CN113917064B - 清热解毒口服液hplc指纹图谱的建立方法及其指纹图谱 - Google Patents

清热解毒口服液hplc指纹图谱的建立方法及其指纹图谱 Download PDF

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Abstract

本发明属于中药制剂分析领域，具体公开了一种清热解毒口服液HPLC指纹图谱的建立方法，该方法包括对照品及供试品溶液的制备、HPLC色谱条件的确定及HPLC标准指纹图谱的制作。本发明同时公开了由该方法得到的清热解毒口服液HPLC标准指纹图谱，该指纹图谱有30个共有峰。本发明质量检测方法操作简便、稳定性高、重现性好，所得图谱特征峰全面，通过标准指纹图谱共有峰的比对，可对清热解毒口服液的质量进行全面评价和控制，有利于精准评估制剂的内在质量，确保临床用药的安全性、有效性。

Description

清热解毒口服液HPLC指纹图谱的建立方法及其指纹图谱
技术领域
本发明公开了一种清热解毒口服液HPLC指纹图谱的建立方法及其指纹图谱，属于中药制剂分析领域。
背景技术
清热解毒口服液收载于中国药典2015版一部，由石膏、金银花、玄参、地黄、连翘、栀子、甜地丁、黄芩、龙胆、板蓝根、知母、麦冬12味药物组成，用于热毒壅盛所致发热面赤、烦躁口渴、咽喉肿痛等症，流感、上呼吸道感染见上述证候者。方中石膏辛甘大寒，清热泻火；金银花、连翘、板蓝根、地丁清热解毒，消肿利咽；玄参、地黄凉血以清血中之热，又能生津止渴；栀子清泄三焦之火，黄芩清肺火，龙胆清肝胆之火；知母、麦冬养阴，清心除烦。诸药同用，共奏清热解毒之功，临床效果显著。
清热解毒口服液制剂是中药复方制剂，含多味中药且化学成分复杂，对其进行有效的质量控制是保证其临床疗效的重要基础。目前，关于清热解毒口服液的质量控制报道主要是对单一或几种成分的定量分析和对部分组方药材的定性鉴别，其药效成分尚不明确，同时缺乏有关清热解毒口服液更为综合、全面的质量控制研究。为保证并稳定产品质量，需要对其质量检测和控制法进行全面地研究。
中药指纹图谱作为一种中药质量控制技术及方法，具有“整体性”和“模糊性”特点，能较为全面地反应中药的整体质量。目前国内外对于以中药指纹图谱控制清热解毒口服液质量的相关专利公开及文献报道较少，尤立华等，清热解毒口服液HPLC指纹图谱研究仅能够确定9个共有峰，很多成分未能得到，未能实现对制剂的全面评价和控制。因此，需要提供一种新的清热解毒口服液的HPLC指纹图谱建立方法，可有效反映清热解毒口服液化学成分的整体性和复杂性，对制剂质量进行全面地评价和控制，进而保证临床用药的安全性与有效性。
发明内容
针对现有清热解毒口服液质量检测方法的不足，本发明的目的是提供一种清热解毒口服液指纹图谱建立方法。具体来说，该方法将清热解毒口服液制备成供试品溶液，经过HPLC分离检测，从而获得清热解毒口服液HPLC标准指纹图谱，实现全方位多方面检测，完善其质量检测体系，进而为清热解毒口服液的真伪鉴别和内在质量提供可靠依据。
本发明一种清热解毒口服液HPLC指纹图谱的建立方法，包括下列步骤：
1)对照品和供试品溶液的制备：称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、栀子苷、龙胆苦苷、连翘酯苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩苷对照品适量，用甲醇溶解，作为对照品溶液；
精密量取清热解毒口服液，加入50％-90％甲醇，超声提取5-30min，放冷，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
2)HPLC色谱条件的确定：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以乙腈为流动相A，0.05-0.2％磷酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱；检测波长：220-260nm；流速：0.6-1.0ml/min；柱温：20-30℃；
3)指纹图谱的制作：按步骤2)色谱条件对对照品溶液和供试品溶液进行分析比较，得到由样品共有特征峰构成的清热解毒口服液HPLC标准指纹图谱。
优选地，步骤1)所述供试品溶液，按如下步骤制备：精密量取清热解毒口服液样品2ml，加入70％甲醇，超声提取10min，放冷，滤过，取续滤液，得供试品溶液。
优选地，步骤2)所述的色谱柱为Waters Xselect HSS T3或Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱。
进一步优选，所述色谱柱的规格为4.6×150mm，2.5μm。
优选地，步骤2)所述流动相B为0.1％磷酸溶液。
步骤2)所述梯度洗脱条件为：
Figure BDA0003348107600000021
优选地，所述的检测波长为225nm，流速为0.8ml/min，柱温为20℃。
本发明的另一个目的，是提供所述清热解毒口服液HPLC标准指纹图谱，将12批清热解毒口服液样品，按上述方法制备成供试品溶液，以HPLC分离检测，使用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件分析，得到清热解毒口服液HPLC标准指纹图谱。
本发明所得到的指纹图谱有30个共有峰，以栀子苷参比峰，其共有峰相对保留时间tR依次分别为：0.083，0.228，0.323，0.334，0.631，0.701，0.725，0.752，0.865，0.889，0.908，0.970，1.025，1.231，1.445，1.467，1.521，1.535，1.563，1.588，1.631，1.728，1.792，1.898，2.053，2.076，2.229，2.302，2.401。
通过对照品比对，其中6号峰为新绿原酸，11号峰为绿原酸，12号峰为隐绿原酸，13号峰为栀子苷，14号峰为龙胆苦苷，19号峰为连翘酯苷A，23号峰为异绿原酸B，24号峰为异绿原酸A，25号峰为异绿原酸C，26号峰为黄芩苷，27号峰为连翘苷，30号峰为汉黄芩苷。
与现有技术相比，本发明的技术方案取得了以下有益技术效果：
1)本发明一种清热解毒口服液HPLC指纹图谱的建立方法，根据清热解毒口服液的处方成分构成特点，优选最佳的HPLC条件，解决了特征峰难以分开及杂质峰干扰大的难题，所得指纹图谱分离度高、峰形好，各特征色谱峰均实现了良好的基线分离，稳定性好、特征峰多，能全面、准确地评价清热解毒口服液的质量，适用于对清热解毒口服液产品质量的控制。
2)本发明检测方法以栀子苷为参比峰，确定了30个共有峰为构成清热解毒口服液指纹图谱的共有峰，从共有峰中鉴定出新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、龙胆苦苷、连翘酯苷A、异绿原酸B等12种化学成分，指纹图谱组成更加丰富、全面。
3)本发明建立的清热解毒口服液HPLC指纹图谱克服了现有技术检测指标单一、不能反映内在质量的缺点，所提供的清热解毒口服液HPLC指纹图谱建立方法精密度高、重现性好，通过对比所得指纹图谱中共有峰的有无，可对清热解毒口服液的质量进行全面评价，有效地保证了成品的质量。
附图说明
图1为清热解毒口服液HPLC混合对照图谱
其中，6号峰为新绿原酸，11号峰为绿原酸，12号峰为隐绿原酸，13号峰为栀子苷，14号峰为龙胆苦苷，19号峰为连翘酯苷A，23号峰为异绿原酸B，24号峰为异绿原酸A，25号峰为异绿原酸C，26号峰为黄芩苷，27号峰为连翘苷，30号峰为汉黄芩苷；
图2为清热解毒口服液HPLC标准指纹图谱
图标1-30为30个共有峰，其中，6号峰为新绿原酸，11号峰为绿原酸，12号峰为隐绿原酸，13号峰为栀子苷，14号峰为龙胆苦苷，19号峰为连翘酯苷A，23号峰为异绿原酸B，24号峰为异绿原酸A，25号峰为异绿原酸C，26号峰为黄芩苷，27号峰为连翘苷，30号峰为汉黄芩苷；
图3为12批清热解毒口服液的HPLC指纹图谱叠加图
其中，6号峰为新绿原酸，11号峰为绿原酸，12号峰为隐绿原酸，13号峰为栀子苷，14号峰为龙胆苦苷，19号峰为连翘酯苷A，23号峰为异绿原酸B，24号峰为异绿原酸A，25号峰为异绿原酸C，26号峰为黄芩苷，27号峰为连翘苷，30号峰为汉黄芩苷。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚、明晰，以下将结合附图对实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。显而易见，以下实施例是本申请实施例的一部分，而不是全部。因此，以下对实施例的详细描述并非限定本申请要求保护的范围，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动的前提下所作出的等同替换或修改，均应包含在本发明的保护范围之内。
实施例1清热解毒口服液HPLC标准指纹图谱的建立
1仪器与试药
1.1仪器
WatersArc超高效液相色谱仪(Waters公司)，Waters 2489UV/Vis检测器(Waters公司)；KQ-50型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2试药
12批清热解毒口服液由鲁南厚普制药有限公司提供，样品批号见表1，乙腈为色谱纯，水为纯化水，其余试剂均为分析纯。
表1清热解毒口服液测试样品批号
Figure BDA0003348107600000041
2方法与结果
2.1色谱条件：Waters Xselect HSS T3色谱柱，4.6×150mm，粒径2.5μm；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.1％磷酸溶液为流动相B；检测波长：225nm；流速：0.8ml/min；柱温：20℃；进样体积：2μl；
按下表进行梯度洗脱：
Figure BDA0003348107600000051
2.2对照品和供试品溶液的制备：
精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、栀子苷、龙胆苦苷、连翘酯苷A、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩苷混合对照品，用70％甲醇溶解后，作为混合对照品溶液。
精密量取清热解毒口服液样品2ml，加入70％甲醇，超声提取10min，放冷，滤过，取续滤液，得供试品溶液。
2.3指纹图谱的建立
将上述对照品溶液和供试品溶液分别注入HPLC色谱系统，测定12个批号清热解毒口服液HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的清热解毒口服液HPLC标准指纹图谱。混合对照品溶液的图谱如图1所示，清热解毒口服液HPLC标准指纹图谱如图2所示，其中以13号栀子苷峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的共有峰的相对保留时间tR分别为：0.083，0.228，0.323，0.334，0.631，0.701，0.725，0.752，0.865，0.889，0.908，0.970，1.025，1.231，1.445，1.467，1.521，1.535，1.563，1.588，1.631，1.728，1.792，1.898，2.053，2.076，2.229，2.302，2.401。
其中，6号峰为新绿原酸，11号峰为绿原酸，12号峰为隐绿原酸，13号峰为栀子苷，14号峰为龙胆苦苷，19号峰为连翘酯苷A，23号峰为异绿原酸B，24号峰为异绿原酸A，25号峰为异绿原酸C，26号峰为黄芩苷，27号峰为连翘苷，30号峰为汉黄芩苷。
将12个批号清热解毒口服液HPLC指纹图谱导入药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件分析，进行色谱峰匹配，确定30个共有峰为构成清热解毒口服液指纹图谱的特征峰，以13号栀子苷色谱峰为参照峰，样品共有峰的相对保留时间分别列于表2，12批清热解毒口服液共有峰的相对峰面积见表3。12批清热解毒口服液与标准指纹图谱相似度计算结果依次为1.000，0.986，0.993，0.983，0.911，0.980，0.995，0.986，0.993，0.983，0.958，0.913。12批清热解毒口服液的HPLC指纹图谱叠加图如图3所示。
表2 12批清热解毒口服液共有峰的相对保留时间(tR)
Figure BDA0003348107600000061
表3 12批清热解毒口服液共有峰的相对峰面积(％)
Figure BDA0003348107600000062
Figure BDA0003348107600000071
2.4方法学考察
2.4.1精密度试验
取样品(352200012-1)，按照2.2项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，以13号栀子苷峰为参照峰，计算出1-30号共有色谱峰相对保留时间的RSD<0.07％、相对峰面积的RSD<1.56％，同时用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版》软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明仪器稳精密度良好。
2.4.2稳定性试验
取样品(352200012-1)，按照2.2项下方法制备供试品溶液，分别在0，2，4，6，8，12，24，48h进样，以13号栀子苷峰为参照峰，计算出1-30号共有峰相对保留时间的RSD<0.21％，相对峰面积的RSD<1.67％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明供试品溶液在48小时内稳定。
2.4.3重现性试验
取同一批号样品(352200012-1)，分别精密量取6份，按照2.2项下方法制备供试品溶液，分别进样，以13号栀子苷峰为参照峰，计算出1-30号共有峰相对保留时间的RSD<0.23％，相对峰面积的RSD<1.16％，同时用相似度评价软件计算各色谱指纹图谱的相似度均大于0.99，表明方法重现性良好。
实施例2清热解毒口服液HPLC标准指纹图谱的建立
1仪器与试药
1.1仪器
Waters Arc超高效液相色谱仪(Waters公司)，Waters 2489UV/Vis检测器(Waters公司)；KQ-50型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2试药
12批清热解毒口服液由鲁南厚普制药有限公司提供，样品批号见表1，乙腈为色谱纯，水为纯化水，其余试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1色谱条件：Waters Xselect HSS T3色谱柱，4.6×150mm，粒径2.5μm；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.05％磷酸溶液为流动相B；检测波长：220nm；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；进样体积：2μl；
按下表进行梯度洗脱：
Figure BDA0003348107600000081
Figure BDA0003348107600000091
2.2对照品和供试品溶液的制备：
精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、栀子苷、龙胆苦苷、连翘酯苷A、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩苷混合对照品，用60％甲醇溶解后，作为混合对照品溶液。
精密量取清热解毒口服液样品2ml，加入50％甲醇，超声提取30min，放冷，滤过，取续滤液，得供试品溶液。
2.3指纹图谱的建立
测定12个批号清热解毒口服液HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的清热解毒口服液HPLC标准指纹图谱，其中以13号栀子苷峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的共有峰的相对保留时间tR分别为：0.083，0.227，0.324，0.334，0.632，0.703，0.724，0.752，0.864，0.889，0.907，0.970，1.023，1.230，1.445，1.467，1.520，1.534，1.563，1.587，1.631，1.727，1.791，1.898，2.052，2.076，2.228，2.303，2.401。
实施例3清热解毒口服液HPLC标准指纹图谱的建立
1仪器与试药
1.1仪器
Agilent超高效液相色谱仪(Agilent公司)，LC/MSD检测器(Agilent公司)；KQ-50型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2试药
12批清热解毒口服液由鲁南厚普制药有限公司提供，样品批号见表1，乙腈为色谱纯，水为纯化水，其余试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1色谱条件：Agilent ZORBAX SB-Aq色谱柱，250×4.6mm，粒径5μm；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.2％磷酸溶液为流动相B；检测波长：260nm；流速：0.6ml/min；柱温：30℃；进样体积：2μl；
按下表进行梯度洗脱：
Figure BDA0003348107600000092
Figure BDA0003348107600000101
2.2对照品和供试品溶液的制备：
精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、栀子苷、龙胆苦苷、连翘酯苷A、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩苷混合对照品，用90％甲醇溶解后，作为混合对照品溶液。
精密量取清热解毒口服液样品2ml，加入90％甲醇，超声提取5min，放冷，滤过，取续滤液，得供试品溶液。
2.3指纹图谱的建立
测定12个批号清热解毒口服液HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的清热解毒口服液HPLC标准指纹图谱，其中以13号栀子苷峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的共有峰的相对保留时间tR分别为：0.085，0.231，0.325，0.339，0.634，0.705，0.729，0.756，0.869，0.892，0.910，0.975，1.026，1.235，1.448，1.467，1.523，1.537，1.569，1.590，1.634，1.731，1.795，1.896，2.050，2.077，2.232，2.305，2.404。
实施例4清热解毒口服液HPLC标准指纹图谱的建立
1仪器与试药
1.1仪器
WatersArc超高效液相色谱仪(Waters公司)，Waters 2489UV/Vis检测器(Waters公司)；KQ-50型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)。
1.2试药
12批清热解毒口服液由鲁南厚普制药有限公司提供，样品批号见表1，乙腈为色谱纯，水为纯化水，其余试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1色谱条件：Waters Xselect HSS T3色谱柱，4.6×150mm，粒径2.5μm；流动相：以乙腈为流动相A，以体积百分含量为0.15％磷酸溶液为流动相B；检测波长：225nm；流速：0.8ml/min；柱温：20℃；进样体积：2μl；
按下表进行梯度洗脱：
Figure BDA0003348107600000111
2.2对照品和供试品溶液的制备：
精密称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、栀子苷、龙胆苦苷、连翘酯苷A、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩苷混合对照品，用80％甲醇溶解后，作为混合对照品溶液。
精密量取清热解毒口服液样品2ml，加入80％甲醇，超声提取15min，放冷，滤过，取续滤液，得供试品溶液。
2.3指纹图谱的建立
测定12个批号清热解毒口服液HPLC指纹图谱，并进行分析比较，得到由其共有特征峰构成的清热解毒口服液HPLC标准指纹图谱，其中以13号栀子苷峰为参照峰，计算得出该标准指纹图谱具有的共有峰的相对保留时间tR分别为：0.085，0.228，0.324，0.337，0.630，0.701，0.724，0.752，0.864，0.889，0.907，0.971，1.025，1.232，1.445，1.466，1.521，1.537，1.563，1.586，1.630，1.728，1.792，1.892，2.053，2.075，2.229，2.301，2.402。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理及构思的前提下，还可以做出若干修饰和改进，这些也应都属于本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种清热解毒口服液指纹图谱的建立方法，其特征在于，包括下列步骤：
1）对照品和供试品溶液的制备：称取新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、栀子苷、龙胆苦苷、连翘酯苷、异绿原酸B、异绿原酸A、异绿原酸C、黄芩苷、连翘苷、汉黄芩苷对照品适量，用甲醇溶解，作为对照品溶液；
精密量取清热解毒口服液，加入50%-90%甲醇，超声提取5-30min，放冷，滤过，取续滤液，作为供试品溶液；
2）色谱条件的确定：十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱，以乙腈为流动相A，0.05-0.2%磷酸溶液为流动相B，采用梯度洗脱；检测波长：225nm；流速：0.8ml/min；柱温：20℃；
所述梯度洗脱条件为：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
所述十八烷基硅烷键合硅胶色谱柱为Waters Xselect HSS T3，规格4.6×150mm，2.5μm；或Agilent ZORBAX SB-Aq，规格4.6×250mm，粒径5μm；
3）指纹图谱的制作：按步骤2）色谱条件对对照品溶液和供试品溶液进行分析比较，得到由样品共有特征峰构成的清热解毒口服液标准指纹图谱。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）所述供试品溶液，按如下步骤制备：精密量取清热解毒口服液样品2ml，加入70%甲醇，超声提取10min，放冷，滤过，取续滤液，得供试品溶液。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2）所述流动相B为0.1%磷酸溶液。
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