CN112362774A - 一种调经养荣汤中多种有效成分的含量测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种调经养荣汤中多种有效成分的含量测定方法，包括以下步骤：S1.对照品溶液的制备：分别精密称取阿魏酸、藁本内酯、芍药苷、地黄苷D、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、延胡索乙素、丹皮酚、香附烯酮、α‑香附酮、橙皮苷、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、羟基红花黄色素A标准品，溶解于溶剂中，得到混合对照品溶液；S2.调经养荣汤供试品溶液的制备；S3.含量测定，采用高效液相色谱法测定。该测定方法测定了调经养荣汤中阿魏酸、藁本内酯、芍药苷、地黄苷D、丹酚酸B等15种化学成分的含量，能更好的控制调经养荣汤的质量。

Description

一种调经养荣汤中多种有效成分的含量测定方法
技术领域
本发明属于药学领域，涉及药品质量的测定方法，具体涉及一种调经养荣汤中多种有效成分的含量测定方法。
背景技术
血枯经闭是妇科疾病中常见的症状，多因先天不足，或早婚早孕，房事不节，多产多育，乳儿过久，或劳倦伤脾，生化乏源，气血不足，或失血久病，致血海空虚，无血下达而导致，不仅给患者带来极大痛苦，也给家庭和社会造成负担。调经养荣汤是中医补血通经的经典名方，出自宋代骆龙吉所著《内经拾遗》卷一引《经验秘方》，现收录于《古代经典名方目录》，由当归、川芎、白芍、熟地、生地、丹参、延胡、牧丹皮、香附、陈皮、白术、砂仁、红花组成，具有温经散寒、补血通经的功效，主要用于血枯经闭、月经过少、闭经、痛经等。
调经养荣汤作为一种中药复方制剂，处方药材较多(由13味药材组成)，成分复杂，需要进行全面的化学成分分析及质量控制。现有文献中未记载其质量控制的相关方法。因此，开发建立一种简便易行，准确性高，重复性良好且能尽可能多地反映调经养荣汤所含多成分的检测方法显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种调经养荣汤中多种有效成分的含量测定方法。
本发明所述的有效成分包括：阿魏酸、藁本内酯、芍药苷、地黄苷D、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、延胡索乙素、丹皮酚、香附烯酮、α-香附酮、橙皮苷、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、羟基红花黄色素A。
本发明所述的含量测定方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
取各标准品适量，精密称定，分别置于容量瓶中，加甲醇溶解定容，配制成每1mL含有适量阿魏酸、藁本内酯、芍药苷、地黄苷D、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、延胡索乙素、丹皮酚、香附烯酮、α-香附酮、橙皮苷、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、羟基红花黄色素A的混合对照品溶液；
(2)供试品溶液的制备
量取调经养荣汤适量，置于容量瓶中，加入适量甲醇，超声处理，放冷，用甲醇定容至刻度线，密塞摇匀，取适量离心，移取上清液至容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混匀，即得供试品溶液；
(3)色谱条件
吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪中，得到色谱图，根据色谱图计算供试品中有效成分的含量；
色谱条件：色谱柱C18、流速0.8-1.2mL/min；柱温20-40℃，以乙腈为流动相A，以0.1％冰醋酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱。
优选的，本发明所述的含量测定方法，包括以下步骤：
(1)对照品溶液的制备
取各标准品适量，精密称定，分别置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，配制成含有阿魏酸150μg/mL、藁本内酯200μg/mL、芍药苷180μg/mL、地黄苷D120μg/mL、丹酚酸B 240μg/mL、丹参酮ⅡA 360μg/mL、延胡索乙素300μg/mL、丹皮酚400μg/mL、香附烯酮180μg/mL、α-香附酮240μg/mL、橙皮苷800μg/mL、白术内酯Ⅰ300μg/mL、白术内酯Ⅱ240μg/mL、白术内酯Ⅲ280μg/mL及羟基红花黄色素A240μg/mL的混合对照品溶液。
(2)供试品溶液的制备
精密量取调经养荣汤5mL，置于25mL容量瓶中，加入适量甲醇，超声处理20min，放冷，用甲醇定容至刻度线，密塞摇匀，取适量5000rpm离心10min，精密移取上清液5mL至10mL容量瓶中，加50％甲醇定容至刻度，混匀，即得供试品溶液。
(3)测定方法：
吸取混合对照品溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪中，得到色谱图，根据色谱图计算供试品中有效成分的含量；
色谱条件：采用色谱柱AC QUITY
Figure BDA0002754578300000022
BEH C18、流速1.0mL/min；柱温30℃，以乙腈和0.1％冰醋酸水溶液作为流动相，进行梯度洗脱。
梯度洗脱过程如下：
Figure BDA0002754578300000021
Figure BDA0002754578300000031
检测波长为：0-13min,230nm；13-22min,300nm；22-26min,403nm；26-30min,286nm；
30-45min,245nm；45-90min,270nm。
本发明的有益效果：本发明建立的液相色谱测定调经养荣汤中15种有效成分的含量的方法，符合方法学验证的要求，并操作简便，灵敏度高，测定准确，适用性强，能够用于对该产品的质量控制。同时，填补了该产品定量控制的空白，使得对该产品能够进行更有效的质量分析，更全面反映产品的质量状况，保证该产品的质量稳定性。
附图说明
图1、调经养荣汤样品溶液色谱图
图2、混合对照品溶液色谱图
(1、地黄苷D；2、芍药苷；3、橙皮苷；4、阿魏酸；5、羟基红花黄色素A；6、丹酚酸B；7、香附烯酮；8、丹皮酚；9、α-香附酮；10、白术内酯Ⅲ；11、延胡索乙素；12、白术内酯Ⅰ；13、白术内酯Ⅱ；14、藁本内酯；15、丹参酮ⅡA)
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为本发明的限制。
实施例1、调经养荣汤HPLC含量测定方法
1材料与方法
1.1仪器
Figure BDA0002754578300000032
Figure BDA0002754578300000041
1.2试药
对照品：
Figure BDA0002754578300000042
调经养荣汤样品，由山东沃华医药科技股份有限公司提供。制备方法如下：取当归4.5g，熟地、香附各3g，白术、白芍、丹参各2.5g，川芎、陈皮各2.1g，延胡索1.8g，生地、牡丹皮各1.5g，红花1g，砂仁0.6g，加400mL纯化水，水浴回流加热1.5h,过滤，取滤液即得。
1.3试剂
Figure BDA0002754578300000051
1.4方法
1.4.1色谱条件
采用色谱柱ACQUITY
Figure BDA0002754578300000054
BEH C18、流速1.0mL/min；柱温30℃，考察乙腈–0.1％冰醋酸水溶液体系不同比例下对调经养荣汤各成分分离的影响。最终确定的梯度洗脱程序见下表1，各候选成分检测波长见表2。
表1流动相梯度洗脱条件
Figure BDA0002754578300000052
表2各成分检测波长
Figure BDA0002754578300000053
Figure BDA0002754578300000061
1.4.2对照品溶液的制备
取各标准品适量，精密称定，分别置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，配制成含有阿魏酸150μg/mL、藁本内酯200μg/mL、芍药苷180μg/mL、地黄苷D120μg/mL、丹酚酸B 240μg/mL、丹参酮ⅡA 360μg/mL、延胡索乙素300μg/mL、丹皮酚400μg/mL、香附烯酮180μg/mL、α-香附酮240μg/mL、橙皮苷800μg/mL、白术内酯Ⅰ300μg/mL、白术内酯Ⅱ240μg/mL、白术内酯Ⅲ280μg/mL及羟基红花黄色素A240μg/mL的混合对照品溶液。
1.4.3供试品溶液的制备
精密量取调经养荣汤5mL，置于25mL容量瓶中，加入适量甲醇，超声处理20min，放冷，用甲醇定容至刻度线，密塞摇匀，取适量5000rpm离心10min，精密移取上清液5mL至10mL容量瓶中，加50％甲醇定容至刻度，混匀，即得供试品溶液。
2.方法学研究
2.1.线性关系考察
将“1.4.2”项下混合对照品溶液用50％甲醇逐级稀释为一系列混合对照品溶液，分别取10μL注入高效相色谱仪中，记录各指标成分峰面积，以化合物浓度x为横坐标，以化合物峰面积y为纵坐标绘制标准曲线。计算标准曲线的回归方程和相关系数。结果表明：各对照品在各自的浓度范围内线性关系良好，线性关系见表3。
表3各指标成分的线性回归方程和相关系数
Figure BDA0002754578300000062
Figure BDA0002754578300000071
2.2精密度试验
取“1.4.2项”下混合对照品溶液稀释为高、中、低三种不同浓度的溶液，按照“1.4.1项”下的方法在一天内连续进样6次，以及连续6天分别进样，测定其峰面积，利用回归方程分别计算15种对照品的浓度及相对标准偏差(RSD)，分别考察其日内精密度和日间精密度。结果表明：该方法日内及日间精密度RSD值均在2.0％以下，其准确度处于95.61～104.09％范围内，符合中药多成分含量测定的要求。
表5调经养荣汤中15个指标成分精密度试验结果(n＝6，峰面积)
Figure BDA0002754578300000072
Figure BDA0002754578300000081
2.3重复性试验
取同一调经养荣汤供试品，按“1.4.3”项下方法平行制得6份供试品溶液，并按“1.4.1”项下色谱条件进行测定，记录对照品峰面积并计算RSD值。结果表明：RSD值介于0.48～1.90％之间，表明重复性良好。
表7调经养荣汤中15个候选指标成分的重复性试验结果(mg/g，n＝6)
Figure BDA0002754578300000082
Figure BDA0002754578300000091
2.4稳定性试验
按照“1.4.3”项下方法制备一份调经养荣汤供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h的时间间隔，按照“1.4.1项”下的方法进行检测，记录对照品峰面积并计算RSD值。结果表明：RSD值均不高于1.96％，表明调经养荣汤在常温实验条件下放置24h稳定性良好。
表8调经养荣汤中15个候选指标成分的稳定性试验结果(mg/g，n＝6)
Figure BDA0002754578300000092
2.5回收率试验
取同一调经养荣汤供试品溶液共9份，将其分为高、中、低剂量3组，每组平行3份。根据药材样品中15种对照品的含量，按照其含量的80％、100％、120％，分别精密加入对照品，按“1.4.3项”下方法制备供试溶液，按照“1.4.1项”下的方法进行检测分析，并计算各成分回收率。结果显示，15种成分的回收率在94.86～103.10％范围内，其RSD值在0.30％-1.80％间，符合相关技术要求。
表9调经养荣汤中15个候选指标成分的加样回收率结果(n＝6)
Figure BDA0002754578300000101
Figure BDA0002754578300000111
经过系统的方法学研究表明，15个化合物的线性关系良好，该方法日内、日间精密度、重复性及稳定性良好，符合相关方法学的要求，可用于样品的含量测定。
实施例2、调经养荣汤多批次含量测定
按照“1.4.3”项下的制备方法制备10批供试品溶液，每批平行两份。以“1.4.1”项下的色谱方法进行检测，检测结果见表10。
表10 10批次调经养荣汤中各指标成分的含量测定结果(n＝2，μg/g)
Figure BDA0002754578300000112
Figure BDA0002754578300000121
实施例3、调经养荣汤含量测定色谱条件的优化
色谱柱的选择：通过对Agilent ZORBAX SB-C18(4.6×100mm,1.8μm)、WatersHPLC BEH C18(2.1×100mm,1.7μm)色谱柱测得的色谱图进行分析，发现选择Waters HPLCBEH C18时调经养荣汤各化合物分离更优。
流动相的选择：通过比较乙腈–0.1％冰醋酸水溶液与甲醇–0.1％甲酸水溶液作系统，采用乙腈-0.1％冰醋酸水溶液作为流动相时分离效果更好，明显优于甲醇-0.1％甲酸水溶液系统。
柱温的选择：通过比较不同柱温(25、30、35℃)对调经养荣汤化学成分色谱分离的影响，柱温为30℃时各色谱峰的分离度较好。
检测波长的选择：采用PAD检测器对调经养荣汤样品进行210-400nm全波长扫描，考虑到不同化合物的最大吸收波长差异较大，分别选择各化合物的最大吸收波长作为检测波长，以定时切换波长的方法同时测定各化合物，避免了以单波长分析时出现化合物灵敏度低的情况。

Claims (5)

1.一种调经养荣汤中多种有效成分的含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.对照品溶液的制备：
分别精密称取阿魏酸、藁本内酯、芍药苷、地黄苷D、丹酚酸B、丹参酮ⅡA、延胡索乙素、丹皮酚、香附烯酮、α-香附酮、橙皮苷、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、羟基红花黄色素A标准品，溶解于溶剂中，得到混合对照品溶液；
S2.调经养荣汤供试品溶液的制备：
量取调经养荣汤适量，置于容量瓶中，加入适量甲醇，超声处理，放冷，用甲醇定容至刻度线，密塞摇匀，取适量离心，移取上清液至容量瓶中，加甲醇定容至刻度，混匀，即得供试品溶液；
S3.含量测定：
采用高效液相色谱法，在相同的检测条件下分别获得对照品溶液和对照品溶液的色谱图；并根据对照品溶液的浓度、对照品溶液在色谱图中的峰面积以及供试品溶液中与对照品溶液相对应成分在色谱图中的峰面积，计算调经养荣汤供试品溶液中与对照品溶液相对应成分的含量；
所述检测条件包括：
色谱柱C18、流速0.8-1.2mL/min；柱温20-40℃，以乙腈为流动相A，以0.1％冰醋酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱。
2.根据权利要求1所述的调经养荣汤中多种有效成分的含量测定方法，其特征在于，步骤S1中，取各标准品适量，精密称定，分别置于10mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，配制成含有阿魏酸150μg/mL、藁本内酯200μg/mL、芍药苷180μg/mL、地黄苷D 120μg/mL、丹酚酸B 240μg/mL、丹参酮ⅡA 360μg/mL、延胡索乙素300μg/mL、丹皮酚400μg/mL、香附烯酮180μg/mL、α-香附酮240μg/mL、橙皮苷800μg/mL、白术内酯Ⅰ300μg/mL、白术内酯Ⅱ240μg/mL、白术内酯Ⅲ280μg/mL及羟基红花黄色素A240μg/mL的混合对照品溶液。
3.根据权利要求1所述的调经养荣汤中多种有效成分的含量测定方法，其特征在于,步骤S2中，精密量取调经养荣汤5mL，置于25mL容量瓶中，加入适量甲醇，超声处理20min，放冷，用甲醇定容至刻度线，密塞摇匀，取适量5000rpm离心10min，精密移取上清液5mL至10mL容量瓶中，加50％甲醇定容至刻度，混匀，即得供试品溶液。
4.根据权利要求1所述的调经养荣汤中多种有效成分的含量测定方法，其特征在于,步骤S3中，所述梯度洗脱过程中，流动相A和流动相B的变化为：
0-8min，流动相A 0-5％，流动相B 100％-95％；
8-13min，流动相A 5％-15％,流动相B 95％-85％；
13-30min，流动相A15％-20％,流动相B 85％-80％；
30-45min，流动相A 20％-30％,流动相B 80％-70％；
45-70min，流动相A 30％-60％，流动相B 70％-40％；
70-80min，流动相A 60％-90％,流动相B 40％-10％；
80-90min，流动相A 90％-10％,流动相B10％-90％。
5.根据权利要求1所述的调经养荣汤中多种有效成分的含量测定方法，其特征在于,步骤S2中，检测波长为：0-13min,230nm；13-22min,300nm；22-26min,403nm；26-30min,286nm；30-45min,245nm；45-90min,270nm。
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周军 等: "HPLC-DAD 法测定脑血栓片中苦杏仁苷、羟基红花黄色素 A、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸 B 和丹参酮ⅡA", 《现代药物与临床》 *
谢媛 等: "HPLC同时测定调经活血片中芍药苷、阿魏酸 金丝桃苷的含量", 《中国实验方剂学杂志》 *

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