KR20080049821A - 비타민 ｅ-관련 대사산물의 측정에 의한 결장암 및난소암의 진단방법 - Google Patents

비타민 ｅ-관련 대사산물의 측정에 의한 결장암 및난소암의 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 결장암 및 난소암(각각 CRC 및 OC)의 진단방법에 관한 것이다. 본 발명은 내재적인 저분자들과 CRC또는 OC사이의 관계성을 설명한다. 특히 본 발명은 비타민 E 이성질체 및 관련 대사산물들을 측정하여 CRC 및 OC의 진단방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 방법에서 동정된 진단 표지자에 관한 것이다. 본 발명은 잠재적인 및 CRC의 증상 전 단계, CRC의 초기 검출, CRC 및 OC 건강상태에서의 치료효과를 모니터링 하고 진단하는 것에 관한 것이다.

Description

비타민 Ｅ-관련 대사산물의 측정에 의한 결장암 및 난소암의 진단방법{METHOD FOR THE DIAGNOSIS OF COLORECTAL CANCER AND OVARIAN CANCER BY THE MEASUREMENT OF VITAMIN E-RELATED METABOLITES}
[0001] 본 발명은 결장암 및 난소암(이하, CRC 및 OC로 각각 표기됨)의 진단에 관한 것이다. 본 발명은 내재성 저분자들과 CRC 또는 OC 간의 상관관계를 나타낸다. 특히, 본 발명은 비타민 E-관련 대사산물들의 측정을 통하여 CRC 및 OR의 진단에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 방법에서 동정된 진단 마커에 관한 것이다.
[0002] 결장암은 세계적으로 세 번째로 자주 발생되는 악성종양이며, 전세계의 암 발병율의 약 10%에 해당한다[I]. 전 세계 인구가 노화되어감에 따라, CRC는 이 질병의 발병을 최소화시킬 수 있는 새로운 대처를 요구하는 심각한 공중보건문제를 나타낸다. CRC의 생존의 기회는 진단시의 이 질병의 단계와 밀접하게 연관된다(표 1 참조;http://www.alternative-cancer-treatments.com/colon-cancer-prognosis.htm); 초기 진단에서 생존 가능성이 높음. 예를들어, 이 질병의 타임프레임(듀크의 단계 D)에서 말기로 진단받을 경우 5년간 생존기회는 5% 이하이며, 초 기(듀크의 단계 A)로 진단받을 경우에 5년간의 생존기회는 90%이상이다. 그러므로, 초기의 외과적 치료 효능성 때문에 CRC 환자들은 초기 발견이 크게 이로울 것이다.
[0003] 현재, CRC의 위험인자는 잘 알려지지 않았다. 사실상, 음식을 제외한 소수의 특이적인 위험인자들이 이 질병에 대하여 확립되었다. 염증성 장 질환(Inflammatory bowel disease : IBD) 및 가족성 선종성 용종증(Familial Adenomatous Polyposis; FAP)의 위험율은 증가하지만 전체 CRC 발병율은 여전히 매우 작은 비율로 평가되고있다. 민족 및 인종적 차이는, 이민자 연구와 마찬가지로, 환경적 요인이 병인학에서 역할을 함이 제시되는데, 이민자들과 그들의 자손들 간의 발병율이 쉽게 상승되어 이민국의 발병율에 도달하게되기 때문이다 [2, 3]. 결국, CRC 경우의 15% 미만이 가족성이며, 음식, 환경 및 생활양식이 질병의 병인학에서 많은 요인을 차지함을 제시하고 있다.
[0004] CRC에 대한 가장 일반적인 통상의 검색방법은: 1) 대변잠혈검사(the fecal occult blood test; FOBT)로, 상기 검사는 암이 (혈관까지 침윤되어) 출혈된다는 가정에 기초하였으며, 그러므로 화학 또는 면역학적 분석 기술로 (암을) 검색할 수 있다;및 2) 육안적 이상을 확인하는 침윤법이다. FOBT는 CRC에 사용되는 가장 널리 보급된 통상적인 검사방법이며, 헤모글로빈에서 헴의 퍼옥시다아제-유사 활성에 대한 투박한 검사방법을 포함한다. 그러나, 검사에 대한 민감성은 단지 약 50%이며, 선종(아데노마)에 대해서는 20% 민감성을 가지며 모두 선종과 CRC 출혈이 다 해당되는 것은 아니라는 사실에 기인한다[2].
[0005] 육안적 이상을 확인하는 방법은 이중조영 바륨 관장술 및 가상 결장경 검사법 뿐만 아니라, 요곡성 s상 결장경 검사법 및 결장경 검사법을 포함할 수 있다. 결장경 검사법은 양성 FOBT, 및, 80% 위양성율(가짜양성비율)을 가진 환자의 2차 검사로, 많은 사람들에게 불필요한 위해성과 위험성을 준다. 결장경 검사법은 일반적으로 CRC 병력 또는 과거에 선종성 용종이 있거나 염증성 장질환과 같은 다른 소인성 질환을 가진 50세 이상의 평균적인 및 증가된 위험율을 가진 개체를 검색하기 위한 우선적인 방법이다. 평균 위험 집단에서 대장내시경 단독을 사용한 검사가 발병율과 사망률을 감소시킨다는 증거는 없다[3]. 그러나, s상 결장경 검사법과 상기 기술의 조합을 포함하는 관련 평가는 주어진 시간 이상의 고 위험율을 가진 개체들의 예상되는 CRC 율을 감소시킬 수 있다[4].
[0006] 비록 결장경 검사법이 여전히 용종과 CRC의 유무를 알아보는 표준 검사라 할지라도, 이 검사법은 직경 1cm 이상의 병소의 15%는 (검색하지 못하고) 놓칠 수 있다[5]. 결장경 검사법에 의한 합병증은 천공, 출혈, 호흡기능저하, 부정맥 및 감염을 포함할 수 있다[6]. 약 1000명 중 1명의 환자는 천공으로 고통 받으며, 1000명 중 3명은 출혈을 경험한다. 검사과정의 결과로서, 10,000명의 검사자 중 1명 내지 3명은 죽는다[3]. 숙련자의 부족, 환자의 불안, 및 값비싼 비용과 같은 다른 불이익은 결장경 검사가 일반인들을 위한 일반적인 CRC 검색방법이 되는 것을 방지할 것이다(표 2 참조). 대부분의 산발성 CRC들은 양성 선종으로부터 발달된 것으로 생각되며, 소수의 선종은 심지어 악성 종양으로 발달 될 수 있다. 양성 선종으로부터 악성종양으로 발전하는데 걸리는 시간은 5년에서 10년이라고 가정 하면, 결장경 검사법/s상 결장경 검사법에 의한 대중의 선종의 검출법은, 값비싸며 잠재적으로 해가 되는 엄청난 과다치료를 요구할 것이다 [7].
[0007] 전산화 단층촬영 대장내시경(CTC) 또는 가상 결장경 검사는 대장을 영상화하는 최신의 비-침입적인 기술로서, 검사의 운행 특성에 극적으로 변화한다는 보고(39% 내지 94% 의 특이성)가 있었으며, 이는 환자 (시료)준비의 기술적 차이 및 분석에 사용된 하드웨어와 소프트웨어에서 주로 비롯된다. CTC의 다른 한계점은 높은 가짜-양성 결과, 편평선종의 검출 불가능, 용종의 제거 불능, 반복적이고 점증적인 방사선 복용 및 값비싼 비용을 포함한다[6].
[0008] CRC의 분자적 병리학의 이해와 발전에 있어, 분변 시료의 DNA 분석에 기초한 몇몇 새로운 검색방법이 알려져 왔다. 이 검색법은 전형적인 PCR에 근간을 둔 분석법으로, 선종 간 종양서열 또는 가족성 CRC에서 발생하는, 알려진 돌연변이의 동정에서 사용된 방법이다. 대개 검색된 유전자 돌연변이는 현미부수체 불안정성 및 고메틸화 DNA 검사법뿐만 아니라, KRAS, TP53 및 APC를 포함한다. 표 2는 Davies 등[7]이 제공한 것으로, 최신의 CRC 검색 방법을 비교한 것이다.
[0009] 상기에서 기술한 모든 방법은 전형적으로 선종이 형성된 후에만 CRC를 검출가능한 방법이며, 일반적으로 대규모 집단 검색법으로 이상적이지는 않다. 상기 검사법 중 어떤 것도 CRC-양성 또는 음성을 촉진시키는 환경에 대한 정량적인 평가는 제공하지 못한다. 상기 검사법 중 어떤 검사도 정상인의 생화학적 및 관련 보건상태에서 CRC의 영향에 대한 정량적인 평가를 제공하지 못한다. 게놈에 기초한 검사는 산발적인 CRC 진단에 대하여 높은 정확성을 보일지는 두고 봐야 한다. Davies 등[7]은 다음과 같이 이상적인 CRC 검색 방법의 아웃트 라인을 만들었다: 1) 경제성; 2) 간단성; 3) 비-침입적인; 4) 대장 전체에 해당될 것; 5) 결과에 대한 해석이 애매하지 않을 것( 다시 말해 높은 민감성, 특이성, 양성 예견 값 및 음성 예견 값에 대한 해석); 6) 훈련시키기 쉬울 것; 및 7) 품질관리를 유지하기 쉬울 것.
[0010] 혈청의 저분자들 또는 대사산물들에 기초한 한 분석검사는 상기 기준을 충족시키는데 특이적인 대사산물들을 검출가능한 검사의 개발이 비교적 간단하고 검사 당 비용도 효율적이기 때문이다. 상기 검사는 침입을 최소화할 수 있을 것이며, 대장의 근접성과 관계없이 질환의 상태를 예견할 수 있을 것이다. 일반적인 임상 화학 실험실의 하드웨어와 호환 가능한 임상검사로 방법을 변환하면 상업적으로 수용가능하며 효과적일 것이며, 전 세계로 빠르게 전파될 것이다. 더군다나, 상기 검사를 운행하고 제어할 매우 훈련된 사람들(숙련자)에 대한 요구는 필요성이 없어질 것이다.
[0011] 사람의 혈청의 CRC-특이적인 생물 표지자들은 CRC, CRC-촉진 또는 저해환경, CRC의 생리적 부담감에 대한 검사에 제공될 수 있으며, 또는 상기의 특성들의 조합이 CRC의 위험율, 예방 및 치료에 극히 이로울 수 있다. 이 생물 표지자들을 측정하기 위해 고안된 한 검사는 침윤의 최소화 때문에 일반인에게 널리 적용되고 있으며, 전통적인 검색방법으로 재분류하기 전에 또는 이와 혼용하여 질병에 대한 개인적인 민감성의 모니터에 사용될 수 있다.
[0012] 난소암은 여성의 암 사망률의 5번째에 해당한다[8]. 올해의 새로운 난소암의 환자는 22,000명 이상이 추정되며, 미국의 경우에만 사망인원이 16,210명으로 예견되었다[9]. 난소암은 전형적으로 단계 III 또는 단계 IV에 이를 때까지도 확인되지 않으며, 예후도 매우 약하다( 5년 생존율이 약 25-30%)[10]. 난소암의 일반적인 검색 과정은 양수골반검사, 질식 초음파검사 및 혈청 CA125 측정을 혼용하여 사용된다[9]. 난소암에 대한 이 검색 과정의 효능성은 현재 이점이 잘 알려져 있지않는데, 이는 이 검색이 사망률을 감소시킨다는 증거가 부족하고, 가짜 양성 결과와 관련하여 위험율에 대한 정확성이 불충분하기 때문이다[8, 11]. 미국 암 협회에 따르면, CA125 측정 및 질식초음파는 난소암의 검사법 또는 진단검사로 신뢰성이 높지 않으며, 확실한 진단이 가능한 현재 방법은 단지 외과적 방법뿐이다(http://www.cancer.org).
[0013] 암 항원-125인 CA125는 고분자량의 뮤신으로, 대부분의 난소암세포는 정상세포와 비교하여 증가되어 발견되어 진다[9]. CA125 검사는 일반적으로 30-35U/ml 이상일 때 증가된 수준으로 인식된다[9]. 난소암에 대한 CA125 검색은 정확성, 민감성 및 특이성을 확립하는데 어려움이 있어 왔는데, 이는 증가된 CA125, 검사된 환자 그룹에서의 다양한 크기 및 환자의 나이와 민족성의 넓은 범위를 한정하는데 대한 어려움 때문이다[8]. 존 홉킨스 대학의 병리학 웹사이트에 따르면, CA125 검사법은 개략적으로 단계 I 환자의 50% 및 단계 II, III, IV 환자의 80% 난소암의 경우에만 진짜 양성결과로 나타났다(http://pathology2,jhu.edu). 자궁내막증, 양성 난소 낭종, 골반 내 염증성 질환 및 심지어 임신기간 중의 초기 3개월간은 혈청 내 CA125 수준이 증가한다고 보고되어 왔다[11]. 국립 보건 기구 의 웹 사이트는, CA-125는 난소암을 위한 일반적인 검색 방법이 아니다고 설명하고 있다. 상기 리포트는 CA125 수준이 증가된 건강한 여성 100명 중 약 3명만 실제로 난소암이 발견되었으며, 난소암으로 진단된 환자의 약 20%가 실제로 CA125 수준이 증가되었다고 그들은 보고한다(http://www.nlm.nih.gov/medlineplus/ency/article/007217.htm).
[0014] 그러므로, 사람의 혈청에서 높은 특이성 및 민감성을 보이는 난소암 생물 표지자의 동정은 매우 유용한데, 이는 상기 검사가 비-침입적이며, 질병에 대한 개인적인 민감성의 모니터에 전통적인 검색방법에 재분류하기 전에 또는 이와 혼용하여 사용될 수 있기 때문이다. 혈청 검사는 침입을 최소화하며, 일반인에 통용하여 적용될 수 있다.
<발명의 요약>
[0015] 본 발명의 한 예시에서, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 CRC 및 OC를 진단하는데 유용한 대사 표지자들을 동정하기 위한 방법을 제공한다: 결장암이 존재하는 환자로부터 얻는 다수의 미확인된 대사산물들을 포함하는 시료를 고해상 질량 분광광도계, 예를 들어 푸리에 변형 이온싸이클로트론공명 질량분석기(FTMS)에 도입하는 단계; 대사산물에 대한 데이터를 획득하며, 동정하며, 정량하는 단계; 상기 동정하고 및 정량한 데이터로부터 데이터베이스를 구축하는 단계; 시료로 부터동정 및 정량한 데이터를 대조시료의 상응하는 데이터와 비교하는 단계; 차이를 보이는 하나 또는 그 이상의 대사산물들을 동정하는 단계; 및 최적의 진단에 필요한 최소 수의 대사산물 표지자들을 선별하는 단계.
[0016] 본 발명의 구체적인 예시에서 하기의 단계들을 포함하는 개체의 건강 상태를 진단하기 위한 대사 생물표지자 검사를 개발하는 방법을 제공한다: 다수의 건강상태의 개체들로부터 생물학적 시료들을 얻는 단계; 상기 생물학 시료들을 고해상/정밀 질량 질량 분광광도계에 도입하여 다수의 건강상태들 간의 강도의 차이가 있는 대사산물을 발견하기 위하여 생물학 시료들 내에 포함된 대사산물들을 동정하고 정량하는 단계; 다변량 통계학을 이용하여 상기 건강상태의 차별화에 필수적인 생물 표지자들의 최소 세트를 동정하는 단계; 독립적인 MS 방법을 사용하여 이 생물 표지자들을 확정하고 동정 및 다양화된 생물 표지자들의 측정을 위하여 표적화 고처리 방법을 구축하는 단계.
[0017] 본 발명의 구체적인 예시에서 하기의 단계를 포함하는 결장암에 특이적인 대사 표지자들을 동정하는 방법을 제공한다: 결장암/난소암으로 진단받은 환자의 다수의 미확인 대사산물을 함유하는 시료를 푸리에 변형 이온싸이클로트론공명 질량분석기(FTMS)에 도입하는 단계; 대사산물에 대한 데이터를 획득하며, 동정하며, 정량하는 단계; 상기 동정하고 정량한 데이터로부터 데이터베이스를 구축하는 단계; 시료로 부터 얻은 동정 및 정량한 데이터를 대조시료의 상응하는 데이터와 비교하는 단계; 차이를 보이는 하나 또는 그 이상의 대사산물들을 동정는 단계; 여기에서 대사산물들은 표3에서 나타난 하나 또는 이상의 대사산물들, 또는 단편 또는 그의 유도체의 하나 또는 그 이상의 대사산물들로 구성된 군으로부터 선택됨.
[0018] 본 발명의 구체적인 예시에서 하기 단계를 포함하는 특이적인 결장암 대사 표지자들을 동정하는 방법을 제공한다: 결장암/난소암으로 진단받은 환자의 다수의 미확인 대사산물을 함유하는 시료를 푸리에 변형 이온싸이클로트론공명 질량분석기(FTMS)에 도입는 단계; 대사산물에 대한 데이터를 획득하며, 동정하며, 정량하는 단계; 상기 동정하고 정량한 데이터로부터 데이터베이스를 구축하는 단계; 시료로 부터 얻은 동정 및 정량한 데이터를 대조시료의 상응하는 데이터와 비교하는 단계; 차이를 보이는 하나 또는 그 이상의 대사산물들을 동정는 단계; 여기에서 대사산물은 정밀 중성 질량이 446.3406, 448.3563, 450.3726, 464.3522, 466.3661, 468.3840, 538.4259, 592.4711 및 594.4851 달톤 또는 실질적으로 등가인 대사산물 및 도 13 내지 21의 어느 하나에서 보여지는 LC-MS/MS 단편 패턴 또는 단편 또는 그의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되고; 및 최적의 진단에 필요한 최소 수의 대사산물 표지자들을 선별함.
[0019] 본 발명의 구체적인 예시에서 하기 단계를 포함하는 특이적인 난소암 대사 표지자들을 동정하는 방법을 제공한다: 결장암/난소암으로 진단받은 환자의 다수의 미확인 대사산물을 함유하는 시료를, 푸리에 변형 이온싸이클로트론공명 질량분석기(FTMS)에 도입는 단계; 대사산물에 대한 데이터를 획득하며, 동정하며, 정량하는 단계; 상기 동정하고 정량한 데이터로부터 데이터베이스를 구축하는 단계; 시료로 부터 얻은 동정 및 정량한 데이터를 대조시료의 상응하는 데이터와 비교하고; 차이를 보이는 하나 또는 그 이상의 대사산물들을 동정는 단계; 여기에서 대사산물은 정밀 중성 질량이 446.3406, 448.3563, 450.3726, 464.3522, 466.3661, 468.3840, 538.4259, 592.4711 및 594.4851 달톤 또는 실질적으로 등가인 대사산물 및 도 13 내지 21의 어느 하나에서 보여지는 LC-MS/MS 단편 패턴 또는 단편 또는 그의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되고; 및 최적의 진단에 필요한 최소 수의 대사산물 표지자들을 선별함.
[0020] 본 발명의 한 예시에서, 표 3에 나열된 대사산물들 또는 단편 또는 그의 유도체로부터 선택되는 CRC/OC 암에 특이적인 대사 표지자들을 제공한다.
[0021] 본 발명의 한 예시에서, 정밀 중성 질량이 446.3406, 448.3563, 450.3726, 464.3522, 466.3661, 468.3840, 538.4259, 592.4711 및 594.4851 (달톤으로 측정되거나) 또는 실질적으로 등가인 대사산물들 또는 단편 또는 그의 유도체(상기 유도체는 상기 대사산물과 +/- 5 ppm의 차이가 있을 수 있음)로 구성된 군으로부터 선택되는 CRC/OC 암에 특이적인 대사 표지자들을 제공한다.
[0022] 본 발명의 구체적인 예시에서는, 정밀 중성 질량이 446.3406, 448.3563, 450.3726, 464.3522, 466.3661, 468.3840, 538.4259, 592.4711 및 594.4851 달톤으로 측정되거나 또는 실질적으로 등가인 대사산물 및 도 13 내지 21에서 보여지는 어느 하나의 LC-MS/MS 단편 패턴 또는 단편 또는 그의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 결장/난소암 특이적인 대사 표지자들을 제공한다.
[0023] 본 발명의 구체적인 예시에서, 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 분자량을 가진 대사산물들로 구성된 군으로부터 선택되는 결장/난소암에 특이적인 대사 표지자들을 제공한다: C28H46O4, C28H48O4, C28H50O4, C28H48O5, C28H50O5, C28H52O5, C32H58O6, C36H64O6 및 C36H66O6.
[0024] 본 발명의 구체적인 측면에서는, 하기 단계를 포함하는 결장암 또는 난소암이 발견되는 환자 또는 발달하고 있는 CRC 또는 OC 위험율의 환자를 진단하는 방법을 제공한다: 상기 환자로부터 얻은 시료로부터, 표 3에 나열된 대사산물, 또는 단편 또는 그의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 대사산물의 유무를 선별하는 단계; 여기에서 상기 하나 또는 그 이상의 대사 표지자들의 강도의 차이는 CRC 또는 OC의 존재를 나타낸다.
[0025] 본 발명의 양태의 구체적인 예시는 하기의 단계를 포함하는 결장암 또는 난소암이 발견되는 환자를 진단하는 방법을 제공한다: 정밀 중성 질량이 446.3406, 448.3563, 450.3726, 464.3522, 466.3661, 468.3840, 538.4259, 592.4711 및 594.4851 달톤으로 측정되거나 또는 실질적으로 등가인 대사산물들로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 대사 표지자의 유 또는 무에 대하여 상기 환자로 부터 얻은 시료를 검색하는 단계; 여기에서 상기 하나 또는 그 이상의 대사 표지자들의 부재는 CRC 또는 OC의 존재를 나타낸다.
[0026] 발명의 구체적인 예시에서, 하기의 단계를 포함하는 미지의 질병 상태의 검사 대상에서 CRC 또는 OC 의 유 또는 무를 진단하는 방법을 제공한다: 상기 검사대상의 혈액 시료 획득하는 단계; 상기 혈액시료를 분석하여, 정밀 중성 질량이 446.3406, 448.3563, 450.3726, 464.3522, 466.3661, 468.3840, 538.4259, 592.4711 및 594.4851으로 동정된 분자들 또는 상기 분자들과 실질적으로 동일한 질량을 같은 분자들 또는 그의 유도체의 단편들을 포함하는 군으로부터 선택되는 분자들의 정량 데이터를 얻는 단계; 상기 검사 대상의 상기 분자들에서 얻은 정량 데이터를 다수의 CRC 또는 OC-양성 사람의 상기 분자들로 부터 얻거나 또는 다수의 CRC 또는 OC-음성 사람으로부터 얻어진 정량 데이터와 비교하는 단계; 및 상기 비교를 이용하여 검사대상이 CRC/OC 양성인지 또는 음성인지의 가능성을 결정하는 단계.
[0027] 본 발명은 또한 CRC- 및 OC-양성 환자와 건강한 대조군의 혈청에서 차별적으로 발현되는 개시된 비타민 E-유사 대사산물들의 동정을 개시한다. 개시된 차별적인 발현은 CRC 및 OC에 특이적이다.
[0028] 본 발명의 한 예시에서, 비타민 E-유사 대사산물들로 구성된 군으로부터 선택되는 대사산물들의 최적의 서브세트를 사용하여 개발된 혈청 검사는, CRC/OC 존재, 또는 CRC 또는 OC-촉진이나 저해환경의 존재를 진단하기 위해 사용될 수 있다.
[0029] 본 발명의 다른 예시에서, 비타민 E-유사 대사산물들로 구성된 군으로부터 선택되는 대사산물들의 최적의 서브세트를 사용하여 개발된 혈청 검사는, CRC로 진단된 환자의 치료효과의 결과로부터 CRC 보건상태를 진단하기 위해 사용될 수 있다. 치료는 화학치료, 외과시술, 방사선 치료, 생물학적 치료 또는 기타를 포함할 수도 있다.
[0030] 본 발명의 다른 예시에서, 비타민 E-유사 대사산물들로 구성된 군으로부터 선택되는 대사산물들의 최적의 서브세트를 사용하여 개발된 혈청 검사는, 적합한 투여량 또는 특이적인 치료를 결정하기 위하여 CRC 치료에서, 환자의 CRC 상태를 세로로(longitudinally) 모니터하는데 사용될 수 있다.
[0031] 본 발명은 또한 건강한 대조군와 비교하여 CRC- 및 OC-양성 환자의 혈청에서 상기 감마-토코페롤/토코트리에놀 대사산물들의 발현이 차별화되며 방향성 환 구조가 감소된, 감마-토코페롤/토코페롤 대사산물들의 동정을 개시한다. 개시된 차별적 발현은 CRC 및 OC에 특이적이다.
[0032] 본 발명은 또한 사람 혈청의 하이드록시크로만-포함 구조에 -OC2H5, -OC4H9 또는 -OC8H17 일부가 부착된 감마-토코페롤/토코트리에놀 대사산물들의 존재를 개시한다.
[0033] 본 발명은 또한 건강한 대조군와 비교하여 CRC-양성 환자의 혈청에서 알파-토코페롤 대사산물들의 차별적으로 발현되는 알파-토코페롤 대사산물들의 동정을 개시한다. 상기 차별화된 발현은 CRC에 특이적이다.
[0034] 본 발명의 구체적인 예시에서, 하기 단계를 포함하는 항산화 치료가 이로울 개체의 동정 및 진단방법을 제공한다: 상기 검사 대상으로부터 혈액시료를 얻는 단계; 상기 혈액 시료를 분석하여 토코페롤, 토코트리에놀, 비타민 E-관련 대사산물들 또는 상기 대사산물계의 대사 유도체의 모두 또는 서브세트의 정량 데이터를 얻는 단계; 상기 검사대상의 상기 분자들에서 얻은 정량 데이터를 다수의 CRC- 또는 OC-음성인 사람의 분석을 통하여 얻은 정량 데이터와 비교하는 단계; 및 상기 비교를 이용하여 검사 대상이 이러한 치료가 이로울 지의 가능성을 결정는 단계.
[0035] 본 발명의 구체적인 예시에서, 하기 단계를 포함하는 대상이 CRC 또는 OC로 발전할 위험율이 있는지의 가능성을 결정하는 방법을 제공한다: CRC 또는 OC 징후가 없는 대상으로부터 혈액시료를 얻는 단계; 상기 혈액 시료를 분석하여 토코페롤, 토코트리에놀, 비타민 E-관련 대사산물들 또는 상기 대사산물계의 대사 유도체의 모두 또는 서브세트의 정량 데이터를 얻는 단계; 상기 검사대상의 상기 분자들에서 얻은 정량 데이터를 다수의 CRC- 또는 OC-음성인 사람의 분석을 통하여 얻은 정량 데이터와 비교하는 단계; 및 상기 비교를 이용하여 검사 대상이 OC 또는 CRC 발달위험이 있는지의 가능성을 결정는 단계.
[0036] 본 발명의 구체적인 양태는, 하기를 포함하는, CRC 또는 OC를 예방하거나, 치료하거나, 안정화 또는 CRC 또는 OC에 관련된 증상을 개선하도록 고안된 음식, 화학적 또는 생물학적 치료적 방법에 반응하는 개체의 진단 방법을 제공한다: 상기 검사대상으로부터 단회 또는 시간에 따라 수회로 획득된 하나 또는 그 이상의 혈액 시료를 얻고; 상기 검사 대상으로부터 혈액시료를 얻고; 상기 혈액 시료를 분석하여 토코페롤, 토코트리에놀, 비타민 E-관련 대사산물들 또는 상기 대사산물계의 대사 유도체의 모두 또는 서브세트의 정량 데이터를 얻고; 상기 분자에서 얻은 정량 데이터를 다수의 CRC- 또는 OC-음성인 사람에 대한 상기 분자들로 부터 얻은 대조군 데이터와 비교하고; 및 상기 비교를 이용하여 상기 치료적 방법이 향상되었는지 결정함.
[0037] 본 발명의 구체적인 양태는, 하기를 포함하는 혈청 또는 조직을 분석하여 세포성 유입 결핍 또는 비타민 E 및 관련대사산물들의 수송이 결핍된 개체들을 동정하는 방법를 제공하나, 이에 제한되지 않는다: 비타민 E 수송 단백질의 방사성표지 트레이서 연구나 유전자 발현 또는 단백질 발현 분석, 비타민 E 수송 단백질들의 게놈 이상 또는 돌연변이의 분석, 인 비보 또는 익스 비보(ex vivo)의 비 타민 E 수송 단백질 수준의 이미지화, 비타민 E 수송 단백질들의 항체-기초 검출법(효소 면역 측정법, ELISA).
[0038] 상기 발명의 요약은 본 발명의 모든 형상을 기술하는데 필수적인 것은 아니다.
[0076] 본 발명은 결장암 및 난소암(각각 CRC 및 OC)의 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명은 내재적인 저분자 및 CRC 또는 OC의 관계를 기술한 것이다. 특히, 본 발명은 비타민 E 이성질체 및 관련 대사산물들의 측정을 통한 CRC 및 OC의 진단 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 사람의 혈청 비타민 E 관련 대사산물들과 CRC 및 OC와의 관련 상관관계에 관한 것이다.
[0077] 본 발명은 특히 CRC와 관련된 명백하고 모호하지 않은 생화학적 변화를 최초로 개시한다. 상기 발견들은 또한 상기 생물 표지자의 측정이 CRC 치료의 효능성을 측정하는 보편적인 값을 제공할 수 있음을 의미한다. 이것은 새로운 치료제에 대한 생존능력을 평가하는데 사용될 수 있음으로써, 단순한 생화학적 검사가 미국 국립보건소의 운행비용을 극적으로 감소시킬 수 있을 것이다. 더군다나, 종양의 진행되거나 또는 환자가 죽을 때까지 기다리지 않고도 이 치료가 어떤 이익을 주는지 결정할 수 있다. 이와 같은 검사의 활용성은, 연구자들이 몇 년이 아닌 몇 달 이내에 CRC 치료제의 유효량, 제형 및 화학적 구조 변형을 결정할 수 있을 것이다.
[0078] 본 발명은 사람의 혈청에 존재하는 특이적인 저분자들의 수준을 측정하고 이를 "정상" 대조군 수준과 비교하여 CRC 또는 OC를 진단하는 방법에 관한 것이다. 본 명세서의 한 예시에서, CRC 또는 OC에 대한 새로운 초기 검출 및 진단방법과 CRC 및 OC의 치료효과를 모니터링하여 기술하고 있다.
[0079] 바람직한 방법은, 하나 또는 그 이상의 질병이나 특별한 건강상태를 진단하기 위하여 표 3에서 선별된 대사산물들의 서브세트로부터 개발된 초고속 검색(HTS) 검사를 사용하는 것을 포함한다. 청구된 방법의 활용성은 CRC-양성 건강상태를 진단 가능한 HTS 검사의 개발을 통하여 증명되고 입증되었다.
[0080] CRC 및 OC에서 이러한 검사의 효과는 굉장할 것이다. 왜냐하면 사실상 누구나 자신의 삶을 가로로 출력하여 위험율을 검사하고 이 질환들의 초기에 위험율을 확인하고 검출할 수 있기 때문이다. 이 검사의 수행 특징이 일반적인 CRC 집단을 위한 대표적으로 제공되는 것으로, 이 검사 단독은 현재 활용 가능한 다른 어떤 CRC 검색법보다 우수하며, 이는 종래의 방법으로 검출할 수 있는 단계보다 더 이전의 질병단계를 검출하는 능력을 가졌기 때문이다. 질병의 초기 검출은 양성 치료 극복에 중요하다.
[0081] 특별한 집단에서 주어진 건강상태의 생화학적 표지자들이 있는지를 결정하기 위하여, 건강상태로 나타나는(예를 들어 특별한 질병) 환자 그룹과 대조로서 "정상" 그룹이 요구된다. 특별한 건강 상태 카테고리의 환자로부터 채취한 생물학적 시료들은 정상집단으로부터 채취한 동일한 시료들과 비교하여 두 그룹간의 차이를 확인할 수 있으며, 그 차이는 시료 추출 및 푸리에 변형 이온싸이클로트론공명 질량분석기(FTMS) 및 액체크로마토그래피 질량분석기 (LC-MS)를 포함하는 다양한 분석방법을 통하여 정상 집단의 시료와 비교할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 생물학적 시료는 혈액(혈청/혈장), 뇌 척수액 (CSF), 뇨, 분변, 숨, 침샘, 또는 종양, 인접 정상조직, 평활근 및 골격근, 지방조직, 간, 피부, 머리카락(털), 신장, 췌장, 허파, 대장, 위장 등을 포함하는 어떤 고형조직의 생검을 포함한 신체의 어느 부분에서 기원될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
[0082] 기술된 CRC 진단검사의 발명을 기술하기 위하여, 건강한 CRC- 및 OC-음성 개체 및 전문적으로 진단된 CRC-양성 환자의 집단으로부터 혈청시료를 얻었다. 본 명세서에서, 용어 "혈청"이 사용될 것이나, 혈장, 전혈 또는 전혈의 일부 분획이 사용될 수 있음은 당업자에게는 자명할 것이다.
[0083] 혈액 시료가 환자로부터 채취되면, 시료는 몇 가지 처리과정을 거치게 된다. 그 과정은 아무것도 하지 않는 최소한의 공정(예를 들어 전혈을 냉동) 또는 특별한 세포 타입으로 분리하는 복잡한 공정을 거칠 수 있다. 가장 일반적이고 일상적인 과정은 전혈로부터 혈청이나 혈장을 분리하는 것을 포함한다. 또한 모든 혈액 시료 처리 방법은 거름종이 또는 다른 부동성 재료와 같은 고형상 지지대에 혈액 시료를 떨어뜨리는 것을 포함하며 본 발명에 의해 또한 고려되어진다.
[0084] 그런 다음, 상기에 기술된 처리된 혈액 시료는 분석 기술과 호환가능하도록 추가 처리하여 처리된 혈액 시료 내에 함유된 생화학물질들의 검출 및 측정에 사용되는 분석 기술과 호환하여 사용된다. 처리 형태는 추가 처리가 없는 최소한의 공정에서부터 미분 추출 및 화학적 유도체화와 같은 복잡한 공정의 범위로 될수 있다. 추출방법은 초음파, 속슬렛 추출, 마이크로웨이브 추출(microwave assisted extraction ;MAE), 초임계 추출 (SFE), 가속 용매 추출 (ASE), 가압 액체 추출 (PLE), 가압 고온수 추출 (PHWE), 및/또는 메탄올, 에탄올, 함수 알코올 또는 에틸 아세테이트나 헥산 등의 유기용매과 같은 전형적인 용매에서의 계면활성제를 이용한 추출법이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. FTMS 비-표적화 분석에 대한 바람직한 대사산물들의 추출방법은 비극성 대사산물이 유기용매에 용해되는데 반해 극성 대사산물들은 수용성 용매에 용해되는, 액체/액체 추출법으로 추출된다. 본 발명의 한 예시에서, 혈청시료에 함유된 대사산물들은 초음파 및 격렬한 혼합(볼텍스 혼합)방법에 의해 극성 및 비극성 추출물로 분리된다.
[0085] 생물학적 시료의 추출물은 직접 주입 또는 하기의 크로마토그래피의 분해에 의한, 필수적으로 어떤 질량 분광광도계 플랫폼에서 분석될 수 있다. 전형적인 질량 분광광도계는 시료내의 분자들을 이온화하는 소스(source) 및 이온화된 입자를 검출하는 이온 검출기로 구성된다. 일반적인 소스의 예로는, 전자 임펙트(impact), 전자분무 이온화(ESI), 대기압 화학 이온화(APCI), 기질 보조 레이저 탈착 이온화 (MALDI), 표면 향상 레이저 탈착 이온화 (SELDI) 및 그의 변형체가 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일반적인 이온 검출기은 4 중극-기초 시스템, 비행시간형(time-of-flight;TOF), 자석부, 이온 사이클로트론 및 그의 변형체를 포함할 수있다.
[0086] 이 저분자들은 비-표적화 분석으로 알려진 방법에 의해 동정된다. 비-표적화 분석은 분석 전에 어떤 사전지식이나 구성성분의 선택 없이, 시료에서 가능한 많은 분자들을 측정하는 것을 포함한다(2001년 8월 9일에 공개된 WO 01/57518 참조). 그러므로, 새로운 대사산물 생물 표지자의 발견하기 위한 비-표적화 분석의 잠재성은 이미 동정된 분자들을 검출하는 표적화 방법에 비하여 높다. 본 발명은 CRC-양성 및 건강한 개체간의 차이를 보이는 대사산물의 구성성분을 동정하기 위하여 비-표적화 방법을 사용하며, 비-표적화 분석에서 동정된 대사산물의 서브세트에 대한 고효율 표적화 검사가 뒤이어 수행된다. 그러나, 다른 대사산물 프로파일링 방법이 본 명세서에서 개시된 차별적으로 조절되는 대사산물의 일부 또는 전부를 개발하기 위하여 잠재적으로 사용될 수 있고, 개발되거나 측정되지는 않았으나, 여기에서 기술된 대사산물들은, 그러나 개발되었거나 측정되었던, 그 대사산물들을 검출하고 측정하는데 사용될 수 있는 분석 기술에 독립적인 독특한 화학적 부분을 나타낸다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.
[0087] 상기 분석에 따르면, 수백만의 저분자들, 대사산물들 또는 대사산물의 단편들은 CRC-양성 혈청 및 정상 혈청간의 많은 차이를 동정할 수 있다. 본 발명은 표3에 나열된 바와 같이 480개의 대사산물의 질량을 개시하며, 이 결과로부터 CRC-양성 혈청 및 정상 혈청간의 통계적으로 유의한 많은 차이를 가지고 있음을 알 수 있었다. 이 모든 특징 즉, 두 개체 간에 통계적인 차이가, 잠재적인 진단적 유용성을 가진다. 그러나, 480개의 신호를 상업적인 진단검사에 결합하는 것은 비현실적인데, 이는 표지자 또는 대사산물의 최적의 진단세트로 선별된 공지의 방법이 전파되었기 때문이다.
[0088] 본 명세서에 기술된 방법에 따르면, 9개의 대사산물들 중에 한 패널은 정상인들로부터 CRC(환자)들을 구별해 내는 최적의 것으로 선별되었다. 본 발명에서 결장암에 특이적인 표지자들은 446.3406, 448.3563, 450.3726, 464.3522, 466.3661, 468.3840, 538.4259, 592.4711, 및 594.4851의 (달톤으로 측정된)로 정확한 중성 질량, 또는 실질적으로 등가인 대사산물들로 구성된 군으로부터 선택되며, 여기에서 +/- 5 ppm의 차이는 동일한 대사산물로 인식될 수 있다. 이 표지자들은 CRC 존재인 환자를 검색위한 진단검사에 사용될 수 있다.
[0089] 상기에 기술된 9개의 대사산물들 중에서, 6개는 초고속 검색(HTS)검사의 실행용으로 추가로 선별되었다. 이 HTS 검사는 전통적인 3중-4중극 질량 분광광도계 기술( 도 26, 요약 참조)에 기초하였다. 이 HTS 검사는 3중-4중극 질량 분광광도계에 혈청 추출물을 직접 주입하여 운행되며, 그런 다음 각각의 6개의 모분자들은 이온 모니터링(single-ion monitoring (SIM))에 의해 개별적으로 분리된다. 이는 비활성 가스(소위 충돌가스(collision gas)로, 충돌 유도 분해 또는 CID(collision-induced dissociation)라 언급됨)를 사용하여 각 분자의 단편화로 반응이 이어진다. 그런 다음, 각 모표지자로부터 얻은 특이적인 단편의 강도는 소위 다중반응 모니터링(multiple-reaction monitoring (MRM))이라 불리는 과정에 의해 측정되고 기록된다. 게다가, 내부 표준분자는 또한 각 시료 및 대상에 추가하여 잘 단편화한다. 그 방법과 기기가 정상적으로 작동만 한다면 내부 표준 단편은 각 시료에 대해서 같은 강도를 가질 수 있다. 내부 표준 단편뿐만 아니라, 6개의 모든 생물 표지자 단편들의 강도들이 수집되면, IS 단편의 강도들에 대한 생물 표지자의 비율이 산출되며, 그 비율들은 log 값으로 변환된다. 그런 다음, 각 환자시료에 대한 6개의 값 중 가장 낮은 값은, 이미 결정된 양성질환자 및 대조군의 값과 비교하여 이 질병에 대하여 양성인지 음성인지의 연관성을 결정한다.
[0090] 분자들을 검출하는데 의존적인, 일반적으로 활용가능한 비용에 효과적인 검사 플랫폼 옵션의 다중 형태가 있다. 그 형태로는 비색 화학적 검사법(UV 또는 다른 파장값), 항체를 기본으로 하는 효소-면역 흡착 검사법(antibody-based enzyme-linked immunosorbant assays (ELISAs)), 칩-기본적인 및 다중화 효소 사슬 반응(PCR)에 의한 핵산 검출 검사법, 비드-기본적인 핵산 검출 방법, 딥스틱 화학적 검사법, MRI, 펫스캔, CT 스캔과 같은 영상 분석 및 다양한 질량 분광광도계- 기본 시스템을 포함할 수 있다.
[0091] 본 발명의 한 예시에서, 이전 섹션에서 동정된 MS/MS 단편 패턴을 이용하여 CRC 환자를 검색하는 상업적인 방법의 개발방법을 제공한다. 전 세계 검사법의 전파하기 위한 많은 옵션들이 있다. 가장 분명한 두 가지는 1) 세계의 많은 실험실에서 쉽게 사용가능하도록 통상의 실험실 기기 및 3중-4중극 질량 분광광도계와 호환가능한 MS/MS 방법의 개발 및/또는 2) 시료가 어느 곳에서도 채택되고 분석될 수 있고, 그 결과를 환자나 환자의 담당의사에게 보내어질 수 있는 검사 설비의 확립이다.
[0092] 선별된 대사산물들의 구조 해명은 물리적 및 화학적 성질의 연구 연속물에 따라 결정되었다. 예를 들어, 이 동정을 위하여 일반적으로 사용된 기본적인 특성은 정확한 질량 및 분자식 결정, 극성, 산/염 성질, NMR 스펙트럼 및 MS/MS 또는 MSn 스펙트럼이다. 본 발명의 대사산물들을 동정하여, 대사 경로 또는 경로들이 그 질병의 과정에 포함되는지를 확인하는 것이 가능하다.
[0093] 9개의 바람직한 분석 표지자들의 분자식(446.3406, 448.3563, 450.3726, 464.3522, 466.3661, 468.3840, 538.4259, 592.4711 및 594.4851)은, 그들의 정확한 중성질량, 극성 및 이온화 특성을 기초로 하여 C28H46O4, C28H48O4, C28H50O4, C28H48O5, C28H50O5, C28H52O5, C32H58O6, C36H64O6, C36H66O6로 결정하였다. 본 발명에 따라, 이 대사산물들은 반-포화된 크로만 환과 피틸 곁사슬로 구성되며, 따라서 비타민 E-관련 구조와 일치하는 것으로 결정되었다.
[0094] CRC에 대한 인 비트로 및 동물 모델에서 비타민 E의 효능을 수행한 연구는 유의할 만큼 많이 되었으나, 그에 반해 비타민 E와 OC에 관한 연구는 매우 적었다. 1980년대 초반에, Cook과 McNamara [12]는 마우스에서 화학적으로 유도된 마우스의 결장암에 대한 비타민 E의 예방효과를 보여주었다. 그러나, 사람에 대한 연구에서, 비타민 E가 CRC의 예방, 원인, 치료 또는 유지치료의 어느 것에 대하여 현저한 역할을 한다는 어떤 강력한 증거를 제공하는 것은 실패하였다. Coulter 등의 38명에 대한 연구에서, 어떤 개체의 암에서도 알파-토코페롤 치료가 현저한 효과가 없었으며, 풀 관련 위험율 단독은 0.91 (95% CI: 0.74m 1.12)임을 보였다[13].
[0095] 용어, "비타민 E" 는 자연적으로 발생하는 8개의 이성질체 즉, 4개의 토코페롤(알파, 베타, 감마, 및 델타) 및 4개의 토코트리에놀(알파, 베타, 감마, 및 델타)를 모두 일컫는다. 서구적인 음식에서 가장 우선적인 형태로 발견되는 것은 감마-토코페롤이며, 반면에 사람의 혈청/혈장에서 발견되는 가장 우선적인 형태는 알파-토코페롤이다. 토코트리에놀은 또한 음식에도 존재하며, 곡물의 낟알(cereal grains)과 팜유 및 쌀겨유와 같은 일부 식물성 오일에 다량으로 농축되어 있었다. 놀랍게도, 토코트리에놀이 토코페롤보다 심장혈관계 질환과 암을 예방하는데 더 능력이 있다고 제기되어왔다[14]. 이것은 토코트리에놀이 토코페롤에 비해 지질막내에 더 많이 분포되어 있고, 라디칼과의 상호 반응능도 크고, 더 빨리 재순환되는 능력이 있기 때문인지도 모른다[15]. 쥐의 간 마이크로솜에서, 철을 매개로 하는 지질 과산화를 방해하는 알파-토코트리에놀의 효능이 알파-토코페롤의 효능성에 비해서 40배나 높다는 것이 증명되어왔다[15]. 그러나, 사람의 혈청을 측정한 결과, 트리에놀은 검출되지 않거나 분 단위로 농축되어 존재하는데, 이는 트리에놀이 고지질성이기 때문에 우선적으로 담즙으로 배출되기 때문이다[17].
[0096] 알파 및 감마 토코페롤 간의 분포 불일치에 관련된 상당량의 연구가 그들 사이의 분배 불일치에 관련되어 있다는 연구가 그들의 이성질체를 통해서 수행되어왔다. 1974년 초반에, 감마- 및 알파-토코페롤이 작은창자에서 유사하게 흡수되지만 혈장 농도에서 유의하게 달라진다고 알려졌다[18]. Bieri와 Evarts 연구에서는[18], 쥐에 비타민 E를 10일 동안 결핍시킨 다음 알파 : 감마 0.5 비율로 포함된 음식을 14일 동안 제공하였다. 제 14일에, 혈장내 알파 : 감마 비율이 5.5로 관찰되었다! 이 저자들은 이러한 결과가 감마-토코페롤이 유의하게 높은 수준으로 턴-오버되기 때문으로 보고 있으나, 턴오버가 증가된 이유는 밝혀내지 못하였다. 토코페롤의 혈장 농도는 간의 토코페롤 결합 단백질에 의해 철저하게 조절되는 것으로 믿어졌다. 이 단백질이 우선적으로 알파-토코페롤과 결합하는 것으로 보였다[19]. 알파-토코페롤 소비를 크게 증가시켜도 혈장 농도에서는 단지 작은 양으로만 증가된다[20]. 이 같은 사실은 토코트리에놀에 대해서도 유사하게 관찰되는데, 토코트리에놀을 많은 양으로 공급하여도 최대 혈장 농도는 약 1 내지 3 마이크로몰라로만 관찰되었다 [21]. 더욱 최근에, Birringer 등 [17]은 50% 이상 소화시킨 감마-토코페롤을 사람의 간 암종 HepG2 세포에서 다양한 알코올류와 카르복시산으로 오메가-산화에 의해 대사시키더라도, 이 경로에 의해 대사되는 알파-토코페롤은 3% 이하임을 보였다. 이 시스템은 감마-토코페롤의 증가된 턴오버 때문으로 보인다. 이 논문에서, 그들은 감마-토코페롤로부터 오메가 COOH 의 생성은 알파-오메가로부터 오메가 COOH 유사체를 생성하는 보다 50X이상의 비율로 생성됨을 보여주었다. Birringer는 또한 트리에놀도 유사한 경로로 대사되어지지만, 더 많은 복합체 오메가 산화 경로가 보조적인 효소를 필요로 하고 있음을 보여주었다[17].
[0097] 이 두 개의 구조적으로 선택적인 과정의 존재는 생물학적으로 의미가 있다. Birringer 등 [17]은 감마-토코페롤 특이적인 P450 오메가 수산화 효소는 2,7,8-트리메틸-2-(베타-카르복시-3'-카르복시에틸)-6-하이드록시크로만(감마-CEHC)로서 감마-토코페롤/트리에놀을 우선적으로 배출한다고 제안하였다. 그러나, 본 발명자들은 만약 감마-토코페롤/트리에놀을 간단하게 배출하는 것이 생물학적 목적이라면, 선택적인 수산화 및 글루콘화를 경유하는 것이 더 간단하며, 에너지 효율도 더 커질 것이라고 주장한다. 비타민 E 문헌에서 논의되지 않았던 두 가지 1차 식이 비타민 E 이성질체(알파 및 감마)는 간에 들어가서 1차 대사되는 동안 두가지 분리된 대사 시스템으로 전환된다. 시스템 1은 가장 생물학적으로 활성화된 항산화제 이성질체(알파-토코페롤)를 혈류로 재빨리 이동시켜 상기 필수적인 비타민을 적정 수준으로 몸의 조직으로 공급한다. 시스템 2는 감마-토코페롤을 오메가 COOH로 재빨리 전환시킨다. 본 발명에서, 유의한 농도의 6개의 이성질체의 감마-토코페롤/토코트리에놀 오메가 COOH는 정상인의 혈청에 항상 존재하는 것을 개시한다. 사람 혈청에서 이 분자들의 각각의 농도는 낮은 마이크로몰라 범위로 추정될 수 있었으며, 이 방법은 3중-4중극 방법을 사용하여 구성적으로 수용성 카르복시산-함유 내부 표준물질인 담즙산을 측정하여 실시되었다. 앞선 보고에서, 혈장에서 γ-토코페롤은 0.5 내지 2 마이크로몰라(알파-토코페롤에 비해 약 20배나 낮다)로 보고되었다[22]. 따라서, 혈청에서 6개의 신규한 γ-토코페릭산 모두를 누적한 총량은 무시할 수 없으며, γ-토코페롤 자체의 누적량도 초과되기 쉽다. Birringer 등 [17]에 의해 기술된 다른 짧은 사슬 길이의 감마-토코페롤/트리에놀 중 아무것도 혈청에서 검출되지 못했다. 또한, 알파 및 감마 토코트리에놀도 이 작업에 보고된 연구에서 활용된 환자혈청에서 검출되지 않았으며, 이는 감마-토코페롤/트리에놀 P45 오메가 가수분해효소의 일차 목적이 오메가 COOH의 형성이며 감마-CEHC가 아니라는 것을 주장한다. 이 이론의 진위성에 상관없이, 본 발명의 명세서에 개시된 다양한 감마-토코페롤/트리에놀 오메가 COOH 대사산물들은 신규한 생물활성제이고, 정상 건강상태를 유지하고 질병을 예방하기 위한 특이적이고 필수적인 생물학적 기능을 수행한다고 주장한다.
[0098] 포유동물은 인 비보에서 트리에놀을 토코페놀로 전환할 수 있음을 보여주고 있어 사실상 타당하다 [23, 24]. 6 가지의 신규한 비타민 E-유사 대사산물들 중 두 가지는 토코페롤-유사구조인 포화된 피톨 곁사슬이며, 다른 4개는 토코트리에놀 기원으로 주장되는 반-포화된 피톨 곁사슬이다. 그러므로, 포유동물이 이중결합을 유도하지는 못하므로, 모든 6개의 분자는 토코페롤-유사 전구체로부터 기원되었을 수도 있다.
[0099] 단지 트리에놀이 토코페롤들로부터 떨어져서 생물학적인 활성을 갖는다고 보고되어 왔기 때문에[25], 감마-토코페롤은 알파-토코페롤로부터 분리되고 떨어져서 생물학적인 기능을 갖는다고 보고되어 왔다. 예를 들어, 알파 토코페롤과 알파토코트리에놀 사이에 주요한 차이점은, 세포죽음을 특이적으로 매개하는 조절자를 조절하여 신경퇴행을 특이적으로 방해하는 알파 토코페롤의 능력[26], 콜레스테롤을 낮추는 트리에놀의 능력 [27], C.elegans의 산화적 단백질 손상을 감소시키고 수명을 연장시키는 능력[28] 및 유방암 세포의 성장을 억제하는 능력[29, 30] 을 포함한다. 감마와 알파형 토코페롤의 주요한 차이점은 쥐의 염증성 손상에서 염증성 전구체 에이코사노이드들을 감소시키는 감마의 능력[31] 및 사이클로옥시게네이즈 (COX-2) 활성 저해[32]를 포함한다. Jiang 등은[32] 감마-토코페롤을 8-24시간동안 처리하는 것이 효과적이며, 아라키돈산은 경쟁적으로 감마-토코페롤의 억제 활성을 저해한다고 보고하였다. 감마-토코페롤의 오메가 COOH 대사산물은 이의 항염증 활성에 반응하는 1차 생물활성종일 수도 있다. 염증에서 아라키돈산의 에이코사노이드로의 전환은 염증에서 중요한 단계이다. 감마-토코페롤의 오메가 COOH 형은 아라키돈산과 구조적으로 유사하기 때문에, 천연의 감마-토코페롤에 비해 그의 형태의 매우 강력한 경쟁적인 저해제로 생각될 수 있다.
[00100] 본 발명의 한 양태로서, 사람의 혈청의 신규한 감마-토코페롤/토코트리올 대사산물들을 제공한다. 이 감마-토코페롤/트리에놀 대사산물들은 환원된 방향성 환 구조를 가진다. 본 발명의 이 예시에서, 감마-토코페롤/토코트리에놀 대사산물들은 사람의 혈청에서 하이드록시크로만 구조에 부착되는 -OC2H5, -OC4H9, 또는 -OC8H17 부분들을 포함한다.
[00101] 어떤 특별한 이론과도 관련됨 없이, 본 발명은 어떻게 감마-토코페롤/토코트리올이 알칸 라디칼과 반응하여 안정한 알켄과 안정화된 감마-토코페롤/토코트리올 라디칼을 형성하는지에 대한 가설을 개시한다. 이 메카니즘을 통하여 감마-토코페롤/토코트리올 한 분자는 6개의 알칸 라디칼로 중화될 수 있음을 주장한다. 더 나아가 본 발명은 어떻게 감마-토코페롤/토코트리올 라디칼이 지질 과산화물과 반응하여 그 결과로서 지질 과산화물을 안정한 감마-토코페롤/토코트리올 알킬 에테르와 안정한 지질 알데하이드로를 중화하는지 제시하고있다. 또한 철의 존재하에서 이 반응이 촉매될 수 있음을 제시하였다.
[00102] 감마-토코페롤의 유입과 농도는 혈장에 관련된 결장 상피세포에서 극적인 차이가 있었다. Tran과 Chan [33]은 감마-토코페롤이 알파-토코페롤에 비하여 우선적으로 사람의 상피세포에 유입됨을 보여주었고, Nair 등[34]은 인 비보에서 사람의 결장 상피세포 내의 감마-토코페롤 농도가 알파-토코페롤에 비해 2배 높다는 것을 보여 주었다. 따라서, 혈액공급에 의해 1차적으로 공급된 조직은 선택적으로 알파-토코페롤이 풍부한 반면[18], 긴 창자로부터 직접 토코페롤을 흡수한 결장 상피세포는, 이 이성질체들의 음식에 의한 비율로 표시되는 농도를 가진다[34].
[00103] 본 명세서는 대조군과 비교하여, OC, 전립선암, 산장세포 암종, 유방암 또는 폐암이 아닌 CRC 환자의 혈청의 알파-토코페롤/토코트리올 농도가 유의하게 감소됨을 공개한다. 추가적으로, 대조군에 대한 전립선암, 산장세포 암종, 유방암 또는 폐암이 아닌 CRC 및 OC 환자의 혈청에서 감마-토코페롤 및 감마-토코페롤/토코트리올-관련 대사산물 강도가 유의하게 감소됨을 공개한다.
[00104] 어떤 특유의 이론에 관련되어 있기를 바라는 바 없이, 본 발명에서, 여기에 개시한 신규한 대사산물들은 비타민 E 활성의 지표이며, 일부 대사산물들의 감소는 하기의 상황 중의 하나를 나타내는 것으로 가정된다:
1. 음식에 의하여 공급된 비타민 E 및 관련 대사산물들이 과산화되거나 초과비율로 소비된 대사상태;
2. 비타민 E 및 관련 대사산물들의 식이성 결핍 또는 흡수성 악화; 및
3. 비타민 E -관련 대사산물들의 식이성 결핍 또는 흡수성/상피세포성 수송 악화.
[00105] 혈청 비타민 E 농도와 CRC 상관관계에 대한 특이적인 연관성 때문에, 대조군에 비하여 CRC 환자에서의 비타민 E 수준이 유의하게 감소된 보고서는 전혀 없었다. 가장 최근에 활발한 연구가 Ingles 등에 의해 이루어졌다[35]. 이 연구에서 저자는 다음과 같이 설명하였다: "본 발명자들은 s상 결장경 검사법에 기초한 이전 연구로부터 332명의 결장성 선종 대상자 및 363명의 대조군 대상자의 혈장 알파 및 감마-토코페롤 농도를 검사하였다. 증가하는 알파 및 감소하는 감마-토코페롤은 큰 크기(>=lcm)의 선종의 발병률 감소와 관련 있었으나 작은 크기(<=lcm)의 선종과는 관계가 없었다; 그러나, 잠재적인 다양한 혼란성이 조정된 이후에는 이 경향성이 유의하지 않았다."
[00106] 전술한 비타민 E와 CRC에 관계된 모든 관련 유행병학 연구에서 연구의 초점은, 질병의 발병률에 음식이 밀접하게 관계하고 있다는 것이다. 상기의 연구들 중 어떤 것도 상기의 내재적인 대사산물들이 질병에 영향이 있음을 염두에 두고 있지 않는다. 그러므로, 잠재적인 가설 중 하나는 특이 비타민 또는 영양성분의 음식에 의한 결핍은 특별한 질병의 발병율을 증가시킬 수 있다는 것이다. 질병상태가 필수적인 영양성분이나 비타민 결핍을 유도한다는 가설은 고려되지 않는다.
[00107] 본 명세서에서 개시된 발명에 기초하여, 비록 식이성 결핍이 CRC 발병율에 대한 위험율을 증가시킬지도 모르지만(결론적으로 증거는 없음), CRC가 존재한다면 비타민 E 이성질체와 관련 대사산물들은 결과적으로 감소한다고 생각되어 진다. 이러한 감소 수준은 단순한 식이성 결핍의 결과로 되기 쉽지 않으며, 그에 대한 강한 연관성은 유행병학 연구에서 밝혀져 왔다. 만약 반대로 CRC가 이러한 대사산물들의 감소의 원인이라면, 비타민 E 농도와 CRC 사이의 약한 유행병학 연관성이 정상인으로 추정되는 무리에서 CRC가 간단하게 검출될 수도 있는 초기 결과가 될지도 모르는데, 이는 CRC가 결장경 검사법으로 검출될 수 있는 크기와 정도(단계)를 밝히기 위하여 수년이 걸린다고 알려져 있기 때문이다.
[00108] 본 명세서에서 개시한 발명에 기초하여, 비타민 E-유사 대사산물의 수준의 감소는 또한 단순한 식이성 결핍의 결과가 아니라 오히려 비타민 E 및 관련 분자들에 대한 결장 상피세포성 유입에 대한 손상의 결과로 생각되어 진다. 그러므로, 이것은 산화적 스트레스가 부하되는 조건하에서 상피세포에 항산화 효능을 충분히 공급하기 위한 비율-제한 단계를 나타낸다. 이 모델에서, 붉은색 육류, 고 포화된 지방 및 감소된 식이섬유(철 킬레이트화 효과를 감소시킴[36])를 통하여 철 소비를 증가시키는 음식 효과는 앞서 언급한 펜톤 유도 자유 라디칼 전파의 결과이며, 이것의 충분한 포집은 적당한 수준의 상피의 비타민 E에 의존된다. 그러므로, 비타민 E 관련 수송 결핍과 연관된 상피의 자유 라디칼 부하 증가는 간의 유입 및 P450-매개 대사에 의한 카르복실화가 감소된 이성질체에서의 감소뿐만 아니라 항산화제인 비타민 E-유사 대사산물들의 감소에 의해 영향 받을 수 있다. 최근, CaCo-2 결장 상피 세포로의 비타민 E 의 유입은 단백질-매개에 매우 의존적인 포화과정임을 보여주었다[37]. 단백질 수송체들이 필수적인 단백질이고, 전형적인 미캘리스-멘톤 운동역학을 따르기 때문에, 비타민 E가 결장의 상피세포에 유입될 수 있는 비율은 최대 속도(Vmax)에 이를 것이며, 상기는 CRC 발달을 위한 충분한 항산화제 방어효과를 제공할 수 없을지도 모른다. 그러므로, 이러한 때, 비타민 E가 결장 상피세포 내로 수송될 수 있는 비율 이상으로 산화 스트레스 비율이 증가되면 결장내/상피의 웅덩이가 고갈될 것이다. 그러므로, CRC의 발달에 대한 가설은 음식에서 철 및 저 식이섬유의 증가뿐만 아니라, 비타민 E 감마 및 관련 대사산물들의 상피의 유입 결핍에서 기초되었다. 이것은 일부 의미있는 CRC 발생율과 식이성 비타민 E 보충물 사이의 상관관계의 결핍을 보여주는 많은 유행병학의 연구와 일치하며, 이는 이 모델 하의 비타민 E의 다량의 복용량은 내부-상피의 수준의 증가에 의해 반영되지 않을 것이기 때문이다.
[00109] CRC 병리학에 특이적인 9개의 대사산물들(M-H 이온이 중성 질량으로 전이됨)의 정밀 중성 질량은 FTICR-MS로 측정되었으며, 상기 중성 질량은 446.3406, 448.3563, 450.3726, 464.3522, 466.3661, 468.3840, 538.4259, 592.4711 및 594.4851이다. 이 정밀 중성 질량 값에 기초로 하여, 9 개의 바람직한 진단용 생물 표지자의 분자식이 각각 C28H46O4, C28H48O4, C28H50O4, C28H48O5, C28H50O5, C28H52O5, C32H58O6, C36H64O6, C36H66O6로 결정되었다.
[00110] 이 대사산물의 M-H 이온은 도 13 내지 21에서 표기된 딸 이온보다, 하나 또는 그 이상을 포함하는 충돌 유도 분해(CID) MS/MS 단편화로 특징되었다. 더욱 상세하게는, 이 7 개의 대사산물들은 도 13 내지 21에서 표기된 각각의 딸 이온을 포함하는 충돌 유도 분해(CID) MS/MS 단편화 패턴으로 특징되었다.
[00111] 정밀 질량 스펙트럼에 기초하여, 추정 구조를 각각의 생물 표지자들과 비교하여 확인하였다. 생물 표지자들에 대하여 수집된 MS/MS 스펙트럼의 해석에서 그들 모두가 카르복시산 부분(CO2 소실에 의해 증명됨)과 최소 하나의 수산기 부분( H2O 소실에 의해 증명됨)을 포함하는 것으로 나타났다. 더군다나, C28H46O4를 제외한 모든 구조가 높은 포화 지방산 곁사슬로 생각되는 C18HxOy 단편을 생산하였다( 여기에서 x>31 및 y>2 임). 이 정보는 감마-토코페롤 및 감마-토코트리에놀의 대사산물인 C28 분자와 일치하였다. C32 및 C36 생물 표지자는 각각 감마-토코페롤과 리놀레산 및 올레 잔기의 지질 과산화물의 반응의 결과로 생기는 대사 부산물로 뒤이어 가정하였다.
[00112] 6개의 선별된 대사산물 중 확정된 4개의 구조 및 2개의 추정 구조를 도 12에 나타내었다.
[00113] 본 발명은 또한 하기의 예시들을 참고하나, 이에 제한되지 않는다.
[0039] 본 발명의 특징 및 다른 특징은 본 발명에 첨부된 그림을 설명한 다음의 설명에 의해 더욱 명확하게 된다:
[0040] 도 1은 본 발명의 예시에 따르는 CRC/OC 진단의 생물 표지자 패널의 동정을 포함하는 단계를 요약하여 나타낸 것이며,
[0041] 도 2는 마이크로어레이 분석의 예측(prediction of microarray analysis;PAM)의 연습과오 플랏 (도 2A) 및 교차확인된 분류오류 과오 플랏 (도 2B)를 나타낸 것이며,
[0042] 도 3은 도2에서 산출된 분류를 기초로 하여 모든 시료에 대한 PAM 출력 교차확인된 진단의 가능성을 나타낸 것이며,
[0043] 도 4는 교차 확인된 가능성에 기초한 ROC 곡선(receiver-operator characteristic curve)를 나타낸 것이며,
[0044] 도 5는 시료의 반은 연습용으로, 나머지 반은 맹검세트로 사용되었을 때, 맹검시료에 대한 진단의 예측을 나타낸 것이며,
[0045] 도 6은 맹검 세트 진단에 의한 예측결과((도 6A) 및 ROC 커브 (도 6B)를 나타낸 것이며,
[0046] 도 7은 6개의 선택된 생물 표지자들의 원 FTMS 스펙스럼들(FTMS 중성 질량 참조; 도 7A-7F)를 나타낸 것으로, 위쪽 패널은 5개의 정상시료들에 대한 것이고, 아래쪽 패널은 5개의 CRC- 양성 시료들에 대한 것이며,
[0047] 도 8은 6개의 생물 표지자들에 대한 QSTAR 추출된 이온 크로마토그램의 결과를 나타낸 것으로(정상 검출된 질량은 도 8A-8F로 표기), 위쪽 패널은 5개의 정상시료들에 대한 것이고, 아래쪽 패널은 5개의 CRC- 양성 시료들에 대한 것이며,
[0048] 도 9는 윈도우의 유지시간동안 추출된 평균 질량 스팩트럼의 결과를 나타낸 것으로, 도 9A 및 도 9B는 각각 5개의 정상 시료 및 CRC 시료에 대한 16-17 분 간 각각 검출된 QSTAR에 대한 것이고, 도 9C는 전체 차이를 나타낸 것이며,
[0049] 도 10은 5명의 CRC와 5명의 정상 시료에 대하여 FTMS(도 10A) 및 Q-star(도 10B)의 평균 CRC 생물 표지자 강도들을 나타낸 것이고; 각 생물 표지자의 제 1 컬럼은 CRC-양성을; 제 2 컬럼은 정상을 나타낸 것,
[0050] 도 11은 FTMS 데이터세트에서 검출된 비타민 E-유사 패밀리의 일부인 30 개의 대산산물들의 그래프를 나타낸 것이고; 상기 대사산물들 포함한 탄소수에 따라 몇 그룹으로 분류할 수 있다. 또한, 감마 토코페롤(GT)과 알파 토코페롤(AT)의 강도를 나타내었다.
[0051] 도 12는 MSMS과 NMR에 의해 결정된 감마 토코페롤(도 12A)과 토코트 리에놀 (도 12B) 및 6개의 C28-함유 비타민 E-유사 분자(도 12C 내지 12H)를 나타낸 것이고,
[0052] 도 13은 중성 질량 생물 표지자 448.3726(C28H48O4)에 대한 주요한 MS/MS 단편들들의 추정 구조를 나타낸 것이며,
[0053] 도 14는 중성 질량 생물 표지자 464.3522 (C28H48O5)에 대한 주요한 MS/MS 단편들의 추정 구조를 나타낸 것이며,
[0054] 도 15는 중성 질량 생물 표지자 446.3522 (C28H46O4)에 대한 주요한 MS/MS 단편들의 추정 구조를 나타낸 것이며,
[0055] 도 16는 중성 질량 생물 표지자 466.3661 (C28H50O5)에 대한 주요한 MS/MS 단편들의 추정 구조를 나타낸 것이며,
[0056] 도 17는 중성 질량 생물 표지자 450.3726 (C28H50O4)에 대한 주요한 MS/MS 단편들의 추정 구조를 나타낸 것이며,
[0057] 도 18는 중성 질량 생물 표지자 468.3840 (C28H52O5)에 대한 주요한 MS/MS 단편들의 추정 구조를 나타낸 것이며,
[0058] 도 19는 중성 질량 생물 표지자 538.4259 (C32H58O6)에 대한 주요한 MS/MS 단편들의 추정 구조를 나타낸 것이며,
[0059] 도 20는 중성 질량 생물 표지자 592.4711 (C36H64O6)에 대한 주요한 MS/MS 단편들의 추정 구조를 나타낸 것이며,
[0060] 도 21는 중성 질량 생물 표지자 594.4851 (C36H66O6)에 대한 주요한 MS/MS 단편들의 추정 구조를 나타낸 것이며,
[0061] 도 22는 448.3406 (C28H48O4)의 1H-NMR 분석 스펙트럼을 나타낸 것이며,
[0062] 도 23는 464.3522 (C28H48O5)의 1H-NMR 분석 스펙트럼을 나타낸 것이며,
[0063] 도 24는 446.3406 (C28H46O4)의 1H-NMR 분석 스펙트럼을 나타낸 것이며,
[0064] 도 25는 466.3661 (C28H50O5)의 1H-NMR 분석 스펙트럼을 나타낸 것이며,
[0065] 도 26는 MS/MS 고처리 검색 방법을 요약하여 나타낸 것이며,
[0066] 도 27은 6개의 생물 표지자 전이와 내부 표준 전이의 분석 스크린샷(도 27A-27F) 및 하우스키핑 전이의 분석 스크린샷(도 27G)을 나타낸 것으로, 각 페이지는 전형적인 "정상" 과 전형적인 "CRC 양성"개체의 전이에서 피크 면적을 보여주며, 위쪽 4개 플랏은 정상 전이이며, 아래쪽 4개는 CRC 양성의 전이이며, 이때, BM는 생물 표지자, IS는 내부 표준을 나타내고,
[0067] 도 28은 288명의 질환 없는 개체들의 최종 HTS 출력을 기초로 분류된 정상 집단을 나타낸 것으로, -1.3은 CRC에 대한 고위험율로 고려되는 사람 이하 점에서 선별된 컷오프 값을 나타낸 것이며(도 29 참조),
[0068] 도 29는 HTS 진단 산출값을 나타낸 것으로, 도 28의 정상인 대상에 기초한 컷오프율은 90.5%의 특이성에 도달되도록 선별된 것이며, 환자 점수가 -4 내지 -1.3이면 CRC에 대하여 고위험율이고, -1.3 내지 -0.8이면 중간 위험율이고, -0.8이하이면 저위험율이며, 이때의 권고과정이 나열되어 있으며,
[0069] 도 30은 지질 과산화에 의한 감마-토코페롤/토코트리에놀 중화를 나타낸 것으로, 도 30A는 불포화지방산의 자가산화를, 도 30B는 감마-토코페롤의 과산화 라디칼의 안정성을, 도 30C는 감마-토코페롤 라디칼에 의한 과산화 라디칼과의 반응을, 및 도 30D는 감마-토코페롤에 의해 형성된 두 개의 반-안정된 과산화물을 나타낸 것이며,
[0070] 도 31은 철의 존재 하에서 감마-토코페롤 과산화물의 내부 분해를 나타낸 것으로, 도 31A는 리놀레산에서 발생된 토코페롤 대산산물의 C30 시리즈를, 도 31B는 리놀레산에서 발생된 토코페롤 대산산물의 C32 시리즈를, 도 31C 는 리놀레산에서 발생된 토코페롤 대산산물의 C36 시리즈를 나타낸 것이며,
[0071] 도 32는 철의 존재 하에서 하이드로과산화물의 분해를 나타내며,
[0072] 도 33는 자유 라디칼의 산발적인 절단을 나타낸 것으로, 도 33A는 점선 "A"에 표시된 결합이 절단된 결과인 짧은 사슬의 라디칼과 긴 사슬의 알데하이드를, 도 33B는 점선 "B" 결합이 산발적으로 절단된 결과인 짧은 사슬의 알데하이드와 긴 사슬의 알칸 알데하이드를 나타낸 것이며,
[0073] 도 34는 감마-토코페롤이 자유 알칼 라디갈을 중화할 수 있다는 것을 나타내는 것으로, 방해받지 않은 감마-토코페롤/토코트리에놀의 방향성 환 구조는 라디칼 알칸으로부터 수소 라디칼을 받아들여, 결과적으로 환-안정적인 토코페롤/토코트리에놀 라디칼 및 안정적인 알켄으로 되며(도 34A), 이 수소 라디칼 수용 반응은 환구조가 단일 이중결합으로 환원될 때 4차례나 발생될 수 있음(도 34B)을 나타내며,
[0074] 도 35는 간의 P450 대사의 결과인 오메가 카르복실화를 나타내며,
[0075] 도 36은 정상 상태(도 36A)에서와 CRC 및 OC (도 36B)에서 비타민 E 및 관련 대사산물의 역할에 대한 가설을 보여주는 것이다.
[00115] 실시예 1: 건강한 정상 대조군에 대하여 CRC -양성에서 차별적으로 발현되는 대사산물들의 개발 및 동정.
[00116] 본 발명에서 기술한 CRC의 생물화학적 표지자들은 CRC-양성 환자(24 TNM 단계 I/II 및 16 단계 III/IV)의 혈청 시료에서 40개 및 정상 대조군의 50개의 혈청 시료를 분석하여 얻었다. 모든 시료는 단회(single time-point)에 수집되었으며, CRC 시료들은 종양의 외과 절제 전 또는 후에 즉시 채취되었다. 모든 시료는 화학치료 또는 방사선 치료 전에 채취되었다.
[00117] 다중 비-표적화 대사학 방법은 NMR [38], GC-MS [39-41], LC-MS, 및 FTMS 방법 [38, 42- 44]을 포함하는 과학 문헌에 기술되어 있다. 본 발명에서 사용된 차별적으로 발현되는 대사산물들의 발견을 적용한 대사 프로파일링 방법은, 피노미넘 디스커버리(본 출원인)에 의해 발명된 비-표적화 FTMS 방법이다[40, 44-47].
[00118] 본 발명은 여기에 기술한 바와 같이, FTMS에 직접 주입 및 ESI 또는 APCI에 의한 이온화를 이용하여 90명( 40명의 CRC 및 50명 정상인)의 혈청추출물을 양성 및 음성 모드로 분석하였다. 다른 MS-기본(질량분석기를 기본으로 하는) 플랫폼 상위에 있는 FTMS의 이점은 높은 해상능력으로, 1 달톤을 오직 수백분의 1로 미분하여 저해상 기기에 의해서는 놓칠 수 있는 많은 대사산물을 분리할 수 있다. 유기(100% 부탄올) 시료 추출물은 메탄올: 0.1%(v/v) 암모늄 수산화물(50:50, v/v)(음성이온화 모드용) 또는 메탄올: 0.1% (v/v) 포름산 (50:50, v/v)(양성이온화 모드용)으로 3배 또는 6배로 희석하였다. APCI용으로, 에틸 아세트산염 유기 시료 추출물은 희석 없이 바로 주입하였다. 모든 분석은 7.0 T 활성 차폐 초전도 자석이 장착된 버커 달토닉스 아펙스(Bruker Daltonics APEX) III FTMS (Bruker Daltonics, Billerica, MA)를 이용하여 수행되었다. 시료들은 ESI 및 APCI를 이용하여 시간당 600 μL 유입율로 직접 주입되었다. 이온 전달/검출 검량계(parameter)들은 세린, 테트라-알라닌, 레세핀, 헤일렛-페카드 조정(tuning) 혼합물 및 아드레노코티토트로픽 호르몬 단편 4-10으로 최적화시켰다. 게다가, 기기의 상태는 기기 매뉴얼(사용설명서)의 권고에 따라, 이온강도 및 전체 밴드들이 100- 1000 amu 질량의 범위 상에 있도록 최적화하여 조정하였다. 상기 언급된 표준 혼합물은 각 시료의 스펙트럼에 대하여 100-1000 amu 범위 상에서 얻은 정확한 질량으로 내부 보정하여 사용하였다.
[00119] 이에 따라 추출물과 이온화 모드의 혼합을 포함하는 6개의 분리 분석은 각 시료로부터 획득하였다:
수용성 추출물
1. 양성 ESI (분석모드 1101)
2. 음성 ESI (분석모드 1102) 유기 추출물
3. 양성 ESI (분석모드 1201)
4. 음성 ESI (분석모드 1202)
5. 양성 APCI (분석모드 1203)
6. 음성 APCI (분석모드 1204)
[00120] 선형 최소제곱회귀선을 이용하여, 각각의 내부 표준 질량 피크는 이론적 질량과 비교하여 1 ppm 이하의 오차값을 갖도록 질량축 값을 보정하였다. 버커 달토닉스 사의 소프트웨어 XMASS를 이용하여, 1 메가 단어의 데이터 총 크기를 얻었으며, 2 메가 단어로 덮어씌웠다(zero-filled). sinm 데이터 변환은 푸리에 변환 및 광도 계산 전에 운행되었다. 각 분석으로 얻은 질량 스펙트럼들은 정밀 질량과 각 피크의 절대적인 강도를 포함하는 피크 리스트를 생성하도록 통합시킨다. 100-2000 m/z 범위의 화합물들이 분석되었다. 서로 다른 이온화 모드 및 극성에 따른 데이터를 비교 요약하기 위하여, 모든 검출된 질량 피크는 수소 부가물 형성에 영향을 미치는 중성 질량으로 전환하였다. DISCOVAmetrics™ 소프트웨어를 사용하여 2차원적인 어레이( 질량 대 시료 강도)를 자동 산출하였다. 다중 파일로부터 얻은 데이터는 병합되었고, 상기 혼합된 파일은 모두 특유의 질량 값으로 결정되어 처리되었다. 각 특유의 질량에 대한 평균값이 결정되어 y-축으로 나타내었다. 그리고 선별된 각 파일에서 얻은 각 질량에 대한 강도는 x, y좌표에 채워 넣었다. 강도 값이 없는 좌표들은 비워 두었다. 한번 (데이터가 좌표에) 정렬되면, 데이터는 뒤이어 처리되고 가시화되고 간섭되며, 가상의 화학적 동정이 선정되었다. 이때, 각 스펙트럼들은 질량을 얻기 위한 피크가 선정되어 만들어지고 모든 대사산물들의 강도가 검출되었다. 모든 모드의 상기 데이터들을 각 시료 당 하나의 데이터 파일을 생성하기 위하여 병합하였다. 각 시료를 컬럼으로 나타내고, 특유의 각각 대사산물은 한 선에 나타내도록 2-차 대사산물의 배열하기 위하여, 총 90개의 시료의 데이터를 병합하고 정렬하였다. 세포에서, 얻어진 대사산물 시료 혼합에 대응하는 상기 시료의 대사산물의 강도가 전시되었다. 데이터가 이 형식으로 표시되면, 시료의 그룹( 예로서 정상과 암 그룹) 간에 차이가 있는 대사산물들을 결정할 수 있다.
[00121] 스튜던트 T-테스트는 정상과 CRC-양성 시료 사이에 차이가 있는 대사산물(p<0.05)을 선별하기 위하여 사용되었다. 대사산물들(480)은 표 3에 나타낸 판정기준을 적용하였다. 모든 특징은 두 개체 간에 통계적으로 유의하게 다르며 따라서 잠재적인 진단 활용성을 가진다. 이 특징은 정확한 질량과 분석 모드에 의해 설명되어지며, 이것들은 서로 각 대사산물들의 예상 분자식과 화학적 특징(예컨대, 극성 및 예상 기능기)을 제공하기에 충분하였다. 그러나, 480개의 신호들을 상업적으로 유용한 검사로 통합 및 개발하는 것은 비현실적이며, 따라서 하기에 기 재된 바와 같이, 관리 통계방법은 480개의 최적의 진단적 특징 세트를 추출하기 위하여 사용하였다.
[00122]소위, 마이크로어레이 추정 분석(PAM; prediction analysis of microarrays) (http://www-stat.stanford.edu/~tibs/PAM/)이라 불리는 한 관리 통계방법은 초기 배열로 부터 최적의 진단 특성을 갖는 대사산물 특징을 선별하기 위하여 사용되었다[48]. 이 방법은 시료를 사용하여 미지의 시료(예를 들어 검사 세트)의 분석에 적용시킬 수 있는 관련 공지의 진단방법으로 분류 알고리즘을 숙련하는 것을 포함한다. 몇몇 관리(supervised) 방법은, 최상의 특징 세트를 동정하기 위하여 사용될 수 있는 것으로서, 인공신경회로망(artificial neural networks ;ANNs), 서포트 벡터 머신(support vector machines ;SVMs), 부분최소자승판별분석(partial least squares discriminant analysis ;PLSDA), 서브 리니어 연관 분석법(sub-linear association methods), 베이즈의 추론 방법(Bayesian inference methods), 관리 주요구성요소 분석(supervised principal component analysis (PCA), 쉬런켄 센트로이드(shrunken centroids)(여기에서 기술됨)을 포함한다([49] 참조).
[00123] 본 연구에서 40명의 CRC 시료를 분석하는 동안, CRC를 진단하는 PAM 방법의 유효성은 두 가지 방법으로 검사하였다. 첫째, 교차 타당 연습용 분류기(a cross-validated training classifier)는 검사 세트에 대하여 어떤 시료도 남기지 않고 90명의 모든 시료(CRC와 정상)를 사용하여 수행하였다. 두 번째 방법은 시료를 무작위로 나누어, 반은 분류 생성을 위해 사용하고, 나머지 반은 진단을 위한 맹 "검사 세트"로 사용하였다. 첫 번째 방법이 더 많은 시료를 사용하여 분류기를 운행하기 때문에, 이의 예측되는 정확성은 두 번째 접근방법에 비해 더 높게 기대되며, 그 결과로서 높은 진단의 정확성을 가진 대사산물을 훨씬 작게 요구될 수 있다. 첫 번째 방법에서 동정된 동일한 진단 특징은 두 번째 방법에서 동정된 하위세트에 포함되는 것이 요점이다. 상기의 결과 및 질량 분광분석 데이터로 부터 얻은 신호-간-노이즈의 강도 정보에 기초하여, 7개의 대사산물들이 더 자세한 구조적 특성을 위하여 최적의 CRC 진단 생물 표지자 세트로 선별되었다. 도 2 A의 그래프는 수많은 대사산물에 대하여 다양한 역치값 (사용자 정의가능한 PAM 파라미터)에서 얻은 연습과오를 나타낸다. 이 플랏은, 10%의 연습과오(0.1 연습과오)률보다 낮은 값을 가지는 연습용 분류기는 겨우 7개의 대사산물 특징(약 5.8의 역치값, 화살표 참조)에 대해서만 가능함을 보여준다. 가장 낮은 연습과오는 300 또는 더 많은 대사산물 특징을 사용하여 달성될 때 유의할 만한 가치가 있으나, 과오는 단지 7개의 대사산물 특징을 사용할 때 보다 낮은 백분율 값을 가지며, 수백의 특징을 사용하는 것에 대해서는 임상적 유용성이 비현실적일 수 있다. 도 2B의 플랏은 개념상 2A와 유사하기는 하나, 2B의 그래프는 PAM 프로그램에 대한 교차확인 과정적분에 따라, CRC와 정상개체에 대한 연습용 분류기의 분류오류 과오를 나타낸다. 마름모로 연결된 선은, CRC-양성 개체에 대한 최소의 교차확인 분류오류과오가 겨우 7개의 대사산물을 사용하여 운행될 수 있었던 이전 결과를 반영한다. 또한 사각형으로 표시된 정상 개체들이 하나의 대사산물 특징만으로도 정확하게 정상으로 진단될 수 있으나, 이 역치에서는 CRC에 대한 분류오류과오는 95%이상이다( 화살표 참조). 그러므로, 상기 CRC 양성과 음성을 모두 진단할 수 있는 방법에 기초한 대사산물 특징에 대한 최상의 혼합은, 7개의 대사산물 특징을 혼합하여 구성된다. 상기 대사산물은446.3406, 450.3726, 466.3661, 538.4259, 468.384, 592.4711 및 594.4851 또는 실질적으로 등가의 질량을 포함한다.
[00124] 본 연구에서 90명의 개체 각각에 대한 개체간 교차확인된 진단의 유용성은 도 3에 나타내었다. 모든 CRC-양성시료는 그래프의 좌측에, 정상개체의 시료는 우측에 나열되었다. 각 시료는 그래프상에서 두 점을 가지는데, 한 점은 CRC(마름모) 가능성을 나타내며, 한 점은 CRC가 아닌(예로서 정상, 사각형) 가능성을 나타낸다. 여기에서 보는 바와 같이, 정상(그래프에서 좌측 원형)으로 분류된 7개의 CRC 시료와 CRC-양성(그래프에서우측 원형)으로 분류된 2개의 정상 시료가 있다. 이때 JROCFIT (http://www.rad.jhmi.edu/jeng/javarad/roc/JROCFITi.html)를 사용하여 도 4의 수신기작동특성(ROC) 곡선 생성에 예측 가능성이 사용되었는데, 이 가능성은 진짜양성분획(CRC로 예측되어진 CRC 시료) 대 가짜양성분획 (CRC로 예측된 정상개체)을 나타내었다. 곡선의 면적은 95%, 82.5% 민감성, 96%의 특이성을 나타낸다. 결국, 교차확인 디자인에 기초한 진단 정확성은 9O%이다. 상기 7개의 대사산물은 구조적 특성을 위해서도 선별되었다.
[00125]많은 시료들은 연습용 세트로서 이용할수록 미지 시료의 진단에 대하여 분류기의 결과는 더 정확해질 것이다. 이것은 상기 기술된 최적의 진단 표지자 패널 동정에 모든90개의 시료를 사용하려는 이유였다. 그러나, 이 접근법의 결점은 어떤 시료도 맹검세트(연습세트에 포함되지 않음)로서 이용가능성은 없다는 점 이다. 이 문제를 해결하기위한 조치로서, 시료들은 무작위로 두 그룹으로 나누었다: 한 그룹은 분류 생성용 그리고, 한 그룹은 검사세트로 사용. 연습세트는 2개의 CRC 시료와 27개의 정상시료를 포함하였다. 상기 시료들을 이용한 가장 낮은 분류오류과오를 위하여 요구된 최적의 대사산물의 수는 16이며, 도 5의 아래에 나타내었다. 상기 16개중에 상기에서 설명된 7개의 하위세트가 포함되었다. 다음으로, 분류기를 남은 시료(맹검, 22 CRC 및 27정상)의 진단 예측용으로 사용하였다. CRC-양성 또는 정상에 대한 맹검시료의 예측 가능성은 도 5에 플랏으로 나타내었다. 그 결과로서, 두개의 CRC-양성 시료는 정상으로 높은 가능성을 보였고, 두개의 정상시료는 CRC-양성의 높은 가능성을 보였다. 도 6A은 검사 세트, 그들의 활성(양성인지 음성인지) 및 예측된 진단에 사용된 환자들을 나타낸 것이다. 이때 도 5의 가능성을 ROC 곡선으로 환산하여 도 6B에 나타내었다. 맹검 분류에 기초한 운행 특징은 91% 민감성, 92.6%의 특이성 및91.8%의 진단 정확성이다.
[00126] 분류기에 의해 선별된 7개의 대사산물의 검증은 스펙트럼 데이터를 가시화하여 CRC 와 정상 간의 차이점을 보여주는 것이다. 5개의 정상 및 5개의 CRC시료에 대한 7개의 대사산물 중 6개의 스펙트럼은 도 7A 내지 7F (각 패널의 위쪽은 정상, 아래쪽은 CRC)에 나타내었다. 각 경우에서, 표지자는 정상시료에는 있었으나, CRC 시료에는 없었다.
[00127] 상기의 결과로서, CRC-양성 환자와 (CRC가 아닌)건강한 개체의 혈청간의 명확한 구별법이 만들어질 수 있다. 그러므로 CRC-양성과 CRC-음성 혈청을 동정하고 구별가능한 이러한 발견은 본 발명에 기술된 바와 같이 CRC 진단검사의 기 초가 될 수 있다.
[00128] 실시예 2: 발견된 대사산물의 독립적인 방법 확정
[00129] FTMS 방법에 의해 발견된 7개의 진단 대사산물에 대한 정상과 CRC 혈청간의 강도 차이는 독립적인 질량광도분석방법으로 입증되었다. 5개의 대표적인 CRC-양성 시료 추출물과 5개의 대표적인 정상 시료추출물은 HP 1050 고성능액체크로마토그래피에 ABI QSTAR® 질량 분광광도계가 연결된 LC-MS로 분석하였다.
[00130] 5개의 CRC 및 5개의 정상 시료 추출물로 부터 얻은 에틸 아세테이트 분획들은 질소 가스로 증발시키고 70 uL 의 이소프로판올 : 메탄올 : 포름산 (10:90:0.1)에 용해하여 환원시켰다. 10 μL의 환원 시료는 HPLC (HP 1050 , 하이퍼실 ODS 5 u, 125 x 4 mm 컬럼 장착, 에질런트 테크놀로지)에 풀스캔으로 로딩하고, 30 μL 은 MS/MS에 유속율 1 ml/min로 로딩하였다.
[00131] HPLC 용출액은 음성 모드에서 대기압화학이온화(atmospheric pressure chemical ionization (APCI))가 장착된 ABI QSTAR® XL 질량 분광광도계로 분석하였다. 풀스캔 모드의 검색형태는 비행시간형(time-of-flight (TOF))으로, 검색 구성은 축적시간 1.0000 초, 50 내지 1500 Da의 질량범위, 그리고 55분간으로 실시되었다. 소스 파라미터는, 이온 소스 가스 1 (GSl) 80; 이온 소스 가스 2 (GS2) 10; 가리개 가스 (CUR) 30; 유동 분무기(Nebulizer Current) (NC) -3.0; 온도 400℃; 광택 제거능(Declustering Potential) (DP) -60; 초점능(Focusing Potential) (FP) -265; 광택제거능 2 (DP2) -15이다. MS/MS 모드에서, 검색 형태는 생산 이온(product ion)이었으며, 축적시간은 1.0000 초, 검색범위는 50 내지 650 Da 그리고, 검색경과시간은 55분 동안 실시되었다. 모든 소스 파라미터는 -35 V의 충돌 에너지 (CE) 및 5 psi의 충돌가스(CAD, 질소)로 상기와 동일하였다.
[00132] QSTAR®에서 검출한 6개의 생물 표지자에 대한 추출 이온 크로마토그램(EICs)의 결과는 도 8A 내지 8F에 나타내었다. 위쪽 패널은 5개의 정상 EICs의 결과이고, 아래쪽패널은 5개의 CRC EICs의 결과를 나타낸 것이다. 또한 QSTAR® 의 민감성은 FTMS과 비교하여 우수하며, 결과적으로, 선별된 생물 표지자에 대한 정상 및 CRC 개체간의 강도차이는 훨씬 크다.
[00133] 도 9는 6개의 대사산물에 대한 16-17분의 유지시간동안 추출 질량 스펙트럼(EMS)의 3 세트를 창으로 나타내었다. 도 9A는 5개의 정상 시료의 평균 EMS를 보여주는 것이고, 도 9B는 5개의 CRC 시료의 평균 EMS를 보여주는 것이고, 도 9C는 두 스펙트럼간의 최종 차이(net difference)를 나타낸 것이다. 본 결과에서 보여지는 바와 같이, 약 445 및 600 Da 사이의 질량범위의 모든 피크는 CRC 패널에서는 겨우 검출되었다(네모로 표시된 영역). FTMS 플랫폼에서 동정된 모든 7개의 생물 표지자는 Q-Trap으로 검출되었으며, 이 질량 범위내에 가장 큰 피크들은 7개의 대사산물에 해당되었다(화살표로 하이라이트).
[00134] FTMS 및 Q-Star로 검출되는 정상 및 CRC 환자에 대한 7개의 대사산물 평균은 도 10A 와 도 10B에 각각 나타내었다. 상기 분자에 대한 재생산 및 항상성 고갈은 CRC-양성 개체에서 발견되었다.
[00135] 비록 PAM 알고리즘이 "최적의" 진단 성능을 가진 7개의 특징들(대사산물들)이 선별되었지만, 본 발명자들은 분자식, 화학적 성질 및 이온화 정보를 기 초로하여 상기 7개에 연관성을 보이는 대사산물에 대한 초기 FTMS 개발 데이터를 재조사하였다. 본 발명자는 환자 지원자에서 발현이 감소되는 7개의 PAM과 관련된 30개 이상의 분자를 동정할 수 있었다. 이것들은 그들이 가진 탄소수에 따라 C28, C32 또는 C36으로 분류할 수 있었다( 도 11 참조). 게다가, 천연의 알파- 및 감마-토코페롤을 동정하였으며, CRC 지원자에서 이들의 강도가 감소됨을 확인하였다(도 11의 GT 및 AT 참조). 이러한 정보를 바탕으로, 본 발명자들은 초고속 검색방법으로 분자를 재평가하였으며, 항상 CRC와 정상의 두 개체 간에 가장 뚜렷하게 식별되는 것으로 나타나는 6개의 C28 분자를 결정하였다.
[00136] 실시예 3: 일차 대사산물 생물 표지자의 구조 해명((NMR, FTIR 및 MSMS)
[00137] 새로운 대사산물의 구조를 해명하는데 일반적으로 사용된 주요 특징들은 정확한 질량과 분자식 결정, 극성, 산/염기 특성, NMR 스펙트럼 및 MS/MS 또는 MSn 스펙트럼이었다. 그러나, 상기 구조를 결정하기 위하여 대사산물의 다른 특징이 사용될 수 있다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[00138] 정밀 중성 질량, 극성 및 이온화 특성에 기초한 9개의 바람직한 진단 표지자의 분자식은 C28H46O4, C28H48O4, C28H50O4, C28H48O5, C28H50O5, C28H52O5, C32H58O6, C36H64O6, C36H66O6 으로 결정되었다. 본 발명에 따르면, 상기 대사산물들은 세미-포화 크로만 환과 피틸 곁사슬로 구성되어 있으며, 따라서 비타민 E-관련 구조로 구 성되어 있음이 확인되었다.
[00139] 흥미있는 관련 대사산물을 함유하는 추출물들은 상기 상세한 방법에 기술된바와 같이 C18 컬럼과 MS를 활용하는 역상 LC-MS에 적용시켰다. 이 HPLC 조건하에서 상기 유사 비타민 E 생물 표지자에 대한 유지시간은 약 16.5분이다.
[00140] 또한 추출조건은 생물 표지자의 화학적 성질에 대한 지식을 제공한다. 상기 대사산물들은 산성 조건하에서 비극성을 나타내어, 7개의 모든 생물 표지자는 유기 에틸 아세테이트 분획으로 추출하였다. 게다가 이 분자에 산성 양성자가 존재하므로, 음성 APCI 모드에서 이온화하였다.
[00141 ] 얻어진 분자 구조는 그 분자(사람의 지문과 동일한)에 특이적인 한정된 조건하에서 특이적인 단편 패턴을 나타낼 것이다. 심지어 분자구조에 대한 미세한 변화는 다른 단편 패턴에서 얻어질 수 있다. 게다가 분자 동정의 지문을 제공하기 때문에, CID에 의해 생성된 단편은 분자 구조에 대한 지식을 얻는데 사용될 수 있다. MS/MS 분석은 충돌가스로 질소를 이용하여 5 psi 및 CE -25, -35 및 -50 볼트로 세팅하여 이미 언급된 모든 파라미터를 장착한 ABI- QSTAR® XL로 수행하였다.
[00142] 가장 좋은 진단능과 HTS 개발에 대한 적합성을 가진 것으로 확인된 6개의 대사산물들은 충돌 유도 분해(collision-induced dissociation ;CID)를 이용한 MS/MS 단편화에 적용시켰다. 6개의 대사산물은, 그룹에 근접한 오리지날 9개 중에서 모든 C28-함유 분자 및 동일한 분석 모드에서 검출될 수 있는 모든 분자를 선별한 것이다. 도 12A 내지 12F는 감마형태의 토코페롤과 토코트리에놀에 대한 6 개 분자 구조와 비교한 것이다. 이 도는 하기와 같이 상세한 구조에 대한 설명으로 참조될 수 있다.
[00143] 정확한 질량 MS/MS 스펙트럼에 기초로 한 예측 구조는 생물 표지자 각각에 대하여 확인되었다. 요컨대, 생물 표지자의 MS/MS 스펙트럼으로부터 모아진 결과의 해석은, 그들이 모두 카르복시산 부분(이산화탄소의 소실로서 증명됨)과 적어도 하나의 수산기 부분(물의 소실에서 증명됨)을 함유하고 있음이 나타났다. 더군다나, C28H46O4를 제외한 모든 구조는, 과포화된 지방산곁사슬로 제시되는 C18HxOy 단편을 생성하며, 상기에서 x>31 및 y>2이다. 이 정보는 C28 분자가 감마 토코페롤 대사산물이라는 것과 일치한다. 그 결과로서 C32와 C36 생물 표지자는 각각 감마-토코페롤과 리놀레산 및 올레산 잔기의 지질 과산화물과의 반응에서 얻어지는 대사산물의 부산물로 가정되었다(도 19 내지 21). MS/MS 스펙트럼은 이 가설을 지지한다. 기술한 바와 같이 생물 표지자들을 동정한 결과로부터 최소한의 차이 (이중결합위치, 수산기의 위치, 일부 탄소원자의 스테레오 또는 키랄 오리엔테이션을 포함하나 이에 제한되지 않는다)는 현저한 차이가 없다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 단편들에 대한 구조 확정은 도 13 내지 21에 나타내었고 6개에 생물 표지자에 대한 특징은 하기 표 5 내지 10에 나열하였다. 질량들은 중성 질량이 아닌 검출된 질량에 대한 MS-MS 결과를 보고하였다. 이것은 M-I 질량 값으로 언급되었으며, 이전 섹션에서 언급된 중성 대조군과 관련된 구조식에서 질량당 1 달톤 또는 수소 한 분자가 부족하게 나타나는데, 이는 그것들이 질량분광광도계의 음성 이온화 모드에서 검출되었기 때문이다. 그러나, M-I 질량들은 중성 대조군로서 동일한 분자로 표시된다. 그 다음의 NMR 섹션은 중성 질량에 대하여 언급하고자 한다.
[00144] 특히, MS/MS 데이터는 각 생물 표지자에 대하여 음성 이온화 모드에서 얻었으며, 특히 기능기의 교체와 같은 구조 확인은 개별적으로 분석되었다. 각각의 생물 표지자에 대한 이 MS/MS 스펙트럼은 물((M-18) 및 이산화탄소 (M-44) 의 소실에서 기인되는 피크를 나타내었다. 이것은 3차 또는 2차 탄소 분자 및 카르복시산 그룹에 인접하여 유리 수산화 그룹의 존재한다는 것을 규정한다. 또한 피톨 사슬 단편의 일차 소실이 관찰되기는 하지만 사슬의 절단은 다른 장소에서 발생하였다.
[00145] C28H47O4 (표 5, 도 13)에 대하여, 물과 이산화탄소의 초기 손실이 (m/z 385; C27H45O) 관찰되었다. m/z 279 (C19H35O)로 표기되는 다음 단편은 O1-C9에서의 연속 크로만 환 열림 및 C10-C4 자리의 피톨 사슬의 절단을 암시한다.
[00146] C28H47O5 (표 6, 도 14)는, 일정한 이산화탄소의 소실 (m/z = 383; C27H43O) 이외에 2개의 물 분자의 소실을 보이는 2개의 자유 수산기 기능성을 가진다. O1-C9에서의 연속적인 환 열림이 여기에서도 나타나며, Cl8- C19간의 절단에 의해 C22H35O (m/z 315) 단편이 생성된다. m/z 297 (C22H33)에 대응하는 연속적인 신호가 관찰되는데, 환 단편 열림으로부터 물 분자의 소실이 나타난다. 생물 표지자 3 (m/z 448.3726)과 다르게, 피톨 사슬의 절단은 C12-Cl3에서 일어나며, 여기에는 두 개의 반쪽 분자인 m/z 241 (C14H25O3)과 223 (C14H23O2)에 대한 신호가 C28H48O5 의 MS/MS 스펙트럼에서 관찰되었다. 이 특이한 단편은 크로만 환과 피톨 사슬사이에 기능기가 분포한다는 강한 증거이다.
[00147] C28H45O4 (표 7, 도 15)에 대한 MS/MS 스펙트럼은 C28H47O5의 MS/MS 스펙트럼의 패턴과 유사하게 존재한다. 물(m/z 427; C28H43O3)과 이산화탄소(m/z 401; C27H45O2)의 소실이 교체적 및 즉각적으로 일어나는 것이 관찰되었다. C28H47O5 과 같이, 피톨 사슬의 절단은 C12-C13에서 일어나며, C17-C18 사이의 물의 초기 소실 후에 m/z 223 (C14H23O2)의 단편이 생성되었다. 다른 계수기 단편인 C14H21O (m/z 205)도 관찰되었으며, 다음의 2개의 연속되는 단편들의 모이온으로 대표된다: 각각 C2H8 과 CH3의 소실을 나타내는 m/z 177 (C12H17O) 과 162 (C11H114O).
[00148] 흥미롭게도, C28H49O5 (표 8, 도 16)에서, 물 (m/z 447; C28H47O4)과 이산화탄소 (m/z 421; C26H45O3)의 익숙한 손실에 추가하여, 에틸렌 단편 (m/z 405; C26H45O3)에 뒤이은 에탄올 단편의 소실(m/z 433; C27H45O4)도 검출되었다. 상기 관찰들은 크롬 환의 C2-C3 에서 제안된 환 열림과 C27 메틸 그룹의 수산화를 나타내며, 메탄올 및 에틸렌 단편들에 대한 확실한 전구체를 생성한다. 몇몇 다른 단편들은 피톨 곁사슬의 단편에 기인하여 관찰되었다. C18-Cl9 (m/z 349; C22H37O3)에서 절단, 다른 물 분자(m/z 279; C18H31O2)의 소실에 의한 C18-C17 (m/z 297; C18H33O3) 사 이의 초기 물 손실 후에 C1-C2에서 절단 및 C15-C16 (m/z 185; C13H19O3)에서 절단이 그것이다. C12-Cl3간의 예상되는 단편-두개의 계측기 분자-이온의 반쪽인, m/z 241(C15H29O2) 와 223 (C13H19O3)도 관찰되었다.
[00149] C28H49O4 (표 9, 도 17)의 MS/MS 스펙트럼은 물과 이산화탄소 소실(m/z 431 ; C28H49O4, 405; C27H49O2)에 대한 예측을 또한 전시하고 있다. C28H47O5 의 경우와 유사하게, 두 개의 물 분자의 소실(m/z 413; C28H45O2)에 의한 단편을 나타내었다. 이것은 이 구조에서 2개의 유리 수산화기의 존재를 암시하는 것이다. 피톨 환의 절단은 C15-Cl6 (m/z 281; C18H33O2) 사이와 물 분자의 소실 후의 C16-Cl7 (m/z 277; C19H33O)사이인 두 지점에서 일어난다. 이 단편들은 피톨 환과 C17-Cl8 사이에 불포화부분에 수산기가 없다는 것을 입증한다. 따라서, 생물 표지자 7의 구조가 조립되었다.
[00150] C28H51O5 (표 10, 도 18)의 MS/MS 스펙트럼은 두 개의 물분자의 소실 (m/z 431; C28H47O3) 및 두 개의 수산기와 탄소기능기가 존재함을 암시하는 물과 이산화탄소 분자가 동시에 소실되는 또 다른 단편(m/z 405; C27H49O2)을 나타내었다. 단편들의 일부는 C28H49O5의 단편과 동일하게 관찰되며, C28H51O5 와는 불포화 정도의 차이만 있었다. C18-Cl7간의 초기 물의 소실 (m/z 297; C18H33O3)이후의 절단은 또 다른 물 분자의 소실 (m/z 279; C18H31O2) 로 이어졌다. C18H31O2에서 연속적인 CH4 의 소실은 m/z 263 (C17H27O2)의 분자 이온 피크로 표시되었다. m/z 215 (C12H23O3)의 분자 이온 피크는, C13-Cl4 결합이 절단되고 CH3 의 소실로 인한 피톨 사슬의 단편을 의미한다. C15-C16 (m/z 187; C10H19O3)에서 피톨 사슬의 절단에 기인한 단편은 다음 2개의 연속적인 단편의 모이온으로 관찰되었는데, C10H19O3에서 물분자 (m/z 169; C10H17O2) 와 에틸렌 단편의 소실 (m/z 141; C8H13O2)에서 각각 기인되었다.
[00151] 6개의 C28-함유 분자에 추가적으로, 도 19 내지 21에 나타난 바와 같이, 비 C28 비타민 E-유사 분자의 MS/MS 분석을 수행하였다. 이 C32와 C36 생물 표지자들은 각각 감마- 토코페롤 및 리놀레산과 올레산의 지질 과산화물과의 반응결과의 대사산물 부산물로 고려되었다. MS/MS 스펙트럼은 도 19 내지 21에 나타난 바와 같이 이 가설을 증명한다.
[00152] NMR 및 FTIR 방법을 위한 모든 화합제품과 매질은 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich Canada Ltd., Oakville, ON)에서 구입하였다. 모든 유기용매는 HPLC 등급으로 구입하였다. 분석용 TLC(thin layer chromatography)는 미리 코팅된 실리카 겔 TLC 알루미늄 쉬트(EM science, Kieselgel 60 F254, 5 x 2 cm x 0.2 mm)에서 수행하였다. 화합물들은 UV 선 (254/366 nm)하에서 가시화하거나, 요오드 증기 탱크에 옮기고, 1% (w/v) 세륨 황산염과 4% (v/v) H2SO4가 함유된 5% 수용성(w/v) 포스포몰리브딕산 용액에 담구어 열을 가한다음 가시화하였다. 준비된 얇은 층 크로마토그래피((프렙용 TLC)는 실리카겔 판(EM science, 60 F254 20 x 20 cm, 0.25 mm 두께)에서 수행되었다. 화합물들은 UV 하에서 및 요오드에서 가시화되었다. HPLC 분석은 4 방향 펌프, 자동 주입기, 탈가스기 및 Hypersil ODS 컬럼(5 μm 입자 크기 실리카가 장착된 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 52 분 동안 1.0 ml/min의 유속률로 실시하였다.
[00153] NMR 스펙트럼은 버커 에반스 분광광도계(Bruker Avance spectrometers)에 기록되었다; 1H (500MHz) δ 값은 CDCl3 (7.24 ppm에서 CHCl3 ) 와 대조하였고, 13C NMR (125.8 MHz)값은 CDCl3 (77.23 ppm)와 대조하였다. 고해상(HR)-질량 스펙트럼(MS)은 버커 아펙스 7T 푸리에 변환 이온 사이클로트론 공명( Bruker apex 7T Fourier transform ion cyclotron resonance ;FT-ICR)과 대기압 화학 이온화 (APCI) 소스가 장착된 Q스타 XL TOF 질량 분광광도계(QStar XL TOF mass spectrometers)로 음성 모드로 기록하였다. 푸리에 변환 적외선 (FT-IR) 스펙트럼은 바이오-라드(Bio-Rad) FTS-40 분광광도계로 기록하였다. 스펙트럼은 확산 반사율 방법으로 KBr에 시료를 분산시켜서 측정되었다.
[00154] 1H NMR 스펙트럼에서 유사 감마- 토코페롤과 유사 감마-토코트리에놀 화합물의 혼합물로 나타난 혈청 추출물의 반-정제된, HPLC 분획물(32 mg)은 (프렙용 TLC로 정제하여 도 12C-12F에 나타낸 구조를 산출하였다; C (3, 3.6 mg), D (4, 2.5 mg), E (5, 3.4 mg), 및 F (6, 4.6 mg). 본 발명자들은 다음 섹션에서 감 마-토코에노익산과 이 신규 구조를 비교하였다.
[00155] 감마-토코에노익산 3의 분자식은 HRAPCI-MS를 이용하여 C28H48O4 (neutral)로 결정되었으며(도 12C (3) 참조), 5의 불포화도를 갖고 있다. 3315 (br) 과 1741 cm-1 에서 FTIR 흡수성은 수산기 및 탄소기를 의미하였다. 1H 및 13C NMR 분석 데이터(표 11 및 12) 의 분석에서 6개의 메틸기, 4개의 올레핀성 탄소 및 감마-토코트리에놀에 존재하는 것과 동일한 긴 피톨사슬을 나타내었다(도 12B(2))[50, 51]. HMQC 및 HMBC 데이터의 분석은 이 구조의 확인하는 수단으로 사용하였다. δH 2.24 (H-22)에서 메틴 양성자와 장거리 상관관계를 보이는 δc 173.8 (C-23)에 존재하는 카르보닐기-유사 탄소는, 이것의 MS/MS 스펙트럼에서 관찰되는 이산화탄소의 소실에 의해서 카르복시산 기능성으로 확인되었다. 마찬가지로, δH 2.28 (H-4) 에서 메틴 양성자와 깊은 상관관계를 보이는 δc 74.2 (C-9)의 탄소는, δH 2.28 (H-6) 이 또 다른 메틸렌 양성자와 함께 δc 130.5 (C-IO)의 sp2 탄소와의 HMBC 상관관계를 보였다. 이것은 감마-토코트리에놀(도 12B)에 존재하는 세미-불포화 크로만 환 시스템을 나타낸다. 피톨 곁사슬에서, 장거리 상관관계는 δH 1.55 (H-26)의 메틸 양성자와 δc 123.2 (C- 13)의 sp2 탄소, δH 1.01 (H- 12, H- 15) 주변의 메틸렌 양성자와 δc 140.2 (C- 14)의 sp2 탄소 및 δH 0.91 (H-25) 주변의 메틸 양성자과 δc 56.6 (C-18)의 4차) 탄소 사이에서 관찰되었다. MS/MS 스펙트럼 분석은 물과 이산화탄소의 소실에 의한 단편들과 피톨 곁사슬 단편의 소실에 의해 일어나는 C9-O1 자리에서의 환 열림을 확인한다. 따라서, 이 감마-토코에노익산의 구조가 3 (도 12C)으로 확정되었다.
[00156] 감마-토코에노익산 4: 도 12D (4)는 분자식이 C28H48O5 (HRAPCI-MS)로서 불포화도가 5로 표시된다. 3437 (br) 및 1743 cm"1 의 FTIR 흡수성은 수산기 및 탄소기를 의미하였다. 1H 및 13C NMR 스펙트럼은 C28H48O4와 매우 유사하였다. 다만 C28H48O4와의 차이는, MS/MS 단편화에서 추가적인 H2O 소실로 나타나는, 추가적인 수산기를 포함하였으며, H-6 (δH 3.69-3.71)의 메틴 양성자에 대하여 H-5 (δH 2.21-2.25 ) 및 H-7 ((δH 1.47-1.53)의 메틸렌 양성자의 1H - 1H COSY 상관관계로 고려되는 C-6을 확인하였다. MS/MS 스펙트럼 분석은 또한 C14H25O3 (m/z 241) 및 C14H23O2 (m/z 223)의 C12-C13 사이의 절단에 의한 이산화탄소분자와 MS/MS 단편들로 나타나는 카르복실기의 존재를 확인하였으며, 이것은 피톨 곁사슬의 디엔과 크로만 환의 수산화 확인에서 입증된다. 따라서, 도 12D에서 볼 수 있듯이, 감마-토코에노익산 4의 구조가 확인되었다.
[00157] 감마-토코에노익산 5; 도 12E (5)는 분자식이C28H46O4 (HRAPCI-MS) 로 서 불포화도가 6로 표시된다. 3125 (br)와 1736 cm- 1 의 FTIR 흡수성은 수산기 및 탄소기의 존재를 시사하였다. 1H 및 13C NMR 스펙트럼은 C28H48O4와 매우 유사하였다; C6-C7 사이의 매우 높은 탈수화(고탈수화)의 결과로 반-포화 크로만 환 시스템의 추가적인 이중결합의 차이만 있었다. MS/MS 스펙트럼 분석을 통하여 카르복실기, C28H48O5에서 관찰되는 것과 유사하게 C12 와 Cl3 사이가 절단되어 생기는 단편들뿐만 아니라 물 소실에 의한 단편인 C14H23O2 [m/z 223; (C14H25O3 - H2O) and C14H21O (m/z 205; C14H23O2 - H2O)의 존재를 확인하였다. 따라서, 감마-토코에노익산 5의 구조가 도 12E에 나타난 것으로 확정되었다.
[00158] 감마-토코페릭산 6 (도 12F)은 분자식이 C28H50O5 (HRAPCI-MS) 이며, 불포화도는 4로 표시된다. 3314 (br)와 1744 cm- 1 의 FTIR 흡수성은 수산기 및 탄소기의 존재를 시사하였다. 1H 및 13C NMR 스펙트럼들은 C28H48O4 및 C28H48O5 와 일부 유사하였으나 일부 유의하게 다른 점도 있었다. 유사한 점은 6개의 메틸기, 4개의 sp2 혼성 탄소 및 δH 2.28 (H-22)자리에 메틴 양성자와 장거리 상관관계를 보이는 δc 174.1 (C-23)자리의 카르보닐-유사 탄소를 가지는 것이다. 차이점은 크로만 환 시스템의 열림을 포함하는 것으로, 1H NMR 스펙트럼에서 δH 5.12 (H-2, m)의 메틴 양성자와 짝지어진(결합된) δH 4.27 - 4.29 (H-27a, dd, J= 4.0, 12.0 Hz) 과 δH4.04 - 4.14 (H-27b, dd, J= 6.0, 12.0 Hz)자리의 두 개의 메틸렌 양성자를 포함하는 스핀 시스템을 나타내었고, 1H - 1H COSY 및 1H - 1H 동핵 탈짝지음 실험(homonuclear decoupling experiments)에 의해 확인되었다. 추가로 C28H50O5의 HMBC 및 1H - 1H COSY는 메틸 양성자와 sp2 탄소 사이의 장거리 상관관계를 전시하지 않았으며, 이는 감마-토코페린산의 유도체로 확인되는 피톨 곁사슬의 포화도를 표시하는 다른 토코트리에노익산인, C28H48O4, C28H48O5 및 C28H46O4와에 대해서는 일반적인 사실이다. MS/MS 스펙트럼 분석은 카르복실기 및 m/z 241 및 223의 C12와 C13사이의 절단의 결과로서 2개의 일반적인 단편들뿐만 아니라 물의 소실에 의한 단편의 존재를 확인하였다. 이는 C2와 C3 사이의 환 열림과 피톨 사슬의 포화 대신에, 구조양상의 잔기가 토코에노익산 C28H48O4, C28H48O5 및 C28H46O4 으로 정의된 다른 것들과 유사하였다. 따라서, 도 12F의 6에서, 감마-토코에노익산 4의 구조가 확정되었다.
[00159] C58H50O4 (7, 도 12G) 및 C28H52O5 (8, 도 12 H)인 시험 유기용매 시스템을 이용한 프렙용 TLC로 분리할 수 없는 다른 두 개의 생물 표지자의 구조는, 도 12G 및 12H에서 보여지듯이 MS/MS 단편화 데이터를 평가하여 각각 조합하였다.
[00160] 대사산물들은 혈청에서 분리하였으며, 구조는 NMR로 재확인하였다. 총 200 mL의 혈청은 에틸아세테이트(500 mL, 3X)로 추출하였고, 질소 증발기로 건조시켰으며, 추출물은 4 mL의 메탄올에 다시 용해시켰다. 추출물은 분획 수집 모드(100 μL 주입, 4Ox)로 LC/MS를 가동시켰으며, 분획은 52분 동안 1분창으로 수집하였다. 15-17분에 용출된 예측 대사산물들은, 혼합한 다음 질소 증발기를 이용하여 건조하여 농축하였다(약 32 mg). 1H NMR 스펙트럼에서 토코페롤 관련 화합물의 혼합물이 보이는 반 정제된 분획은, 프렙용 TLC에 로딩한 다음 CH2Cl2 - 헥산 (2: 1) 으로 전개하였으며, 그 결과 감마- 토코에노익산 3 (3.6 mg) 및 감마-토코에노익산 4 (2.5 mg)을 얻었다. 남은 밴드는 혼합한 후(약 22 mg) 사이클로헥산 - CH2Cl2 - EtOAc (35:5:1, 2회 전개)을 사용하여 프렙용 TLC 에 전개시켜 감마-토코에노익산 5(3.4 mg), 감마-토코페릭산 6 (4.6 mg) 및 혼합물을 가진 분획 (6.6 mg)을 얻었다.
감마-토코에노익산 3
[00161] TLC Rf = 0.81 (사이클로헥산-CH2C12-EtOAc, 10:4:1); 1H 및 13C NMR 스펙트럼은, 표 11 및 12 참조; FTIR (cm-1) 3315 (br), 2935, 2852, 1741, 1465, 1377, 1178, 726; HRAPCI-MS m/z는 447.3490 ([M - H]-, C28H47O4에 대하여 447.3480 로 계산됨)로 측정되었다; MS/MS m/z (상대강도): 447 ([M - H]-, 50%), 429 (45%), 403 (100%), 385 (20%), 279 (10%).
감마-토코에노익산 4
[00162] TLC Rf = 0.21 (사이클로헥산-CH2Cl2-EtOAc, 10:4:1); 1H and 13C NMR 스펙트럼은, 표 11 및 12 참조; FTIR (cm-1)3347 (br), 2935, 2868, 1743, 1466, 1377, 1057, 958; HRAPCI-MS m/z는 463.3449 ([M-H]-, C28H47O5에 대하여 463.3429 로 계산됨)로 측정되었다; MS/MS m/z (상대강도): 463 ([M - H]", 100%), 445 (50%), 419 (90%), 401 (25%), 241 (20%).
감마-토코에노익산 5
[00163] TLC Rf = 0.79 (사이클로헥산-CH2Cl2-EtOAc, 10:4:1, UV active spot); 1H and 13C NMR 스펙트럼은, 표 11 및 12 참조; FTIR (cm-1) 3125 (br), 2941, 2855, 1736, 1556, 1466, 1377, 1177, 1008, 773; HRAPCI-MS m/z는 445.3333 ([M-H]-, C28H45O4에 대하여 445.3323 로 계산됨)로 측정되었다; MS/MS m/z (상대강도): 445 ([M - H]", 100%), 427 (60%), 401 (85%), 383 (40%), 223 (12%), 205 (20%), 177 (10%), 162 (18%).
감마-토코페릭산 6
[00164] TLC Rf = 0.62 (사이클로헥산-CH2CI2-EtOAc, 10:4:1, UV active spot); 1H and 13C NMR 스펙트럼은, 표 11 및 12 참조; FTIR (cm-1) 3314 (br), 2926, 2854, 1744, 1465, 1379, 1253, 1145, 722; HRAPCI-MS m/z는 465.3588([M-H]-, C28H49O5에 대하여 465.3585 로 계산됨)로 측정되었다; MS/MS m/z (상대강도): 465 ([M - H]", 100%), 447 (50%), 421 (35%), 403 (20%), 349 (10%), 279 (18%).
[00165] 실시예 4. 초고속 검색 ( HTS ) 방법 개발 및 독립적인 시료 세트의 분석
[00166] FTMS 방법으로 발견한 6개의 초기 생물 표지자들을 위하여 개발된 초고속분석검색법은 LC-MS 방법으로 확인하였다 .
[00167] 시료 혈청은 비표적화 FTMS 분석에서 기술된 바와 같이 추출하였다. 에틸 아세테이트 유기 분획은 각 시료의 분석에 사용되었다. 12OuL의 에틸 아세테이트 분획이 있는 각 시료액(같은 양으로 분할된)에 15uL의 내부표준물질(메탄올에 녹인 lng/mL 의 (24-13C)-담즙산)을 추가하여 135uL의 총 부피가 되었다. 자동시료기는 흐름-주입 분석을 이용하여 lOOuL의 시료를 4000QTRAP으로 주입시켰다. 담체 용매는 90% 메탄올:10% 에틸 아세테이트이며, APCI 소스에서 360uL/분 의 유속율을 가진다.
[00168] MS/MS HTS 방법은, 터보 V™ 소스, APCI 탐침자가 장착된, 4중극 직선 이온 트랩 ABI 4000QTrap 질량 분광광도계에서 전개시켰다. 소스 가스 파라미터는 하기와 같다: CUR: 10.0, CAD: 6, NC: -3.0, TEM: 400, GSl : 15, 간섭 온풍 기 켜짐. "화합물" 세팅은 하기와 같다: 엔트랜스능(entrance potential) (EP): -10, 및 충돌 세포 출구능 (collision cell exit potential:CXP): -20.0. 방법은 각 대사산물들에 대한 하나의 모이온 전이, 내재성 하우스키퍼에 대한 하나의 전이 및 내부 표준물질에 대한 단회전이의 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring :MRM)에 기초하였다. 각 전이는 총 회전시간 2.3초에 대하여 250ms로 모니터하였다. 시료에 대한 총 수집 시간은 약 1분이다. 도 26에 전반적인 방법에 대한 요약을 나타내었다. 간단하게, 이 방법은 6개 생물 표지자 각각의 강도를 측정하는 것이며, "하우스키핑"생물 표지자 전이(도 27G)와 마찬가지로, 내부표준물질(IS)전이( 도 27A 내지 27F 참조)는 사람의 혈청에 내재적으로 존재하는 것으로 사전에 결정하였다. 하우스키핑 생물 표지자는 질병의 상태에 따른 변화가 없는 대사산물이며, 정확하게 준비된 어떤 혈청 시료로도 검출될 수 있어야 한다. 그러므로 "하우스키핑" 생물 표지자의 대상은 여러 곳에서 수집된 시료들이 HTS 검사에 대한 호환성이 있음이 확실한 것이다. 6개의 생물 표지자 대 환자당 IS 전이의 비율에 대한 최소 평균-표준화 로그(2)(lowest mean-normalized log(2) 값을 결정한 다음. 이로부터 환자 점수를 책정하였다. 그런 다음, 이 점수를 정상 개체의 점수와 비교함으로써, CRC 위험율 요소가 확인된다. 본 발명자들은, 상기 기술된 방법인 하우스키핑 대사산물 뿐 만 아니라 6개의 생물 표지자 각각에 대한 생물 표지자 전이 대 내부표준물질전이의 비율을 프롯팅한 피크 면적을 ABI 4000QTrap이 정확하게 측정할 수 있다는 것을 확인하였다(도 26). 게다가, 이 HTS 방법은 또한 대조(비교참조로 사용할) 혈청 물질을 희석한 시리즈들을 사용하여 기기에 의한 데 이터의 직선성을 결정 및 확정시킨다. 만약 하우스키핑 대사산물이 검출되지 않거나, 검정곡선의 R2 값이 >0.98이면, 시료 분석은 실패한 것으로 생각하고 시료를 다시 분석할 필요가 있다.
[00169] 상기 비타민 E-유사 분자가 CRC, 186 CRC를 포함하는 독립적인 시료 세트, 288 정상인, 24 전립선 암, 25 난소암, 30 신장 세포 암 종, 25 허파 암 및 20 유방암과 관련 있다는 초기 발견을 입증하기 위하여 상기에서 기술한 HTS 방법을 이용하여 시료를 분석하였다. 이 분석의 결과는 표 13 A에 나타내었는데, 컷 오프율이 -1.3 일 때 CRC에 대한 이 방법의 민감성은 약 78%이며, 이때 상기 컷 오프율은 CRC 발병 고위험율로 고려되는 기준값으로, 도28의 정상에서의 빈도 및 도 29의 진단결과에서 참조되었다. 상기 결과는 대장암에서 상기 신규의 비타민 E-유사 분자의 감소수준을 반박할 수 없게 증명한다. 그러나, 여기에서 전환 암(cross-cancer) 비교는 난소암에 대하여 70%의 민감성, 신장암과 폐암에 대하여 36% 내지 40%의 민감성을 각각 보여주고 있다. 상기 민감성 값은 CRC에 대한 89% 민감성 컷오프에 기초하여 선택되었다(이는 5% 가짜-양성율과 동일한 것으로, 도 28에서 볼 수 있듯이, 정상인의 값은 결장경 검사에서 질환 없음으로 확정되지 않는 개체에 기초한 것이다). 10%의 평균 저위험율 집단은 높은 등급의 형성장애에 대한 내시경 검사가 양성이라는 것은 이미 공지되었으며, 이것은 우리 발명에 고려되지 않는다[52]. 비록 비-CRC 암 세트가 수적으로 작게 관련될지라도, 난소암에 대한 이 검사 결과의 중복은 (의미 있을 만큼)중요하며, 따라서 난소암의 진단방법 을 본 청구항에 포함시켰다. 궁극적으로, 다수의 비-CRC 암 집단은 상기 결과를 확인하기 위한 검사가 필요할 것이다.
[00170] 본 발명자들은 또한 나이, 민족성, BMI 및 성별에 기인되는 경향을 검사하기 위해서 정상인과 CRC-양성 개체의 하위세트를 무작위로 선별하였으며, 어떤 다양한 글래스 내의 상기 생물 표지자의 수준에서도 현저한 차이가 없음을 관찰하였다(표 13B). 게다가, 본 발명자들은 CRC에 대하여 단계 I/II 또는 III/IV (TNM) 중 어느 단계의 환자 그룹 또는 용종의 유무에 대한 어떤 경향성도 없는 것을 관찰하였다(표 13B).
[00171] 실시예 5: CRC 및 OC의 대사경로 혼란의 생물학적 간섭
[00172] 6개의 생물 표지자의 구조해명에 기초하여, FTMS 데이터의 상세 연구 즉, 자유 라디칼 형성과 CRC에 관련된 추가적인 식견이 가설화 되었다.
[00173] 추정되는 토코페롤 및 토코트리에날 대사산물들에 대한 상세 연구에서, 혈청내의 알파 및 감마-토코페롤 농도가 CRC 환자 집단에서 유의하게 감소되어지는 것이 관찰되었다(도 11 참조). 본 발명자들은 알파/감마-토코페롤 비율을 6.3으로 측정하였으며, 이는 이전에 공개된 문헌과 동일하다. 특히, 비록 혈청에서는 알파-토코페롤 강도가 감마 보다 유의하게 높게 관찰되었다고는 하나, 오메가-산화 감마-토코페롤/토코트리에놀 대사산물들에 대한 분자식을 가진 6가지의 대사산물들은 정상인과 CRC 환자에서 모두 관찰되었으며, 이와 같은 사실은 결코 이전문헌에는 보고된 바가 없고, 어디에도 오메가-산화 감마-토코페롤/토코트리에놀이 관찰된 바도 없다는 사실을 밝혔다. 이와 같은 발견은, 사람의 간의 HepG2 세포에 서 오메가 COOH의 형성은 감마 토코페롤에 비해 50배 이상 높다는 것을 밝힌, Sontag과 Parker가 최근에 발견한 내용과도 동일한 것이다[53]. 이 오메가 카르복실화 및 토코페롤에 수반되는 대사는 토코트리에놀에서도 관찰되어왔다[17]. 상기 대사산물들이 Sontag 및 Parker [53] 또는 Birringer 등[17]에 의해 발견되지 않았던 이유는 상기 과학자들이 기술한 오메가-산화 메카니즘이 비-변형 알파 및 감마 토코페롤/토코트리에놀 대사산물들에서 수행되었기 때문이라고 믿어진다. 우리의 결과들은, 오메가-산화는 감마-토코페롤/토코트리에놀이 추정컨대 대장/난소의 상피세포의 둘 중에 하나에서, 또는 대장/난소의 상피세포에서 동시에, 자유라디칼과 반응한 후에 발생함을 의미한다.
[00174] CRC에서 감소되어 관찰되는 수많은 다른 대사산물은, 감마-토코페롤 또는 감마-토코트리에놀-관련으로 추정되어 동정되는 것과 유사한 분자식을 가졌다. 상기 대사산물들은 세 개의 큰 카테고리 즉, 그들이 가진 탄소분자수에 따라 특히 30, 32 또는 36 탄소수를 가진 그룹으로 얻어졌다(도 11). 상기 대사산물들은 감마- 토코페롤과 리놀레닉, 리놀레 및 올레산 지질 잔기(하기에 기재됨)의 과산화 라디칼 사이에 반응으로부터 유래된다는 가정을 세웠다. 상기 감마-토코페롤/토코트리에놀 대사유도체는 간에서 첫 번째 대사를 거치면서 P450을 경유하면서 오메가 산화반응을 겪는다.
[00175] 어떤 특별한 이론에 의해 결합되기를 바라는 것이 아니라, 본 발명은 CRC 및 OC 발병 및 진행과정에서 비타민 E 및 관련 대사산물의 역할에 밀접하게 관련되어 있다는 하나의 가설(도 36)을 개시하는 것으로, 이는 특수한 지방산, 비 타민 E 이성질체, 및 관련대사산물들이 단순한 음식의 결핍의 결과가 아니라, 대장암 상피의 유입에 의해 비타민 E 및 관련 분자들이 감소된다는 것에 기초한 가설이다. 이 감소는 정상 또는 가속화된 산화 스트레스 상에서 항산화 수용능력의 충분한 양에 대한 속도 제한 단계(a rate-limiting step)를 의미한다. 이 모델에서, 대장의 상피세포에서 CRC 또는 OC의 진행과정에 대한 개시는 비타민 E 감마의 결핍이다. 두 개체의 동일한 식이상태의 가정 하에서, 대장 상피세포에 비타민 E 공급을 감소시킨 사람은 자유 라디칼이 상승할 것이다. 이는 본 발명에서 기술한 바와 같이 감소된 혈청 비타민 E 대사산물들에 대하여 직접 비례하였다. 그러나, 본 발명에서 이전에 언급한 바와 같이, 이 가설은 혈청의 감소된 오메가-COOH 대사산물들이 아라키돈산에서 감소된 경쟁적인 저해 효과에 기인하는 프로스타글란딘 생합성 경로에서 음성 저해 효과를 가질 것이라는 결과도 생각하게 하였다. 본 발명자들은 프로스타글란딘 경로 활성이 상피세포 유래의 다른 암 특히, 난소암의 진행과정에 영향을 미친다고 가정한다. 본 발명자들은 또한 CRC 및 다른 암에서 항암제로 쓰이는 비-스테로이드 항염증제(non-steroidal anti-inflammatory drugs :NSAIDS)의 잘 알려진 역할을 설명할 수 있는, 이 메카니즘을 경유하는 CRC의 COX 경로의 추가 활성을 예상하였다.
[00176] 상기 발견들은 CRC 및 OC의 처치전략과 관련하여 중요하다. 이 질병들 모두에서 염증은 위험요소이다. 감마-토코페롤과 감마 카르복시에틸 하이드로크로마놀(CEHC)은 아라키돈 관련 염증을 감소하는 것으로 나타났었다. 감마-토코페롤의 활성 지연은 감마-토코페롤이 생물학적으로 활성분자의 활동에 전구체일 수도 있음을 나타낸다. 다중 오메가 COOH 감마-토코페롤/토코트리에놀 대사산물들의 발견은, 이것들이 내재적인 항염증제이고, 상기 대사산물들의 감소는 CRC 및 OC에 관련된 염증의 결과이거나 염증을 나타냄을 입증한다.
[00177] 자유 라디칼은 대장암의 병인학에 중요한 역학을 할 것으로 생각된다[36], [54], [55]. 본 명세서에서, 본 발명자들은 첫째, CRC가 만성 과산화 스트레스에 연관되어 있으며, 감마-토코페롤은 대장과 난소 상피세포들에서 건강한 산화상태를 유지하는데 중요한 항산화 성질을 가진다는 사실을 관련 가설로 제시한다. 비록 [56] 문헌이 감마-토코페롤의 항산화 성질을 언급하고 있지만, 이 성질은 알파-토코페롤과 동일한 것으로 가정하였다. 본 발명은 감마-토코페롤/트리에놀 또는 관련 대사산물들이 지질 라디칼 포섭 메카니즘을 가질 것임을 나타내는 특유의 메카니즘을 동정한다. 다른 암들과 비교하여 CRC 및 OC에서 높은 정도의 민감성(표 13)을 가지는 이 발견들- 이전 보고서의 조합에서 감마-토코페롤의 대장 상피세포들로의 우선적인 유입, 대장 상피세포에서 알파-토코페롤에 대한 고농도의 감마-토코페롤, 토코페롤들에 대한 트리에놀들의 증가된 생물활성 및 알파-토코페롤에 대한 감마-토코페롤의 증가된 턴오버는 감마-토코페롤/트리에놀- 관련 과정이 상피세포에 항상성에 선택적으로 포함된다는 가설을 지지하는 강한 증거이다.
[00178] 항산화제들은 그들의 작용 과정에서 소비되고 이 작용은 실시간으로 작동되는 즉, 그것은, 하루의 과도한 항산화제 (활성)능력이 다른 날의 결핍된 항산화 능력을 보상하지는 못한다는 것이 잘 확립되어 있다. 게다가 적절하게 부수적인(2차적인) 순환 메카니즘인 항산화제는 (활성)능력과 저장수명이 제한받기 때 문에, 한번 사용되면 산화반응 과정이 점검되지 않는다. 이런 이유로, 다중으로 자유라디칼 분자를 중화하는 능력이 있는 항산화제 분자의 선별은 생물학적으로 인기가 있을 것이다. 단순한 감마-토코페롤/토코트리에놀 한 분자가 6개의 자유 라디칼 분자를 중화할 수 있는 메카니즘은 분석학적인 데이터와 자유라디칼에 대한 이전 문헌에 의해 제안되고 지지되어진다.
[00179] 지질 산화과정은 널리 연구되어 왔다. 도 30은 불포화 지방산(일 실시예에서 리놀레닉산이 사용됨)의 산화 과정을 묘사한다. 간단하게, 수소 라디칼은 탄화수소 분자에서 추출되어진다(도 30A). 빛, 열, 방사선 조사, 금속 이온 또는 라디칼에 의해 매개되는 이 추출은, 포화탄화수소와 비교하여 불포화 탄화수소에서 높은 인기가 있다. 생물학적인 시스템에서, 과산화물의 형성은 개시단계이다(도 30A). 과산화 라디칼은 감마-토코페롤-수산화물(도 30B)에 의해 안정화되거나 또는 b) 감마-토코페롤 과산화 라디칼과 반응할 수 있으며(도 30C), 두 가지 경우 모두에서 반-안정 과산화물을 형성한다. 그런 다음 두 과산화물은 철-촉매화 펜톤 반응(iron-catalyzed Fenton reaction)을 통해서[36] 또는 철에 독립적인 패턴으로 산화질소에 의해서[57], [58], 수산화 라디칼로 전환되었다. 비록 감마-토코페롤이 인 비트로 [59]에서 산화질소를 무독화 하는데 알파-토코페롤에 비해 뛰어난 것으로 보여지나, Stone 등 [60]의 인 비보에서의 연구는 ~2:1 및 1:18의 고비율 또는 저비율의 감마-/알파-토코페롤 음식 및 철의 하루 권장량 또는 8 배의 풍부한 음식 중의 하나를 쥐에게 먹이므로서 대장세포(32%)와 혈장(18%)에서 감마-토코페롤의 수준 및 대장세포에서 알파-토코페롤 수준이 유의하게 감소되어 관찰된 것을 명확하게 설명하였다. 증가된 철은 간이나 배설물에서 알파- 또는 감마-토코페롤 농도에 아무런 영향도 없었다. 소화 장관 내 철 농도는 작은창자와 관련된 대장에서 상당히 높았다. 대장에서의 철 농도는 다른 조직에서 발견되는 철 농도에 비해 10배 이상 높은 것으로 추정되었다[36]. 그러므로, 대장에서의 자유 라디칼 형성은 철-촉매되기 매우 쉽다.
[00180] 수산화 라디칼은 수소 라디칼을 추출하여 안정한 물 분자를 형성하며 그에 의해 지질 라디칼이 생긴다. 모든 토코페롤 및 토코트리에놀은 상기 수산화 라디칼을 중화할 수 있으며, 그에 의하여 지질 자유 라디칼 형성을 막는다. 그러나, 한번 지질 라디칼이 형성되면, 항산화제의 활성은 지질 라디칼과 yk화 편재되는 능력과 관련이 있다. 비타민 E 이성질체들은 지질 막내로 결합되는 적절한 피톨 곁사슬 길이를 포함하며, 이 분자들이 막의 지질 라디칼을 소거하는데 이상적인 역할 한다.
[00181] 쉽게 소거되지 않는 지질 자유 라디칼은 산소와 반응하여 지질 과산화 라디칼을 형성한다(도 30A). 토코페롤/ 토코트리에놀들은 지질 고산화물에 수소 라디칼을 전해줄 수 있고, 그 결과로 토코페롤/ 토코트리에놀 라디칼이 형성되며, 이 라디칼은 크로만 링 구조로 안정화 되며 그 결과 지질 하이드로과산화물이 생긴다(도 30B). 정상 조건하에서, 자유 라디칼 증가는 이 단계에서 멈춰진다. 토코페롤/ 토코트리에놀라디칼은 두 번째 지질 과산화물 라디칼과 반응하여 7개의 전자 분자를 가진 토코페롤/ 토코트리에놀 과산화물을 형성할 수 있다(도 30C). 비록 하이드로/ 알킬 퍼옥사이드 분자가 자유 라디칼은 아니지만, 0-0 결합은 고 에너지로 이 결합을 깨는데 에너지가 많이 소요된다(도 30D). 하이드로과산화물을 쉽게 분해하는 것으로 잘 알려진 대표적인 두 촉매제는 구리와 철이다. 앞서 이 명세서에서 언급한 바와 같이, 긴 창자(작은 창자)는 특히 철이 풍부한 원천이다. 그러므로, 이 하이드로과산화물은 수산화 라디칼과 지질 산화 라디칼로 분해되어 자유 라디칼을 증가시키는 일련의 사건이 재개시된다. 자유 지질 하이드로과산화물과 마찬가지로, 토코페롤/토코트리에놀 과산화물은 철과 이온의 존재 하에서 민감하게 분해되는 것으로 추정된다.
[00182] 본 발명은 이 과산화물이 안정한 토코페롤/토코트리에놀 알킬 에테르와 지질 알데하이드로 내부 분해되는 새로운 메카니즘을 제공한다. 제안된 반응은 열역학적으로 안정한 두 개의 생산물을 생성한다. 내재적인 지질인 리놀레닉, 리놀레산의 초기 불포화 지방산 잔기로부터 형성된 세 개의 과산화물이 이 메카니즘의 토코페롤/토코트리에놀로 중화되었다(도 31 A to C). 이 메카니즘은 감마-토코페롤에 선택적인 것으로 나타났으며, C30, C32 및 C36, 감마-토코페롤의 부산물(알마-토코페롤은 제외됨)이 사람에서 형성된 것이 관찰된 것으로도 입증된다. 개시 하이드로과산화물은 철의 존재하에서 중성 토코페롤/토코트리에놀 분해반응에 의해 형성된 것으로, 이를 분해하여 안정한 생산물을 생성하는 어떤 메카니즘도 없다(도 32). 상기 반응에 의해 수산화 라디칼과 지질 산화 라디칼이 형성되므로, 고전적인 방법으로 중성화할 필요가 있다. 지질 산화 라디칼은 자발적으노 알데하이드와 라디칼 알칸 또는 알켄으로 분해될 수 있다(도 33). 그런고로 본 발명자들은 토코페롤/토코트리에놀이 자유 라디칼 알칸으로 중화되는 추가적인 메카니즘 을 제공한다. 본 발명자들은 감마-토코페롤/토코트리에놀의 방해받지 않는 방향성 환 구조가 라디칼 알칸으로부터 수소 라디칼을 받아서 환-안정적인 토코페롤/토코트리에놀 라디칼과 안정한 알켄을 형성할 수 있다는 점을 제공한다(도 34). 이 메카니즘을 통하여 감마-토코페롤/토코트리에놀은 6개의 알칸 라디칼을 중화할 수 있게 된다. 이 가설은 감마-토코페롤 대사산물의 관찰로서 지지되며, 여기에서 방향성 환은 하나의 이중결합으로 환원된다. 따라서, 감마-토코페롤은 최대 4개의 수소 라디칼을 받아들일 수 있다는 것을 보여준다(도 34). 이 결과로부터, 감마-토코페롤/토코트리에놀 한 분자는 6개의 라디칼을 중화할 수 있다.
[00183] 앞서 논의된 바와 같이, 이 제안된 메카니즘의 결과인 감마-토코페롤 관련 대사산물은 간의 첫 번째 대사를 통과하는 동안 P450 반응을 경유하여 ω-산화를 거친다.
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[00185] 모든 문헌은 여기에 참조로서 관련되어졌다.
[00186] 본 발명은 관련되는 하나 또는 그 이상의 예시를 기술하고 있으나, 발명의 범위로부터 벗어남 없이 많은 다양성과 변형이 있을 수 있음은 당업자에게 자명할 것이다.
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Claims (37)

  1. 하기 단계를 포함하는, 대상에서 결장암 (CRC) 또는 난소암 (OC)을 진단에 사용하기 위한 진단용 대사산물 생물 표지자들을 동정하는 방법 :
    결장암이 존재하는 환자로부터 얻는 다수의 미확인된 대사산물들을 포함하는 시료를 고해상 질량 분광광도계 내에 도입하는 단계;
    대사산물들로부터 데이터를 획득하며, 동정하며 정량하는 단계;
    상기 동정하고 정량한 데이터로부터 데이터베이스를 구축하는 단계;
    시료로부터 동정하며 및 정량한 데이터를 대조 시료의 상응하는 데이터와 비교하는 단계;
    하나 또는 그 이상의 다른 대사산물들을 동정하는 단계로서, 상기 하나 또는 그 이상의 대사산물들은 대상에서 결장암 및 난소암을 진단하는 용도로 사용될 수 있다
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 대사산물들은 표 3에 나열된 대사산물들 또는 단편들 또는 그의 유도체로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2항의 방법에 최적의 진단방법에 필요한 최소수의 대사산물 생물 표지자 들을 선별하는 단계를 더 포함하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 고해상 질량분광광도계는 푸리에 변형 이온싸이클로트론공명 질량분석기(FTMS)인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 대사산물은 정밀 중성 질량이 446.3406, 448.3563, 450.3726, 464.3522, 466.3661, 468.3840, 538.4259, 592.4711 및 594.4851 달톤으로 측정되거나 실질적으로 등가의 대사산물 또는 단편 또는 그의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5 항에 있어서, 상기 대사산물은 정밀 중성 질량이 446.3406, 448.3563, 450.3726, 464.3522, 466.3661, 468.3840, 538.4259, 592.4711 및 594.4851 달톤으로 측정되거나 실질적으로 등가의 대사산물 및 도 13 내지 21 중의 어느 하나에서 보여지는 LC-MS/MS 패턴 또는 단편 또는 그의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 대사산물은 분자식이 C28H46O4, C28H48O4, C28H50O4, C28H48O5, C28H50O5, C28H52O5, C32H58O6, C36H64O6 및 C36H66O6으로 이루어지는 대사산물 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 대사산물은 토코페롤류, 토코트리에놀류, 비타민 E-관련 대사산물들 또는 상기 대사산물의 대사 유도체임을 특징으로 하는 방법.
  9. 표 3에 나열된 대사산물들 또는 단편들 또는 그의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 CRC/OC 암-특이적인 대사 표지자.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 표지자는 정밀 중성 질량이 446.3406, 448.3563, 450.3726, 464.3522, 466.3661, 468.3840, 538.4259, 592.4711 및 594.4851 달톤으로 측정되거나 실질적으로 등가의 대사산물 또는 단편 또는 그의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 대사 표지자.
    여기에서 +/- 5 ppm의 차이는 같은 대사산물로 표시된다.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 표지자는 정밀 중성 질량이 446.3406, 448.3563, 450.3726, 464.3522, 466.3661, 468.3840, 538.4259, 592.4711 및 594.4851 달톤으로 측정되거나 실질적으로 대사산물 등가의 및 도 13 내지 21 중의 어느 하나에서 보여지는 LC-MS/MS 패턴 또는 단편 또는 그의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 대사 표지자.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 표지자는 분자식이 C28H46O4, C28H48O4, C28H50O4, C28H48O5, C28H50O5, C28H52O5, C32H58O6, C36H64O6 및 C36H66O6으로 이루어지는 대사산물 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 대사 표지자.
  13. 제 12 항에 있어서, 상기 대사산물은 토코페롤류, 토코트리에놀류, 비타민 E-관련 대사산물들 또는 상기 대사산물의 대사 유도체임을 특징으로 하는 방법.
  14. CRC 또는 OC의 존재에서 또는 CRC 또는 OC의 발달 위험율에서 다음 단계를 포함하는 환자를 진단하는 방법:
    표 3에 나열된 대사산물들 또는 단편들 또는 그의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 또는 그 이상의 대사산물 표지자에 대한 존재 또는 부재를 상기 환자의 시료로 부터 검색하는 단계로서, 여기에서 상기 하나 또는 그 이상의 대사 표지자들의 강도의 차이는 CRC 또는 OC의 존재, 또는 CRC 또는 OC의 발달 위험율을 나타낸다.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 대사 표지자는 정밀 중성 질량이 446.3406, 448.3563, 450.3726, 464.3522, 466.3661, 468.3840, 538.4259, 592.4711 및 594.4851 달톤으로 측정되거나 실질적으로 등가의 대사산물 또는 단편 또는 그의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단 방법; 여기에서 상기 하나 또는 그 이상의 대사 표지자들의 부재는 CRC 또는 OC의 존재, 또는 CRC 또는 OC의 발달 위험율을 나타낸다.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 표지자는 정밀 중성 질량이 446.3406, 448.3563, 450.3726, 464.3522, 466.3661, 468.3840, 538.4259, 592.4711 및 594.4851 달톤으로 측정되거나 실질적으로 등가의 대사산물 및 도 13 내지 21 중의 어느 하나에서 보여지는 LC-MS/MS 패턴 또는 단편 또는 그의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단 방법.
  17. 제 16 항에 있어서, 상기 표지자는 분자식이 C28H46O4, C28H48O4, C28H50O4, C28H48O5, C28H50O5, C28H52O5, C32H58O6, C36H64O6 및 C36H66O6으로 이루어지는 대사산물 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 상기 대사산물은 토코페롤류, 토코트리에놀류, 비타민 E-관련 대사산물들 또는 상기 대사산물의 대사 유도체임을 특징으로 하는 방법.
  19. 하기를 포함하는, 미지의 질병상태의 검사 대상에서 CRC 또는 OC의 유무, 또는 CRC 또는 OC의 발달 위험율을 진단하는 방법:
    상기 검사대상으로부터 혈액 시료를 획득하는 단계;
    상기 혈액 시료로 부터 표 3에 나열된 대사산물들 또는 단편들 또는 그의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 분자에 대한 정량 데이터를 얻기 위해 분석하는 단계;
    상기 검사 대상에서 상기 분자들에 대하여 얻은 정량 데이터를, 다수의 CRC 또는 OC-양성 사람으로부터 얻은 상기 분자들의 정량 데이터 또는 다수의 또는 CRC 또는 OC-음성 사람으로부터 얻은 상기 분자들의 정량 데이터와 비교하는 단계; 및
    상기 비교를 이용하여 검사대상이 CRC 또는 OC 양성 또는 음성인지 또는 CRC 또는 OC 발달 위험율에 있는지의 가능성을 결정하는 단계.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 분자는 정밀 중성 질량이 446.3406, 448.3563, 450.3726, 464.3522, 466.3661, 468.3840, 538.4259, 592.4711 및 594.4851 으로 동정된 분자들 또는 실질적으로 등가의 분자들 또는 단편 또는 그의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단 방법
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 분자는 정밀 중성 질량이 446.3406, 448.3563, 450.3726, 464.3522, 466.3661, 468.3840, 538.4259, 592.4711 및 594.4851 달톤으로 측정되거나 실질적으로 등가의 분자 및 도 13 내지 21 중의 어느 하나에서 보여지는 LC-MS/MS 패턴 또는 단편 또는 그의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 분자는 C28H46O4, C28H48O4, C28H50O4, C28H48O5, C28H50O5, C28H52O5, C32H58O6, C36H64O6 및 C36H66O6의 분자식을 가진 분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 분자는 토코페롤류, 토코트리에놀류, 비타민 E-관련 대사산물들 또는 상기 대사산물의 대사 유도체임을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 22 항에 있어서, 상기 분자는 액체 크로마토그래피-질량 분광광도계(LC-MS) 방법 또는 3중-4중극 질량 분광 광도계 직접 주입 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 24 항에 있어서, 상기 분자 각각에 대한 강도 전이 및 내부표준물질 강도 전이를 측정하는 것을 전이 특징으로 하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 환자 점수는 상기 환자에 대한 분자들 사이에 최소 평균-정상화 로그(2)를 결정하여 생성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 26 항에 있어서, 상기 환자 점수를 정상 개체로부터 생성된 점수와 비교하여, 그에 의하여 CRC 또는 OC의 유무 또는 CRC 또는 OC의 발달 위험율 진단하는 방법.
  28. 하기 단계를 포함하는, 항산화제 치료 효과가 있는 개체를 동정하고 진단하는 방법:
    상기 검사대상으로부터 혈액 시료 획득하는 단계;
    상기 혈액 시료를 분석하하여 토코페롤류, 토코트리에놀류, 비타민 E-관련 대사산물들 또는 상기 대사산물의 대사 유도체의 전체, 또는 일부에 대한 정량 데이터를 얻는 단계;
    상기 검사 대상에서 상기 분자들에 대하여 얻은 정량 데이터를, 다수의 또는 CRC 또는 OC-음성 사람으로부터 얻은 참조 데이터와 비교하는 단계; 및
    상기 비교를 이용하여 검사대상이 이러한 치료에 효과적일 수 있을지 가능성을 결정하는 단계.
  29. 제 28 항에 있어서, 상기 토코페롤류, 토코트리에놀류, 비타민 E-관련 대사산물들 또는 상기 대사산물 클래스의 대사 유도체는 표 3에 나열된 대사산물들 또는 단편들 또는 그의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 토코페롤류, 토코트리에놀류, 비타민 E-관련 대사산물들 또는 상기 대사산물 클래스의 대사 유도체는 정밀 중성 질량이 446.3406, 448.3563, 450.3726, 464.3522, 466.3661, 468.3840, 538.4259, 592.4711 및 594.4851 달톤으로 측정되거나 실질적으로 등가의 대사산물 또는 단편 또는 그의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법; 여기에서 +/- 5 ppm의 차이는 같은 대사산물로 표시된다.
  31. 제 30 항에 있어서, 상기 토코페롤류, 토코트리에놀류, 비타민 E-관련 대사산물들 또는 상기 대사산물 클래스의 대사 유도체는 정밀 중성 질량이 446.3406, 448.3563, 450.3726, 464.3522, 466.3661, 468.3840, 538.4259, 592.4711 및 594.4851 달톤으로 측정되거나 실질적으로 등가의 대사산물들 및 도 13 내지 21 중의 어느 하나에서 보여지는 LC-MS/MS 패턴 또는 단편 또는 그의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 토코페롤류, 토코트리에놀류, 비타민 E-관련 대사산물들 또는 상기 대사산물 클래스의 대사 유도체는 C28H46O4, C28H48O4, C28H50O4, C28H48O5, C28H50O5, C28H52O5, C32H58O6, C36H64O6 및 C36H66O6의 분자 식을 가진 분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 하기 단계를 포함하는, CRC 또는 OC를 예방하고, 치료하고, 안정화하기위해 또는 CRC 또는 OC 관련 증상을 개선하기위해 고안된 식이의, 화학적 또는 생물학적 치료방법에 반응하는 개체를 진단하는 방법:
    상기 검사대상으로부터 하나 또는 그 이상의 혈액 시료를 단회 또는 긴 시간 중복 수집하여 획득하는 단계;
    상기 혈액 시료를 분석하여 토코페롤류, 토코트리에놀류, 비타민 E-관련 대사산물들 또는 상기 대사산물의 대사 유도체의 전체, 또는 일부에 대한 정량 데이터를 얻는 단계;
    상기 검사 대상의 시료들에서 상기 분자들에 대하여 얻은 정량 데이터를 다수의 또는 CRC 또는 OC-음성 사람으로부터 얻은 참조 데이터와 비교하는 단계; 및
    상기 비교를 이용하여 상기 검사 대상의 대사 상태가 상기 치료 방법을 시행하는 동안에 향상되는지를 결정하는 단계.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 토코페롤류, 토코트리에놀류, 비타민 E-관련 대사산물들 또는 상기 대사산물 클래스의 대사 유도체는 표 3에 나열된 대사산물들 또 는 단편들 또는 그의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제 34 항에 있어서, 상기 토코페롤류, 토코트리에놀류, 비타민 E-관련 대사산물들 또는 상기 대사산물 클래스의 대사 유도체는 정밀 중성 질량이(달톤으로 측정됨) 446.3406, 448.3563, 450.3726, 464.3522, 466.3661, 468.3840, 538.4259, 592.4711 및 594.4851 이거나 또는 실질적으로 등가의 대사산물 또는 단편 또는 그의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법; 여기에서 +/- 5 ppm의 차이는 같은 대사산물로 표시된다.
  36. 제 35 항에 있어서, 상기 토코페롤류, 토코트리에놀류, 비타민 E-관련 대사산물들 또는 상기 대사산물 클래스의 대사 유도체는 정밀 중성 질량이 446.3406, 448.3563, 450.3726, 464.3522, 466.3661, 468.3840, 538.4259, 592.4711 및 594.4851 달톤으로 측정되거나 실질적으로 등가의 대사산물들 및 도 13 내지 21 중의 어느 하나에서 보여지는 LC-MS/MS 패턴 또는 단편 또는 그의 유도체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 상기 토코페롤류, 토코트리에놀류, 비타민 E-관련 대사산물들 또는 상기 대사산물 클래스의 대사 유도체는 C28H46O4, C28H48O4, C28H50O4, C28H48O5, C28H50O5, C28H52O5, C32H58O6, C36H64O6 및 C36H66O6의 분자식을 가진 분자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
KR1020087008798A 2005-09-12 2006-09-12 비타민 ｅ-관련 대사산물의 측정에 의한 결장암 및난소암의 진단방법 KR20080049821A (ko)

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