CN116399997A - 一种银黄药物组合物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种银黄药物组合物的检测方法。所述检测方法包括：(1)黄芩提取物中黄芩苷的薄层鉴别；(2)金银花提取物中绿原酸的薄层鉴别；(3)黄芩提取物中黄芩苷的含量测定；(4)金银花提取物中绿原酸的含量测定。通过方法学考察，该检测方法具有专属性强、耐用性好、良好的回收率等效果，方法稳定可行。用于检测银黄药物组合物中黄芩苷和绿原酸含量。能有效的检测产品的质量情况，准确地控制产品质量。
Description
技术领域
本发明属于中药质量检测技术领域，具体涉及一种银黄药物组合物的检测方法。
背景技术
银黄含化滴丸，为贵州威利德制药有限公司的产品，功能与主治：清热解毒，消炎。用于急慢性扁桃体炎、咽炎、上呼吸道感染。
处方：金银花提取物90g、黄芩提取物90g；制法：以上两味，粉碎成细粉，加812g聚乙二醇-4000混合均匀后，加热(约80～90℃)熔融成均匀的药液，再加入阿司帕坦4.5g及薄荷脑3.5g，混合均匀后，药液保持温度在70～80℃，滴入二甲基硅油(5～10℃)中，滴制成丸，制成1000g，即得。
现有技术中，《中华人民共和国药典》2020版中收载有银黄口服液、银黄丸、银黄片等中药制剂，其制备工艺各不相同，检测标准中只包括黄芩苷和绿原酸含量测定，每种功效成分的含量测定需要通过采取不同的测定方法，导致其检测效率低；且没有药物功效成分的鉴别，不能有效全面控制药物质量。
为了提高检测效率，有效控制药物质量，提升银黄药物组合物的质量标准，本发明团队对银黄药物组合物的检测进行深入研发、考察，建立了一种银黄药物组合物的检测方法，增加了提取物中黄芩苷和绿原酸的薄层鉴别，采用高效液相色谱法在相同条件下可同时测出黄芩苷和绿原酸的含量。
发明内容
本发明的目的是提供一种银黄药物组合物的检测方法。
本发明技是通过如下技术方案实现的：
一种银黄药物组合物的检测方法，所述检测方法包括：(1)黄芩提取物中黄芩苷的薄层鉴别；(2)金银花提取物中绿原酸的薄层鉴别；(3)黄芩苷和绿原酸的含量测定。
本发明所述黄芩苷的薄层鉴别方法为：
取样品细粉1-3g，加乙醚10-30mL，超声处理10-20min，滤过，滤渣挥尽乙醚，加甲醇10-30mL，超声处理10-20min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10-30mL，加热使溶解，加稀盐酸调节pH值至2-3，加乙酸乙酯振摇提取1-3次，每次10-30mL，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1-2mL使溶解，作为供试品溶液；另取黄芩苷对照品，加甲醇制成每lmL含1mg的溶液，作为黄芩苷对照品溶液；吸取上述两种溶液各2-4μL，分别点于同一硅胶G板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(15:4.5:1:2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3-5％三氯化铁乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视。
优选的，本发明所述黄芩苷的薄层鉴别方法为：
取样品细粉2g，加乙醚20mL，超声处理15min，滤过，滤渣挥尽乙醚，加甲醇20mL，超声处理15min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL，加热使溶解，加稀盐酸调节pH值至2.5，加乙酸乙酯振摇提取2次，每次20mL，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液；另取黄芩苷对照品，加甲醇制成每lmL含1mg的溶液，作为黄芩苷对照品溶液；吸取上述两种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(15:4.5:1:2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以4％三氯化铁乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视。
本发明所述绿原酸的薄层鉴别方法为：
取样品细粉2-4g，加无水乙醇40-60mL，超声处理20-40min，滤过，滤液蒸干，残渣加10-20mL水使溶解，过聚酰胺柱，用40-60mL水洗脱，弃去水液，用甲醇20-40mL分次洗脱，收集洗脱液，置水浴锅上蒸干，残渣加甲醇1-2mL使溶解，作为供试品溶液；另取绿原酸对照品，加甲醇制成每lmL含1mg的溶液，作为绿原酸对照品溶液；吸取上述两种溶液各2-4μL，分别点于同一硅胶G板上，以乙酸乙酯-丁酮-三氯甲烷-甲酸-水(15:12:4:3:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1-5％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视。
优选的，本发明所述绿原酸的薄层鉴别方法为：
取样品细粉3g，加无水乙醇50mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加15mL水使溶解，过聚酰胺柱，用50mL水洗脱，弃去水液，用甲醇30mL分次洗脱，收集洗脱液，置水浴锅上蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；另取绿原酸对照品，加甲醇制成每lmL含1mg的溶液，作为绿原酸对照品溶液；吸取上述两种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G板上，以乙酸乙酯-丁酮-三氯甲烷-甲酸-水(15:12:4:3:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视。
本发明所述黄芩苷和绿原酸的含量测定方法包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷和绿原酸对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为40μg·mL-1黄芩苷、25μg·mL-1绿原酸的混合对照品溶液，即得；
(2)供试品溶液的制备：取样品0.1g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，加甲醇适量，超声处理0.5h，放冷至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，得续滤液，精密吸取续滤液10m1，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；
(3)色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以含0.01％甲酸的乙腈溶液为流动相A，以含0.2％甲酸水溶液为流动相B，梯度洗脱：0-5min，15％A；5-15min，85％A；15-20min，15％A；检测波长为315nm；柱温32℃；流速1.0mL·min-1；进样量10uL；理论板数按黄芩苷和绿原酸峰计算应不低于3000；
(4)测定法：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。
本发明步骤(1)和(2)所述甲醇的浓度为：50-70％甲醇溶液。
优选的，本发明步骤(1)和(2)所述甲醇的浓度：60％甲醇溶液。
本发明步骤(2)所述超声处理的条件为：超声功率300-400W，频率30-50kHz。
优选的，本发明步骤(2)所述超声处理的条件为：超声功率350W，频率40kHz。
本发明的有益效果：
1.本发明增加了对黄芩苷和绿原酸的薄层鉴别，对薄层鉴别中供试品的称样量、溶剂选择及提取方法、展开剂等进行了大量筛选实验，得到黄芩苷和绿原酸的薄层鉴别方法的优选方案，并对其进行了方法学考察，结果在专属性考察中，在供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上显相同颜色的主斑点，且斑点分离较好，阴性无干扰，表明此方法专属性强；在重现性考察中，10批样品检验结果一致，表明此方法的稳定性；在耐用性考察中，在不同薄层板、温度、湿度下考察，结果斑点分离好，无干扰，表明此方法耐用性好。
2.本发明利用高效液相色谱建立了灵敏、准确、简便测定银黄药物中黄芩苷和绿原酸含量的检测方法，可作为关键功效成分的质量控制方法，此方法条件下黄芩苷和绿原酸色谱峰形较理想，基线平稳，分离效果好。将该方法应用于银黄药物组合物的测定，其方法特异性、重复性、中间精密度、稳定性、准确度良好。
3.本发明对含量测定方法中供试品提取溶剂、提取方法、提取时间，流动相等进行了的筛选实验，得到了含量测定的优选方案，并对其进行了方法学考察，结果：
(1)在线性考察中，黄芩苷在0.0799μg-0.3995μg范围内呈良好的线性关系(R2＝0.9994)；绿原酸在0.0498μg-0.2492μg范围内与其峰面积呈良好的线性关系(R2＝0.9998)；
(2)在精密度考察中，测定黄芩苷和绿原酸峰面积，结果黄芩苷的RSD为1.96％，绿原酸的RSD为1.81％，表明仪器的精密度良好；
(3)在稳定性考察中，测定黄芩苷和绿原酸峰面积，结果黄芩苷的RSD为1.94％，绿原酸的RSD为1.18％，表明供试品溶液在12h小时内检测具有良好的稳定性；
(4)在重复考察中，测定黄芩苷和绿原酸的含量，结果黄芩苷的RSD为0.89％，绿原酸的RSD为1.14％，表明该方法重复性良好；
(5)在回收率考察中，结果黄芩苷平均回收率为98.73％，RSD为0.93％，绿原酸平均回收率为98.35％，RSD为1.32％，均符合要求；
(6)在专属性考察结果表明样品溶液色谱在对照品溶液色谱相应位置有相应的色谱峰，且阴性无干扰；并对10批样品进行了黄芩苷和绿原酸含量测定，结果10批样品中黄芩苷和绿原酸平均含量分别为81.78mg/g，15.21mg/g，均符合要求。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用于限制本发明的范围。
实施例1黄芩苷的薄层鉴别一
取样品细粉2g，加乙醚20mL，超声处理15min，滤过，滤渣挥尽乙醚，加甲醇20mL，超声处理15min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL，加热使溶解，加稀盐酸调节pH值至2.5，加乙酸乙酯振摇提取2次，每次20mL，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液；另取黄芩苷对照品，加甲醇制成每lmL含1mg的溶液，作为黄芩苷对照品溶液；吸取上述两种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(15:4.5:1:2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以4％三氯化铁乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视。
实施例2黄芩苷的薄层鉴别二
取样品细粉3g，加乙醚30mL，超声处理20min，滤过，滤渣挥尽乙醚，加甲醇30mL，超声处理20min，滤过，滤液蒸干，残渣加水30mL，加热使溶解，加稀盐酸调节pH值至3，加乙酸乙酯振摇提取3次，每次30mL，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液；另取黄芩苷对照品，加甲醇制成每lmL含1mg的溶液，作为黄芩苷对照品溶液；吸取上述两种溶液各4μL，分别点于同一硅胶G板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(15:4.5:1:2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％三氯化铁乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视。
实施例3黄芩苷的薄层鉴别三
取样品细粉1g，加乙醚10mL，超声处理10min，滤过，滤渣挥尽乙醚，加甲醇10mL，超声处理10min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10mL，加热使溶解，加稀盐酸调节pH值至2，加乙酸乙酯振摇提取1次，每次10mL，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；另取黄芩苷对照品，加甲醇制成每lmL含1mg的溶液，作为黄芩苷对照品溶液；吸取上述两种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G板，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(15:4.5:1:2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3％三氯化铁乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视。
实施例4绿原酸的薄层鉴别一
取样品细粉3g，加无水乙醇50mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加15mL水使溶解，过聚酰胺柱，用50mL水洗脱，弃去水液，用甲醇30mL分次洗脱，收集洗脱液，置水浴锅上蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；另取绿原酸对照品，加甲醇制成每lmL含1mg的溶液，作为绿原酸对照品溶液；吸取上述两种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G板上，以乙酸乙酯-丁酮-三氯甲烷-甲酸-水(15:12:4:3:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视。
实施例5绿原酸的薄层鉴别二
取样品细粉4g，加无水乙醇60mL，超声处理40min，滤过，滤液蒸干，残渣加20mL水使溶解，过聚酰胺柱，用60mL水洗脱，弃去水液，用甲醇40mL分次洗脱，收集洗脱液，置水浴锅上蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液；另取绿原酸对照品，加甲醇制成每lmL含1mg的溶液，作为绿原酸对照品溶液；吸取上述两种溶液各4μL，分别点于同一硅胶G板上，以乙酸乙酯-丁酮-三氯甲烷-甲酸-水(15:12:4:3:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视。
实施例6绿原酸的薄层鉴别三
取样品细粉2g，加无水乙醇40mL，超声处理20min，滤过，滤液蒸干，残渣加10mL水使溶解，过聚酰胺柱，用40mL水洗脱，弃去水液，用甲醇20mL分次洗脱，收集洗脱液，置水浴锅上蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；另取绿原酸对照品，加甲醇制成每lmL含1mg的溶液，作为绿原酸对照品溶液；吸取上述两种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G板上，以乙酸乙酯-丁酮-三氯甲烷-甲酸-水(15:12:4:3:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视。
实施例7含量测定
(1)对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷和绿原酸对照品适量，加60％甲醇制成质量浓度分别为40μg·mL-1黄芩苷、25μg·mL-1绿原酸的混合对照品溶液，即得；
(2)供试品溶液的制备：取样品0.1g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，加60％甲醇适量，超声处理0.5h(功率350W，频率40kHz)，放冷至室温，加60％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，得续滤液，精密吸取续滤液10m1，置25ml量瓶中，加60％甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；
(3)色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以含0.01％甲酸的乙腈溶液为流动相A，以含0.2％甲酸水溶液为流动相B，梯度洗脱：0-5min，15％A；5-15min，85％A；15-20min，15％A；检测波长为315nm；柱温30℃；流速1.0mL·min-1；进样量10uL；理论板数按黄芩苷和绿原酸峰计算应不低于3000；
(4)测定法：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。
为了进一步验证本发明的可行性，发明人进行了一系列的实验，步骤如下：
一、银黄药物组合物中黄芩苷和绿原酸的薄层鉴别试验研究
1、黄芩苷的薄层鉴别筛选
1.1方法一：参照《中国药典》2020版一部中黄芩提取物鉴别标准
取样品1g，加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取上述两种溶液各2μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
结果：在与对照品色谱相应的位置上，斑点模糊，有拖尾，分离度不符合要求。
1.2方法二：以“方法一”的分析结果，结合黄芩苷的性质，将供试品的处理方式、展开剂以及显色剂进行调整，暂定薄层鉴别方法为：
取样品细粉2g，加乙醚20mL，超声处理15min，滤过，滤渣挥尽乙醚，加甲醇20mL，超声处理15min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL，加热使溶解，加稀盐酸调节pH值至2.5，加乙酸乙酯振摇提取2次，每次20mL，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液；另取黄芩苷对照品，加甲醇制成每lmL含1mg的溶液，作为黄芩苷对照品溶液；吸取上述两种溶液各2μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(15:4.5:1:2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以4％三氯化铁乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视。
结果：在365nm紫外灯光下观察，斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好。
1.3方法的确认
1.3.1供试品取样量的确定
取样品，按“1.2”项下方法实验，筛选供试品取样量。结果见表1。
表1供试品取样量筛选表
结果：由表1可知，取样量为2.0g、3.0g时，薄层均为斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好。故“2.0g”为优选取样量。
1.3.2供试品提取溶剂的筛选
根据“1.3.1”项下的优选方法实验，筛选样品的提取溶剂。结果见表2。
表2提取溶剂筛选表
由表2可知，甲醇作供试品提取溶剂时，结果斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，无拖尾现象，重现性好。故“甲醇”为优选样品提取溶剂。
1.3.3提取方法的筛选
根据“1.3.2”项下的优选薄层方法，筛选样品的提取方法。结果见表3。
表3提取方法筛选表
由表3可知，超声提取时，结果显示斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好。故“超声提取”为优选样品提取方法。
1.3.4提取时间的筛选
根据“1.3.3”项下的优选薄层方法，筛选样品的提取时间。结果见表4。
表4提取时间筛选表
由表4可知，超声提取时间为15min时，薄层结果均显示斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好。故“15min”为优选样品提取时间。
1.3.5供试品溶液pH值的筛选
根据“1.3.4”项下的优选薄层方法，筛选样品的pH值。结果见表5。
表5提取时间筛选表
由表5可知，pH值为2.5时，薄层结果显示斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，无拖尾，重现性好。故优选“pH值为2.5”。
1.3.6展开剂比例筛选
根据“1.3.5”项下的优选薄层方法，筛选展开剂比例。结果见表6。
表6展开剂比例筛选表
由表6可知，展开剂乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水比例为“15:4.5:1:2”时，薄层结果显示斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好。故“15:4.5:1:2”为展开剂优选比例。
1.3.7供试品点样量的确定
根据“1.3.6”项下的优选薄层方法，筛选供试品点样量。结果见表7。
表7供试品点样量筛选表
由表7可知，点样量为2μL时，薄层斑点清晰，无拖尾，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好。故“2μL”为优选样品点样量。
1.3.8结果
经过以上筛选实验，得出黄芩苷的薄层鉴别优选方法为：
取样品细粉2g，加乙醚20mL，超声处理15min，滤过，滤渣挥尽乙醚，加甲醇20mL，超声处理15min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL，加热使溶解，加稀盐酸调节pH值至2.5，加乙酸乙酯振摇提取2次，每次20mL，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液；另取黄芩苷对照品，加甲醇制成每lmL含1mg的溶液，作为黄芩苷对照品溶液；吸取上述两种溶液各2μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(15:4.5:1:2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以4％三氯化铁乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视。
1.4方法学验证
1.4.1专属性
取样品3批，薄层板选用青岛海洋化工厂硅胶G板，在温度为25℃，湿度为60％的环境下，按“1.3.8”项下的方法制得供试品溶液，分别取供试品溶液、对照品溶液、阴性样品溶液点样、展开、显色，365nm紫外光灯下检视，在供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上显相同的主斑点，斑点分离较好，且阴性无干扰。
1.4.2重现性
取样品10批，分别按“1.3.8”的薄层鉴别方法展开，结果见表8。
表8试验方法、条件及重现性试验结果
由表8可知，10批银黄药物样品的薄层均显示斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好，表明本方法重现性好。
1.4.3耐用性
1.4.3.1不同薄层板的比较
取样品10批，分别按“1.3.8”的的方法展开，比较青岛海洋化工厂分厂硅胶G商品板和高效硅胶G商品板的薄层，结果见表9。
表9不同薄层板耐用性结果表
由表9可知，高效硅胶板商品板斑点清晰，分离符合要求，Rf值适中；硅胶G商品板斑点清晰，分离达到要求,Rf值适中，故本方法耐用性好。
1.4.3.2不同温度的比较
取样品(20211201)，薄层板选用青岛海洋化工厂硅胶G板，按“1.3.8”的薄层鉴别方法，分别在温度为4℃和24℃，湿度均为55％的环境下，展开，结果见表10。
表10不同温度试验结果
由表10可知，薄层斑点清晰，分离符合要求，Rf值适中，两个温度条件下均能得到较好的鉴别色谱，故本方法耐用性好。
1.4.3.3不同湿度的比较
取样品(20211201)，薄层板选用青岛海洋化工厂硅胶G板，按“1.3.8”的薄层鉴别方法，在温度24℃，湿度分别为30％和65％的环境下，展开，结果见表11。
表11不同湿度试验结果
由表11可知，薄层斑点清晰，分离符合要求，Rf值适中，两个湿度条件下均能得到较好的鉴别色谱，故本方法耐用性好。
2、绿原酸的薄层鉴别筛选
2.1方法一：参照《中国药典》2020版一部中金银花药材鉴别标准
取本品粉末0.2g，加甲醇5ml，放置12小时，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取绿原酸对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取供试品溶液10～20μl、对照品溶液10μl，分别点于同一硅胶H薄层板上，以乙酸丁酯-甲酸-水(7:2.5:2.5)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
结果：在与对照品色谱相应的位置上，斑点模糊，有拖尾，分离度不符合要求。
2.2方法二：以“方法一”的分析结果结合绿原酸的性质，将供试品的处理、展开剂以及显色剂进行调整，暂定薄层鉴别方法为：
取样品细粉3g，加无水乙醇50mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加15mL水使溶解，过聚酰胺柱，用50mL水洗脱，弃去水液，用甲醇30mL分次洗脱，收集洗脱液，置水浴锅上蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；另取绿原酸对照品，加甲醇制成每lmL含1mg的溶液，作为绿原酸对照品溶液；吸取上述两种溶液各2μL，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯-丁酮-三氯甲烷-甲酸-水(15:12:4:3:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视。
结果：在365nm紫外灯光下观察，斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好。
2.3方法的确认
2.3.1供试品取样量的确定
取样品，按“2.2”项下方法实验，筛选供试品取样量。结果见表12。
表12供试品取样量筛选表
结果：由表12可知，取样量为3.0g时，薄层均为斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好。故“3.0g”为优选取样量。
2.3.2供试品提取溶剂的筛选
根据“2.3.1”项下的优选方法实验，筛选样品的提取溶剂。结果见表13。
表13提取溶剂筛选表
由表13可知，无水乙醇作供试品提取溶剂时，结果斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，无拖尾现象，重现性好。故“无水乙醇”为优选样品提取溶剂。
2.3.3提取方法的筛选
根据“2.3.2”项下的优选薄层方法，筛选样品的提取方法。结果见表14。
表14提取方法筛选表
由表14可知，超声提取时，结果显示斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好。故“超声提取”为优选样品提取方法。
2.3.4提取时间的筛选
根据“2.3.3”项下的优选薄层方法，筛选样品的提取时间。结果见表15。
表15提取时间筛选表
由表15可知，超声提取时间为30min时，薄层结果均显示斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好。故“30min”为优选样品提取时间。
2.3.5展开剂的筛选
根据“2.3.4”项下的优选薄层方法，筛选样品的展开剂剂。结果见表16。
表16展开剂筛选表
由表16可知，乙酸乙酯-丁酮-三氯甲烷-甲酸-水为展开剂时，薄层结果显示斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，无拖尾，重现性好。故优选“乙酸乙酯-丁酮-三氯甲烷-甲酸-水”为展开剂。
2.3.6展开剂比例筛选
根据“2.3.5”项下的优选薄层方法，筛选展开剂比例。结果见表17。
表17展开剂比例筛选表
由表17可知，展开剂乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水比例为“15:12:4:3:1”时，薄层结果显示斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好。故“15:12:4:3:1”为展开剂优选比例。
2.3.7供试品点样量的确定
根据“2.3.6”项下的优选薄层方法，筛选供试品点样量。结果见表18。
表18供试品点样量筛选表
由表18可知，点样量为2μL时，薄层斑点清晰，无拖尾，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好。故“2μL”为优选样品点样量。
2.3.8结果
经过以上筛选实验，得出绿原酸的薄层鉴别优选方法为：
取样品细粉3g，加无水乙醇50mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加15mL水使溶解，过聚酰胺柱，用50mL水洗脱，弃去水液，用甲醇30mL分次洗脱，收集洗脱液，置水浴锅上蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；另取绿原酸对照品，加甲醇制成每lmL含1mg的溶液，作为绿原酸对照品溶液；吸取上述两种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G板上，以乙酸乙酯-丁酮-三氯甲烷-甲酸-水(15:12:4:3:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视。
2.4方法学验证
2.4.1专属性
取样品3批，薄层板选用青岛海洋化工厂硅胶G板，在温度为25℃，湿度为60％的环境下，按“2.3.8”项下的方法制得供试品溶液，分别取供试品溶液、对照品溶液、阴性样品溶液点样、展开、显色，365nm紫外光灯下检视，在供试品色谱中，与对照品色谱相应的位置上显相同的主斑点，斑点分离较好，且阴性无干扰。
2.4.2重现性
取样品10批，分别按“2.3.8”的薄层鉴别方法展开，结果见表19。
表19试验方法、条件及重现性试验结果
由表19可知，10批银黄药物样品的薄层均显示斑点清晰，分离度符合要求，Rf值适中，重现性好，表明本方法重现性好。
2.4.3耐用性
2.4.3.1不同薄层板的比较
取样品10批，分别按“2.3.8”的的方法展开，比较青岛海洋化工厂分厂硅胶G商品板和高效硅胶G商品板的薄层，结果见表20。
表20不同薄层板耐用性结果表
由表20可知，高效硅胶板商品板斑点清晰，分离符合要求，Rf值适中；硅胶G商品板斑点清晰，分离达到要求,Rf值适中，故本方法耐用性好。
2.4.3.2不同温度的比较
取样品(20211201)，薄层板选用青岛海洋化工厂硅胶G板，按“2.3.8”的薄层鉴别方法，分别在温度为4℃和24℃，湿度均为55％的环境下，展开，结果见表21。
表21不同温度试验结果
由表21可知，薄层斑点清晰，分离符合要求，Rf值适中，两个温度条件下均能得到较好的鉴别色谱，故本方法耐用性好。
2.4.3.3不同湿度的比较
取样品(20211201)，薄层板选用青岛海洋化工厂硅胶G板，按“2.3.8”的薄层鉴别方法，在温度24℃，湿度分别为30％和65％的环境下，展开，结果见表22。
表22不同湿度试验结果
由表22可知，薄层斑点清晰，分离符合要求，Rf值适中，两个湿度条件下均能得到较好的鉴别色谱，故本方法耐用性好。
3、黄芩苷和绿原酸含量测定方法试验研究
3.1仪器与试药
高效液相色谱仪：THERMO液相色谱仪；黄芩苷对照品(纯度≥99％，中国食品药品检定研究院所提供)；绿原酸对照品(纯度≥99％，中国食品药品检定研究院所提供)；试剂：甲醇、乙腈为色谱醇，甲酸、磷酸为分析纯，水为重蒸馏水。
3.2含量测定方法设计
由于本发明银黄药物组合物制剂是由黄芩提取物和金银花提取物两种物质制备而成，指标成分分别为黄芩苷和绿原酸，现有技术中含量测定多数采用分别测定各指标含量，很少报道在同一条件下同时测定两种指标含量。本发明研究团队采用高效液相色谱法同时测定黄芩苷和绿原酸的含量，采用梯度洗脱，在相同条件下测定，更有利于控制银黄药物组合物的质量。
方法一：参照《中国药典》2020版药典银黄丸含量测定方法
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.4％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱：0-15min，A为5→20％；15-30min，A为20→30％；30-40min，A为30％；柱温为25℃；流速为每分钟1.0ml；检测波长为327nm。理论板数按绿原酸峰计算应不低于2000。
对照品溶液的制备 取绿原酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加50％甲醇制成每1ml含40μg的溶液，即得。
供试品溶液的制备取样品约0.25g，精密称定，置100ml棕色量瓶中，加50％甲醇80ml，超声处理(功率500W，频率40kHz)30分钟，放冷，加50％甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果：“方法一”供试品图谱中黄芩苷和绿原酸主峰与杂质峰不能很好低分离，峰型拖尾，峰响应值低，精准度差。针对所述问题，对样品的处理、色谱条件、提取溶剂等进行考察，具体如下：
3.2.1检测波长的选择
供试品溶液的制备：取样品1g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，加甲醇适量，超声处理0.5h，放冷至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，得续滤液，精密吸取续滤液10m1，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。
按照“方法一”项下方法进样，记录190-400nm范围内的吸收光谱。
结果：黄芩苷在280nm处有最强吸收，绿原酸在315nm处有最强吸收，银黄药物制剂中绿原酸含量远比黄芩苷低,在同一波长下同时测定黄芩苷和绿原酸,应选择含量相对低的绿原酸的最大吸收波长315nm作为检测波长,从而减小误差，不仅能够提高绿原酸检测的灵敏度,而且对黄芩苷的检测也没有明显的影响。因此，最终选择检测波长为315nm。
3.2.2流动相及梯度的选择
优化方法一：THERMO液相色谱仪；以乙腈为流动相A，以含0.2％甲酸水溶液为流动相B，梯度洗脱：0-10min，5％A；10-25min，95％A；25-35min，5％A；检测波长为315nm；柱温30℃；流速1.0mL·min-1；进样量10uL；理论板数按黄芩苷和绿原酸峰计算应不低于3000；
结果：改变流动相及流动相梯度比例，该方法基线不平稳，峰形较一般，出现相邻峰分离度不好的情况，稳定性差。
优化方法二：THERMO液相色谱仪；以含0.01％甲酸的乙腈溶液为流动相A，以含0.2％甲酸水溶液为流动相B，梯度洗脱：0-5min，15％A；5-15min，85％A；15-20min，15％A；检测波长为315nm；柱温30℃；流速1.0mL·min-1；进样量10uL；理论板数按黄芩苷和绿原酸峰计算应不低于3000；
结果：基线平稳，峰分离度、峰形以及峰纯度均良好，稳定性好。故优选“优化方法二”作为含量检测色谱条件的最佳方案。
3.2.3提取溶剂的考察
取“3.2.1”项下方法制样品5份，按照“3.2.2”项下优选的色谱条件进行进样，结果如下表23所示：
表23提取溶剂的筛选
由结果可知，采用60％甲醇作为提取溶剂时，黄芩苷与绿原酸含量均最高，故优选60％甲醇作为提取溶剂。
3.2.4提取方式的考察
取“3.2.1”项下方法制样品3份，按照“3.2.3”项下优选的色谱条件进行进样，结果如下表24所示：
表24不同提取方式对含量影响
由结果可知，采用超声提取时，黄芩苷与绿原酸含量均最高，故优选超声提取方法。
3.3.5提取时间的考察
取“3.2.1”项下方法制样品3份，按照“3.2.4”项下优选的色谱条件进行进样，结果如下表25所示：
表25不同提取时间含量影响
由结果可知，超声提取45min时黄芩苷与绿原酸含量均最高，但与提取时间为30min几乎无差别，考虑的成本因素及效率，故超声时间优选为30min。
3.3.6最终含量测定方法
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以含0.01％甲酸的乙腈溶液为流动相A，以含0.2％甲酸水溶液为流动相B，梯度洗脱：0-5min，15％A；5-15min，85％A；15-20min，15％A；检测波长为315nm；柱温30℃；流速1.0mL·min-1；进样量10uL；理论板数按黄芩苷和绿原酸峰计算应不低于3000；
对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷和绿原酸对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为40μg·mL-1黄芩苷、25μg·mL-1绿原酸的混合对照品溶液，即得；
供试品溶液的制备：取样品0.1g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，加甲醇适量，超声处理0.5h，放冷至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，得续滤液，精密吸取续滤液10m1，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
3.4方法验证
3.4.1线性考察
精密吸取混合对照品溶液(39.95μg·mL-1黄芩苷、24.92μg·mL-1绿原酸)2、4、6、8、10μl进样，记录色谱，以峰面积为横坐标，以进样量为纵坐标作图，得到黄芩苷和绿原酸的回归方程分别为Y＝623347x+5631.8，R2＝0.9994，Y＝499609x+1231.8，R2＝0.9998，结果表明黄芩苷在0.0799μg-0.3995μg之间线性关系良好，绿原酸在0.0498μg-0.2492μg之间线性关系良好。
3.4.2精密度试验
取混合对照品溶液，照“3.3.6”项下色谱条件连续进样6次，测定黄芩苷和绿原酸峰面积，结果黄芩苷的RSD为1.96％，绿原酸的RSD为1.81％，表明仪器的精密度良好。见表26。
表26精密度试验
3.4.3稳定性试验
取供试品溶液，在0、2、4、8、12h分别进样6次，每次进样10uL，测定黄芩苷和绿原酸峰面积，结果黄芩苷的RSD为1.94％，绿原酸的RSD为1.18％，表明供试品溶液在12h小时内检测具有良好的稳定性。见表27。
表27稳定性试验
3.4.4重复性试验
按“3.3.6”项下的方法制备6份供试品溶液，按照“3.3.6”项下色谱条件，测定黄芩苷和绿原酸的含量，结果黄芩苷的RSD为0.89％，绿原酸的RSD为1.14％，表明该方法重复性良好。见表28。
表28重复性试验
3.4.5回收率考察
分别精密称取6份样品，加入相应黄芩苷和绿原酸对照品溶液适量，按照“3.3.6”项下色谱条件测定含量，并计算RSD，结果黄芩苷平均回收率为98.73％，RSD为0.93％，绿原酸平均回收率为98.35％，RSD为1.32％，符合要求。见表29。
表29回收率试验
3.4.6专属性
取样品按供试品溶液制备方法制备样品溶液，按“3.3.6”项下色谱条件，分别取对照品溶液、样品溶液注入液相色谱仪，样品溶液色谱在对照品溶液色谱相应位置有相应的色谱峰，且分离较好，阴性无干扰。
3.4.7含量样品测定
取样品10批，按“3.3.6”项下方法测定，计算。结果见表30。说明本发明方法稳定可行。
表30十批样品含量测定结果
3.4.8样品测定
按“3.3.6”项下测定方法对3批银黄药物制剂中黄芩苷和绿原酸含量进行测定，每批平行测定2次，结果见表31。
表31样品含量测定结果(n＝2)
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的，因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种银黄药物组合物的检测方法，所述组合物由黄芩提取物和金银花提取物制成，其特征在于，所述检测方法包括：(1)黄芩提取物中黄芩苷的薄层鉴别；(2)金银花提取物中绿原酸的薄层鉴别；(3)黄芩苷和绿原酸的含量测定。
2.根据权利要求1所述的银黄药物组合物的检测方法，其特征在于，所述黄芩苷的薄层鉴别方法为：取样品细粉1-3g，加乙醚10-30mL，超声处理10-20min，滤过，滤渣挥尽乙醚，加甲醇10-30mL，超声处理10-20min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10-30mL，加热使溶解，加稀盐酸调节pH值至2-3，加乙酸乙酯振摇提取1-3次，每次10-30mL，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1-2mL使溶解，作为供试品溶液；另取黄芩苷对照品，加甲醇制成每lmL含1mg的溶液，作为黄芩苷对照品溶液；吸取上述两种溶液各2-4μL，分别点于同一硅胶G板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(15:4.5:1:2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3-5％三氯化铁乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视。
3.根据权利要求2所述的银黄药物组合物的检测方法，其特征在于，所述黄芩苷的薄层鉴别方法为：取样品细粉2g，加乙醚20mL，超声处理15min，滤过，滤渣挥尽乙醚，加甲醇20mL，超声处理15min，滤过，滤液蒸干，残渣加水20mL，加热使溶解，加稀盐酸调节pH值至2.5，加乙酸乙酯振摇提取2次，每次20mL，分取乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇2mL使溶解，作为供试品溶液；另取黄芩苷对照品，加甲醇制成每lmL含1mg的溶液，作为黄芩苷对照品溶液；吸取上述两种溶液各2μL，分别点于硅胶G板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲酸-水(15:4.5:1:2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以4％三氯化铁乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视。
4.根据权利要求1所述的银黄药物组合物的检测方法，其特征在于，所述绿原酸的薄层鉴别方法为：取样品细粉2-4g，加无水乙醇40-60mL，超声处理20-40min，滤过，滤液蒸干，残渣加10-20mL水使溶解，过聚酰胺柱，用40-60mL水洗脱，弃去水液，用甲醇20-40mL分次洗脱，收集洗脱液，置水浴锅上蒸干，残渣加甲醇1-2mL使溶解，作为供试品溶液；另取绿原酸对照品，加甲醇制成每lmL含1mg的溶液，作为绿原酸对照品溶液；吸取上述两种溶液各2-4μL，分别点于同一硅胶G板上，以乙酸乙酯-丁酮-三氯甲烷-甲酸-水(15:12:4:3:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以1-5％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视。
5.根据权利要求4所述的银黄药物组合物的检测方法，其特征在于，所述绿原酸的薄层鉴别方法为：取样品细粉3g，加无水乙醇50mL，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加15mL水使溶解，过聚酰胺柱，用50mL水洗脱，弃去水液，用甲醇30mL分次洗脱，收集洗脱液，置水浴锅上蒸干，残渣加甲醇1mL使溶解，作为供试品溶液；另取绿原酸对照品，加甲醇制成每lmL含1mg的溶液，作为绿原酸对照品溶液；吸取上述两种溶液各2μL，分别点于同一硅胶G板上，以乙酸乙酯-丁酮-三氯甲烷-甲酸-水(15:12:4:3:1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以3％三氯化铝乙醇溶液，置紫外光灯365nm下检视。
6.根据权利要求1所述的银黄药物组合物的检测方法，其特征在于，所述黄芩苷和绿原酸的含量测定方法包括如下步骤：
(1)对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷和绿原酸对照品适量，加甲醇制成质量浓度分别为40μg·mL-1黄芩苷、25μg·mL-1绿原酸的混合对照品溶液，即得；
(2)供试品溶液的制备：取样品0.1g，精密称定，置50ml棕色量瓶中，加甲醇适量，超声处理0.5h，放冷至室温，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，得续滤液，精密吸取续滤液10m1，置25ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得；
(3)色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以含0.01％甲酸的乙腈溶液为流动相A，以含0.2％甲酸水溶液为流动相B，梯度洗脱：0-5min，15％A；5-15min，85％A；15-20min，15％A；检测波长为315nm；柱温30℃；流速1.0mL·min-1；进样量10uL；理论板数按黄芩苷和绿原酸峰计算应不低于3000；
(4)测定法：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，测定，即得。
7.根据权利要求6所述的银黄药物组合物的检测方法，其特征在于，步骤(1)和(2)所述甲醇的浓度为：50-70％甲醇溶液。
8.根据权利要求7所述的银黄药物组合物的检测方法，其特征在于，步骤(1)和(2)所述甲醇的浓度为：60％甲醇溶液。
9.根据权利要求6所述的银黄药物组合物的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述超声处理的条件为：功率300-400W，频率30-50kHz。
10.根据权利要求9所述的银黄药物组合物的检测方法，其特征在于，步骤(2)所述超声处理的条件为：功率350W，频率40kHz。
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