CN113567577A - 一种肾衰乙方颗粒中指标性成分的薄层鉴别及高效液相色谱检测方法 - Google Patents

一种肾衰乙方颗粒中指标性成分的薄层鉴别及高效液相色谱检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种肾衰乙方颗粒中指标性成分的薄层鉴别及高效液相色谱检测方法。本发明进一步提供一种肾衰乙方颗粒中指标性成分的高效液相色谱检测方法。本发明提供的一种肾衰乙方颗粒中指标性成分的薄层鉴别及高效液相色谱检测方法，准确可靠、简便易行、专属性强，提高了颗粒的质量标准，可用于肾衰乙方颗粒的质量控制。

Description

一种肾衰乙方颗粒中指标性成分的薄层鉴别及高效液相色谱 检测方法
技术领域
本发明属于中药成分检测的技术领域，涉及一种肾衰乙方颗粒中指标性成分的薄层鉴别及高效液相色谱检测方法。
背景技术
肾衰乙方颗粒由制大黄、徐长卿、土茯苓、炒王不留行、陈皮、半夏、黄芪、当归、灵芝、胡芦巴、黄连共11味中药组成，经现代提取其有效成分，加入适宜的糊精精制而成的中药制剂。该方通过对大量慢性肾衰竭病人中药临床治疗的长期观察总结而成，其功能主治为扶正解毒，主要用于脾肾亏虚、浊毒瘀阻型慢性肾功能不全的治疗，在改善早、中期慢性肾脏病病人的症状体征方面疗效显著。为了有效控制生产过程的质量，保证产品的疗效，需要研究设计出能准确检测肾衰乙方颗粒中有效成分的检测方法。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种肾衰乙方颗粒中指标性成分的薄层鉴别及高效液相色谱检测方法，采用薄层色谱法对处方颗粒中的制大黄、徐长卿、土茯苓、陈皮、和黄芪进行了薄层色谱鉴别，同时采用高效液相色谱法测定处方君药制大黄中的芦荟大黄素和大黄素，臣药土茯苓中的落新妇苷，佐药陈皮中的橙皮苷的含量，从而有效控制制剂的质量，保证产品的疗效，并为制订肾衰乙方颗粒质量标准提供实验依据。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种肾衰乙方颗粒中指标性成分的薄层鉴别方法，包括以下步骤：
1)将肾衰乙方颗粒样品加水溶解后加入萃取试剂进行萃取，获得的萃取液去除液体至干，残余物加甲醇溶解定容，获得供试品溶液；
2)将大黄素、芦荟大黄素、丹皮酚、落新妇苷、橙皮苷、黄芪甲苷的对照品，分别加甲醇溶解并定容，分别配成相应的对照品溶液；
3)将步骤1)中的供试品溶液与步骤2)中的对照品溶液，分别点于同一硅胶板上，采用展开剂展开后取出、晾干，采用光照检视，比较供试品与对照品的斑点位置，对供试品中指标性成分进行鉴别。
优选地，步骤1)中，所述水的温度为55-65℃，优选为60℃。
优选地，步骤1)中，所述肾衰乙方颗粒样品加入质量g与水加入体积mL之比为10:10-200，优选为10:50-100。
更优选地，当所述供试品溶液用于鉴别大黄素、芦荟大黄素、丹皮酚、落新妇苷、橙皮苷时，所述肾衰乙方颗粒样品加入质量g与水加入体积mL之比为10:100；当所述供试品溶液用于鉴别黄芪甲苷时，所述肾衰乙方颗粒样品加入质量g与水加入体积mL之比为10:50。
优选地，步骤1)中，当供试品溶液用于鉴别大黄素、芦荟大黄素时，所述水中还加入盐酸，所述盐酸与水加入的体积之比为1:90-110，优选为1:100。
上述盐酸为体积百分比浓度为36-38％的盐酸水溶液。
优选地，步骤1)中，所述萃取试剂选自二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇中的一种或多种组合。
更优选地，当所述供试品溶液用于鉴别大黄素、芦荟大黄素、丹皮酚时，所述萃取试剂为二氯甲烷，所述萃取试剂的用量为90-110mL/次，萃取次数为2-4次，合并萃取液。
进一步优选地，所述萃取试剂的用量为100mL/次，萃取次数为3次。
更优选地，当所述供试品溶液用于鉴别落新妇苷时，所述萃取试剂为石油醚和乙酸乙酯，先采用石油醚进行萃取后合并萃取液，分为石油醚层和水相层，去除石油醚层，所述石油醚的用量为90-110mL/次，萃取次数为1-3次；水相层再采用乙酸乙酯进行萃取后合并萃取液，所述乙酸乙酯的用量为90-110mL/次，萃取次数为1-3次。
所述去除石油醚层是将合并的石油醚溶液(90-330mL)，直接弃去。
进一步优选地，所述石油醚的用量为100mL/次，萃取次数为2次；所述乙酸乙酯的用量为100mL/次，萃取次数为2次。
更优选地，当所述供试品溶液用于鉴别橙皮苷时，所述萃取试剂为乙酸乙酯，所述萃取试剂的用量为90-110mL/次，萃取次数为1-3次，合并萃取液。
进一步优选地，所述萃取试剂的用量为100mL/次，萃取次数为2次。
更优选地，当所述供试品溶液用于鉴别黄芪甲苷时，所述萃取试剂为用水饱和的正丁醇，所述萃取试剂的用量为40-60mL/次，萃取次数为4-6次，合并萃取液。
上述用水饱和的正丁醇为采用加入水和正丁醇的体积mL之比为10:100后液体分层，收集上层液体即得。
进一步优选地，当所述供试品溶液用于鉴别黄芪甲苷时，所述萃取液先采用氨试液洗涤后分为正丁醇层和氨试液层，合并氨试液层去除，所述氨试液的用量为40-60mL/次，洗涤次数为2-4次；正丁醇层再采用水洗涤后分为正丁醇层和水层，合并水层去除，所述水的用量为40-60mL/次，洗涤次数为2-4次。
上述氨试液为取400mL浓氨水加水稀释到1000mL，即得。其中，浓氨水为常规使用的含氨25-28％的水溶液。
优选地，步骤1)中，所述去除液体至干的方式选自浓缩挥干或浓缩至干中的一种。所述浓缩挥干可以为吹氮仪吹干。所述浓缩至干可以为旋转蒸发仪蒸干。
更优选地，当所述供试品溶液用于鉴别大黄素、芦荟大黄素、丹皮酚时，所述去除液体至干的方式为浓缩挥干。
更优选地，当所述供试品溶液用于鉴别落新妇苷、橙皮苷、黄芪甲苷时，所述去除液体至干的方式为浓缩至干。
优选地，步骤2)中，所述对照品溶液中对照品的浓度为0.5-2mg/mL，优选为1mg/mL。
优选地，步骤2)中，所述大黄素的CAS号为518-82-1，所述芦荟大黄素的CAS号为481-72-1，所述丹皮酚的CAS号为552-41-0，所述落新妇苷的CAS号为29838-67-3，所述橙皮苷的CAS号为520-26-3，所述黄芪甲苷的CAS号为83207-58-3。
优选地，步骤3)中，所述硅胶板为GF254硅胶板。
优选地，步骤3)中，所述供试品溶液或对照品溶液的点加量为2-4μL，优选为3μL。
优选地，步骤3)中，所述展开剂选自石油醚-乙酸乙酯-甲酸的混合溶液的上层溶液、乙酸乙酯-甲醇-水的混合溶液的上层溶液、二氯甲烷-甲醇-水的混合溶液的下层溶液中的一种。
更优选地，当所述供试品溶液用于鉴别大黄素、芦荟大黄素、丹皮酚、落新妇苷时，所述展开剂为石油醚-乙酸乙酯-甲酸的混合溶液的上层溶液。
进一步优选地，所述展开剂为石油醚-乙酸乙酯-甲酸(体积比为10-20:4-6:1，优选为15:5:1)的混合溶液的上层溶液。
更优选地，当所述供试品溶液用于鉴别橙皮苷时，所述展开剂为乙酸乙酯-甲醇-水的混合溶液的上层溶液。
进一步优选地，所述展开剂为乙酸乙酯-甲醇-水(体积比为140-160:15-20:13，优选为150:17:13)的混合溶液的上层溶液。
更优选地，当所述供试品溶液用于鉴别黄芪甲苷时，所述展开剂为二氯甲烷-甲醇-水的混合溶液的下层溶液。
进一步优选地，所述展开剂为二氯甲烷-甲醇-水(体积比为10-20:5-10:2，优选为15:7:2)的混合溶液的下层溶液。
优选地，步骤3)中，所述光照检视选自紫外光灯检视或日光检视中的一种。
更优选地，当所述供试品溶液用于鉴别大黄素、芦荟大黄素、丹皮酚、落新妇苷、橙皮苷时，所述光照检视为紫外光灯检视；当所述供试品溶液用于鉴别黄芪甲苷时，所述光照检视为日光检视。所述日光是指在普通白天光照。
进一步优选地，当所述供试品溶液用于鉴别大黄素、芦荟大黄素、橙皮苷时，所述紫外光灯的检测波长为360-370nm，优选为365nm。
进一步优选地，当所述供试品溶液用于鉴别大黄素、芦荟大黄素时，在紫外光灯检视后，所述硅胶板再置于氨蒸气中熏蒸检视。
更进一步优选地，所述熏蒸检视在日光下检视。
进一步优选地，当所述供试品溶液用于鉴别丹皮酚、落新妇苷时，所述紫外光灯的检测波长为250-260nm，优选为254nm。
进一步优选地，当所述供试品溶液用于鉴别丹皮酚时，在紫外光灯检视后，所述硅胶板再喷三氯化铁的乙醇溶液，加热至斑点显色清晰检视。
更进一步优选地，所述三氯化铁的乙醇溶液中，三氯化铁的质量浓度为4-6％，优选为5％。
进一步优选地，当所述供试品溶液用于鉴别落新妇苷时，在紫外光灯检视后，所述硅胶板再喷三氯化铁的乙醇溶液，加热至斑点显色清晰检视，再采用紫外光灯检视。
更进一步优选地，所述三氯化铁的乙醇溶液中，三氯化铁的质量浓度为4-6％，优选为5％。
更进一步优选地，再采用紫外光灯检视时，所述紫外光灯的检测波长为360-370nm，优选为365nm。
进一步优选地，当所述供试品溶液用于鉴别橙皮苷时，在紫外光灯检视前，先喷以三氯化铝的乙醇溶液后加热。
更进一步优选地，所述三氯化铝的乙醇溶液为9-11％的三氯化铝的乙醇溶液,(取9-11g三氯化铝加95％乙醇稀释到100mL，即得)，优选为10％的三氯化铝的乙醇溶液,(取10g三氯化铝加95％乙醇稀释到100mL，即得)。
进一步优选地，当所述供试品溶液用于鉴别黄芪甲苷时，喷以硫酸的乙醇溶液加热至斑点显色清晰。
更进一步优选地，所述硫酸的乙醇溶液中，乙醇的体积百分比浓度为9-11％，优选为10％。
更进一步优选地，所述加热温度为100-110℃，优选为105℃。
所述薄层鉴别方法的判断标准为：在紫外光灯或日光下，供试品与对照品在同一硅胶板上相同的位置上，显示相同的颜色斑点，即视供试品中的检测成分存在。
本发明第二方面提供一种肾衰乙方颗粒中指标性成分的高效液相色谱检测方法，包括以下步骤：
1)将肾衰乙方颗粒样品分为第一肾衰乙方颗粒样品和/或第二肾衰乙方颗粒样品；在第一肾衰乙方颗粒样品中加入第一溶剂溶解后加入混合试剂混合，再加入提取试剂振荡提取，获得的提取液挥干、定容，获得第一供试品溶液；在第二肾衰乙方颗粒样品中加入第二溶剂溶解后超声提取、冷却、过滤，取续滤液得到第二供试品溶液；
2)将芦荟大黄素和大黄素的对照品加入第三溶剂溶解并定容，配成第一对照品溶液；将落新妇苷和橙皮苷的对照品加入第三溶剂溶解并定容，配成第二对照品溶液；
3)采用第一高效液相色谱法分别检测第一供试品溶液和第一对照品溶液，采用第二高效液相色谱法分别检测第二供试品溶液和第二对照品溶液，比较第一供试品溶液与第一对照品溶液的保留时间和/或第二供试品溶液与第二对照品溶液的保留时间进行定性，采用外标法进行定量，确定第一供试品溶液中芦荟大黄素和大黄素的含量，和/或确定第二供试品溶液中落新妇苷和橙皮苷的含量。
优选地，步骤1)中，所述第一溶剂为水。所述水为超纯水。
优选地，步骤1)中，所述第一肾衰乙方颗粒样品加入的质量g与第一溶剂加入的体积mL之比为2.5:20-30，优选为2.5:25。
优选地，步骤1)中，所述混合试剂为盐酸。所述盐酸为体积百分比浓度为36-38％的盐酸的水溶液。
优选地，步骤1)中，所述第一肾衰乙方颗粒样品加入的质量g与混合试剂加入的体积mL之比为2.5:0.5-1.0，优选为2.5:0.75。
优选地，步骤1)中，所述提取试剂为二氯甲烷。
优选地，步骤1)中，所述提取试剂的用量为70-80mL/次，振荡提取次数为2-4次，合并提取液。
优选地，步骤1)中，所述定容采用的溶剂为甲醇。
优选地，步骤1)中，所述第二溶剂为40-60％甲醇的水溶液，优选为50％甲醇的水溶液。
优选地，步骤1)中，所述第二肾衰乙方颗粒样品加入的质量g与第二溶剂加入的体积mL之比为1:20-30，优选为1:25。
优选地，步骤1)中，所述超声提取时间为20-40min，优选为30min。
优选地，步骤1)中，所述冷却后需再称重，并用第二溶剂补足失重。
优选地，步骤1)中，所述过滤是指：取冷却后溶液的上清液过滤膜，放弃初滤液后，即得续滤液。
更优选地，所述滤膜为0.45μm滤膜。
优选地，步骤2)中，所述第三溶剂为甲醇。
优选地，步骤2)中，所述第一对照品溶液中，芦荟大黄素的浓度为150μg/mL，大黄素的浓度为20μg/mL。
优选地，步骤2)中，所述第二对照品溶液中，落新妇苷的浓度为40μg/mL，橙皮苷的浓度为260μg/mL。
优选地，步骤2)中，所述第一对照品溶液和/或第二对照品溶液可采用逐级稀释制得。
优选地，步骤3)中，所述第一高效液相色谱法中，采用检测器为二极管阵列检测器(DAD)。
优选地，步骤3)中，所述第一高效液相色谱法中，采用色谱柱为C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)。
更优选地，所述色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)。
优选地，步骤3)中，所述第一高效液相色谱法中，采用检测器波长为250-260nm，优选为254nm。
优选地，步骤3)中，所述第一高效液相色谱法中，采用柱温为25-35℃。更优选地，所述柱温为30.5℃。
优选地，步骤3)中，所述第一高效液相色谱法中，流动相采用流速为1.0-1.4ml/min。更优选地，所述流动相采用流速为1.2ml/min。
优选地，步骤3)中，所述第一高效液相色谱法中，进样量为5-20μL。更优选地，所述进样量为10μL。
优选地，步骤3)中，所述第一高效液相色谱法中，流动相为0.4-0.6％磷酸水溶液-乙腈，其中，A相为0.4-0.6％磷酸水溶液，B相为乙腈；分析时间为60min；梯度洗脱。
更优选地，所述第一高效液相色谱法中，流动相为0.5％磷酸水溶液-乙腈，其中，A相为0.5％磷酸水溶液，B相为乙腈；分析时间为60min；梯度洗脱。
更优选地，所述梯度洗脱的具体程序为：
0-20min，A相：B相体积比为70：30-70：30；
20-30min，A相：B相体积比为70：30-60：40；
30-50min，A相：B相体积比为60：40-30：70；
50-55min，A相：B相体积比为30：70-30：70；
55-56min，A相：B相体积比为30：70-70：30；
56-60min，A相：B相体积比为70：30-70：30。
优选地，步骤3)中，所述第二高效液相色谱法中，采用检测器为二极管阵列检测器(DAD)。
优选地，步骤3)中，所述第二高效液相色谱法中，采用色谱柱为C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)。
更优选地，所述色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)。
优选地，步骤3)中，所述第二高效液相色谱法中，采用检测器波长为290-295nm，优选为291nm。
优选地，步骤3)中，所述第二高效液相色谱法中，采用柱温为25-35℃。更优选地，所述柱温为30℃。
优选地，步骤3)中，所述第二高效液相色谱法中，流动相采用流速为0.8-1.2ml/min。更优选地，所述流动相采用流速为1.0ml/min。
优选地，步骤3)中，所述第二高效液相色谱法中，进样量为5-20μL。更优选地，所述进样量为10μL。
优选地，步骤3)中，所述第二高效液相色谱法中，流动相为0.05-0.15％磷酸水溶液-乙腈，其中，A相为0.05-0.15％磷酸水溶液，B相为乙腈；分析时间为60min；梯度洗脱。
更优选地，所述第一高效液相色谱法中，流动相为0.1％磷酸水溶液-乙腈，其中，A相为0.1％磷酸水溶液，B相为乙腈；分析时间为60min；梯度洗脱。
更优选地，所述梯度洗脱的具体程序为：
0-15min，A相：B相体积比为90：10-85：15；
15-30min，A相：B相体积比为85：15-80：20；
30-35min，A相：B相体积比为80：20-80：20；
35-45min，A相：B相体积比为80：20-20：80；
45-50min，A相：B相体积比为20：80-20：80；
50-55min，A相：B相体积比为20：80-90：10；
55-60min，A相：B相体积比为90：10-90：10。
上述0.4-0.6％磷酸水溶液为体积百分数为0.4-0.6％的磷酸水溶液。上述0.05-0.15％磷酸水溶液为体积百分数为0.05-0.15％的磷酸水溶液。上述0.5％磷酸水溶液为体积百分数为0.5％的磷酸水溶液。上述0.1％磷酸水溶液为体积百分数为0.1％的磷酸水溶液。
优选地，步骤3)中，所述外标法包括以下步骤：
A)取一系列不同体积的第一对照品溶液和/或第二对照品溶液，分别进行高效液相色谱法(HPLC)检测，获得第一对照品溶液中芦荟大黄素和大黄素的色谱峰面积与对应芦荟大黄素和大黄素的浓度之间线性关系，和/或第二对照品溶液中落新妇苷和橙皮苷的色谱峰面积与对应落新妇苷和橙皮苷的浓度之间线性关系，绘制相应的标准工作曲线，分别计算得到芦荟大黄素、大黄素、落新妇苷、橙皮苷的标准工作曲线的回归方程；
B)将第一供试品溶液和/或第二供试品溶液进行高效液相色谱法(HPLC)检测，将获得的芦荟大黄素、大黄素、落新妇苷、橙皮苷的色谱峰面积，代入步骤A)中相应的芦荟大黄素、大黄素、落新妇苷、橙皮苷的标准工作曲线的回归方程，计算得到第一供试品溶液中芦荟大黄素、大黄素和/或第二供试品溶液中落新妇苷、橙皮苷的含量。
更优选地，所述标准工作曲线中，以芦荟大黄素、大黄素、落新妇苷、橙皮苷的色谱峰面积为纵坐标(Y轴)，其相应芦荟大黄素、大黄素、落新妇苷、橙皮苷的浓度为横坐标(X轴)。
本发明第三方面提供一种肾衰乙方颗粒中指标性成分的薄层鉴别方法，和/或一种肾衰乙方颗粒中指标性成分的高效液相色谱检测方法，在肾衰乙方颗粒的质量检测中的用途。
如上所述，本发明提供的一种肾衰乙方颗粒中指标性成分的薄层鉴别及高效液相色谱检测方法，采用薄层色谱法对该复方颗粒中大黄素、芦荟大黄素、丹皮酚、落新妇苷、橙皮苷、黄芪甲苷进行定性鉴别，从而定性确定制大黄(含大黄素、芦荟大黄素)、徐长卿(含丹皮酚)、土茯苓(含落新妇苷)、陈皮(含橙皮苷)、黄芪(含黄芪甲苷)。同时，采用高效液相色谱法对该复方颗粒中指标性成分芦荟大黄素、大黄素、落新妇苷、橙皮苷进行定量鉴别。该方法准确可靠、简便易行、专属性强，提高了颗粒的质量标准，可用于肾衰乙方颗粒的质量控制。
附图说明
图1显示为本发明的实施例1中大黄素、芦荟大黄素的薄层色谱鉴别比较图1A、1B，其中，图1A为365nm紫外光灯检视图，图1B为氨蒸气中熏蒸后的检视图。
图2显示为本发明的实施例2中丹皮酚的薄层色谱鉴别比较图2A、2B，其中，图2A为254nm紫外光灯检视图，图2B为喷5％的三氯化铁的乙醇溶液后的检视图。
图3显示为本发明的实施例3中落新妇苷的薄层色谱鉴别比较图3A、3B、3C，其中，图3A为254nm紫外光灯检视图，图3B为喷5％的三氯化铁的乙醇溶液后的检视图，图3C为365nm紫外光灯检视图。
图4显示为本发明的实施例4中橙皮苷在365nm紫外光灯检视下的薄层色谱鉴别比较图。
图5显示为本发明的实施例5中黄芪甲苷在日光检视下的薄层色谱鉴别比较图。
图6显示为本发明的实施例6中芦荟大黄素、大黄素的高效液相色谱鉴别比较图6A、6B、6C，其中，图6A为第一供试品溶液的高效液相色谱图，图6B为第一对照品溶液的高效液相色谱图，图6C为第一阴性对照溶液的高效液相色谱图，图6B中1为芦荟大黄素、2为大黄素。
图7显示为本发明的实施例8中落新妇苷、橙皮苷的高效液相色谱鉴别比较图7D、7E、7F，其中，图7D为第二供试品溶液的高效液相色谱图，图7E为第二对照品溶液的高效液相色谱图，图7F为第二阴性对照溶液的高效液相色谱图，图7E中3为落新妇苷、4为橙皮苷。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
以下实施例使用的试剂和仪器如下：
1、试剂
肾衰乙方颗粒(批号：20210301、20210303、20210305)，由上海市第七人民医院中心实验室制备。
11味药材饮片(制大黄、徐长卿、土茯苓、炒王不留行、陈皮、半夏、黄芪、当归、灵芝、胡芦巴、黄连)均购自上海康桥药业有限公司。
芦荟大黄素对照品(纯度>95％，批号110795-202011)、大黄素对照品(纯度>95％，批号110756-201913)、丹皮酚对照品(纯度>95％，批号110708-201407)、落新妇苷对照品(纯度>95％，批号111798-201805)、橙皮苷对照品(纯度>95％，批号110721-201818)、黄芪甲苷对照品(纯度>95％，批号110781-202118)均购于中国食品药品检定研究院。
甲醇、乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)；超纯水(纯水机自制)；盐酸、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氨水、甲酸、三氯化铁、乙醇、三氯化铝、硫酸、磷酸(分析纯，国药)。
2、仪器
1260型高效液相色谱仪(美国Agilent科技有限公司)。
实施例1
1、供试品溶液的制备
取肾衰乙方颗粒样品10g，加60℃温水100ml溶解，再加入盐酸1ml混合均匀。然后加入二氯甲烷进行萃取3次，每次100ml，合并萃取液，挥干，残余物加甲醇溶解定容至2ml，获得供试品溶液1#。
2、对照品溶液的制备
取大黄素、芦荟大黄素对照品，加甲醇溶解并定容，配成浓度分别为1mg/mL的对照品溶液1#。
同时，取缺制大黄的阴性样品10g，同上述步骤1，制成阴性对照溶液1#。
3、测定
吸取供试品溶液1#、对照品溶液1#、阴性对照溶液1#各3μl，分别点于同一GF254硅胶板上，以石油醚-乙酸乙酯-甲酸(15:5:1)的上层溶液为展开剂展开后取出、晾干，先置紫外光灯(365nm)检视，比较供试品与对照品的斑点位置，对供试品中指标性成分进行鉴别。如图1A所示，供试品色谱中与对照品色谱相应的位置上显相同的橙黄色荧光斑点。再置氨蒸气中熏蒸，如图1B所示，斑点变为红色，而阴性对照溶液1#在相同的位置上不显示相应的斑点，即未见干扰。如图1A、1B所示，从左至右依次为批号为20210301的供试品溶液、批号为20210303的供试品溶液、批号为20210305的供试品溶液、大黄素对照品溶液、芦荟大黄素对照品溶液、阴性对照溶液。通过图1A、1B可知，供试品溶液中含有大黄素和芦荟大黄素，而阴性对照溶液中在相应位置不含有相应的对照品物质，说明该鉴别方法能够有效地鉴别出供试品中含有制大黄，从而鉴别制大黄的存在。
实施例2
1、供试品溶液的制备
取肾衰乙方颗粒样品10g，加60℃温水100ml溶解。然后加入二氯甲烷进行萃取3次，每次100ml，合并萃取液，挥干，残余物加甲醇溶解定容至2ml，获得供试品溶液2#。
2、对照品溶液的制备
取丹皮酚对照品，加甲醇溶解并定容，配成浓度分别为1mg/mL的对照品溶液2#。
同时，取缺徐长卿的阴性样品10g，同上述步骤1，制成阴性对照溶液2#。
3、测定
吸取供试品溶液2#、对照品溶液2#、阴性对照溶液2#各3μl，分别点于同一GF254硅胶板上，以石油醚-乙酸乙酯-甲酸(15:5:1)的上层溶液为展开剂展开后取出、晾干，先置紫外光灯(254nm)检视，比较供试品与对照品的斑点位置，对供试品中指标性成分进行鉴别。如图2A所示，供试品色谱中与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点。再喷5％的三氯化铁的乙醇溶液，加热至斑点显色清晰，如图2B所示，供试品色谱中与对照品色谱相应的位置上显相同的蓝褐色斑点，而阴性对照溶液2#在相同的位置上不显示相应的斑点，即未见干扰。如图2A、2B所示，从左至右依次为批号为20210301的供试品溶液、批号为20210303的供试品溶液、批号为20210305的供试品溶液、丹皮酚对照品溶液、阴性对照溶液。通过图2A、2B可知，供试品溶液中含有丹皮酚，而阴性对照溶液中在相应位置不含有相应的对照品物质，说明该鉴别方法能够有效地鉴别出供试品中含有徐长卿，从而鉴别徐长卿的存在。
实施例3
1、供试品溶液的制备
取肾衰乙方颗粒样品10g，加60℃温水100ml溶解。然后加入石油醚进行萃取2次，每次100ml，合并萃取液，弃去石油醚；再加入乙酸乙酯进行萃取2次，每次100ml，合并萃取液，浓缩至干，残余物加甲醇溶解定容至2ml，获得供试品溶液3#。
2、对照品溶液的制备
取落新妇苷对照品，加甲醇溶解并定容，配成浓度分别为1mg/mL的对照品溶液3#。
同时，取缺土茯苓的阴性样品10g，同上述步骤1，制成阴性对照溶液3#。
3、测定
吸取供试品溶液3#、对照品溶液3#、阴性对照溶液3#各3μl，分别点于同一GF254硅胶板上，以石油醚-乙酸乙酯-甲酸(15:5:1)的上层溶液为展开剂展开后取出、晾干，先置紫外光灯(254nm)检视，比较供试品与对照品的斑点位置，对供试品中指标性成分进行鉴别。如图3A所示，供试品色谱中与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的荧光斑点。再喷5％的三氯化铁的乙醇溶液，如图3B所示，加热至斑点显色清晰。再置紫外光灯(365nm)检视，如图3C所示，供试品色谱中与对照品色谱相应的位置上显相同的荧光斑点，而阴性对照溶液3#在相同的位置上不显示相应的斑点，即未见干扰。如图3A、3B、3C所示，从左至右依次为批号为20210301的供试品溶液、批号为20210303的供试品溶液、批号为20210305的供试品溶液、落新妇苷对照品溶液、阴性对照溶液。通过图3A、3B、3C可知，供试品溶液中含有落新妇苷，而阴性对照溶液中在相应位置不含有相应的对照品物质，说明该鉴别方法能够有效地鉴别出供试品中含有土茯苓，从而鉴别土茯苓的存在。
实施例4
1、供试品溶液的制备
取肾衰乙方颗粒样品10g，加60℃温水100ml溶解。然后加入乙酸乙酯进行萃取2次，每次100ml，合并萃取液，浓缩至干，残余物加甲醇溶解定容至2ml，获得供试品溶液4#。
2、对照品溶液的制备
取橙皮苷对照品，加甲醇溶解并定容，配成浓度分别为1mg/mL的对照品溶液4#。
同时，取缺陈皮的阴性样品10g，同上述步骤1，制成阴性对照溶液4#。
3、测定
吸取供试品溶液4#、对照品溶液4#、阴性对照溶液4#各3μl，分别点于同一GF254硅胶板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(150:17:13)的上层溶液为展开剂展开后取出、晾干，先喷以三氯化铝试液，加热，置紫外光灯(365nm)检视，比较供试品与对照品的斑点位置，对供试品中指标性成分进行鉴别。如图4所示，供试品色谱中与对照品色谱相应的位置上显相同的橙黄色荧光斑点，而阴性对照溶液4#在相同的位置上不显示相应的斑点，即未见干扰。如图4所示，从左至右依次为批号为20210301的供试品溶液、批号为20210303的供试品溶液、批号为20210305的供试品溶液、橙皮苷对照品溶液、阴性对照溶液。通过图4可知，供试品溶液中含有橙皮苷，而阴性对照溶液中在相应位置不含有相应的对照品物质，说明该鉴别方法能够有效地鉴别出供试品中含有陈皮，从而鉴别陈皮的存在。
实施例5
1、供试品溶液的制备
取肾衰乙方颗粒样品10g，加60℃温水50ml溶解。然后加入用水饱和的正丁醇进行萃取5次，每次50ml，合并萃取液，用氨液充分洗涤萃取液2次，每次50ml，弃去氨液，再用水洗涤3次，每次50ml，弃去水液，蒸干，残余物加甲醇溶解定容至2ml，获得供试品溶液5#。
2、对照品溶液的制备
取黄芪甲苷对照品，加甲醇溶解并定容，配成浓度分别为1mg/mL的对照品溶液5#。
同时，取缺黄芪的阴性样品10g，同上述步骤1，制成阴性对照溶液5#。
3、测定
吸取供试品溶液5#、对照品溶液5#、阴性对照溶液5#各3μl，分别点于同一GF254硅胶板上，以二氯甲烷-甲醇-水(15:7:2)的下层溶液为展开剂展开后取出、晾干，先喷以10％硫酸的乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，分别置于日光和紫外灯光(365nm)下检视，比较供试品与对照品的斑点位置，对供试品中指标性成分进行鉴别。
如图5所示，供试品色谱中与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的斑点，而阴性对照溶液5#在相同的位置上不显示相应的斑点，即未见干扰。如图5所示，从左至右依次为批号为黄芪甲苷对照品溶液、批号为20210301的供试品溶液、批号为20210303的供试品溶液、批号为20210305的供试品溶液、阴性对照溶液。通过图5可知，供试品溶液中含有黄芪甲苷，而阴性对照溶液中在相应位置不含有相应的对照品物质，说明该鉴别方法能够有效地鉴别出供试品中含有黄芪，，从而鉴别黄芪的存在。
实施例6
1、供试品溶液的制备
精密称取2.5g肾衰乙方颗粒样品作为第一肾衰乙方颗粒样品，加入25ml蒸馏水溶解，再加盐酸0.75ml混合均匀，然后加入二氯甲烷振荡提取3次，每次75ml，合并提取液挥干，加甲醇定容至2ml，作为第一供试品溶液。
2、对照品溶液的制备
精密称取芦荟大黄素和大黄素的对照品，加甲醇溶解，配成第一对照品溶液。第一对照品溶液中，芦荟大黄素的浓度为150μg/mL，大黄素的浓度为20μg/mL。
同时，取缺制大黄的阴性样品，同上述步骤1，制成第一阴性对照溶液。
3、测定
采用第一高效液相色谱法分别检测第一供试品溶液和第一对照品溶液，比较第一供试品溶液与第一对照品溶液的保留时间，采用外标法进行定量，即取一系列不同体积的第一对照品溶液，分别进行高效液相色谱法(HPLC)检测，获得第一对照品溶液中芦荟大黄素和大黄素的色谱峰面积与对应芦荟大黄素和大黄素的浓度之间线性关系，绘制相应的标准工作曲线，分别计算得到芦荟大黄素、大黄素的标准工作曲线的回归方程。再将第一供试品溶液进行高效液相色谱法(HPLC)检测，将获得的芦荟大黄素、大黄素的色谱峰面积，代入相应的芦荟大黄素、大黄素的标准工作曲线的回归方程，计算得到第一供试品溶液中芦荟大黄素、大黄素的含量。同步，按上述测定步骤测定第一阴性对照溶液，保证在相同保留时间内，没有干扰。
其中，第一高效液相色谱法包括以下检测条件：
检测器为二极管阵列检测器(DAD)；色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；检测器波长为254nm；柱温为30.5℃；流速为1.2ml/min；进样量为10μL；流动相为0.5％磷酸水溶液-乙腈，其中，A相为0.5％磷酸水溶液，B相为乙腈；分析时间为60min；梯度洗脱。
梯度洗脱的具体程序为：
0-20min，A相：B相体积比为70：30-70：30；
20-30min，A相：B相体积比为70：30-60：40；
30-50min，A相：B相体积比为60：40-30：70；
50-55min，A相：B相体积比为30：70-30：70；
55-56min，A相：B相体积比为30：70-70：30；
56-60min，A相：B相体积比为70：30-70：30。
第一供试品溶液的高效液相色谱图见图6A，第一对照品溶液的高效液相色谱图见图6B，第一阴性对照溶液的高效液相色谱图见图6C。由图6可知，2种指标性成分与其相邻的色谱峰分离系数均大于1.5，并且各组分互不干扰，理论塔板数符合要求，阴性无干扰，专属性良好。
实施例7
对实施例6中第一高效液相色谱法进行方法学验证，其性能指标结果如下。
1、线性关系
分别精密吸取1、2.5、5、10、15、25μl的实施例6中的第一对照品溶液，注入高效液相色谱仪，按实施例6中步骤3的色谱条件进行测定。以芦荟大黄素、大黄素的色谱峰面积为纵坐标(Y轴)，其相应芦荟大黄素、大黄素的浓度为横坐标(X轴)作图，测定并计算获得2种成分的标准回归方程、相关系数和线性范围，具体结果见表1。根据表1可知，2种指标成分在一定浓度的线性范围内均呈良好的线性关系，其标准回归方程的相关系数均大于0.9999。
表1
回归方程 r 浓度范围/(μg)
芦荟大黄素 Y＝137.1139X+6.4701 1.0000 0.15～3.75
大黄素 Y＝16.8674X+1.4908 0.9999 0.020～0.5
2、精密度实验
精密吸取实施例6中的第一对照品溶液5μl，按实施例6中步骤3的色谱条件重复进样6次，测定峰面积，结果见表2。由表2所示，仪器的精密度良好。
表2
Figure BDA0003163934540000151
3、重复性实验
按实施例6中步骤1制备获得6份第一供试品溶液，按实施例6中步骤3的色谱条件分别进样10μl，具体结果见表3。由表3所示，方法重复性良好。
表3
Figure BDA0003163934540000152
4、稳定性实验
按实施例6中步骤1制备获得第一供试品溶液，分别于室温放置0h、6h、12h、18h、24h。按实施例6中步骤3的色谱条件，分别进样10μl，具体结果见表4。由表4所示，第一供试品溶液在24h内稳定。
表4
Figure BDA0003163934540000153
5、加样回收率实验
精密称取已知指标成分含量的第一供试品溶液1份，在线性范围内按80％、100％和120％分别加入一定量的第一对照品溶液，共9份，按实施例6中步骤3的色谱条件测定含量，具体结果见表5。由表5所示，本方法回收率良好。
表5
Figure BDA0003163934540000161
实施例8
1、供试品溶液的制备
精密称取1g肾衰乙方颗粒样品作为第二肾衰乙方颗粒样品，加入25ml的50％甲醇的水溶液，超声提取30min，放冷后补足失去体积，0.45μM微孔滤膜滤过，取续滤液，作为第二供试品溶液。
2、对照品溶液的制备
精密称取落新妇苷和橙皮苷的对照品，加甲醇溶解，配成第二对照品溶液。第二对照品溶液中，落新妇苷的浓度为40μg/mL，橙皮苷的浓度为260μg/mL。
同时，取缺徐长卿、陈皮的阴性样品，同上述步骤1，制成第二阴性对照溶液。
3、测定
采用第二高效液相色谱法分别检测第二供试品溶液和第二对照品溶液，比较第二供试品溶液与第二对照品溶液的保留时间，采用外标法进行定量，即取一系列不同体积的第二对照品溶液，分别进行高效液相色谱法(HPLC)检测，获得第二对照品溶液中落新妇苷和橙皮苷的色谱峰面积与对应落新妇苷和橙皮苷的浓度之间线性关系，绘制相应的标准工作曲线，分别计算得到落新妇苷、橙皮苷的标准工作曲线的回归方程。再将第二供试品溶液进行高效液相色谱法(HPLC)检测，将获得的落新妇苷、橙皮苷的色谱峰面积，代入相应的落新妇苷、橙皮苷的标准工作曲线的回归方程，计算得到第二供试品溶液中落新妇苷、橙皮苷的含量。同步，按上述测定步骤测定第二阴性对照溶液，保证在相同保留时间内，没有干扰。
其中，第二高效液相色谱法包括以下检测条件：
检测器为二极管阵列检测器(DAD)；色谱柱为ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)；检测器波长为291nm；柱温为30℃；流速为1.0ml/min；进样量为10μL；流动相为0.1％磷酸水溶液-乙腈，其中，A相为0.1％磷酸水溶液，B相为乙腈；分析时间为60min；梯度洗脱。
梯度洗脱的具体程序为：
0-15min，A相：B相体积比为90：10-85：15；
15-30min，A相：B相体积比为85：15-80：20；
30-35min，A相：B相体积比为80：20-80：20；
35-45min，A相：B相体积比为80：20-20：80；
45-50min，A相：B相体积比为20：80-20：80；
50-55min，A相：B相体积比为20：80-90：10；
55-60min，A相：B相体积比为90：10-90：10。
第二供试品溶液的高效液相色谱图见图7D，第二对照品溶液的高效液相色谱图见图7E，第二阴性对照溶液的高效液相色谱图见图7F。由图7可知，2种指标性成分与其相邻的色谱峰分离系数均大于1.5，并且各组分互不干扰，理论塔板数符合要求，阴性无干扰，专属性良好。
实施例9
对实施例8中第二高效液相色谱法进行方法学验证，其性能指标结果如下。
1、线性关系
分别精密吸取1、2.5、5、10、15、25μl的实施例8中的第二对照品溶液，注入高效液相色谱仪，按实施例8中步骤3的色谱条件进行测定。以落新妇苷、橙皮苷的色谱峰面积为纵坐标(Y轴)，其相应落新妇苷、橙皮苷的浓度为横坐标(X轴)作图，测定并计算获得2种成分的标准回归方程、相关系数和线性范围，具体结果见表6。根据表6可知，2种指标成分在一定浓度的线性范围内均呈良好的线性关系，其标准回归方程的相关系数均大于0.9988。
表6
回归方程 r 浓度范围/(μg)
落新妇苷 Y＝21.862X+0.969 0.9997 0.04～1.0
橙皮苷 Y＝18.286X+9.0764 0.9988 0.26～6.5
2、精密度实验
精密吸取实施例8中的第二对照品溶液5μl，按实施例8中步骤3的色谱条件重复进样6次，测定峰面积，结果见表7。由表7所示，仪器的精密度良好。
表7
Figure BDA0003163934540000181
3、重复性实验
按实施例8中步骤1制备获得6份第二供试品溶液，按实施例8中步骤3的色谱条件分别进样10μl，具体结果见表8。由表8所示，方法重复性良好。
表8
Figure BDA0003163934540000182
4、稳定性实验
按实施例8中步骤1制备获得第二供试品溶液，分别于室温放置0h、6h、12h、18h、24h。按实施例8中步骤3的色谱条件，分别进样10μl，具体结果见表9。由表9所示，第二供试品溶液在24h内稳定。
表9
Figure BDA0003163934540000183
5、加样回收率实验
精密称取已知指标成分含量的第二供试品溶液1份，在线性范围内按80％、100％和120％分别加入一定量的第二对照品溶液，共9份，按实施例8中步骤3的色谱条件测定含量，具体结果见表10。由表10所示，本方法回收率良好。
表10
Figure BDA0003163934540000191
综上所述，本发明提供的一种肾衰乙方颗粒中指标性成分的薄层鉴别及高效液相色谱检测方法，准确可靠、简便易行、专属性强，提高了颗粒的质量标准，可用于肾衰乙方颗粒的质量控制。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种肾衰乙方颗粒中指标性成分的薄层鉴别方法，包括以下步骤：
1)将肾衰乙方颗粒样品加水溶解后加入萃取试剂进行萃取，获得的萃取液去除液体至干，残余物加甲醇溶解定容，获得供试品溶液；
2)将大黄素、芦荟大黄素、丹皮酚、落新妇苷、橙皮苷、黄芪甲苷的对照品，分别加甲醇溶解并定容，分别配成相应的对照品溶液；
3)将步骤1)中的供试品溶液与步骤2)中的对照品溶液，分别点于同一硅胶板上，采用展开剂展开后取出、晾干，采用光照检视，比较供试品与对照品的斑点位置，对供试品中指标性成分进行鉴别。
2.根据权利要求1所述的一种肾衰乙方颗粒中指标性成分的薄层鉴别方法，其特征在于，步骤1)中，包括以下条件中的任一项或多项：
A1)所述水的温度为55-65℃；
A2)所述肾衰乙方颗粒样品加入质量g与水加入体积mL之比为10:10-200；
A3)当供试品溶液用于鉴别大黄素、芦荟大黄素时，所述水中还加入盐酸，所述盐酸与水加入的体积之比为1:90-110；
A4)所述萃取试剂选自二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇中的一种或多种组合。
3.根据权利要求1所述的一种肾衰乙方颗粒中指标性成分的薄层鉴别方法，其特征在于，步骤3)中，包括以下条件中的任一项或多项：
B1)所述硅胶板为GF254硅胶板；
B2)所述展开剂选自石油醚-乙酸乙酯-甲酸的混合溶液的上层溶液、乙酸乙酯-甲醇-水的混合溶液的上层溶液、二氯甲烷-甲醇-水的混合溶液的下层溶液中的一种；
B3)所述光照检视选自紫外光灯检视或日光检视中的一种。
4.一种肾衰乙方颗粒中指标性成分的高效液相色谱检测方法，包括以下步骤：
A)将肾衰乙方颗粒样品分为第一肾衰乙方颗粒样品和/或第二肾衰乙方颗粒样品；在第一肾衰乙方颗粒样品中加入第一溶剂溶解后加入混合试剂混合，再加入提取试剂振荡提取，获得的提取液挥干、定容，获得第一供试品溶液；在第二肾衰乙方颗粒样品中加入第二溶剂溶解后超声提取、冷却、过滤，取续滤液得到第二供试品溶液；
B)将芦荟大黄素和大黄素的对照品加入第三溶剂溶解并定容，配成第一对照品溶液；将落新妇苷和橙皮苷的对照品加入第三溶剂溶解并定容，配成第二对照品溶液；
C)采用第一高效液相色谱法分别检测第一供试品溶液和第一对照品溶液，采用第二高效液相色谱法分别检测第二供试品溶液和第二对照品溶液，比较第一供试品溶液与第一对照品溶液的保留时间和/或第二供试品溶液与第二对照品溶液的保留时间进行定性，采用外标法进行定量，确定第一供试品溶液中芦荟大黄素和大黄素的含量，和/或确定第二供试品溶液中落新妇苷和橙皮苷的含量。
5.根据权利要求1所述的一种肾衰乙方颗粒中指标性成分的高效液相色谱检测方法，其特征在于，步骤A)或B)中，包括以下条件中的任一项或多项：
C1)步骤A)中，所述第一溶剂为水；
C2)步骤A)中，所述第一肾衰乙方颗粒样品加入的质量g与第一溶剂加入的体积mL之比为2.5:20-30；
C3)步骤A)中，所述混合试剂为盐酸；
C4)步骤A)中，所述第一肾衰乙方颗粒样品加入的质量g与混合试剂加入的体积mL之比为2.5:0.5-1.0；
C5)步骤A)中，所述提取试剂为二氯甲烷；
C6)步骤A)中，所述定容采用的溶剂为甲醇；
C7)步骤A)中，所述第二溶剂为40-60％甲醇的水溶液；
C8)步骤A)中，所述第二肾衰乙方颗粒样品加入的质量g与第二溶剂加入的体积mL之比为1:20-30；
C9)步骤A)中，所述超声提取时间为20-40min；
C10)步骤B)中，所述第三溶剂为甲醇。
6.根据权利要求1所述的一种肾衰乙方颗粒中指标性成分的高效液相色谱检测方法，其特征在于，步骤C)中，所述第一高效液相色谱法的检测条件为：检测器为二极管阵列检测器；色谱柱为C18色谱柱，250mm×4.6mm、5μm；检测器波长为250-260nm；柱温为25-35℃；流速为1.0-1.4ml/min；进样量为5-20μL；流动相为0.4-0.6％磷酸水溶液-乙腈，其中，A相为0.4-0.6％磷酸水溶液，B相为乙腈；分析时间为60min；梯度洗脱。
7.根据权利要求1所述的一种肾衰乙方颗粒中指标性成分的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的具体程序为：0-20min，A相：B相体积比为70：30-70：30；20-30min，A相：B相体积比为70：30-60：40；30-50min，A相：B相体积比为60：40-30：70；50-55min，A相：B相体积比为30：70-30：70；55-56min，A相：B相体积比为30：70-70：30；56-60min，A相：B相体积比为70：30-70：30。
8.根据权利要求1所述的一种肾衰乙方颗粒中指标性成分的高效液相色谱检测方法，其特征在于，步骤C)中，所述第二高效液相色谱法的检测条件为：检测器为二极管阵列检测器；色谱柱为C18色谱柱，250mm×4.6mm、5μm；检测器波长为290-295nm；柱温为25-35℃；流速为0.8-1.2ml/min；进样量为5-20μL；流动相为0.05-0.15％磷酸水溶液-乙腈，其中，A相为0.05-0.15％磷酸水溶液，B相为乙腈；分析时间为60min；梯度洗脱。
9.根据权利要求1所述的一种肾衰乙方颗粒中指标性成分的高效液相色谱检测方法，其特征在于，所述梯度洗脱的具体程序为：0-15min，A相：B相体积比为90：10-85：15；15-30min，A相：B相体积比为85：15-80：20；30-35min，A相：B相体积比为80：20-80：20；35-45min，A相：B相体积比为80：20-20：80；45-50min，A相：B相体积比为20：80-20：80；50-55min，A相：B相体积比为20：80-90：10；55-60min，A相：B相体积比为90：10-90：10。
10.根据权利要求1-3任一所述的一种肾衰乙方颗粒中指标性成分的薄层鉴别方法，和/或根据权利要求4-9任一所述的一种肾衰乙方颗粒中指标性成分的高效液相色谱检测方法，在肾衰乙方颗粒的质量检测中的用途。
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