CN115980250A - 一种用于复方鱼桔颗粒的鉴别方法及质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于复方鱼桔颗粒的鉴别方法，采用薄层色谱法鉴别复方鱼桔颗粒中的特征成分：绿原酸、黄芩苷、盐酸小檗碱和甘草苷；本发明还提供一种用于复方鱼桔颗粒的质量检测方法，采用混合标准品溶液，一个波长同时测定颗粒剂中两个主成分绿原酸和黄芩苷的含量，简便了含量测定的方法，本发明建立的复方鱼桔颗粒4种特征成分薄层鉴别及其中2种有效成分的含量测定方法，实验方法简便可行，灵敏度高，重现性好，可用于复方鱼桔颗粒的质量控制。

Description

一种用于复方鱼桔颗粒的鉴别方法及质量检测方法

技术领域

本发明涉及复方鱼桔颗粒的成分检测领域，特别是涉及一种用于复方鱼桔颗粒的鉴别方法及质量检测方法。

背景技术

复方鱼桔汤是上海市名老中医叶景华教授的经验方，临床应用近60年，疗效确切。该方由鱼腥草、桔梗、黄芩、黄连、金银花、野荞麦根、甘草、冬瓜仁、生苡仁、桃仁和象贝母11味药材组成，具有清热解毒、消痈化脓、止咳平喘的功效，主治邪热伤肺、蕴结不解、瘀阻肺络所致的肺痈病。

近年来，随着医疗事业和科学技术的不断发展，出现了将我国独有的中医学与现代科技相结合的一种新型中药制剂—中药配方颗粒，将中药饮片制作加工成了免煎的颗粒，患者服用方便、简单，便于携带。所以为使复方鱼桔汤也能规范化应用于临床，可将复方鱼桔汤研制为复方鱼桔颗粒，但是颗粒制备过程中复杂的工艺程序容易造成配方颗粒成分与汤剂成分较大的差异，难以判断复方鱼桔颗粒的质量。

为保证药物的安全性、稳定性、有效性和可控性，需要寻找一种简便、准确、可靠的方法鉴定复方鱼桔颗粒，并进行质量检测。

发明内容

鉴于以上技术问题，本发明的目的在于提供一种用于复方鱼桔颗粒的鉴别方法及质量检测方法，以简便、准确、可靠的鉴定复方鱼桔颗粒并进行质量检测。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种用于复方鱼桔颗粒的鉴别方法，采用薄层色谱法鉴别复方鱼桔颗粒中的特征成分：绿原酸、黄芩苷、盐酸小檗碱和甘草苷。

所述的用于复方鱼桔颗粒的鉴别方法包括以下步骤：

1)供试品溶液的制备：取复方鱼桔颗粒溶于溶剂I中超声，萃取，萃取液浓缩至干，溶于溶剂II中，得供试品溶液；

2)标准品溶液的制备：取绿原酸、黄芩苷、盐酸小檗碱和甘草苷中的至少一种溶于溶剂III中，作为标准品溶液；

3)薄层色谱鉴别：吸取步骤1)制得的供试品溶液与步骤2)制得的标准品溶液分别点于同一硅胶G薄层板上，采用展开剂展开，置紫外光灯下检视，比较薄层色谱上供试品溶液与标准品溶液的荧光斑点位置，确定供试品溶液中特征成分的存在。

优选地，步骤3)中标准品溶液为绿原酸溶液时，展开剂为乙酸乙酯-甲酸-水，体积比为(70～90):(2～2.5):1。

优选地，步骤3)中标准品溶液为黄芩苷溶液时，展开剂为乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水，体积比为(5～6):(3～4):1:1，且薄层板展开并晾干后，喷以0.5～2％三氯化铁乙醇溶液，100～110℃加热至斑点显色清晰。

优选地，步骤3)中步骤3)中标准品溶液为盐酸小檗碱溶液时，展开剂为环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺，体积比为3:(3～4):1:1.5:0.5:1，且薄层板先置浓氨试液预饱和4～8min，再于展开剂中展开。

优选地，步骤3)中步骤3)中标准品溶液为甘草苷溶液时，展开剂为乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水，体积比为(15～20):1:1:2，且薄层板展开并晾干后，喷以8～12％硫酸乙醇溶液，在100～110℃加热至斑点显色清晰。

本发明还提供一种用于复方鱼桔颗粒的质量检测方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：称取复方鱼桔颗粒溶于甲醇中，超声、过滤得供试品溶液；

(2)标准品溶液的制备：称取绿原酸、黄芩苷于甲醇中溶解，制得混合标准品溶液；

(3)阴性对照品溶液制备：称取不含金银花、黄芩的复方鱼桔阴性颗粒，溶于甲醇，超声、过滤得阴性对照品溶液；

(4)高效液相色谱法测定：分别称取步骤(1)、(2)、(3)的供试品溶液、混合标准品溶液和阴性对照品溶液，以流动相A、流动相B进行梯度洗脱，比较保留时间进行定性，采用标准曲线法进行定量，确定供试品溶液中绿原酸、黄芩苷的含量。

优选地，步骤(1)所述复方鱼桔颗粒与甲醇的质量体积比为1～2g:25～40mL。

优选地，步骤(2)中称取的绿原酸、黄芩苷的质量比为1:(1～1.2)。

优选地，步骤(4)中所述流动相A为甲醇、流动相B为0.1％磷酸水。

优选地，步骤(4)中所述高效液相色谱法测定条件还包括：流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：330nm；进样量：10μL；色谱柱：安捷伦ZORBAX Elipse XDB-C₁₈，250mm×4.6mm，5μm。

优选地，步骤(4)中所述梯度洗脱程序：

0～15min，流动相A为80％-70％，流动相B为20％-30％；

15～30min，流动相A为70％-40％，流动相B为30％-60％；

30～35min，流动相A为40％-0％，流动相B为60％-100％；

35～40min，流动相A为0，流动相B为100％；

40～12min，流动相A为0％-80％，流动相B为100％-20％；

42～45min，流动相A为80％，流动相B为20％。

如上所述，本发明的用于复方鱼桔颗粒的鉴别方法及质量检测方法，具有以下有益效果：

本发明的用于复方鱼桔颗粒的鉴别方法可作为检测复方鱼桔颗粒中间体及成品质量的方法，同时也可准确判断复方鱼桔颗粒中间体或成品所含绿原酸、黄芩苷、盐酸小檗碱和甘草苷等成分的总体情况，以控制复方鱼桔颗粒的质量，该方法简便、准确、快速，具有良好的应用前景。

本发明的用于复方鱼桔颗粒的质量检测方法采用混合标准品溶液，一个波长同时测定复方鱼桔颗粒中两个主成分绿原酸和黄芩苷的含量，简便了含量测定的方法，且灵敏度高，重现性好，可用于复方鱼桔颗粒的质量控制。

附图说明

图1显示为本发明实施例2的薄层色谱图；其中，1为绿原酸标准品；2为第I批次；3为第II批次；4为第III批次；5为不含金银花阴性颗粒。

图2显示为本发明实施例3的薄层色谱图；其中，1为黄芩苷标准品；2为第I批次；3为第II批次；4为第III批次；5为不含黄芩苷阴性颗粒。

图3显示为本发明实施例4的薄层色谱图；其中，1为盐酸小檗碱标准品；2为第I批次；3为第II批次；4为第III批次；5为不含盐酸小檗碱阴性颗粒。

图4显示为本发明实施例5的薄层色谱图；其中，1为甘草苷标准品；2为第I批次；3为第II批次；4为第III批次；5为不含甘草苷阴性颗粒。

图5显示为本发明实施例6的高效液相色谱图；其中，A为供试品溶液；B.混合标准品溶液；C.阴性对照溶液；1为绿原酸；2为黄芩苷。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

请参阅附图。需要说明的是，本实施例中所提供的图示仅以示意方式说明本发明的基本构想，遂图式中仅显示与本发明中有关的组件而非按照实际实施时的组件数目、形状及尺寸绘制，其实际实施时各组件的型态、数量及比例可为一种随意的改变，且其组件布局型态也可能更为复杂。

本发明第一方面提供一种用于复方鱼桔颗粒的鉴别方法，采用薄层色谱法鉴别复方鱼桔颗粒中的特征成分：绿原酸、黄芩苷、盐酸小檗碱和甘草苷。

绿原酸、黄芩苷、盐酸小檗碱和甘草苷为复方鱼桔方中君臣药的主要成分，含量高，鉴别四种成分的含量即能反应整个组方的质量情况。

其中，本发明中复方鱼桔颗粒采用以下制备方法获得：将鱼腥草、桔梗、黄芩、黄连、金银花、野荞麦根、甘草、冬瓜仁、生苡仁、桃仁和象贝母11种组分加水煎煮，煎液滤过，滤液合并，浓缩，真空干燥后制成细粉，加蔗糖和糊精适量，混匀，干法制粒，整形，即得。

本发明的用于复方鱼桔颗粒的鉴别方法，包括以下步骤：

1)供试品溶液的制备：取复方鱼桔颗粒溶于溶剂I中超声，萃取，萃取液浓缩至干，溶于溶剂II中，得供试品溶液；

2)标准品溶液的制备：取绿原酸、黄芩苷、盐酸小檗碱和甘草苷中的至少一种溶于溶剂III中，作为标准品溶液；

3)薄层色谱鉴别：吸取步骤1)制得的供试品溶液与步骤2)制得的标准品溶液中的一种分别点于同一硅胶G薄层板上，采用展开剂展开，置紫外光灯下检视，比较薄层板上供试品溶液与标准品溶液的荧光斑点位置，确定供试品溶液中特征成分的存在。

其中，步骤1)中，溶剂I为水。复方鱼桔颗粒溶于水后可以进行超声处理，超声时间为20～30min。例如为20～25min或25～30min。在本发明优选的实施方式中，超声时间为30min。

萃取采用的萃取剂为水饱和正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷中的一种。

溶剂II为甲醇。

步骤1)的具体过程为：取复方鱼桔颗粒，溶于溶剂I中，超声处理，加入相应的萃取剂萃取，合并萃取液，浓缩至干，加溶剂II，得供试品溶液。

其中，复方鱼桔颗粒与溶剂I的质量体积比为5g:45-55mL。例如为5g:45-50mL或5g:50-55mL。优选为5g:50mL。

萃取次数为2～3次。优选为2次。

复方鱼桔颗粒的加入量与萃取所用萃取剂的体积的比例为5g:45-55mL。例如为5g:45-50mL或5g:50-55mL。优选为5g:50mL。

复方鱼桔颗粒的加入量与溶剂I的体积的比例为5g:1～2mL。

步骤2)中，溶剂III为甲醇。标准品溶液的浓度为≤1.1mg/mL。例如为≤0.4mg/mL、0.4～0.6mg/mL、0.6～0.8mg/mL、0.8～1.0mg/mL或1.0～1.1mg/mL。在本发明优选的实施方式中，标准品溶液的浓度为1.0mg/mL。

步骤2)的具体过程为：取绿原酸、黄芩苷、盐酸小檗碱或甘草苷标准品中的一种，加甲醇，制得标准品溶液。

步骤3)中，紫外灯波长为365nm。

步骤3)中标准品溶液为绿原酸溶液时，展开剂为乙酸乙酯-甲酸-水，体积比为(70～90):(2～2.5):1。例如为(70～75):(2～2.5):1、(75～80):(2～2.5):1、(85～90):(2～2.5):1、(70～90):(2～2.5):1、(70～90):(2～2.3):1或(70～90):(2.3～2.5):1。在本发明优选的实施方式中，展开剂乙酸乙酯-甲酸-水的体积比为80：2：1。

步骤3)中标准品溶液为黄芩苷溶液时，展开剂为乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水，体积比为(5～6):(3～4):1:1，且薄层板展开并晾干后，喷以0.5～2％三氯化铁乙醇溶液，100～110℃加热至斑点显色清晰。其中，0.5～2％三氯化铁乙醇溶液是由0.5～2g三氯化铁溶于100mL乙醇中得到的。展开剂乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水的比例可以为(5～5.5):(3～4):1:1、(5.5～6):(3～4):1:1、(5～6):(3～3.5):1:1或(5～6):(3.5～4):1:1。在本发明优选的实施方式中，展开剂乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水的比例为5:3:1:1。三氯化铁乙醇溶液的浓度为0.5～1％、1～1.5％或1.5～2％。在本发明优选的实施方式中，三氯化铁乙醇溶液的浓度为1％。薄层板喷三氯化铁乙醇溶液后，加热以使斑点显色清晰的温度为100～102℃、102～104℃、104～106℃、106～108℃或108～110℃。在本发明优选的实施方式中，加热温度为105℃。

步骤3)中标准品溶液为盐酸小檗碱溶液时，展开剂为环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺，体积比为3:(3～4):1:1.5:0.5:1，且薄层板先置浓氨试液预饱和4～8min，再于展开剂中展开。展开剂环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺的比例可以为3:(3～3.5):1:1.5:0.5:1或3:(3.5～4):1:1.5:0.5:1。在本发明优选的实施方式中，展开剂环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺的比例为3:3.5:1:1.5:0.5:1。薄层板于浓氨试液中预饱和时间为4～5min、5～6min、6～7min或7～8min。

步骤3)中标准品溶液为甘草苷溶液时，展开剂为乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水，体积比为(15～20):1:1:2，且薄层板展开并晾干后，喷以8～12％硫酸乙醇溶液，在100～110℃加热至斑点显色清晰。其中，8～12％硫酸乙醇溶液是由8～12mL硫酸溶于100mL乙醇中得到的。展开剂乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水的比例可以为(15～17):1:1:2、(17～19):1:1:2或(19～20):1:1:2。在本发明优选的实施方式中，展开剂乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水的比例为15:1:1:2。硫酸乙醇溶液的浓度为8～9％、9～10％、10～11％或11～12％。在本发明优选的实施方式中，硫酸乙醇溶液的浓度为10％。薄层板喷硫酸乙醇溶液后，加热以使斑点显色清晰的温度为100～102℃、102～104℃、104～106℃、106～108℃或108～110℃。在本发明优选的实施方式中，加热温度为105℃。

步骤3)的具体过程为：吸取供试品溶液和一种标准品溶液各2～5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以展开剂上层溶液为展开剂，将薄层板展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与标准品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，而阴性对照未见干扰。其中，标准品溶液为黄芩苷溶液时，薄层板展开并晾干后，喷以0.5～2％三氯化铁乙醇溶液，100～110℃加热至斑点显色清晰。标准品溶液为甘草苷溶液时，薄层板展开并晾干后，喷以8～12％硫酸乙醇溶液，在100～110℃加热至斑点显色清晰。

本发明的用于复方鱼桔颗粒的鉴别方法，在供试品处理上，结合所含成分极性的差异采取特殊处理，黄连中的小檗碱属于低极性物质，用二氯甲烷溶剂进行萃取，获得检测主成分，黄芩中的黄芩苷和甘草中的甘草苷属于中等极性物质，本发明采用乙酸乙酯进行萃取，金银花中的绿原酸属于大极性物质，本发明采用水饱和正丁醇进行萃取。在展开剂选择方面，检测黄芩中的黄芩苷时，药典采用以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(10：3：1：2)，而甲苯不容易获得，本发明将其改为乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水((5～6):(3～4):1:1)取得了满意的效果。以上供试品处理方法，展开剂的选择，显色剂的选择稳定可行，所得的薄层色谱斑点清晰，且阴性对照无干扰，适用于复方鱼桔颗粒薄层的质量控制。

本发明还提供一种用于复方鱼桔颗粒的质量检测方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：称取复方鱼桔颗粒溶于甲醇中，超声、过滤得供试品溶液；

(2)标准品溶液的制备：称取绿原酸、黄芩苷于甲醇中溶解，制得混合标准品溶液；

(3)阴性对照品溶液制备：称取不含金银花、黄芩的复方鱼桔阴性颗粒，溶于甲醇，超声、过滤得阴性对照品溶液；

(4)高效液相色谱法测定：分别称取步骤(1)、(2)、(3)的供试品溶液、混合标准品溶液和阴性对照品溶液，以流动相A、流动相B进行梯度洗脱，比较保留时间进行定性，采用标准曲线法进行定量，确定供试品溶液中绿原酸、黄芩苷的含量。

其中，步骤(1)中，复方鱼桔颗粒与甲醇的质量体积比为1～2g:25～40mL。例如为1～1.5g:25～40mL、1.5～2g:25～40mL、1～2g:25～30mL、1～2g:30～35mL或1～2g:35～40mL。在本发明优选的实施方式中，复方鱼桔颗粒与甲醇的质量体积比为1g:25mL。

步骤(1)中，超声时间为20～30min。例如为20～25min或25～30min。在本发明优选的实施方式中，超声时间为30min。

步骤(1)中，过滤采用0.45～0.6μM微孔滤膜过滤。例如为0.45～0.5μM、0.5～0.55μM或0.55～0.6μM。在本发明优选的实施方式中，过滤采用0.45μM微孔滤膜过滤。

步骤(1)的具体过程为：称取1g复方鱼桔颗粒，加入25ml 50％甲醇溶液，超声30min，放冷后补足失去体积，0.45μM微孔滤膜滤过，取滤液，即得供试品溶液。

步骤(2)中，混合标准品溶液的浓度为100～150μg/mL。例如为100～110μg/mL、110～120μg/mL、120～130μg/mL、130～140μg/mL或140～150μg/mL。混合标准品溶液的浓度为120μg/mL。

步骤(2)中称取的绿原酸、黄芩苷的质量比为1:(1～1.2)。例如为1:(1～1.1)或1:(1.1～1.2)。在本发明优选的实施方式中，步骤(2)中称取的绿原酸、黄芩苷的质量比为1：1。

步骤(2)的具体过程为：称取绿原酸、黄芩苷标准品适量，加甲醇溶解，配制成浓度为120μg/ml混合标准品溶液，备用。

步骤(3)中，复方鱼桔阴性颗粒为按照复方鱼桔颗粒的制备方法制备，不同之处为复方鱼桔阴性颗粒的原料不含金银花和黄芩。

步骤(4)中，高效液相色谱法测定条件还包括：流动相A为甲醇、流动相B为0.1％磷酸水；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：330nm；进样量：10μL；色谱柱：安捷伦ZORBAXElipse XDB-C₁₈，250mm×4.6mm，5μm。

步骤(4)中梯度洗脱程序：

0～15min，流动相A为80％-70％，流动相B为20％-30％；

15～30min，流动相A为70％-40％，流动相B为30％-60％；

30～35min，流动相A为40％-0％，流动相B为60％-100％；

35～40min，流动相A为0，流动相B为100％；

40～12min，流动相A为0％-80％，流动相B为100％-20％；

42～45min，流动相A为80％，流动相B为20％。

步骤(4)中，标准曲线法为通过标准溶液的不同进样量与峰面积之间的关系，绘制标准曲线，再通过供试样品的峰面积确定供试品溶液中绿原酸、黄芩苷的含量。

步骤(4)的具体过程为：分别吸取混合标准品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液各10μl，按上述液相色谱法测定条件及梯度洗脱程序进行分析。

本发明的用于复方鱼桔颗粒的质量检测方法采用混合标准品溶液，一个波长，同时测定颗粒剂中两个主成分绿原酸和黄芩苷的含量，简便了含量测定的方法。

实施例1

复方鱼桔颗粒的制备：将鱼腥草、桔梗、黄芩、黄连、金银花、野荞麦根、甘草、冬瓜仁、生苡仁、桃仁和象贝母11种组分加八倍量水煎煮二次，每次1.5h，煎液过滤，滤液合并，浓缩，真空干燥后制成细粉，加蔗糖和糊精适量，混匀，干法制粒，整形，即得。

采用该复方鱼桔颗粒的制备方法制得原料完全相同的第I批次、第II批次、第III批次的复方鱼桔颗粒，并采用该制备方法分别制备不含金银花的阴性颗粒、不含黄芩的阴性颗粒、不含黄连的阴性颗粒、不含甘草的阴性颗粒以及同时不含金银花和黄芩的阴性颗粒。

实施例2绿原酸的薄层色谱鉴别方法

1)供试品溶液的制备：分别取第I批次、第II批次、第III批次的复方鱼桔颗粒5g溶于50mL水中，超声处理30min，加入水饱和正丁醇萃取2次，每次50mL，合并萃取液，浓缩至干，加甲醇至2mL，得第I批次、第II批次、第III批次的供试品溶液；

2)阴性对照品溶液的制备：取不含金银花的阴性颗粒按照步骤1)的方法制备阴性对照品溶液；

3)标准品溶液的制备：取绿原酸，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为标准品溶液；

4)薄层色谱鉴别：吸取步骤1)制得的供试品溶液与步骤2)、3)制得的阴性对照品溶液、标准品溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(80：2：1)为展开剂，将薄层板展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与标准品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，而阴性对照未见干扰。如图1所示。

实施例3黄芩苷的薄层色谱鉴别方法

1)供试品溶液的制备：分别取第I批次、第II批次、第III批次的复方鱼桔颗粒5g溶于50mL水中，超声处理30min，加入乙酸乙酯萃取2次，每次50mL，合并萃取液，浓缩至干，加甲醇至2mL，得第I批次、第II批次、第III批次的供试品溶液；

2)阴性对照品溶液的制备：取不含黄芩的阴性颗粒按照步骤1)的方法制备阴性对照品溶液；

3)标准品溶液的制备：取黄芩苷，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为标准品溶液；

4)薄层色谱鉴别：吸取步骤1)制得的供试品溶液与步骤2)、3)制得的阴性对照品溶液、标准品溶液各2μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5：3：1：1)为展开剂，将薄层板展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铁乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与标准品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，而阴性对照未见干扰。如图2所示。

实施例4盐酸小檗碱的薄层色谱鉴别方法

1)供试品溶液的制备：分别取第I批次、第II批次、第III批次的复方鱼桔颗粒5g溶于50mL水中，超声处理30min，加入二氯甲烷萃取2次，每次50mL，合并萃取液，浓缩至干，加甲醇至1mL，得第I批次、第II批次、第III批次的供试品溶液；

2)阴性对照品溶液的制备：取不含黄连的阴性颗粒按照步骤1)的方法制备阴性对照品溶液；

3)标准品溶液的制备：取盐酸小檗碱，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为标准品溶液；

4)薄层色谱鉴别：吸取步骤1)制得的供试品溶液与步骤2)、3)制得的阴性对照品溶液、标准品溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺(3:3.5:1:1.5:0.5:1)为展开剂，将薄层板先置浓氨试液预饱和5min，再展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与标准品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，而阴性对照未见干扰。如图3所示。

实施例5甘草苷的薄层色谱鉴别方法

1)供试品溶液的制备：分别取第I批次、第II批次、第III批次的复方鱼桔颗粒5g溶于50mL水中，超声处理30min，加入乙酸乙酯萃取2次，每次50mL，合并萃取液，浓缩至干，加甲醇至1mL，得第I批次、第II批次、第III批次的供试品溶液；

2)阴性对照品溶液的制备：取不含甘草的阴性颗粒按照步骤1)的方法制备阴性对照品溶液；

3)标准品溶液的制备：取甘草苷品，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为标准品溶液；

4)薄层色谱鉴别：吸取步骤1)制得的供试品溶液与步骤2)、3)制得的阴性对照品溶液、标准品溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15:1:1:2)为展开剂，将薄层板展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，供试品色谱中，在与标准品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，而阴性对照未见干扰。如图4所示。

由上述实施例2～5及附图1～4可知：本发明复方鱼桔颗粒的薄层色谱鉴别方法，斑点清洗，分离度高，专属性强，阴性样品无干扰。

实施例6复方鱼桔颗粒的质量检测方法

(1)供试品溶液的制备：称取1g实施例1中第I批次的复方鱼桔颗粒，加入25ml50％甲醇溶液，超声30min，放冷后补足失去体积，0.45μM微孔滤膜滤过，取滤液，即得供试品溶液；

(2)标准品溶液的制备：以质量比1:1称取绿原酸、黄芩苷，加甲醇溶解，配制成二者浓度均为120μg/ml混合标准品溶液，备用；

(3)阴性对照品溶液制备：称取不含金银花和黄芩的复方鱼桔阴性颗粒，溶于甲醇，超声、过滤得阴性对照品溶液；

(4)高效液相色谱法测定：分别吸取混合标准品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液各10μl，按下述液相色谱法测定条件及梯度洗脱程序进行测定；结果如图5所示；

测定条件包括：流动相A为甲醇、流动相B为0.1％磷酸水；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：330nm；进样量：10μL；色谱柱：安捷伦ZORBAX Elipse XDB-C₁₈，250mm×4.6mm，5μm；

梯度洗脱程序：

0～15min，流动相A为80％-70％，流动相B为20％-30％；

15～30min，流动相A为70％-40％，流动相B为30％-60％；

30～35min，流动相A为40％-0％，流动相B为60％-100％；

35～40min，流动相A为0，流动相B为100％；

40～12min，流动相A为0％-80％，流动相B为100％-20％；

42～45min，流动相A为80％，流动相B为20％。

由图5数据可知：(图中：A为供试品溶液；B为混合标准品溶液；C为阴性对照溶液；1为绿原酸；2为黄芩苷)绿原酸与黄芩苷2种活性成分与其相邻的色谱峰分离系数均大于1.5，并且各组分互不干扰，理论塔板数符合要求，专属性良好。

实施例7线性关系试验

以质量比1:1称取绿原酸、黄芩苷适量，加甲醇溶解，配制成二者浓度均为120μg/ml混合标准品溶液，备用；

精密吸取1、2.5、5、10、15、25μl的混合标准品溶液，注入液相色谱仪，按照实施例6的液相色谱测定条件及梯度洗脱程序进行测定，记录峰面积。以进样量为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，得各组分线性方程、相关系数、线性范围，结果见表1。

表1两种主成分的线性关系考察结果

由表1数据可知：绿原酸在0.12～3.00μg(r＝0.9991)范围内线性关系良好，黄芩苷在0.11～2.80μg(r＝0.9999)范围内线性关系良好，即绿原酸、黄芩苷各成分在各自浓度范围内呈良好的线性关系。

实施例8精密度试验

精密吸取实施例7制备的混合标准品溶液5μl，按照实施例6的液相色谱条件重复进样6次，记录峰面积，计算RSD(相对标准偏差)值，结果见表2。

表2精密度试验结果

由表2数据可知，仪器的精密度良好。

实施例9重复性试验

按照实施例6的供试品溶液的制备方法，取实施例1中第I批次的复方鱼桔颗粒制备6份供试品溶液，按照实施例6的液相色谱条件分别称取6份供试品溶液10μl进样，记录绿原酸，黄芩苷的含量，计算RSD(相对标准偏差)值，结果见表3。

表3重复性试验结果

由上述表3结果结果可知：6份供试品溶液中，测得的绿原酸含量的RSD为0.46％，黄芩苷含量的RSD为0.47％，表明本发明的质量检测方法重复性良好。

实施例10稳定性试验

取实施例1中第I批次的复方鱼桔颗粒，按照实施例6的供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，备用；

等量取上述供试品溶液分别于室温放置0h，2h，10h，18h，24h。按照实施例6的液相色谱条件进样10μl，测定峰面积，计算RSD(相对标准偏差)值，结果见表4。

表4稳定性试验结果

由上述表4结果可知：24h内，绿原酸峰面积的RSD为0.55％，黄芩苷峰面积的RSD为0.62％，表明供试品溶液在24h内稳定。

实施例11加样回收率试验

取已知指标成分含量的复方鱼桔颗粒样品9份，在线性范周内分别加入一定量的绿原酸，黄芩苷标准品溶液，共9份，按照实施例6的液相色谱条件测定含量，结果见表5。

表5加样回收率试验结果

由上述表5可知，绿原酸加样回收率均值为101.95％，RSD为2.90％；黄芩苷加样回收率均值为101.19％，RSD为2.72％；表明本发明的质量检测方法回收率良好。

实施例12含量测定

取实施例1中第I批次、第II批次、第III批次的复方鱼桔颗粒样品，按照实施例6制备方法制备3份不同批次的供试品溶液，并分别按实施例6的液相色谱条件测定绿原酸，黄芩苷的含量。具体为：分别取3份不同批次的供试品溶液10μl进样，将峰面积带入实施例7的线性方程中，得出进样供试品中绿原酸、黄芩苷的含量，进而得出第I批次、第II批次、第III批次的复方鱼桔颗粒样品绿原酸、黄芩苷的含量。结果见表6。

表6颗粒中绿原酸，黄芩苷的含量测定结果

由表6数据可知，实施例1制得的三个批次的复方鱼桔颗粒的绿原酸、黄芩苷含量稳定，同时也验证了上述本发明复方鱼桔颗粒的质量检测方法的可行性与稳定性。

综上所述，本发明的用于复方鱼桔颗粒的鉴别方法及质量检测方法，采用薄层色谱法对该复方颗粒中金银花、黄芩、黄连、甘草进行定性鉴别，采用高效液相色谱法同时测定该颗粒中绿原酸和黄芩苷的含量，建立了复方鱼桔颗粒4种特征成分的薄层鉴别及其中2种有效成分的含量测定方法，实验方法简便可行，专属性强，灵敏度高，重现性好，可用于复方鱼桔颗粒的质量控制。所以，本发明有效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。

上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (10)

1.一种用于复方鱼桔颗粒的鉴别方法，其特征在于，采用薄层色谱法鉴别复方鱼桔颗粒中的特征成分：绿原酸、黄芩苷、盐酸小檗碱和甘草苷。

2.根据权利要求1所述的用于复方鱼桔颗粒的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)供试品溶液的制备：取复方鱼桔颗粒溶于溶剂I中超声，萃取，萃取液浓缩至干，溶于溶剂II中，得供试品溶液；

2)标准品溶液的制备：取绿原酸、黄芩苷、盐酸小檗碱和甘草苷中的至少一种溶于溶剂III中，作为标准品溶液；

3)薄层色谱鉴别：吸取步骤1)制得的供试品溶液与步骤2)制得的标准品溶液分别点于同一硅胶G薄层板上，采用展开剂展开，置紫外光灯下检视，比较薄层板上供试品溶液与标准品溶液的荧光斑点位置，确定供试品溶液中特征成分的存在。

3.根据权利要求2所述的用于复方鱼桔颗粒的鉴别方法，其特征在于，步骤1)中所述溶剂I为水；

和/或，步骤1)中所述超声时间为20～30min；

和/或，步骤1)中所述萃取采用的萃取剂为水饱和正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷中的一种；

和/或，步骤1)中所述溶剂II为甲醇。

4.根据权利要求2所述的用于复方鱼桔颗粒的鉴别方法，其特征在于，步骤2)中所述溶剂III为甲醇；

和/或，步骤2)中所述标准品溶液的浓度为≤1.1mg/mL。

5.根据权利要求2所述的用于复方鱼桔颗粒的鉴别方法，其特征在于，步骤3)中所述紫外灯波长为365nm。

6.根据权利要求2所述的用于复方鱼桔颗粒的鉴别方法，其特征在于，步骤3)中标准品溶液为绿原酸溶液时，展开剂为乙酸乙酯-甲酸-水，体积比为(70～90):(2～2.5):1；

和/或，步骤3)中标准品溶液为黄芩苷溶液时，展开剂为乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水，体积比为(5～6):(3～4):1:1，且薄层板展开并晾干后，喷以0.5～2％三氯化铁乙醇溶液，100～110℃加热至斑点显色清晰；

和/或，步骤3)中标准品溶液为盐酸小檗碱溶液时，展开剂为环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺，体积比为3:(3～4):1:1.5:0.5:1，且薄层板先置浓氨试液预饱和4～8min，再于展开剂中展开；

和/或，步骤3)中标准品溶液为甘草苷溶液时，展开剂为乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水，体积比为(15～20):1:1:2，且薄层板展开并晾干后，喷以8～12％硫酸乙醇溶液，在100～110℃加热至斑点显色清晰。

7.一种用于复方鱼桔颗粒的质量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：称取复方鱼桔颗粒溶于甲醇中，超声、过滤得供试品溶液；

(2)标准品溶液的制备：称取绿原酸、黄芩苷于甲醇中溶解，制得混合标准品溶液；

(3)阴性对照品溶液制备：称取不含金银花、黄芩的复方鱼桔阴性颗粒，溶于甲醇，超声、过滤得阴性对照品溶液；

(4)高效液相色谱法测定：分别称取步骤(1)、(2)、(3)的供试品溶液、混合标准品溶液和阴性对照品溶液，以流动相A、流动相B进行梯度洗脱，比较保留时间进行定性，采用标准曲线法进行定量，确定供试品溶液中绿原酸、黄芩苷的含量。

8.根据权利要求7所述的用于复方鱼桔颗粒的质量检测方法，其特征在于，步骤(1)所述复方鱼桔颗粒与甲醇的质量体积比为1～2g:25～40mL；

和/或，步骤(1)中所述超声时间为20～30min；

和/或，步骤(1)中所述过滤采用0.45～0.6μM微孔滤膜过滤。

9.根据权利要求7所述的用于复方鱼桔颗粒的质量检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述混合标准品溶液的浓度为100～150μg/mL；

和/或，步骤(2)中称取的绿原酸、黄芩苷的质量比为1:(1～1.2)。

10.根据权利要求7所述的用于复方鱼桔颗粒的质量检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述流动相A为甲醇、流动相B为0.1％磷酸水；

和/或，步骤(4)中所述高效液相色谱法测定条件还包括：流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：330nm；进样量：10μL；色谱柱：安捷伦ZORBAX Elipse XDB-C₁₈，250mm×4.6mm，5μm；

和/或，步骤(4)中所述梯度洗脱程序：

0～15min，流动相A为80％-70％，流动相B为20％-30％；

15～30min，流动相A为70％-40％，流动相B为30％-60％；

30～35min，流动相A为40％-0％，流动相B为60％-100％；

35～40min，流动相A为0，流动相B为100％；

40～12min，流动相A为0％-80％，流动相B为100％-20％；

42～45min，流动相A为80％，流动相B为20％。

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