前記サンプルの前記平均年齢を正常対照サンプルの平均年齢と比較する、請求項１８に記載のシステム。
20. ある年齢の細胞の平均細胞ヘモグロビンの計算器を更に含み、前記平均細胞ヘモグロビンが前記細胞の前記年齢に応じて変化するか否かを判定する、請求項１８又は請求項１９に記載のシステム。
21. 方法の工程を実施するための命令を含む非一時的コンピュータ可読媒体を備えるシステムであって、前記方法は、サンプル中の個々の赤血球それぞれのヘモグロビン、ＨｂＡ１ｃ、及びＲＮＡ含有量を決定する工程と、前記個々の赤血球それぞれの前記ＨｂＡ１ｃ含有量及び前記ヘモグロビン含有量から個々の細胞それぞれにおけるＨｂＡ１ｃの割合を決定する工程と、前記個々の細胞におけるＨｂＡ１ｃの前記割合と前記サンプルにおける基準細胞分画のＨｂＡ１ｃの平均割合とを比較することによって、前記赤血球集団を複数の分画に分画する工程であって、各分画は実質的に等しい数の赤血球を含む工程と、各分画におけるＨｂＡ１ｃの平均割合を決定し、ＨｂＡ１ｃの前記平均割合を基準対照分画に関するＨｂＡ１ｃの平均割合と比較することによって、前記分画における前記赤血球の前記年齢を識別する工程とを含む、システム。
22. 平均年齢が２８日の前記基準対照分画と比較したとき、特定のＨｂＡ１ｃ割合の分画に属する前記サンプル中の前記赤血球の密度を決定する工程を更に含む、請求項２１に記載のシステム。
23. サンプル中の赤血球集団の年齢構成を決定するキットであって、ａ）ＨｂＡ１Ｃ又はその変種と特異的に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントと、ｂ）ＲＮＡと特異的に結合する色素と、ｃ）赤血球基準対照のサンプルと、を含む、キット。
24. 前記赤血球基準対照の分画は既知の割合のＨｂＡ１Ｃを含む、請求項２３に記載のキット。
25. 前記抗体又は抗原結合フラグメントは検出可能に標識化される、請求項２３〜２４のいずれか一項に記載のキット。
26. 前記標識は蛍光標識である、請求項２５に記載のキット。
27. ＲＮＡと特異的に結合する前記色素はアクリジン・オレンジである、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載のキット。
28. 命令を格納する非一時的コンピュータ可読媒体を更に含み、前記命令はコンピュータ装置によって実行された時、前記コンピュータ装置に対して、サンプル中の前記個々の赤血球それぞれのヘモグロビン、ＨｂＡ１ｃ、及びＲＮＡ含有量を決定する工程と、前記個々の赤血球のそれぞれの前記ＨｂＡ１ｃ含有量及び前記ヘモグロビン含有量から前記個々の細胞それぞれにおけるＨｂＡ１ｃの割合を決定する工程と、前記個々の細胞におけるＨｂＡ１ｃの前記割合と前記サンプルにおける基準細胞分画のＨｂＡ１ｃの平均割合とを比較することで、前記赤血球集団を複数の分画に分画する工程であって、各分画は実質的に等しい数の赤血球を含む工程と、各分画におけるＨｂＡ１ｃの平均割合を決定し、ＨｂＡ１ｃの前記平均割合を基準対照分画に関するＨｂＡ１ｃの平均割合と比較することによって、前記分画における前記赤血球の前記年齢を識別する工程と、を実行させる、請求項２７に記載のキット。