CN114778710A - 一种连翘败毒片的hplc特征图谱构建方法以及监控连翘败毒片质量的方法 - Google Patents

一种连翘败毒片的hplc特征图谱构建方法以及监控连翘败毒片质量的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种连翘败毒片的HPLC特征图谱构建方法，包括以下步骤：A)以连翘败毒片的甲醇水溶液作为供试品溶液，以栀子苷的甲醇溶液作为参照物溶液；B)分别吸取参照物溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪，进行高效液相色谱检测，得到连翘败毒片特征图谱。本发明提供的连翘败毒片的HPLC特征图谱构建方法可全面反应药材及中间体到成品的过程控制，且通过特征图谱的构建，生成的对照图谱，可标定多个特征峰，方法快捷、简便、结果重现性、稳定性良好。不仅可定性鉴别，还可以通过相似度评价，对多批次样品进行比较分析，保持样品批与批之间的一致性。

Description

一种连翘败毒片的HPLC特征图谱构建方法以及监控连翘败毒 片质量的方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种连翘败毒片的HPLC特征图谱构建方法以及监控连翘败毒片质量的方法。
背景技术
连翘败毒片其组方组成金银花、连翘、大黄、紫花地丁、蒲公英、栀子、白芷、黄芩、赤芍、浙贝母等。其质量标准收载于WS3-B-3600-98-2011中，包含显微鉴别、白芷薄层鉴别、浙贝母薄层鉴别、大黄薄层鉴别、黄芩薄层鉴别、防风薄层鉴别、栀子薄层鉴别、赤芍薄层鉴别、连翘薄层鉴别；大黄素、大黄酚薄层扫描含量测定。但上述方法专属性及重现性差，且检测设备的灵敏度低，操作繁琐。
发明内容
有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种连翘败毒片的HPLC特征图谱构建方法以及监控连翘败毒片质量的方法，本发明提供的方法快捷、简便、结果重现性、稳定性良好。
本发明提供了一种连翘败毒片的HPLC特征图谱构建方法，包括以下步骤：
A)以连翘败毒片的甲醇水溶液作为供试品溶液，以栀子苷的甲醇溶液作为参照物溶液；
B)分别吸取参照物溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪，进行高效液相色谱检测，得到连翘败毒片特征图谱。
优选的，所述供试品溶液按照如下方法进行制备：
取连翘败毒片，加入甲醇水溶液后，进行超声处理，冷却后，用甲醇水溶液补足减失的重量，过滤，取续滤液，得到连翘败毒片的甲醇水溶液。
优选的，所述供试品溶液的浓度为25～95μg/ml。
优选的，所述高效液相色谱测定中，参照物溶液和供试品溶液的上样量为5～15μl。
优选的，所述高效液相色谱测定的色谱条件为：
以C18柱为色谱柱；紫外检测波长为220～260nm；柱温为30～40℃；
以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱，流速为1.0ml/min；
流动相A、B的比例变化为：
0～20min，A相：5～24％、B相：95～76％；
20～45min，A相24～38％、B相：76～62％；
45～95min，A相：38～86％、B相：62～14％。
本发明还提供了一种监控连翘败毒片质量的方法，包括以下步骤：
a)按照权利要求1所述的连翘败毒片HPLC特征图谱构建方法构建n批连翘败毒片的HPLC特征图谱，n≥10；
采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件生成由12个共有峰构成的连翘败毒片HPLC对照特征图谱，所述共有峰中峰1归属为玄参药材，峰2归属为连翘药材、峰3(S)为栀子苷，峰4归属为防风药材，峰5归属为芍药苷，峰6归属为防风药材，峰7归属为黄芩苷，峰8归属为连翘苷，峰9归属为黄芩药材，峰10归属为天花粉药材，峰11归属为大黄素，峰12归属为大黄酚峰；
在对照特征图谱中，以栀子苷为参照峰S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在第一规定值的±2％之内，所述第一规定值分别为：0.84-峰1、0.91-峰2、1.00-峰S、1.11-峰4、1.18-峰5、1.54-峰6、2.11-峰7、2.21-峰8、2.67-峰9、3.08-峰10、4.30-峰11、4.93-峰12；
b)取待测连翘败毒片，按权利要求1的方法操作，得到连翘败毒片待测样品特征图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件对样品图谱与对照特征图谱进行分析，相似度大于0.90为合格产品。
与现有技术相比，本发明提供了一种连翘败毒片的HPLC特征图谱构建方法，包括以下步骤：A)以连翘败毒片的甲醇水溶液作为供试品溶液，以栀子苷的甲醇溶液作为参照物溶液；B)分别吸取参照物溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪，进行高效液相色谱检测，得到连翘败毒片特征图谱。本发明提供的连翘败毒片的HPLC特征图谱构建方法可全面反应药材及中间体到成品的过程控制，且通过特征图谱的构建，生成的对照图谱，可标定多个特征峰，方法快捷、简便、结果重现性、稳定性良好。不仅可定性鉴别，还可以通过相似度评价，对多批次样品进行比较分析，保持样品批与批之间的一致性。
附图说明
图1为连翘败毒片HPLC特征图谱；
图2为连翘败毒片HPLC对照特征图谱；
图3为连翘败毒片HPLC特征图谱叠加图；
图4为连翘败毒片3D扫描图；
图5为流动相选择1色谱图(230nm)；
图6为流动相选择2色谱图(230nm)；
图7-1为流动相梯度选择1色谱图；
图7-2为流动相梯度选择2色谱图；
图7-3为流动相梯度选择3色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种连翘败毒片的HPLC特征图谱构建方法，包括以下步骤：
A)以连翘败毒片的甲醇水溶液作为供试品溶液，以栀子苷的甲醇溶液作为参照物溶液；
B)分别吸取参照物溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪，进行高效液相色谱检测，得到连翘败毒片特征图谱。
本发明首先制备供试品溶液和参照物溶液。
其中，所述供试品溶液按照如下方法进行制备：
取连翘败毒片，加入甲醇水溶液后，进行超声处理，冷却后，用甲醇水溶液补足减失的重量，过滤，取续滤液，得到连翘败毒片的甲醇水溶液。
其中，在所述连翘败毒片的甲醇水溶液中，连翘败毒片的浓度为0.02g/ml～0.04g/ml。
所述甲醇水溶液浓度为50％～70％，优选为50％、70％，或50％～70％之间的任意值
本发明对所述超声处理的时间并没有特殊限制，能够实现样品在溶液中充分溶解即可。在本发明中，所述超声处理的时间优选为20～40min，进一步优选为25～35min。
所述参照物溶液按照如下方法进行制备：
取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含连栀子苷25～95μg。
得到供试品溶液和参照物溶液后，分别吸取参照物溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪，进行高效液相色谱检测，得到连翘败毒片特征图谱。
所述高效液相色谱测定中，参照物溶液和供试品溶液的上样量为5～15μl，优选为5、10、15，或5～15μl之间的任意值。
在本发明中，所述高效液相色谱测定的色谱条件为：
以C18柱为色谱柱；紫外检测波长为220～260nm；柱温为30～40℃；
以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱，流速为1.0ml/min；
流动相A、B的比例变化为：
0～20min，A相：5～24％、B相：95～76％；
20～45min，A相24～38％、B相：76～62％；
45～95min，A相：38～86％、B相：62～14％。
在本发明的一些具体实施方式中，所述连翘败毒片HPLC特征图谱的构建方法如下：
(1)供试品溶液的制备：取连翘败毒片约1g，精密称定，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，用70％甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得；
(2)参照物溶液的制备：取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含连栀子苷25～95μg。
(3)测定：精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，即得连翘败毒片特征图谱。
其中，高效液相色谱测定的色谱条件为：以C18柱为色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱，紫外检测波长为230nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃。
优选地，梯度洗脱过程中，流动相A、B的比例变化为：0～20min，A相：5～24％、B相：95～76％；20～45min，A相24～38％、B相：76～62％；45～95min，A相：38～86％、B相：62～14％。
本发明还提供了一种监控连翘败毒片质量的方法，包括以下步骤：
a)按照权利要求1所述的连翘败毒片HPLC特征图谱构建方法构建n批连翘败毒片的HPLC特征图谱，n≥10；
采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件生成由12个共有峰构成的连翘败毒片HPLC对照特征图谱，所述共有峰中峰1归属为玄参药材，峰2归属为连翘药材、峰3(S)为栀子苷，峰4归属为防风药材，峰5为芍药苷，峰6归属为防风药材，峰7为黄芩苷，峰8为连翘苷，峰9归属为黄芩药材，峰10归属为天花粉药材，峰11为大黄素，峰12为大黄酚峰；
在对照特征图谱中，以栀子苷为参照峰S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在第一规定值的±2％之内，所述第一规定值分别为：0.84-峰1、0.91-峰2、1.00-峰S、1.11-峰4、1.18-峰5、1.54-峰6、2.11-峰7、2.21-峰8、2.67-峰9、3.08-峰10、4.30-峰11、4.93-峰12；
b)取待测连翘败毒片，按权利要求1的方法操作，得到连翘败毒片待测样品特征图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件对样品图谱与对照特征图谱进行分析，相似度大于0.90为合格产品。
本发明的有益效果如下：
(1)用本发明所提供的方法能有效的监控不同批次连翘败毒片的质量，使其质量稳定，方法具有精密度高、重现性好等特点，有利于全面监控产品的质量。
(2)本发明建立的连翘败毒片特征图谱以栀子苷为参照物，归属了各特征峰与药材及中间产品的相关性，并明确了主要特征峰的成分。能全面评价产品的整体质量面貌特征，方法科学可靠。
(3)采用本发明中方法用DAD检测器对连翘败毒片进行测定，根据等值吸收图中所有色谱峰出现最大吸收的检测波长结果分别调取各波长下色谱图，当检测波长为230nm时，特征峰数目较多，峰面积适中，且各特征峰之间分离效果也最好。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的连翘败毒片的HPLC特征图谱构建方法以及监控连翘败毒片质量的方法进行说明，本发明的保护范围不受以下实施例的限制。
实施例1：一种连翘败毒片HPLC特征图谱的构建方法
仪器：UltiMate 3000高效液相色谱仪，紫外DAD检测器；Mettler AE240十万分之一分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；AB204-E电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)等。
试剂：甲醇等为分析纯，磷酸、乙腈为色谱纯，水为超纯水。
试药：连翘苷、芍药苷、栀子苷、黄芩苷、大黄素、大黄酚(均来自中国食品药品检定研究院)。
方法与结果
(1)供试品溶液的制备：取连翘败毒片内容物1g，精密称定，精密加入70％甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，用70％甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得；
(2)参照物溶液的制备：取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含连栀子苷25μg。
(3)测定：以C18柱为色谱柱；紫外检测波长为230nm；流速为0.8ml/min；柱温为30℃。以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱，梯度洗脱的时间及流动相比例如表1所示：
表1连翘败毒片特征图谱流动相时间及梯度
Figure BDA0003512810840000061
精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到连翘败毒片的HPLC特征图谱。
实施例2：一种连翘败毒片HPLC特征图谱的构建方法
仪器：UltiMate 3000高效液相色谱仪，紫外DAD检测器；Mettler AE240十万分之一分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；AB204-E电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)等。
试剂：甲醇等为分析纯，磷酸、乙腈为色谱纯，水为超纯水。
试药：连翘苷、芍药苷、栀子苷、黄芩苷、大黄素、大黄酚(均来自中国食品药品检定研究院)。
方法与结果
(1)供试品溶液的制备：取连翘败毒片约2g，精密称定，精密加入50％甲醇25ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，用50％甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得；
(2)参照物溶液的制备：取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含连栀子苷50μg。
(3)测定：以C18柱为色谱柱；紫外检测波长为230nm；流速为1.0ml/min；柱温为30℃。以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱，梯度洗脱的时间及流动相比例如表2所示：
表2连翘败毒片特征图谱流动相时间及梯度
Figure BDA0003512810840000071
精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到连翘败毒片的HPLC特征图谱，如图1所示。
实施例3：一种连翘败毒片HPLC特征图谱的构建方法
仪器：UltiMate 3000高效液相色谱仪，紫外DAD检测器；Mettler AE240十万分之一分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；AB204-E电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)等。
试剂：甲醇等为分析纯，磷酸、乙腈为色谱纯，水为超纯水。
试药：连翘苷、芍药苷、栀子苷、黄芩苷、大黄素、大黄酚(均来自中国食品药品检定研究院)。
方法与结果
(1)供试品溶液的制备：取连翘败毒片内容物约3g，精密称定，精密加入70％甲醇50ml，称定重量，超声处理40分钟，放冷，用70％甲醇补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得；
(2)参照物溶液的制备：取栀子苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含连栀子苷95μg。
(3)测定：以C18柱为色谱柱；紫外检测波长为258nm；流速为1.0ml/min；柱温为40℃。以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱，梯度洗脱的时间及流动相比例如表3所示：
表3连翘败毒片特征图谱流动相时间及梯度
Figure BDA0003512810840000081
精密吸取参照物溶液和供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，得到连翘败毒片的HPLC特征图谱。
实施例4：连翘败毒片特征图谱测定方法学考察
精密度试验：取连翘败毒片，按实施例1供试品溶液制备方法制成供试品溶液，连续进样6次，依法检测。结果：6次测定特征图谱中各共有峰的相对保留时间RSD值均﹤1％，表明仪器精密度良好。
稳定性试验：取连翘败毒片，按实施例1供试品溶液制备方法制成供试品溶液，分别在0、4、10、16、20、24小时依法进行检测。结果：6次测定特征图谱中各共有峰的相对保留时间RSD值均﹤1％，表明供试品溶液在24小时之内稳定。
重复性试验：取同一批连翘败毒片，按实施例1供试品溶液制备方法制成制备6份供试品溶液，依法测定。结果：6次测定特征图谱中各共有峰的相对保留时间RSD值均﹤1％，表明方法的重复性较好。
实施例5：构建连翘败毒片的对照特征图谱
取连翘败毒片10批(批号分别为180601、180602、180603、180701、180702、180703、180712、200601、200602、200603)，按实施例2的条件进行测定，得到10批次样品HPLC特征图谱，参见图3，图3为10批连翘败毒片HPLC特征图谱叠加图，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件对10批特征图谱进行比较，确定共有特征峰，生成由12个共有峰构成的对照特征图谱，如图2所示。其中参照峰为栀子苷峰(3号峰)。
所述共有峰中峰1归属为玄参药材，峰2归属为连翘药材、峰3(S)为栀子苷，峰4归属为防风药材，峰5归属为芍药苷，峰6归属为防风药材，峰7归属为黄芩苷，峰8归属为连翘苷，峰9归属为黄芩药材，峰10归属为天花粉药材，峰11归属为大黄素，峰12归属为大黄酚峰；
相似度分析:计算10批供试品特征图谱与生成的对照特征图谱的相似度，结果均大于0.90。相似度比较结果如表4所示。
表4连翘败毒片HPLC特征图谱相似度评价结果
Figure BDA0003512810840000091
对比例：连翘败毒片特征图谱色谱条件及供试品溶液制备方法选择
仪器：UltiMate 3000高效液相色谱仪，紫外DAD检测器；Mettler AE240十万分之一分析天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)；AB204-E电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)等。
试剂：甲醇等为分析纯，磷酸、乙腈、甲醇为色谱纯，水为超纯水。
方法与结果
(1)采用DAD检测器，200-400nm全波长扫描，结果表明紫外检测波长为220～260nm处色谱峰较多，且在230nm处色谱峰数量较多、峰高吸收值适中。见图4所示。
(2)流动相的选择：分别采用①乙腈-水、②甲醇-水、③乙腈-0.1％磷酸溶液作为流动相,洗脱过程中流动相A、B的比例变化分别为：0～100min，A相：5～100％、B相：95～0％,进行测定。结果，以乙腈-0.1％磷酸溶液为流动相时，色谱图中各色谱峰分离度、不对称度均较好，基线平稳，如图5、图6和图7-1所示。
(3)流动相比例选择：为达到最佳分离效果，以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，对不同流动相比例进行考察，洗脱过程中流动相A、B的比例变化分别为：①0～100min，A相：5～100％、B相：95～0％；②0～20min，A相：5～24％、B相：95～76％；20～45min，A相：24～38％、B相：76～62％；45～95min，A相：38～86％、B相：62～14％；③0～85min，A相：5～86％、B相：95～14％；结果，采用乙腈-0.1％磷酸溶液为流动相，按比例②进行梯度洗脱所得色谱图中各色谱峰分离度优于①，如图7-1、7-2、7-3所示。
(4)供试品提取溶剂的选择：取连翘败毒片样品，分别以甲醇、50％甲醇、70％甲醇为提取溶剂，考察3种不同溶剂对提取结果的影响。结果，以50％、70％甲醇为溶剂时，各色谱峰分离效果较好。
(5)供试品提取溶剂加入量选择：取连翘败毒片样品，分别加入70％甲醇25ml、50ml，考察不同溶剂量对提取结果的影响。结果，溶剂量为25ml和50ml提取供试品中色谱峰数目及分离效果无差异，故确定最优溶剂加入量为25ml。
(6)供试品提取时间考察：取连翘败毒片样品，分别超声处理20、30、40分钟，考察不同提取时间对提取结果的影响。结果，超声处理20、30、40分钟的供试品色谱图中，峰数目和分离效果无差异，超声处理30和40分钟提取效率无明显差异但色谱峰大小均高于超声处理20分钟，故确定最优超声时间为30分钟。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种连翘败毒片的HPLC特征图谱构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
A)以连翘败毒片的甲醇水溶液作为供试品溶液，以栀子苷的甲醇溶液作为参照物溶液；
B)分别吸取参照物溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪，进行高效液相色谱检测，得到连翘败毒片特征图谱。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液按照如下方法进行制备：
取连翘败毒片，加入甲醇水溶液后，进行超声处理，冷却后，用甲醇水溶液补足减失的重量，过滤，取续滤液，得到连翘败毒片的甲醇水溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述供试品溶液的浓度为25～95μg/ml。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱测定中，参照物溶液和供试品溶液的上样量为5～15μl。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱测定的色谱条件为：
以C18柱为色谱柱；紫外检测波长为220～260nm；柱温为30～40℃；
以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，梯度洗脱，流速为1.0ml/min；
流动相A、B的比例变化为：
0～20min，A相：5～24％、B相：95～76％；
20～45min，A相24～38％、B相：76～62％；
45～95min，A相：38～86％、B相：62～14％。
6.一种监控连翘败毒片质量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a)按照权利要求1所述的连翘败毒片HPLC特征图谱构建方法构建n批连翘败毒片的HPLC特征图谱，n≥10；
采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件生成由12个共有峰构成的连翘败毒片HPLC对照特征图谱，所述共有峰中峰1玄参药材，峰2连翘药材、峰3(S)为栀子苷，峰4防风药材，峰5为芍药苷，峰6防风药材，峰7为黄芩苷，峰8为连翘苷，峰9黄芩药材，峰10天花粉药材，峰11为大黄素，峰12为大黄酚峰；
在对照特征图谱中，以栀子苷为参照峰S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在第一规定值的±2％之内，所述第一规定值分别为：0.84-峰1、0.91-峰2、1.00-峰S、1.11-峰4、1.18-峰5、1.54-峰6、2.11-峰7、2.21-峰8、2.67-峰9、3.08-峰10、4.30-峰11、4.93-峰12；
b)取待测连翘败毒片，按权利要求1的方法操作，得到连翘败毒片待测样品特征图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价软件对样品图谱与对照特征图谱进行分析，相似度大于0.90为合格产品。
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