CN113447596A

CN113447596A - 一种药物制剂中3种活性成分的测定方法

Info

Publication number: CN113447596A
Application number: CN202110825986.6A
Authority: CN
Inventors: 周宽; 但济修; 詹常森; 李淞明; 周永全; 张正光
Original assignee: Shanghai Hutchison Pharmaceuticals Ltd
Current assignee: Shanghai Hutchison Pharmaceuticals Ltd
Priority date: 2021-07-21
Filing date: 2021-07-21
Publication date: 2021-09-28
Anticipated expiration: 2041-07-21
Also published as: CN113447596B

Abstract

本发明提供一种药物制剂中3种活性成分的测定方法，包括：将药物制剂加水溶解后定容，摇匀，过滤，获得的供试品溶液采用双检测波长下的高效液相色谱法进行检测，确定供试品溶液中3种活性成分：梓醇、地黄苷D、王百合苷B的含量。本发明提供的一种药物制剂中3种活性成分的测定方法，准确可靠，简便快速，稳定性和重复性好，为药物制剂的系统评价和质量控制提供依据，为该药物制剂的合理开发应用提供了研究基础，可更全面地保障药物制剂的质量，提高药物的安全性和可靠性，应用前景广阔。

Description

一种药物制剂中3种活性成分的测定方法

技术领域

本发明属于中药质量控制与成分检测的技术领域，涉及一种药物制剂中3种活性成分的测定方法，具体涉及一种药物制剂中3种活性成分：梓醇、地黄苷D和王百合苷B的HPLC检测方法。

背景技术

随着中药经典名方开发成为当下中医药界研究的热点，相关管理部门已经规定经典名方需严格遵从古方的处方、剂量和制备工艺进行研究。本发明的研究对象药物制剂最早见于东汉·张仲景的《金匮要略·百合狐惑阴阳毒病脉证治》上篇，由百合、地黄2味药组成,以“百合七枚(擘)、生地黄汁一升”入药。原方记载“意欲食复不能食,常默默,欲卧不能卧,欲行不能行,饮食,或有美时,或有不用闻食臭时,如寒无寒,如热无热,口苦,小便赤,诸药不能治,得药则剧吐利,如有神灵者,身形如和,其脉微数。”、“百合病，不经吐、下、发汗，病形如初者，百合地黄汤主之”。百合地黄汤主要用于治疗由情志内伤所致的“百合病”，而“百合病”的病机为心肺阴虚内热，与现代神经精神系统相关疾病关系密切。临床与动物药理实验都表明了其疗效确切，但是与之相应的化学成分研究却较少。

百合地黄汤在《金匮要略》中已有煎煮、服用方法，但由于现代和汉代的计量单位存在较大的差异，现代的称量参数、煎煮参数均不明确，且《中国药典》中只有单味药的检测方法，其复方(汤剂及物质基准)尚无源于传统制法且符合现代制备技术的制备方法，缺乏客观的复方(汤剂及物质基准)质量评价体系。

专利文献CN112285221 A，公开日2021.01.29，一种百合地黄汤中化学成分的检测方法及指纹图谱的建立方法中，所述百合地黄汤的检测方法是采用梓醇和毛蕊花糖苷作为检测参照物进行定量测定，均为地黄中的化学成分，其并未对百合中的成分进行定量检测。

因此，研究出一种能够同时测定药物制剂中多种成分含量的方法，对药物制剂的质量控制具有非常重要的意义。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种药物制剂中3种活性成分的测定方法，用于解决现有技术中缺乏对药物制剂的质量进行有效控制的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种药物制剂中3种活性成分的测定方法，包括：将药物制剂加水溶解后定容，摇匀，过滤，获得的供试品溶液采用双检测波长下的高效液相色谱法(HPLC)进行检测，确定供试品溶液中3种活性成分：梓醇、地黄苷D、王百合苷B的含量。

较佳地，所述梓醇的CAS号为2415-24-9，所述地黄苷D的CAS号为81720-08-3，所述王百合苷B的CAS号为114420-67-6。

鲜地黄中主要含有环烯醚萜苷类化学成分，且为其主要活性成分。生地黄性味甘、寒，入心、肝、肾经，有清热生津、滋阴养血之功效，可能通过保护神经元、促进神经再生、改善脑缺血等途径来治疗抑郁。所述梓醇与地黄苷D是药物制剂如百合地黄汤中组成药材鲜地黄中含量较高的环烯醚萜类化合物，而地黄中主要含有环烯醚萜苷类化学成分，且为其主要活性成分；其中，梓醇具有降血糖、保护神经、保护心脏、抗肿瘤的作用，地黄苷D具有滋阴，调节免疫，补血，降血糖的作用。

百合性甘、寒，归心、肺经，具有养阴润肺、清心安神功效。而王百合苷B是药物制剂如百合地黄汤中组成药材百合中具有代表性的酚酸甘油酯类成分；王百合苷B具有抗抑郁、抗氧化、抗炎、等药理作用。故本发明是采用梓醇、地黄苷D、王百合苷B作为检测参照物进行定量测定。

较佳地，所述药物制剂包括且不限于百合地黄汤。所述百合地黄汤是按照经典名方《金匮要略》中记载的古方工艺制得。具体工艺如下：取新鲜的百合用清水冲洗泥沙，除去表面浮水，称取百合7枚，掰开鳞茎用清水浸泡10h，去浮沫，用清水清洗干净放置备用；取鲜地黄于榨汁机中榨取鲜地黄汁200mL煮沸备用。取上述百合于烧杯中加水400mL，置于药壶中加热煎煮至200mL，滤过，滤液中加上述鲜地黄汁搅拌均匀，加热煎煮至300mL，即得。

所述地黄，为玄参科植物地黄Rehmannia glutinosa Libosch.的新鲜或干燥块根。秋季釆挖，除去芦头、须根及泥沙，鲜用；或将地黄缓缓烘焙至约八成干。前者习称“鲜地黄”，后者习称“生地黄”。

所述百合，为百合科植物卷丹Lilium lancifolium Thunb.、百合Lilium browniiF.E.Brown var.viridulum Baker或细叶百合Lilium pumilum DC.的新鲜或干燥肉质鳞叶。

较佳地，所述药物制剂加入的质量与水加入的体积之比为3:45-55，g/mL。

优选地，所述药物制剂加入的质量与水加入的体积之比为3:50，g/mL。

较佳地，所述过滤为滤膜过滤。优选地，所述滤膜为0.45μm滤膜。

较佳地，所述采用双检测波长下的高效液相色谱法(HPLC)进行检测，包括以下步骤：

1)配制对照品溶液：将梓醇、地黄苷D、王百合苷B对照品，加水溶解并定容，配成对照品溶液；

2)样品检测：采用双检测波长下的高效液相色谱法(HPLC)分别检测供试品溶液和步骤1)中的对照品溶液，比较保留时间进行定性，采用外标法进行定量，确定供试品溶液中梓醇、地黄苷D、王百合苷B的含量。

优选地，步骤1)中，所述对照品溶液中梓醇的含量范围为14.2926-457.3632μg/ml，地黄苷D的含量范围为1.2385-39.6312μg/ml，王百合苷B的含量范围为0.8355-26.7344μg/ml。

优选地，步骤1)中，所述对照品溶液采用逐级稀释制得。

优选地，步骤2)中，所述高效液相色谱法(HPLC)中，检测器为二极管阵列检测器(DAD)。

优选地，步骤2)中，所述高效液相色谱法中的色谱柱为T3色谱柱。

更优选地，所述高效液相色谱法中的色谱柱为Waters XSelect HSS T3反相色谱柱(柱长为250mm，内径为4.6mm，填料粒径为5μm)，色谱柱中的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶。

优选地，步骤2)中，所述高效液相色谱法中的双检测波长分别为193-195nm和311-313nm。所述双检测波长是指，在梯度洗脱程序中同时采用2个不同波长进行检测。更优选地，所述检测波长为194nm和312nm。

当所述高效液相色谱法中的检测波长为193-195nm、优选为194nm时，可检测出梓醇和地黄苷D；当所述高效液相色谱法中的检测波长为311-313nm、优选为312nm时，可检测出王百合苷B。

优选地，步骤2)中，所述高效液相色谱法中的柱温为33-37℃。更优选地，所述高效液相色谱法中的柱温为35℃。

优选地，步骤2)中，所述高效液相色谱法中的流速为0.95-1.05ml/min。更优选地，所述高效液相色谱法中的流速为1.0ml/min。

优选地，步骤2)中，所述高效液相色谱法中的进样量为10-30μL。更优选地，所述高效液相色谱法中的进样量为20μL。

优选地，步骤2)中，所述高效液相色谱法中理论板数按梓醇峰计算≥5000。

优选地，步骤2)中，所述高效液相色谱法中，流动相为乙腈-0.09-0.11％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.09-0.11％磷酸水溶液；分析时间为60min；梯度洗脱。更优选地，所述高效液相色谱法中，流动相为乙腈-0.10％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.10％磷酸水溶液；分析时间为60min；梯度洗脱。

上述0.09-0.11％磷酸水溶液为体积百分数为0.09-0.11％的磷酸水溶液。上述0.10％磷酸水溶液为体积百分数为0.10的磷酸水溶液。

更优选地，所述梯度洗脱的具体程序为：

0～13min，A相：B相体积比为1：99-1：99；

13～17min，A相：B相体积比为1：99-5：95；

17～30min，A相：B相体积比为5：95-5：95；

30～35min，A相：B相体积比为5：95-20：80；

35～50min，A相：B相体积比为20：80-20：80；

50～51min，A相：B相体积比为20：80-1：99；

51～60min，A相：B相体积比为1：99-1：99。

优选地，步骤2)中，所述外标法包括以下步骤：

A)按步骤1)制备一系列不同浓度的对照品溶液，分别进行HPLC检测，获得梓醇、地黄苷D、王百合苷B的色谱峰面积与对应梓醇、地黄苷D、王百合苷B的含量之间线性关系，绘制相应的标准工作曲线，分别计算得到梓醇、地黄苷D、王百合苷B的标准工作曲线的回归方程；

B)将供试品溶液进行HPLC检测，将获得的梓醇、地黄苷D、王百合苷B的色谱峰面积，代入步骤A)中相应的梓醇、地黄苷D、王百合苷B的标准工作曲线的回归方程，计算得到供试品溶液中梓醇、地黄苷D、王百合苷B的含量。

更优选地，所述标准工作曲线中，以梓醇、地黄苷D、王百合苷B的色谱峰面积为纵坐标(Y轴)，其相应梓醇、地黄苷D、王百合苷B的含量为横坐标(X轴)。

本发明第二方面提供一种药物制剂中3种活性成分的检测方法在药物制剂的质量检测中的用途。所述药物制剂为含有地黄和百合的药物制剂，具体包括且不限于百合地黄汤等。

本发明第三方面提供一种药物制剂的质量检测方法，所述药物制剂中梓醇含量≥1.1mg/g，所述药物制剂中地黄苷D含量≥0.11mg/g，所述药物制剂中王百合苷B含量≥42μg/g。

如上所述，本发明提供的一种药物制剂中3种活性成分的测定方法，将按照经典名方《金匮要略》古方工艺制得的药物制剂，采用特定前处理方法制成供试品溶液，在特定液相色谱条件下同时测定梓醇、地黄苷D和王百合苷B这3种成分。该种方法准确可靠，简便快速，稳定性和重复性好，为药物制剂的系统评价和质量控制提供依据，为该药物制剂的合理开发应用提供了研究基础，可更全面地保障药物制剂的质量，提高药物的安全性和可靠性，应用前景广阔。

附图说明

图1显示为本发明中3种活性成分在双检测波长下的高效液相色谱图，图中，1为药物制剂的供试品，2为梓醇的对照品，3为地黄苷D的对照品，4为空白溶剂，5为王百合苷B的对照品。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

以下实施例使用的试剂和仪器如下：

1、试剂

药物制剂(上海和黄药业有限公司制备)；乙腈(色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司)；磷酸(色谱纯，上海安谱实验科技股份有限公司)；超纯水(纯水仪制备)；其余试剂(分析纯，国药)。

对照品的信息见表1。

表1

2、仪器

1260型高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；e2695高效液相色谱仪(美国Waters公司)；SR205 DU/A型电子天平(瑞士METTLER TOLEDO公司)；ME204E/02型电子天平(梅特勒-托利多(上海)有限公司)。

实施例1

1、供试品溶液的制备

将药物制剂样品按照经典名方《金匮要略》中记载的古方工艺制备，即将新鲜的百合用清水冲洗泥沙，除去表面浮水，称取百合7枚，掰开鳞茎用清水浸泡10h，去浮沫，用清水清洗干净放置备用；取鲜地黄于榨汁机中榨取鲜地黄汁200mL煮沸备用。取上述百合于烧杯中加水400mL，置于药壶中加热煎煮至200mL，滤过，滤液中加上述鲜地黄汁搅拌均匀，加热煎煮至300mL，即得。

将药物制剂样品取3g，精密称定，置50ml量瓶中，加水溶解，并稀释至刻度定容，摇匀，经0.45μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2、对照品溶液的制备

将梓醇、地黄苷D、王百合苷B对照品，加水溶解并定容，配成对照品溶液。

3、测定

采用双检测波长下的高效液相色谱法(HPLC)分别检测供试品溶液和一系列不同浓度的对照品溶液，比较保留时间进行定性，采用外标法进行定量。即将一系列不同浓度的对照品溶液分别进行双检测波长下HPLC检测，获得梓醇、地黄苷D、王百合苷B的色谱峰面积与对应梓醇、地黄苷D、王百合苷B的含量之间线性关系，绘制相应的标准工作曲线，计算得到梓醇、地黄苷D、王百合苷B的标准工作曲线的回归方程。再将供试品溶液进行HPLC检测，将获得的梓醇、地黄苷D、王百合苷B的色谱峰面积，代入相应的梓醇、地黄苷D、王百合苷B的标准工作曲线的回归方程，计算得到供试品溶液中梓醇、地黄苷D、王百合苷B的含量。

其中，高效液相色谱法包括以下检测条件：

检测器为二极管阵列检测器(DAD)；色谱柱为Waters XSelect HSS T3反相色谱柱(柱长为250mm，内径为4.6mm，填料粒径为5μm)，色谱柱中的填充剂为十八烷基硅烷键合硅胶；理论板数按梓醇峰计算≥5000；双检测波长分别为194nm和312nm；柱温为35℃；流速为1.0ml/min；进样量为20μl；流动相为乙腈-0.10％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.10％磷酸水溶液；分析时间为60min；梯度洗脱。

梯度洗脱的具体程序为：

0～13min，A相：B相体积比为1：99-1：99；

13～17min，A相：B相体积比为1：99-5：95；

17～30min，A相：B相体积比为5：95-5：95；

30～35min，A相：B相体积比为5：95-20：80；

35～50min，A相：B相体积比为20：80-20：80；

50～51min，A相：B相体积比为20：80-1：99；

51～60min，A相：B相体积比为1：99-1：99。

通过上述测定方法，对照品溶液和供试品溶液中梓醇、地黄苷D、王百合苷B分离良好，谱图见图1。由图1可知，空白溶剂对其检测无干扰，该方法的专属性良好。同时，在该方法下，色谱峰形较好，梓醇、地黄苷D、王百合苷B可作为样品的定量检测指标。

实施例2

对本发明的药物制剂中梓醇、地黄苷D、王百合苷B的检测方法进行方法学验证，其性能指标结果如下。

1、精密度

取药物制剂样品，按实施例1中步骤1制备获得供试品溶液，按实施例1中步骤3的色谱条件，连续进样分析6次，测定峰面积，精密度具体结果见表2。结果表明，梓醇、地黄苷D、王百合苷B的色谱峰面积RSD均小于2.0％，说明该方法精密度良好。

表2

2、重复性

取同一批药物制剂样品，按实施例1中步骤1平行制备获得6份供试品溶液，按实施例1中步骤3的色谱条件，分别进样分析，测定峰面积，重复性具体结果见表3。结果表明，梓醇、地黄苷D、王百合苷B的色谱峰面积RSD均小于2％，说明该方法重复性良好。

表3

3、稳定性

取药物制剂样品，按实施例1中步骤1制备获得供试品溶液，按实施例1中步骤3的色谱条件，在室温下分别于0h、1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h进样分析，测定峰面积，稳定性具体结果见表4。结果表明，梓醇、地黄苷D、王百合苷B的色谱峰面积RSD小于2％，供试品溶液在24小时内基本稳定，说明该方法稳定性良好。

表4

4、检测方法的线性关系

精密称取梓醇、地黄苷D、王百合苷B对照品适量，按实施例1中步骤2加水配成一系列不同浓度的对照品溶液。按实施例1中步骤3的色谱条件，测定峰面积，以各成分进样量(μg)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标作图，测定并计算获得梓醇、地黄苷D、王百合苷B的标准回归方程、相关系数和线性范围，具体结果见表5。根据表5可知，3种活性成分梓醇、地黄苷D、王百合苷B分别在14.2926～457.3632μg/ml、1.2385～39.6312μg/ml、0.8355～26.7344μg/ml范围内呈良好的线性关系(r≥0.9999)。可见，各成分对照品在各自质量浓度范围内线性关系良好，说明本发明方法线性范围广，准确度高。

表5

5、加标回收率

称取药物制剂样品，每份约1.5g，精密称定，平行制备9份，分成高、中、低3个浓度组(每组3份)，分别按约150％、100％、50％比例向各份样品中精密加入梓醇、地黄苷D、王百合苷B的混合对照品溶液，按实施例1中步骤1制备获得供试品溶液，并按实施例1中步骤3的色谱条件，分别进样分析，结果见表6。由表6可知，对梓醇、地黄苷D、王百合苷B的测定结果的回收率良好，说明本方法的准确度较好。

表6

6、中间精密度

更换操作人员，在不同日期使用不同检测仪器、色谱柱进行试验。该人员取WZJZ-01批样品，按实施例1中步骤1平行制备获得2份供试品溶液，并按实施例1中步骤3的色谱条件，分别进样分析，结果见表7。结果表明，中间精密度实验结果良好，相对平均偏差均在6％以内。

表7

7、耐用性

按实施例1中步骤1制备获得供试品溶液，按实施例1中步骤3的色谱条件进行微调，以色谱条件中柱温、流速、流动相pH、检测波长以及色谱柱型号发生轻微变化，进行分析，考察其影响，结果见表8。结果表明，上述考察因素发生轻微变化后对含量检测结果的影响不大，耐用性良好，但优选范围的检测结果相对较佳。

表8

实施例3

按照经典名方《金匮要略》古方工艺制得的药物制剂样品32份，按实施例1中步骤1制备获得供试品溶液，并按实施例1中步骤3的色谱条件，进行检测，结果如表9所示。结果表明，本发明方法可以测定不同药物制剂中的成分含量。

表9

根据研究建立的药材质量标准要求：鲜地黄含梓醇、地黄苷D分别不得低于1.0％、0.10％，平均含水量为76％；鲜百合含王百合苷B不得低于0.08％，平均含水量为67％。投料量及制备工艺各步骤的转移率见下表10。

表10

根据计算：按平均投料量计，合格药材投入每份药物制剂的梓醇、地黄苷D、王百合苷B量分别为939.5mg、93.95mg、58.40mg；梓醇、地黄苷D、王百合苷B的平均总转移率分别为45.29％、51.70％、33.10％，每份药物制剂对应实物中梓醇、地黄苷D、王百合苷B的平均含量分别为497.0mg、48.57mg、19.33mg；每份药物制剂对应实物为300ml(密度平均为1.0653g/ml，折为319.6g)中，梓醇、地黄苷D、王百合苷B的平均含量分别为1.555mg/g、0.152mg/g、60.5μg/g；按下浮30％取整计，梓醇、地黄苷D、王百合苷B的含量分别不得低于1.1mg/g、0.11mg/g、42μg/g。对于该药物制剂的质量标准建立了研究基础。

综上所述，本发明提供的一种药物制剂中3种活性成分的测定方法，准确可靠，简便快速，稳定性和重复性好，为药物制剂的系统评价和质量控制提供依据，为该药物制剂的合理开发应用提供了研究基础，可更全面地保障药物制剂的质量，提高药物的安全性和可靠性，应用前景广阔。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims

1.一种药物制剂中3种活性成分的测定方法，包括：将药物制剂加水溶解后定容，摇匀，过滤，获得的供试品溶液采用双检测波长下的高效液相色谱法进行检测，确定供试品溶液中3种活性成分：梓醇、地黄苷D、王百合苷B的含量。

2.根据权利要求1所述的一种药物制剂中3种活性成分的测定方法，其特征在于，所述药物制剂加入的质量与水加入的体积之比为3:45-55，g/mL。

3.根据权利要求1所述的一种药物制剂中3种活性成分的测定方法，其特征在于，所述采用双检测波长下的高效液相色谱法进行检测，包括以下步骤：

2)样品检测：采用双检测波长下的高效液相色谱法分别检测供试品溶液和步骤1)中的对照品溶液，比较保留时间进行定性，采用外标法进行定量，确定供试品溶液中梓醇、地黄苷D、王百合苷B的含量。

4.根据权利要求3所述的一种药物制剂中3种活性成分的测定方法，其特征在于，步骤1)中，所述对照品溶液中梓醇的含量范围为14.2926-457.3632μg/ml，地黄苷D的含量范围为1.2385-39.6312μg/ml，王百合苷B的含量范围为0.8355-26.7344μg/ml。

5.根据权利要求3所述的一种药物制剂中3种活性成分的测定方法，其特征在于，步骤2)中，所述高效液相色谱法的检测条件为：检测器为二极管阵列检测器；色谱柱为T3色谱柱；双检测波长分别为193-195nm和311-313nm；流动相为乙腈-0.09-0.11％磷酸水溶液，其中，A相为乙腈，B相为0.09-0.11％磷酸水溶液；分析时间为60min；梯度洗脱。

6.根据权利要求3所述的一种药物制剂中3种活性成分的测定方法，其特征在于，步骤2)中，所述高效液相色谱法的检测条件还包括有：柱温为33-37℃；流速为0.95-1.05ml/min；进样量为10-30μL。

7.根据权利要求5所述的一种药物制剂中3种活性成分的测定方法，其特征在于，所述梯度洗脱的具体程序为：0～13min，A相：B相体积比为1：99-1：99；13～17min，A相：B相体积比为1：99-5：95；17～30min，A相：B相体积比为5：95-5：95；30～35min，A相：B相体积比为5：95-20：80；35～50min，A相：B相体积比为20：80-20：80；50～51min，A相：B相体积比为20：80-1：99；51～60min，A相：B相体积比为1：99-1：99。

8.根据权利要求1-7任一所述的一种药物制剂中3种活性成分的测定方法在药物制剂的质量检测中的用途。

9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述药物制剂为含有地黄和百合的药物制剂。

10.一种药物制剂的质量检测方法，所述药物制剂中梓醇含量≥1.1mg/g，所述药物制剂中地黄苷D含量≥0.11mg/g，所述药物制剂中王百合苷B含量≥42μg/g。