CN111272934A - 一种超高效液相色谱串联质谱法测定防己黄芪汤中十九种成分含量的方法 - Google Patents

一种超高效液相色谱串联质谱法测定防己黄芪汤中十九种成分含量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属中药成分检测技术领域，提供一种超高效液相色谱串联质谱法测定防己黄芪汤中十九种成分含量的方法，分别制备供试品溶液、对照品溶液、混合标准品溶液，超高效液相色谱串联质谱检测混合标准品溶液，绘制标准曲线和供试品溶液，用超高效液相色谱串联质谱进行质谱正、负离子模式分析，根据标准曲线得供试品防己黄芪汤中十九种成分含量。该方法灵敏度高、重现性好，分析准确可靠，可同时定量检测防己黄芪汤中19种化学成分：芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、紫檀烷、紫檀烷苷、异黄烷、甘草素、甘草苷、甘草次酸、粉防己碱、防己诺啉碱、白术内酯Ⅰ、白术内酯ⅡⅠ、异黄烷苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ。

Description

一种超高效液相色谱串联质谱法测定防己黄芪汤中十九种成 分含量的方法
技术领域
本发明属于中药成分检测技术领域，具体涉及一种超高效液相色谱串联质谱法测定防己黄芪汤中十九种成分含量的方法。
背景技术
防己黄芪汤始载于《金匮要略》，全方由防己、黄芪、白术、甘草、生姜、大枣组成，具有固表益气、祛风利湿等功效。近年来关于防己黄芪汤在临床上的应用主要集中于慢性心衰、心源性水肿、类风湿关节炎、慢性肾小球肾炎、肾病综合征等疾病，确切的利水药理作用使得防己黄芪汤近年来越来越受到关注。然而，现有的研究多集中在临床以及药理作用上，对其化学成分的研究较少。为了更好地研究防己黄芪汤，保证其生产质量和临床应用，急需提供对防己黄芪汤化学成分分析的方法。
中药药效作用的发挥有赖于其所含的化学成分，且化学成分含量的高低和稳定性直接影响了其药效作用的强弱。中药作为一个整体，强调的是各味药的协同作用。中药中单一有效成分或指标成分控制，难以真正控制药品质量，而采用多指标多成分的含量测定方法将成为中药未来质量控制的方法的主流。随着现代分析技术的发展，超高效液相色谱串联质谱由于其分离速度快，超高灵敏度，测定专属性强而被广泛运用于中药及复方制剂的分析中。
发明内容
本发明的目的在于提供一种超高效液相色谱串联质谱法测定防己黄芪汤中十九种成分含量的方法，该方法灵敏度高、重现性好，分析准确、可靠，可满足同时定量检测防己黄芪汤中十九种化学成分（芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、紫檀烷、紫檀烷苷、异黄烷、甘草素、甘草苷、甘草次酸、粉防己碱、防己诺啉碱、白术内酯Ⅰ、白术内酯ⅡⅠ、异黄烷苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ）。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种超高效液相色谱串联质谱法测定防己黄芪汤中十九种成分含量的方法，其特征在于：具体步骤如下：
(1)供试品溶液的制备：精密称取防己黄芪汤冻干粉末35mg、300mg各一份分别于离心管中，分别加入甲醇1mL，涡旋1min混匀，控制超声温度：30℃，频率：30KHz超声处理30min，13000r/min的条件下离心15min，取上清，即得供试品溶液1 号和2号，分别用于超高效液相色谱串联质谱正、负离子模式分析；
（2）对照品溶液的制备：取芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、紫檀烷、紫檀烷苷、异黄烷、甘草素、甘草苷、甘草次酸、粉防己碱、防己诺啉碱、白术内酯Ⅰ、白术内酯ⅡⅠ、异黄烷苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ对照品精密称定，分别置5mL容量瓶中，加入甲醇定容，制成浓度分别为0.624mg/mL、0.576mg/mL、0.432mg/mL、0.683mg/mL、0.462mg/mL、0.326mg/mL、0.722mg/mL、0.428mg/mL、0886mg/mL、0.550mg/mL、0.438mg/mL、0.440mg/mL、0.434mg/mL、0.642mg/mL、0.580mg/mL、1.100mg/mL、0.980mg/mL、0.500mg/mL和0.600mg/mL的对照品溶液；
（3）混合标准品溶液的制备：分别吸取适量体积的十九种成分的对照品溶液于两个5mL容量瓶中，定容，得到白术内酯Ⅰ、白术内酯ⅡⅠ、甘草素、芒柄花素、毛蕊异黄酮、紫檀烷、异黄烷、甘草苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮苷、紫檀烷苷、粉防己碱和防己诺啉碱组成的终浓度为15.19μg/mL、30.49μg/mL、21.4μg/mL、6.48μg/mL、10.26μg/mL、4.62μg/mL、9.025μg/mL、151.3μg/mL、54.6μg/mL、59.76μg/mL、29.34μg/mL、82.12μg/mL和82.5μg/mL的混合标准品溶液A；异黄烷苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪皂苷Ⅳ和甘草次酸组成的终浓度为23.2μg/mL、198.00μg/mL、137.2μg/mL、40μg/ml、18μg/ml和16.5μg/mL的混合标准品溶液B；
(4)标准曲线的绘制：将混合标准品溶液A稀释至终浓度为100％、 75％、 50％、 30％、10％、 2％的系列浓度，将混合标准品溶液B稀释至终浓度为60%、40%、20%、7%、5%、2%的系列浓度；采用超高效液相色谱串联质谱检测，其中混合标准品溶液A在正离子模式下分析，混合标准品溶液B在负离子模式下分析，并分别绘制标准曲线；
所述液相色谱条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3液相色谱柱，规格：2.1mm×100mm，1 .8μm；柱温：30℃；流动相：乙腈和0.1％甲酸水溶液；分析时间正离子为23min；负离子为17min；
所述质谱条件：采用MRM多反应监测模式、ESI离子源，离子源温度400℃，质量范围：M/Z50-1500，喷雾电压：3 .5千伏(+)、3 .5千伏(－)，鞘气体体积：35，辅助体积：10，毛细管温度：320℃，透镜电压：55千帕，质量分辨率：70000；
(5)取步骤(1)配置的1号和2号供试品溶液，采用步骤(4)中所述液相色谱条件和质谱条件，进行质谱正、负离子模式分析，再根据标准曲线即得到供试品防己黄芪汤中十九种成分含量。
本发明优化流动相时，比较了有机相(甲醇、乙腈、0 .1％甲酸甲醇和 0.1％甲酸乙腈)和水相(水和0 .1％甲酸水)，最终发现乙腈、0 .1％甲酸水为流动相系统进行梯度洗脱时，色谱峰分离度和峰形良好，且保留时间大大缩短，该流动相系统提高了实验效率，同时也节约了试剂，具有重要经济意义。提取溶剂选择上考察了甲醇、50％甲醇和80％甲醇溶液，最终发现纯甲醇溶液能有效的提取出防己黄芪汤中19种成分，因此提取溶剂采用甲醇溶液。
本发明与现有技术相比具有如下优点和效果：样本前处理简单、快捷，重现性好；分析时间短，不超22分钟；分离度较好，可准确测定十九种成分的含量。该方法可用于防己黄芪汤的生产质量监控。
附图说明
图1为样品溶液的质谱总离子流图(A：正离子；B：负离子)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细、完整的说明。
实施例中使用到的仪器和试剂如下：
仪器：Agilent 1290超高效液相色谱仪(Agilent公司)，3200QTrap质谱仪(AB Sciex公司)超声波清洗器(KQ5200E，昆山市超声仪器有限公司)，色谱柱Waters ACQUITY UPLC HSST3(2.1mm×100mm，1 .8μm)。
试剂：乙腈(质谱纯，Fisher公司)、甲醇(色谱纯，Fisher公司)、超纯水、甲酸(色谱纯，Fisher公司)，其余试剂均为分析纯。
（1）供试品溶液的制备：精密称取防己黄芪汤冻干粉末35mg、300mg各一份于离心管中，加入甲醇1mL，涡旋1min混匀，进行超声处理30min（温度：30℃，频率：30KHz），13000r/min的条件下离心15min，取上清，即得供试品溶液1 号和2号，分别用于超高效液相色谱串联质谱正、负离子模式分析；
（2）对照品溶液的制备：取芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、紫檀烷、紫檀烷苷、异黄烷、甘草素、甘草苷、甘草次酸、粉防己碱、防己诺啉碱、白术内酯Ⅰ、白术内酯ⅡⅠ、异黄烷苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ对照品精密称定，分别置5mL容量瓶中，加入甲醇定容，制成浓度分别为0.624mg/mL、0.576mg/mL、0.432mg/mL、0.683mg/mL、0.462mg/mL、0.326mg/mL、0.722mg/mL、0.428mg/mL、0886mg/mL、0.550mg/mL、0.438mg/mL、0.440mg/mL、0.434mg/mL、0.642mg/mL、0.580mg/mL、1.100mg/mL、0.980mg/mL、0.500mg/mL和0.600mg/mL的对照品溶液。
（3）混合标准品溶液的制备：分别吸取适量体积的十九种成分的对照品溶液于两个5mL容量瓶中，定容，得到白术内酯Ⅰ、白术内酯ⅡⅠ、甘草素、芒柄花素、毛蕊异黄酮、紫檀烷、异黄烷、甘草苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮苷、紫檀烷苷、粉防己碱和防己诺啉碱组成的终浓度为15.19μg/mL、30.49μg/mL、21.4μg/mL、6.48μg/mL、10.26μg/mL、4.62μg/mL、9.025μg/mL、151.3μg/mL、54.6μg/mL、59.76μg/mL、29.34μg/mL、82.12μg/mL和82.5μg/mL的混合标准溶液A。异黄烷苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪皂苷Ⅳ和甘草次酸组成的终浓度为23.2μg/mL、198.00μg/mL、137.2μg/mL、40μg/ml、18μg/ml和16.5μg/mL的混合标准品溶液B；
（4）将混合标准品溶液A稀释至终浓度为100％、 75％、 50％、 30％、 10％、 2％的系列浓度，将混合标准品溶液B稀释至终浓度为60%、40%、20%、7%、5%、2%的系列浓度，采用超高效液相色谱串联质谱检测，其中混合标准品溶液A在正离子模式下分析，混合标准品溶液B在负离子模式下分析，并分别绘制标准曲线；
所述液相色谱条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3液相色谱柱，规格：2.1mm×100mm，1 .8μm；柱温：30℃；流动相A为：0.1％甲酸水溶液；流动相B为：乙腈。正离子流动相梯度洗脱程序为：0-1min, B 20%; 1-5min, B 25%; 5-8min, B 30%; 8-12min, B 40%;12-16min, B 60%; 16-18min, B 75%; 18-20min, B 99%; 20-21min, B 99%; 21-23min,B 20%；进样量为3 μL，液相流速为0.2 mL/min。负离子流动相梯度洗脱程序为：0-1min，B20%；1-7min，B57%；7-10min，B60%；10-12min，B80%；12-16min，B99%；16-17min，B20%。
所述质谱条件：采用MRM多反应监测模式、ESI离子源，离子源温度400℃，质量范围：M/Z 50-1500，喷雾电压：3 .5千伏(+)、3 .5千伏(－)，鞘气体体积：35，辅助体积：10，毛细管温度：320℃，透镜电压：55千帕，质量分辨率：70000；
(5)取步骤(1)配置的1号和2号供试品溶液，采用步骤(4)中所述液相色谱条件和质谱条件，进行质谱正、负离子模式分析，再根据标准曲线即可得到供试品防己黄芪汤中十九种成分含量。监测离子、碰撞能量、锥孔电压等参数见表1。
表1十九种成分的监测离子、碰撞能量、锥孔电压参数
Figure DEST_PATH_IMAGE002
实例2：防己黄芪汤中十九种成分含量测定方法学考察：下述实验的供试品溶液均采用如下方法制备：取防己黄芪汤粉末， 精密称取35mg和300mg，加入甲醇1mL， 超声提取30min（温度：30℃，频率：30KHz）， 13000r/min的条件下离心15min， 取上清， 0.22μm微孔滤膜过滤， 即得供试品 溶液， 分别用于质谱正、 负离子模式分析。
标准曲线的建立及线性范围试验：将混合标准品溶液A稀释至终浓度为100％、 75％、50％、 30％、 10％、 2％的系列浓度，将混合标准品溶液B稀释至终浓度为60%、40%、20%、7%、5%、2%的系列浓度。采用拟定的方法，采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3(2.1mm×100mm，1.8μ m)色谱柱以Agilent 1290超高效液相色谱仪联用3200QTrap串联质谱进行检测绘制标准曲 线并得到个成分的线性范围结果见表2。
表2标准曲线、相关系数及线性范围结果
Figure DEST_PATH_IMAGE004
精密度试验：取混和标准品溶液A和B，分别连续进样6次，测定样品中19种成分的峰面积，其同一种供试品溶液的峰面积RSD≤4%，表明整个检测系统的精密度良好，结果见表3。
表3 精密度、重复性和稳定性试验结果
Figure DEST_PATH_IMAGE006
重复性试验：取防己黄芪汤粉末，精密称取35mg和300mg制备供试品溶液1号和2号，各平行备样6份，供试品溶液1号在正离子模式下，供试品溶液2号在负离子模式下进行超高效液相色谱串联质谱检测，结果显示，供试品溶液中十九种成分的峰面积的RSD≤4%，表明该方法重现性良好，结果见表3。
稳定性试验：取防己黄芪汤粉末，精密称取35mg和300mg制备供试品溶液1号和2号，分别在0小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时、12小时测定十九种成分的峰面积，结果显示，供试品溶液中十九种成分的峰面积的RSD≤4%，表明防己黄芪汤的待测溶液在12小时内稳定性良好，结果见表3。
加样回收率试验：防己黄芪汤粉末作为加样回收试验样本，取35mg和300mg制备供试品溶液1号和2号，分别在正离子模式和负离子模式下进行加样回收率试验，所得十九种成分峰面积的平均值作为该方中含量的真实值。依据防己黄芪汤中十九种成分含量的80%、100%、120%分别加入对照品储备液，每个浓度下平行备样三份，制备供试品溶液，测定含量，并依据如下公式计算回收率及RSD，具体结果见表4。回收率（%）=（测得量-样品中含量）/加入对照品量。
表4加样回收率试验结果
Figure DEST_PATH_IMAGE008
Figure DEST_PATH_IMAGE010
实例3防己黄芪汤中十九种成分的含量检测：利用上述建立的十九种成分含量测定条件对防己黄芪汤进行测定：精密称取防己黄芪汤冻干粉末35mg、300mg各一份于离心管中，加入甲醇1mL，涡旋1min混匀，进行超声处理30min（温度：30℃，频率：30KHz），13000r/min的条件下离心15min，取上清，即得供试品溶液1 号和2号。
采用MRM多反应监测模式、ESI离子源，离子源温度400℃，质量范围：M/Z 50-1500，喷雾电压：3 .5千伏(+)、3 .5千伏(－)，鞘气体体积：35，辅助体积：10，毛细管温度：320℃，透镜电压：55千帕，质量分辨率：70000；
采用标准曲线法计算供试品中十九种成分的含量，结果如下：防己黄芪汤粉末中芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、紫檀烷、紫檀烷苷、异黄烷、甘草素、甘草苷、甘草次酸、粉防己碱、防己诺啉碱、白术内酯Ⅰ、白术内酯ⅡⅠ、异黄烷苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ的含量是428.286μg/g，12.285μg/g，32.000μg/g，573.429μg/g，11.714μg/g，244.571μg/g，7.714μg/g，111.143μg/g，1684.286μg/g，1.933μg/g，898.158μg/g，912.857μg/g，30.857μg/g，202.001μg/g，14.267μg/g，56.100μg/g，26.433μg/g，3.870μg/g，1.62μg/g。

Claims (2)

1.一种超高效液相色谱串联质谱法测定防己黄芪汤中十九种成分含量的方法，其特征在于：具体步骤如下：
（1）供试品溶液的制备：精密称取防己黄芪汤冻干粉末35mg、300mg各一份分别于离心管中，分别加入甲醇1mL，涡旋1min混匀，控制超声温度30℃，频率30KHz超声处理30min，13000r/min的条件下离心15min，取上清，即得供试品溶液1 号和2号，分别用于超高效液相色谱串联质谱正、负离子模式分析；
（2）对照品溶液的制备：取芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、紫檀烷、紫檀烷苷、异黄烷、甘草素、甘草苷、甘草次酸、粉防己碱、防己诺啉碱、白术内酯Ⅰ、白术内酯ⅡⅠ、异黄烷苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ和黄芪皂苷Ⅳ对照品精密称定，分别置5mL容量瓶中，加入甲醇定容，制成浓度分别为0.624mg/mL、0.576mg/mL、0.432mg/mL、0.683mg/mL、0.462mg/mL、0.326mg/mL、0.722mg/mL、0.428mg/mL、0886mg/mL、0.550mg/mL、0.438mg/mL、0.440mg/mL、0.434mg/mL、0.642mg/mL、0.580mg/mL、1.100mg/mL、0.980mg/mL、0.500mg/mL和0.600mg/mL的对照品溶液；
（3）混合标准品溶液的制备：分别吸取适量体积的十九种成分的对照品溶液于两个5mL容量瓶中，定容，得到白术内酯Ⅰ、白术内酯ⅡⅠ、甘草素、芒柄花素、毛蕊异黄酮、紫檀烷、异黄烷、甘草苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮苷、紫檀烷苷、粉防己碱和防己诺啉碱组成的终浓度为15.19μg/mL、30.49μg/mL、21.4μg/mL、6.48μg/mL、10.26μg/mL、4.62μg/mL、9.025μg/mL、151.3μg/mL、54.6μg/mL、59.76μg/mL、29.34μg/mL、82.12μg/mL和82.5μg/mL的混合标准品溶液A；异黄烷苷、黄芪皂苷Ⅰ、黄芪皂苷Ⅱ、黄芪皂苷Ⅲ、黄芪皂苷Ⅳ和甘草次酸组成的终浓度为23.2μg/mL、198.00μg/mL、137.2μg/mL、40μg/ml、18μg/ml和16.5μg/mL的混合标准品溶液B；
(4)标准曲线的绘制：将混合标准品溶液A稀释至终浓度为100％、 75％、 50％、 30％、10％、 2％的系列浓度，将混合标准品溶液B稀释至终浓度为60%、40%、20%、7%、5%、2%的系列浓度；采用超高效液相色谱串联质谱检测，其中混合标准品溶液A在正离子模式下分析，混合标准品溶液B在负离子模式下分析，并分别绘制标准曲线；
(5)取步骤(1)配置的1号和2号供试品溶液，采用步骤(4)中所述液相色谱条件和质谱条件，进行质谱正、负离子模式分析，再根据标准曲线即得到供试品防己黄芪汤中十九种成分含量。
2.根据权利要求1所述的一种超高效液相色谱串联质谱法测定防己黄芪汤中十九种成分含量的方法，其特征在于：所述液相色谱条件：色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3液相色谱柱，规格：2.1mm×100mm，1 .8μm；柱温：30℃；流动相：乙腈和0.1％甲酸水溶液；分析时间正离子为23min；负离子为17min；
所述质谱条件：采用MRM多反应监测模式、ESI离子源，离子源温度400℃，质量范围：M/Z50-1500，喷雾电压：3 .5千伏(+)、3 .5千伏(－)，鞘气体体积：35，辅助体积：10，毛细管温度：320℃，透镜电压：55千帕，质量分辨率：70000。
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