CN112964807B - 乙肝慢加急性肝衰竭预后的代谢标记物及其筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种乙肝慢加急性肝衰竭预后的代谢标记物及其筛选方法。1)收集HBV‑ACLF血清标本，2)运用超高效液相色谱质谱联用技术（UPLC‑MS）检测血清样本的代谢组，3)比较健康对照，慢乙肝患者患者肝组织中的代谢组，分析处理数据，获得HBV‑ACLF生物标记物，4)从步骤3)所述的HBV‑ACLF生物标记物中确定死亡风险的生物标记物。基于患者临床数据和代谢组学的乙肝慢加急性肝衰竭预后的代谢标记物，为Gamma‑Linolenic acid和Glutamylphenylalanine。

Description

乙肝慢加急性肝衰竭预后的代谢标记物及其筛选方法
技术领域
本发明涉及血液中乙肝慢加急性肝衰竭预后的代谢标记物及其筛选方法。
背景技术
慢加急性肝衰竭 (acute-on-chronic liver failure，ACLF) 是一种以肝功能急性损害，炎症和多器官衰竭为主要表现的临床综合征，其病情发展迅速，短期死亡率高。全世界约3.5亿人感染乙肝病毒 (hepatitis B virus， HBV)，是ACLF主要病因之一。而在我国乃至大多数亚太地区，HBV是ACLF最主要的病因，70%以上ACLF患者由HBV感染所致。因此，HBV-ACLF给世界尤其是亚太地区带来沉重的卫生健康负担。但目前，对于HBV-ACLF的诊治还缺乏可靠的预后标志物，常用的预后模型，包括终末期肝病模型 (the model for endstage liver disease， MELD)，欧洲慢性肝衰竭研究协会 (the European Associationfor the Study of Chronic Liver Failure CLIF) 推出的 CLIF-C ACLF模型等，对HBV-ACLF患者预后预测价值均存在争议。
代谢组学是继基因组学、转录组学、蛋白质组学之后新兴发展的一门学科，其研究对象是相对分子质量在1000以内的小分子物质，这些物质在细胞信号释放、能量传递和细胞间通信发挥重要的调控作用。其中液相色谱质谱联用仪(Liquid Chromatography-MassSpectrometry，LC-MS ) 用于检测难以衍生化、不易挥发、分子量较大的物质，其样品前处理比较简单，检测快速，灵敏度高，广泛用于代谢物的检测。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供乙肝慢加急性肝衰竭预后的代谢标记物及其筛选方法。
一种基于患者临床数据和代谢学的乙肝慢加急性肝衰竭预后的代谢标记物筛选方法，包括下列步骤：
1) 收集血清标本，包括健康对照、慢乙肝患者以及HBV-ACLF血清标本；
2) 运用UPLC-MS代谢组学技术检测肝组织样本的代谢组；
3) 比较健康对照、慢乙肝患者血清中的代谢组，分析处理数据，获得HBV-ACLF生物标记物；步骤3)包括：
（A）将UPLC-MS的原始数据导入MetaboScape 3.0软件进行峰校正、峰提取、去卷积、峰对齐等处理，其中在一次峰提取的基础上降低阈值进行二次峰提取，以增加特征峰覆盖范围，相关参数设置如下：采用甲酸钠（Na Formate pos /Na Formate neg）进行质量轴校正；基于峰面积进行峰提取，质荷比范围在50-1000，峰强度阈值为1000，每个特征峰至少包含有7个采集数据点，二次峰提取时至少包含3个采集数据点；保留在50%以上样本中出现的特征峰为有效特征峰；提取离子去卷积阈值为0.8。将数据矩阵导入MetaboAnalyst 4.0，缺失值用最小平均值的一半代替，采用峰面积进行归一化再乘以100得到最终的数据矩阵用于后续统计分析；
(B) 将数据矩阵导入SIMCA+P 14.1(Umerics AB, Umea, Sweden)软件进行正交偏最小二乘法判别分析(Orthogonal Partial Least Squares DiscriminationAnalysis, OPLS-DA)，根据VIP＞1，P＜0.05以及倍数>1.2 筛选特征离子峰；
（C）对于提取得到的特征峰，以精确质量数、保留时间和二级质谱碎片离子作为定性依据，通过和本地数据库Bruker HMDB Metabolite Library 2.0、Bruker MetaboBASEPersonal Library 的MS/MS谱图比对及与HMDB(http://hmdb.ca/)、MycompoundID(http://www.mycompoundid.org/mycompoundid_IsoMS/)等网络数据库的MS谱图比对，鉴定代谢物；对于磷脂类物质、胆汁酸和氨基酸则通过标准品比对的方式进行确证；
4)从步骤3) 所述的HBV-ACLF生物标记物中确定乙肝慢加急性肝衰竭预后的代谢标记物。
步骤（4）包括：（A）收集HBV-ACLF患者临床资料，包括入院检验及检查数据，并发症情况；将患者根据30天是否存活分为生存组和死亡组；
（B）采用SPSS 22.0软件，利用logistic回归分析，结合临床资料及筛选出的代谢标记物，建立预测HBV-ACLF患者30天是否死亡的预后预测模型；
（C）采用SPSS 22.0软件，计算不同预后模型，包括Child-Pugh，MELD，CLIF-CACLF，COSSH，HINT的ROC曲线及曲线下面积，并与新建立的模型进行比较。
步骤1) 血清标本包括35例正常对照 (normal control，NC) 的供肝，48例慢乙肝(chronic hepatitis B，CHB)，和215例HBV-ACLF患者的肝组织。
步骤3)所述的HBV-ACLF生物标记物为42个，分别为：
L-Phenylalanine 、D-Proline 、L-Methionine 、L-Tryptophan 、L-Glutamine 、L-Acetylcarnitine 、L-Carnitine 、L-Octanoylcarnitine 、Decanoylcarnitine 、9-Decenoylcarnitine 、12-Ketodeoxycholic acid 、Bilirubin 、Biliverdin 、Tauroursodeoxycholic acid 、Ursocholic acid 、Glycocholic acid 、Glutamylphenylalanine 、gamma-Glutamylmethionine 、Phenylalanylphenylalanine 、Isoleucylproline 、gamma-Glutamyltyrosine 、Gamma-Linolenic acid 、15,16-DiHODE、3-Oxotetradecanoic acid 、12,13-DHOME 、2-Hydroxyhexadecanoic acid 、Eicosadienoic acid 、Docosapentaenoic acid (22n-6) 、15(S)-Hydroxyeicosatrienoic acid 、Hexadecanedioic acid 、Palmitoleic acid 、11Z-Eicosenoic acid 、LysoPC(16:0) 、LysoPC(18:2(9Z,12Z)) 、LysoPC(18:0) 、LysoPC(18:1(9Z)) 、LysoPC(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z)) 、LysoPC(16:1(9Z)/0:0) 、LysoPE(18:2(9Z,12Z)/0:0) 、LysoPE(0:0/18:1(9Z)) 、PC(20:3(8Z,11Z,14Z)/16:0) 、LysoPE(20:0/0:0)。
步骤4) 所述的乙肝慢加急性肝衰竭预后的代谢标记物包括以下的一个或者多个：Gamma-Linolenic acid和Glutamylphenylalanine。
步骤4) 所述的乙肝慢加急性肝衰竭预后的代谢标记物为Gamma-Linolenic acid和Glutamylphenylalanine。
基于患者临床数据和代谢组学的乙肝慢加急性肝衰竭预后的代谢标记物，所述的代谢标记物为Gamma-Linolenic acid和Glutamylphenylalanine。
本发明的有益效果：通过血清代谢组学筛选HBV-ACLF差异表达代谢物，分析不同疾病严重程度的HBV-ACLF患者血清代谢谱差异，筛选出与病情严重程度相关的代谢物，分析其代谢通路变化，阐释其相应的生理意义，探索HBV-ACLF的病理生理机制。然后筛选出HBV-ACLF新型预后标志物，并联合患者临床数据，通过logistic回归模型建立HBV-ACLF短期预后模型，从而为临床HBV-ACLF的管理和决策提供科学指导。
附图说明
图１是基于患者临床数据和代谢组学的乙肝慢加急性肝衰竭预后的代谢标记物筛选流程图。
图2是入院时Gamma-Linolenic acid和Glutamylphenylalanine在和HBV-ACLF预后的关系图。
图3是推导组和验证组不同预后模型的ROC曲线比较图；
图中各部分分别是：A、推导队列中各评分预测HBV-ACLF患者30天结局的ROC曲线比较；B、验证集中各评分预测 HBV ACLF 30 天结局的 ROC 曲线比较。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步阐述。
本发明的目的是运用代谢组学筛选与HBV-ACLF预后相关的代谢标记物，并与患者临床数据相结合，建立一种可用于预测HBV-ACLF患者预后的预测模型，建立模型的基本数据包括病人的基本信息、完整的临床检验信息，血清代谢组学学数据。
基于患者临床数据和代谢组学的乙肝慢加急性肝衰竭预后的代谢标记物筛选过程如图1，主要包括以下几个步骤：
收集血清标本，包括35例正常对照 (normal control，NC) 的供肝，48例慢乙肝(chronic hepatitis B， CHB)，和215例HBV-ACLF患者，运用UPLC-MS代谢组学技术检测血清样本的代谢组中的差异代谢物。
我们将HBV-ACLF分为生存组（ACLF-S）和死亡组（ACLF-D），在SIMCA+P软件中建立OPLS-DA模型对两组进行差异分析，根据VIP＞1和S-Plot图，在正离子模式下筛选出差异特征离子有295个，在负离子模式有188个；然后根据p＜0.05和FC>1.2筛选条件挑选出245个特征离子。最终根据二级质谱和标准品比对共鉴定出42个代谢物（如表1）。
Metabolites VIP值 RT M/Z Adduct Delta (ppm) Adduct (MZ) FC <i>p </i>
L-Phenylalanine 3.87 3.44 166.0865 [M+H]+ 2 166.0863 1.26 0.005
D-Proline 3.08 0.96 116.0707 [M+H]+ 1 116.0706 1.56 ＜0.001
L-Methionine 2.91 1.38 150.0584 [M+H]+ 1 150.0583 1.96 0.002
L-Tryptophan 1.19 4.33 203.0828 [M-H]- 1 203.0826 0.79 0.015
L-Glutamine 1.06 7.93 145.0619 [M-H]- 0 145.0619 1.65 ＜0.001
L-Acetylcarnitine 4.1 1.01 204.1233 [M+H]+ 1 204.123 1.72 ＜0.001
L-Carnitine 1.63 0.92 162.1126 [M+H]+ 1 162.1125 1.63 ＜0.001
L-Octanoylcarnitine 1.48 7.37 288.2174 [M+H]+ 2 288.2169 2.19 ＜0.001
Decanoylcarnitine 1.47 8.56 316.2487 [M+H]+ 1 316.2482 1.92 0.007
9-Decenoylcarnitine 1.21 8.06 314.233 [M+H]+ 2 314.2326 1.58 0.006
12-Ketodeoxycholic acid 1.56 10.39 373.2742 [M+H-H2O]+ 0 373.2743 3.89 ＜0.001
Bilirubin 1.53 12.95 585.2706 [M+H]+ 0 585.2708 1.27 0.017
Biliverdin 1.38 12.5 583.2561 [M+H]+ 2 583.2551 1.69 0.005
Tauroursodeoxycholic acid 5.6 9.14 498.2899 [M-H]- 1 498.2895 0.46 0.006
Ursocholic acid 1.93 10.39 407.2809 [M-H]- 1 407.2803 2.74 0.007
Glycocholic acid 1.24 10.19 464.3022 [M-H]- 1 464.3018 1.66 0.038
Glutamylphenylalanine 1.46 5.11 295.1291 [M+H]+ 1 295.1288 2.59 ＜0.001
gamma-Glutamylmethionine 1.98 3.33 279.1012 [M+H]+ 1 279.1009 2.21 ＜0.001
Phenylalanylphenylalanine 1.58 6.14 313.1551 [M+H]+ 1 313.1547 0.46 ＜0.001
Isoleucylproline 1.53 1.1 229.1549 [M+H]+ 1 229.1547 2.08 0.001
gamma-Glutamyltyrosine 1.06 3.64 311.1242 [M+H]+ 1 311.1238 2.17 ＜0.001
Gamma-Linolenic acid 2.09 12.17 279.2323 [M+H]+ 2 279.2319 1.37 0.017
15,16-DiHODE 2.04 11.14 335.2198 [M+Na]+ 1 335.2193 2.46 0.002
3-Oxotetradecanoic acid 1.82 10.91 241.1813 [M-H]- 1 241.1809 1.7 0.002
12,13-DHOME 1.76 11.46 313.2388 [M-H]- 1 313.2388 2.58 0.005
2-Hydroxyhexadecanoic acid 1.73 12.17 271.2283 [M-H]- 1 271.2279 1.2 0.011
Eicosadienoic acid 1.69 13.04 307.2647 [M-H]- 1 307.2643 1.3 0.014
Docosapentaenoic acid (22n-6) 1.35 12.56 329.2491 [M-H]- 1 329.2486 1.32 0.007
15(S)-Hydroxyeicosatrienoic acid 1.27 12.02 321.244 [M-H]- 1 321.2435 2.17 ＜0.001
Hexadecanedioic acid 1.05 10.8 287.222 [M+H]+ 1 287.2217 1.83 0.002
Palmitoleic acid 2.4 12.3 253.2177 [M-H]- 1 253.2173 1.25 0.01
11Z-Eicosenoic acid 2.28 13.5 309.2804 [M-H]- 1 309.2799 1.45 0.001
LysoPC(16:0) 5.92 12.02 496.3405 [M+H]+ 1 496.3398 0.74 ＜0.001
LysoPC(18:2(9Z,12Z)) 4.93 11.77 520.3405 [M+H]+ 2 520.3398 0.71 0.001
LysoPC(18:0) 4.53 12.55 524.3719 [M+H]+ 2 524.3711 0.74 0.004
LysoPC(18:1(9Z)) 3.95 12.13 522.3563 [M+H]+ 2 522.3554 0.76 0.007
LysoPC(20:4(5Z,8Z,11Z,14Z)) 1.81 11.72 544.3404 [M+H]+ 1 544.3398 0.7 0.003
LysoPC(16:1(9Z)/0:0) 1.52 11.55 494.3249 [M+H]+ 2 494.3241 0.68 0.011
LysoPE(18:2(9Z,12Z)/0:0) 1.35 11.79 478.2935 [M+H]+ 1 478.2928 0.66 0.001
LysoPE(0:0/18:1(9Z)) 1.03 12.15 480.3093 [M+H]+ 2 480.3085 0.7 0.001
PC(20:3(8Z,11Z,14Z)/16:0) 2.04 16.62 784.5858 [M+H]+ 1 784.5851 0.66 0.04
LysoPE(20:0/0:0) 1.02 12.29 510.3564 [M+H]+ 2 510.3564 0.68 0.022
采用SPSS 22.0软件，利用logistic回归分析，结合临床资料及筛选出的代谢标记物，筛选出与HBV-ACLF患者预后最为相关的两个代谢物，即γ-亚麻酸（Gamma-Linolenicacid）和谷氨酰苯丙氨酸（Glutamylphenylalanine）。
纳入前瞻性HBV-ACLF队列（n=n=90）作为验证队列，对γ-亚麻酸（Gamma-Linolenic acid）和谷氨酰苯丙氨酸（Glutamylphenylalanine）进行验证。如图2所示，将γ-亚麻酸（Gamma-Linolenic acid）和谷氨酰苯丙氨酸（Glutamylphenylalanine）在生存组和死亡组中的相对峰强度作图，该两种物质在死亡组中相对峰强度显著升高。
通过多因素logistic回归建立并评估新的HBV-ACLF预后评分。
自建模型：“GBITL”，公式为： =1.382×lg[Glutamylphenylalanine]+0.513×BUN+1.453×INR+0.007×TB+2.349×lg[Gamma-Linolenic acid]GBITL评分预测 HBV-ACLF患者30天生存结局的效能优于Child-Pugh评分， MELD评分， CLIF-C ACLF评分及COSSH评分，ROC曲线比较见图3A部分。
纳入多中心前瞻性HBV-ACLF队列（n=90）作为验证队列，对GBITL进行独立的临床验证，结果显示，GBITL在验证队列中的预测效能高于其他模型，结果与推导队列相似，具体ROC曲线比较见图3B部分。

Claims (1)

1.代谢标记物Gamma-Linolenic acid和Glutamylphenylalanine在制备乙肝慢加急性肝衰竭预后的药物中的用途。
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