CN118243840A - 一种十五味萝蒂明目片特征图谱的构建方法及其应用 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明属于中药分析技术领域，具体涉及一种十五味萝蒂明目片特征图谱的构建方法及其应用。本发明提供的特征图谱的构建方法主要包括以下过程：(1)供试品溶液的制备；(2)参照物溶液的制备；(3)利用高效液相色谱法构建色谱图。最终构建的色谱图中，供试品色谱中应呈现10个特征峰，以峰4作为S1峰，以峰9作为S2峰，计算峰1、峰2、峰3、峰5与S1峰的相对保留时间，计算峰6、峰7、峰8、峰10与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间均在规定值的±10％范围之内。因此，本发明构建的图谱操作简单，重复性好，稳定性好，精密度高，专属性好，可用于检测和评价十五味萝蒂明目片的药品质量，保证药品的安全性和有效性。
Description
技术领域
本发明属于中药分析技术领域，具体涉及一种十五味萝蒂明目片特征图谱的构建方法及其应用。
背景技术
十五味萝蒂明目片处方中含有萝蒂、寒水石(奶制)、藏茴香、石灰华、甘草、红花、渣驯膏、丁香、金钱白花蛇、绿绒蒿、铁屑(诃子制)、诃子、余甘子(去核)、代赭石、毛诃子十五味药材。通过文献、资料、2020版药典等，对几味药材及制剂进行查询，得知十五味萝蒂明目片处方中虽有15味药，但4味为矿物药(寒水石、石灰华、铁屑、代赭石)，2味药为动物药(金钱白花蛇、渣驯膏)。其余9味药材主含成分分别为：萝蒂主含山柰素、槲皮素，藏茴香主含葛缕酮；甘草主含甘草苷、甘草酸、甘草酸铵；红花主含羟基红花黄色素A、山柰素、槲皮素、没食子酸、原儿茶酸；丁香主含丁香酚；绿绒蒿主含槲皮素、木犀草素、原儿茶酸；诃子、余甘子、毛诃子主含没食子酸、鞣花酸、柯里拉京、诃子酸、诃子次酸、诃黎勒酸等成分。
根据现行《已上市中药药学变更研究技术指导原则》的相关技术要求，十五味萝蒂明目片的研究内容一般包括但不限于出膏率(干膏率)、浸出物、指纹图谱(特征图谱)以及多种成份含量的比较。变更前后质量对比研究资料，口服固体制剂尤其应关注对药物的溶化性、溶散时限或崩解时限的影响。
因此，建立一种可以精确监测十五味萝蒂明目片质量的方法，对于药物效果至关重要，这也成为近年来的研究热点。
发明内容
本发明成功建立了一种十五味萝蒂明目片特征图谱的构建方法及其应用，可用于检测和评价十五味萝蒂明目片的药品质量，保证药品的安全性和有效性。
本发明采用的技术方案具体如下：
一种十五味萝蒂明目片特征图谱的构建方法，包括如下步骤：
S1、供试品溶液的制备：取十五味萝蒂明目片0.45～0.55g，研细，精密称定，精密加入70％甲醇，密塞，称定重量，回流提取，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
S2、参照物溶液的制备：分别取柯里拉京、丁香酚，精密称定，置于容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，即得；
S3、高效液相色谱测定：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱仪，测定，得到具有特征峰的特征图谱。
优选地，步骤S3所述高效液相色谱仪测定条件包括：以Waters CORTECS UPLC T3色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B进行洗脱；柱温：28～32℃；进样体积：0.8～1μL；流速：0.18～0.22mL/min，检测波长为237nm。
优选地，步骤S3所述的洗脱程序具体如下表1所示。
表1洗脱梯度表
| 时间(min) | A(％) | B(％) |
| 0→8 | 2→8 | 98→92 |
| 8→20 | 8→10 | 92→90 |
| 20→28 | 10→13 | 90→87 |
| 28→36 | 13→17 | 87→83 |
| 36→44 | 17→19 | 83→81 |
| 44→52 | 19→33 | 81→67 |
| 52→64 | 33→45 | 67→55 |
| 64→72 | 45→52 | 55→48 |
| 72→76 | 52→100 | 48→0 |
| 76→81 | 100→100 | 0→0 |
| 81→83 | 100→2 | 0→98 |
| 83→88 | 2→2 | 98→98 |
优选地，步骤S3最终得到的特征图谱中共包含10个特征峰。
优选地，获得的10个特征峰中，峰1为没食子酸，峰4为柯里拉京，峰6为诃黎勒酸，峰7为鞣花酸，峰8为诃子酸，峰9为丁香酚，峰10为甘草酸铵。
优选地，所述十五味萝蒂明目片的高效液相色谱图中各共有峰的相对保留时间变化范围为±10％。
优选地，所述十五味萝蒂明目片的高效液相色谱图中，以柯里拉京为S1峰，以丁香酚为S2峰，算峰1、峰2、峰3、峰5与S1峰的相对保留时间，计算峰6、峰7、峰8、峰10与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。
优选地，所述规定值分别为：峰1-0.182，峰2-0.542，峰3-0.674，峰5-1.128，峰6-0.643，峰7-0.658，峰8-0.756，丁香酚峰10-1.082。
本发明还提供了一种所述的十五味萝蒂明目片特征图谱的构建方法在评价十五味萝蒂明目片的药品质量方面的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下优势：本发明提供的特征图谱构建方法，可以全面、准确、客观地评价十五味萝蒂明目片的质量，具有重复性好，稳定性好，精密度高，专属性高等优点，可以有效保证药品质量，为药物安全提供重要保障。
附图说明
图1为以210nm为检测波长制得的十五味萝蒂明目片特征图谱；
图2为以237nm为检测波长制得的十五味萝蒂明目片特征图谱；
图3为以250nm为检测波长制得的十五味萝蒂明目片特征图谱；
图4为以273nm为检测波长制得的十五味萝蒂明目片特征图谱；
图5为以310nm为检测波长制得的十五味萝蒂明目片特征图谱；
图6为以350nm为检测波长制得的十五味萝蒂明目片特征图谱；
图7为以403nm为检测波长制得的十五味萝蒂明目片特征图谱；
图8为以乙腈-水为流动相制得的十五味萝蒂明目片特征图谱；
图9为以乙腈-0.4％磷酸为流动相制得的十五味萝蒂明目片特征图谱；
图10为以乙腈-0.2％磷酸为流动相制得的十五味萝蒂明目片特征图谱；
图11为以乙腈-0.1％磷酸为流动相制得的十五味萝蒂明目片特征图谱；
图12为以乙腈-0.05％磷酸为流动相制得的十五味萝蒂明目片特征图谱；
图13为2g供试品得到的十五味萝蒂明目片特征图谱；
图14为1.5g供试品得到的十五味萝蒂明目片特征图谱；
图15为1g供试品得到的十五味萝蒂明目片特征图谱；
图16为0.5g供试品得到的十五味萝蒂明目片特征图谱；
图17为以甲醇为提取溶剂制得的十五味萝蒂明目片特征图谱；
图18为以70％甲醇为提取溶剂制得的十五味萝蒂明目片特征图谱；
图19为以50％甲醇为提取溶剂制得的十五味萝蒂明目片特征图谱；
图20为以乙醇为提取溶剂制得的十五味萝蒂明目片特征图谱；
图21为以70％乙醇为提取溶剂制得的十五味萝蒂明目片特征图谱；
图22为以50％乙醇为提取溶剂制得的十五味萝蒂明目片特征图谱；
图23为10批十五味萝蒂明目片特征图谱叠加图；
图24为十五味萝蒂明目片特征图谱；
图25为参照物空白溶液的特征图谱；
图26为参照物没食子酸溶液的特征图谱；
图27为参照物柯里拉京溶液的特征图谱；
图28为参照物诃黎勒酸溶液的特征图谱；
图29为参照物鞣花酸溶液的特征图谱；
图30为参照物诃子酸溶液的特征图谱；
图31为参照物丁香酚溶液的特征图谱；
图32为参照物甘草酸铵溶液的特征图谱；
图33为空白溶液专属性试验的特征图谱；
图34为鞣花酸溶液专属性试验的特征图谱；
图35为诃子酸溶液专属性试验的特征图谱；
图36为供试品溶液专属性试验的特征图谱；
图37为十五味萝蒂明目片特征图谱整体性考察结果；
图38为人员1制得的十五味萝蒂明目片特征图谱中间精密度；
图39为人员2制得的十五味萝蒂明目片特征图谱中间精密度；
图40为以28℃为柱温制得的十五味萝蒂明目片特征图谱；
图41为以30℃为柱温制得的十五味萝蒂明目片特征图谱；
图42为以32℃为柱温制得的十五味萝蒂明目片特征图谱；
图43为以0.19mL/min为流速制得的十五味萝蒂明目片特征图谱；
图44为以0.20mL/min为流速制得的十五味萝蒂明目片特征图谱；
图45为以0.21mL/min为流速制得的十五味萝蒂明目片特征图谱；
图46为YF-SZ-025-01色谱柱制得的特征图谱；
图47为YF-SZ-022色谱柱制得的特征图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。本实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域常规技术方法和仪器说明书内容进行操作；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。无特殊说明，下面取样约0.5g，取样范围需在0.45～0.55g内，误差不能太大。
所述高效液相色谱仪(型号：G18QSM448A)、所述色谱柱Waters CORTECS UPLC T3色谱柱(柱长150mm，内径为2.1mm，粒径为1.6μm)均可购自沃特世公司；所述十万分之一天平(MS105)、万分之一天平(ML204T/02)均可购自梅特勒-托利多公司；所述超声清洁器(JP-080ST)可购自深圳市洁盟清洗设备有限公司有限公司；所述数显恒温水浴锅(HH-6)可购自金坛区白塔新宝仪器厂；所述数显恒温水浴锅(HH-S11.4)可购自江苏金怡仪器科技有限公司。
所述磷酸(批号：20230626)、无水乙醇(20220105)均可购自天津市百世化工有限公司；所述色谱甲醇(L1191507204)、色谱乙腈(JA081930)均可购自默克股份两合有限公司；所述乙醇(20211201)可购自烟台市双双化工有限公司；所述纯净水(20211201H)可购自屈臣氏；所述十五味萝蒂明目片(190509、190510、190511、200413、200414、200415、210903、220508、220509、230505)由国药普兰特(青海)药业有限公司提供。
所述对照品的购买信息如下表2所示。
表2对照品信息汇总表
实施例1最佳吸收波长的确定
1.检测过程：分别以210nm、237nm、250nm、273nm、310nm、350nm、403nm为检测波长，进行色谱图比较，确定最佳吸收波长。具体过程如下：
S1、取十五味萝蒂明目片(220508)适量，研细，取约2.0g，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，称定重量，90℃回流处理30min，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.22μm的有机膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
S2、色谱条件：以Waters CORTECS UPLC T3为色谱柱(2.1mm×150mm，1.6μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B；柱温：30℃；进样体积：1μL；流速：0.20mL/min；按表1的规定进行梯度洗脱。
2.检测结果：具体检测结果如图1～图7所示，对比7种检测波长色谱图，选取237nm作为检测波长时，各特征峰响应值较大，峰信息较为完整，基线平稳，干扰较小。综上所述，选取237nm作为检测波长。
实施例2流动相的确定
1.检测过程：本次实验选取乙腈-水、乙腈-0.4％磷酸溶液、乙腈-0.2％磷酸溶液、乙腈-0.1％磷酸溶液、乙腈-0.05％磷酸溶液五种流动相进行比较，确定合适浓度的流动相。以237nm为检测波长，除选择的流动相不同外，其余检测过程同实施例1。
2.检测结果：具体检测结果如图8～图12所示。对比5种不同流动相的色谱图，选取0.4％的磷酸溶液作为水相时，峰的信息较完整，但其比0.1％的磷酸溶液作为水相时的分离度差；当0.2％的磷酸溶液作为水相时，峰信息完整，分离度优于0.4％的磷酸溶液作为水相；0.1％的磷酸溶液与0.2％的磷酸溶液作为水相时的整体效果相当；当0.05％的磷酸溶液作为水相时，峰信息完整，分离度较0.1％的磷酸溶液作为水相时差；纯化水作水相时，峰信息不完整且峰形较差。综上所述，结合色谱柱的保护，选取0.1％的磷酸溶液作为水相。
实施例3供试品用量确定
1.检测过程：本次实验考察了不同供试品用量对十五味萝蒂明目片特征图谱的影响，选取2.0g、1.5g、1.0g、0.5g作为供试品用量，通过暂时确定的色谱峰总峰面积/称样量及色谱图来比较不同供试品用量特征图谱结果。具体过程如下：
S1、取十五味萝蒂明目片(220508)适量，研细，取约2.0g、1.5g、1.0g、0.5g，平行4组，每组2份，精密称定，分别置于100mL具塞锥形瓶中，分别精密加入70％甲醇25mL，称定重量，回流处理30min，放冷，在称定重量，用70％甲醇溶剂补足减失的重量，摇匀，用0.22μm有机膜过滤，取续滤液作为供试液，即得；
S2、以237nm为检测波长，其余色谱条件参照实施例1的步骤S2，进行分析。
2.检测结果：具体检测结果如表3及图13～图16所示。
表3十五味萝蒂明目片特征图谱不同供试品用量考察结果表
通过对比4种供试品用量的特征图谱可发现，当供试品用量为0.5g时，总峰面积/称样量为最大，且其峰5的峰形优于供试品用量为2.0g、1.5g、1.0g时峰5的峰形。综上所述，采用0.5g为供试品用量时，可充分表现十五味萝蒂明目片特征图谱，因此选取0.5g为供试品用量。
实施例4提取溶剂的选择
1.检测过程：本次实验考察了不同提取溶剂对十五味萝蒂明目片特征图谱的影响，选取甲醇、70％甲醇、50％甲醇、乙醇、70％乙醇、50％乙醇作为提取溶剂，通过色谱峰总峰面积/称样量及色谱图来比较不同提取溶剂特征图谱结果。具体过程如下：
取十五味萝蒂明目片(220508)适量，研细，取约0.5g，平行6组，每组2份，精密称定，置100mL具塞锥形瓶中，分别精密加入甲醇、70％甲醇、50％甲醇、乙醇、70％乙醇、50％乙醇25mL，称定重量，回流处理30min，取出，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，用0.22μm有机膜过滤，取续滤液作为供试液，即得。以237nm为检测波长，按照实施例1步骤S2确定的色谱条件，进样，记录峰面积。
2.检测结果：具体结果见表4及图17～图22。
表4十五味萝蒂明目片特征图谱不同提取溶剂考察结果表
通过对比6种提取溶剂的特征图谱可发现，当溶剂为乙醇、甲醇、70％乙醇时色谱峰数目较少，色谱峰信息不完整；当溶剂为50％乙醇时，总峰面积/称样量为最大，但峰1均出现了色谱峰分叉的情况；当溶剂为70％甲醇、50％甲醇时，色谱峰数目均较丰富，各特征峰峰形较佳，但70％甲醇作为提取溶剂时，基线较平稳。综上所述，选取70％甲醇为供试品的提取溶剂。
试验例1共有峰的确定
1.试验过程：取10批十五味萝蒂明目片样品(190509、190510、190511、200413、200414、200415、210903、220508、220509、230505)，精密称取0.5g，按实施例1的方法制备供试品溶液，以237nm为检测波长，其余按实施例1的色谱条件，进样测定，使用《中药色谱指纹图谱相似度评价软件》对10批十五味萝蒂明目片进行共有峰标识。
2.试验结果：具体试验结果如图23所示。对10批十五味萝蒂明目片特征图谱进行分析，以相对保留时间进行定位，可确定的共有峰为：0.182(峰1)、0.542(峰2)、0.674(峰3)、柯里拉京(S1)、1.128(峰5)、0.643(峰6)、0.658(峰7)、0.756(峰8)、丁香酚(S2)、1.082(峰10)。
试验例2特征峰的指认
1.试验过程：具体过程如下：
S1、供试品溶液的制备：精密称取0.5g，参照实施例1的方法制备；
S2、参照物溶液的制备：没食子酸对照品溶液：精密称取没食子酸对照品0.00961g，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，即得；
柯里拉京对照品溶液：精密称定柯里拉京对照品0.00520g，置50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，即得；
诃黎勒酸对照品溶液：精密称取诃黎勒酸对照品0.00269g，置25mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，即得；
鞣花酸对照品溶液：精密称取鞣花酸对照品0.00506g置50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，即得；
诃子酸对照品溶液：精密称取诃子酸对照品0.00518g，置50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，即得；
丁香酚对照品溶液：精密称取丁香酚对照品0.15051g，置50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，即得；
甘草酸铵对照品溶液：精密称取甘草酸铵对照品0.01029g，置50mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，即得。
S3、测定方法：以237nm为检测波长，其余参照实施例1的色谱条件进行测定。2.试验结果：具体试验结果如图24～图32。供试品色谱中应呈现10个特征峰，峰1与没食子酸参照物相应的峰对应，峰4与柯里拉京参照物相应的峰对应，峰6与诃黎勒酸参照物相应的峰对应，峰7与鞣花酸参照物相应的峰相对应，峰8与诃子酸参照物相应的峰相对应，峰9与丁香酚参照物相应的峰相对应，峰10与甘草酸铵参照物相应的峰相对应。以峰4作为S1峰，以峰9作为S2峰，计算峰1、峰2、峰3、峰5与S1峰的相对保留时间，计算峰6、峰7、峰8、峰10与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.182(峰1)、0.542(峰2)、0.674(峰3)、柯里拉京(S1)、1.128(峰5)、0.643(峰6)、0.658(峰7)、0.756(峰8)、丁香酚(S2)、1.082(峰10)。
由此可知，在十五味萝蒂明目片特征图谱中能找到与没食子酸、柯里拉京、诃黎勒酸、鞣花酸、诃子酸、丁香酚、甘草酸铵保留时间一致的色谱峰，初步推断峰1为没食子酸、峰4为柯里拉京、峰6为诃黎勒酸、峰7为鞣花酸、峰8为诃子酸、峰9为丁香酚、峰10为甘草酸铵。
试验例3专属性考察
1.试验过程：取十五味萝蒂明目片(220508)适量，研细，取约0.5g，按实施例1的供试品制备方法制备供试品溶液，同时，按照试验例2所述方法制备鞣花酸溶液、诃子酸溶液作为参照物溶液，精密吸取供试品溶液，参照物溶液与空白溶液各1μL，注入液相色谱仪，以237nm为检测波长，其余色谱条件按照实施例1测定，记录色谱图。
2.试验结果：具体试验结果如图33～图36所示。供试品色谱在与对照品色谱相应的保留时间处有相同的色谱峰，不受提取溶剂的干扰，表明该方法专属性良好。
试验例4整体性考察
1.试验过程：精密吸取十五味萝蒂明目片试验例3制得的供试品溶液1μL，注入液相色谱仪，以237nm为检测波长，其余色谱条件按照实施例1测定，保持同一梯度，在梯度终点的流动相比例下延长洗脱时间，分析特征图谱。
2.试验结果：具体试验结果见图37。由此可知，该色谱条件延长洗脱时间后无明显色谱峰流出，表明该色谱条件基本满足信息量最大化的要求。
试验例5精密度考察
1.试验过程：精密吸取试验例3制得的十五味萝蒂明目片(220508)供试品溶液，以237nm为检测波长，按照实施例1确定的色谱条件重复进样6次，进样体积1μL。以峰4作为S1峰，以峰9作为S2峰，计算峰1、峰2、峰3、峰5与S1峰的相对保留时间，计算峰6、峰7、峰8、峰10与S2峰的相对保留时间；计算RSD值。
2.试验结果：具体试验结果如表5、表6所示。
表5十五味萝蒂明目片特征图谱精密度考察结果表(相对保留时间)
表6十五味萝蒂明目片特征图谱精密度考察结果表(相对峰面积)
由此可知，各特征峰相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于3％，该仪器精密度良好。
试验例6重复性考察
1.试验过程：取同一批十五味萝蒂明目片(210903)适量，研细，取约0.5g(±0.05g)，精密称定，平行6份，按实施例1的方法制备供试品溶液，以237nm为检测波长，按照实施例1确定的其他色谱条件，分别进样1μL。以峰4作为S1峰，以峰9作为S2峰，计算峰1、峰2、峰3、峰5与S1峰的相对保留时间，计算峰6、峰7、峰8、峰10与S2峰的相对保留时间；计算RSD值。
2.试验结果：具体试验结果如表7、表8。
表7十五味萝蒂明目片特征图谱重复性结果表(相对保留时间)
表8十五味萝蒂明目片特征图谱重复性结果表(相对峰面积)
由此可知，各特征峰相对保留时间RSD值均小于3％，各特征峰相对峰面积RSD值均小于3％，说明该方法重复性良好。
试验例7稳定性考察
1.试验过程：取十五味萝蒂明目片(220508)适量，研细，取约0.5g(±0.05g)，精密称定，按实施例1的制备方法制备供试品溶液，以237nm为检测波长，其他按实施例1确定的色谱条件，分别在1，3，6，9，12，25，48小时进样，进样体积1μL。以峰4作为S1峰，以峰9作为S2峰，计算峰1、峰2、峰3、峰5与S1峰的相对保留时间，计算峰6、峰7、峰8、峰10与S2峰的相对保留时间；计算RSD值。
2.试验结果：具体试验结果如表9、表10所示。
表9十五味萝蒂明目片特征图谱稳定性考察结果表(相对保留时间)
表10十五味萝蒂明目片特征图谱稳定性考察结果表(相对峰面积)
由此可知，25小时内各特征峰相对保留时间与相对峰面积的RSD值均小于3％；48小时内各特征峰相对保留时间RSD值在0～4.061％，相对峰面积的RSD值在0～5.067％，该供试品溶液在25小时内稳定。
试验例8中间精密度考察
1.试验过程：由不同的分析人员(即人员1、人员2)在不同时间于同一台仪器下操作，取同一批十五味萝蒂明目片(210903)适量，研细，取约0.5g(±0.05g)，精密称定，平行6份，按实施例1的制备方法制备供试品溶液，以237nm为检测波长，其他按实施例1确定的色谱条件，分别进样1μL。以峰4作为S1峰，以峰9作为S2峰，计算峰1、峰2、峰3、峰5与S1峰的相对保留时间，计算峰6、峰7、峰8、峰10与S2峰的相对保留时间；计算RSD值。
2.试验结果：具体试验结果如表11～12及图38～图39所示。
表11十五味萝蒂明目片中间精密度考察结果表(相对保留时间)
表12十五味萝蒂明目片中间精密度考察结果表(相对峰面积)
由此可知，不同分析人员在不同日期下操作，各特征峰相对保留时间RSD值小于3％，各特征峰相对峰面积RSD值小于5％，由于十五味萝蒂明目片成分复杂，在峰2、峰5、峰6、峰7旁均存在其他细小的特征峰，分离度易受保留时间波动的干扰，导致相对峰面积有波动，因此，本研究不建议规定十五味萝蒂明目片特征图谱的相对峰面积范围。
试验例9耐用性考察
9.1不同柱温的考察：比较不同柱温28℃、30℃、32℃对十五味萝蒂明目片特征图谱耐用性影响。具体试验过程如下：
取十五味萝蒂明目片(220508)适量，研细，取约0.5g(±0.05g)，精密称定，按实施例1的制备方法制备供试品溶液，以237nm为检测波长，除柱温分别更改为28℃、30℃、32℃外，其他色谱条件以实施例1为准，分别进样1μL。以峰4作为S1峰，以峰9作为S2峰，计算峰1、峰2、峰3、峰5与S1峰的相对保留时间，计算峰6、峰7、峰8、峰10与S2峰的相对保留时间；并计算RSD值。
试验结果：具体试验结果如表13～14及图40～图42所示。
表13十五味萝蒂明目片特征图谱柱温耐用性考察结果表(相对保留时间)
表14十五味萝蒂明目片特征图谱柱温耐用性考察结果表(相对峰面积)
| 柱温(℃) | 峰1 | 峰2 | 峰3 | 峰4(S1) | 峰5 | 峰6 | 峰7 | 峰8 | 峰9(S2) | 峰10 |
| 28℃ | 6.880 | 2.979 | 0.750 | 1.000 | 4.034 | 0.479 | 1.211 | 0.452 | 1.000 | 0.232 |
| 30℃ | 6.547 | 3.002 | 0.783 | 1.000 | 3.958 | 0.459 | 1.192 | 0.447 | 1.000 | 0.237 |
| 32℃ | 6.818 | 3.119 | 0.778 | 1.000 | 4.143 | 0.486 | 1.192 | 0.464 | 1.000 | 0.229 |
| RSD％ | 2.624 | 2.475 | 2.309 | 0.000 | 2.299 | 2.952 | 0.915 | 1.923 | 0.000 | 1.737 |
由此可知，不同柱温时，各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD<5％，结果表明该分析方法不同柱温耐用性较好。
9.2不同流速的考察：比较不同流速0.19mL/min、0.20mL/min和0.21mL/min对十五味萝蒂明目片特征图谱耐用性影响。具体试验过程如下：
取十五味萝蒂明目片(220508)适量，研细，取约0.5g，精密称定，按实施例1确定的制备方法制备供试品溶液，以237nm为检测波长，除流速分别更改为0.19mL/min、0.20mL/min和0.21mL/min外，其他色谱条件同实施例1，分别进样1μL。以峰4作为S1峰，以峰9作为S2峰，计算峰1、峰2、峰3、峰5与S1峰的相对保留时间，计算峰6、峰7、峰8、峰10与S2峰的相对保留时间；并计算RSD值。
试验结果：具体试验结如表15～16及图43～图45所示。
表15十五味萝蒂明目片特征图谱流速耐用性考察结果表(相对保留时间)
| 流速(mL/min) | 峰1 | 峰2 | 峰3 | 峰4(S1) | 峰5 | 峰6 | 峰7 | 峰8 | 峰9(S2) | 峰10 |
| 0.19 | 0.182 | 0.541 | 0.683 | 1.000 | 1.125 | 0.651 | 0.668 | 0.764 | 1.000 | 1.076 |
| 0.20 | 0.183 | 0.541 | 0.675 | 1.000 | 1.126 | 0.643 | 0.659 | 0.756 | 1.000 | 1.082 |
| 0.21 | 0.176 | 0.532 | 0.676 | 1.000 | 1.109 | 0.646 | 0.660 | 0.758 | 1.000 | 1.087 |
| RSD％ | 2.099 | 0.966 | 0.643 | 0.000 | 0.852 | 0.625 | 0.745 | 0.548 | 0.000 | 0.509 |
表16十五味萝蒂明目片特征图谱流速耐用性考察结果表(相对峰面积)
由此可知，在不同流速时，各特征峰相对保留时间和相对峰面积的RSD<3％，结果表明该分析方法不同流速耐用性较好，小的流速变动变动能满足系统适用性要求。
9.3不同批次色谱柱的考察：比较不同批次色谱柱：Waters CORTECS UPLC T3(150mm×2.1，1.6μm)(YF-SZ-025—01、YF-SZ-025-02)对十五味萝蒂明目片特征图谱耐用性的影响。具体试验过程如下：
取十五味萝蒂明目片(220508)适量，研细，取约0.5g，精密称定，按实施例1的制备方法制备供试品溶液，以237nm为检测波长，其他条件按实施例1确定的色谱条件，分别进样1μL。以峰4作为S1峰，以峰9作为S2峰，计算峰1、峰2、峰3、峰5与S1峰的相对保留时间，计算峰6、峰7、峰8、峰10与S2峰的相对保留时间，并计算RSD值。
试验结果：具体试验结果如表17～18及图46～图47。
表17十五味萝蒂明目片特征图谱色谱柱耐用性考察结果表(相对保留时间)
| 色谱柱编号 | 峰1 | 峰2 | 峰3 | 峰4(S1) | 峰5 | 峰6 | 峰7 | 峰8 | 峰9(S2) | 峰10 |
| YF-SZ-025-01 | 0.181 | 0.543 | 0.677 | 1.000 | 1.126 | 0.643 | 0.659 | 0.755 | 1.000 | 1.083 |
| YF-SZ-025-02 | 0.179 | 0.541 | 0.695 | 1.000 | 1.129 | 0.656 | 0.675 | 0.772 | 1.000 | 1.085 |
| RSD％ | 0.786 | 0.261 | 1.855 | 0.000 | 0.188 | 1.415 | 1.696 | 1.574 | 0.000 | 0.130 |
表18十五味萝蒂明目片特征图谱色谱柱耐用性考察结果表(相对峰面积)
| 色谱柱编号 | 峰1 | 峰2 | 峰3 | 峰4(S1) | 峰5 | 峰6 | 峰7 | 峰8 | 峰9(S2) | 峰10 |
| YF-SZ-025-01 | 6.846 | 3.138 | 0.831 | 1.000 | 4.000 | 0.431 | 1.119 | 0.434 | 1.000 | 0.230 |
| YF-SZ-025-02 | 6.593 | 3.031 | 0.797 | 1.000 | 4.131 | 0.447 | 1.165 | 0.415 | 1.000 | 0.239 |
| RSD％ | 2.662 | 2.453 | 2.954 | 0.000 | 2.278 | 2.577 | 2.848 | 3.165 | 0.000 | 2.714 |
由此可知，采用不同批次色谱柱，各特征峰相对保留时间RSD值小于3％，各特征峰相对峰面积RSD值小于5％，说明该方法不同批次色谱柱间的重现性良好。
综上所述，对十五味萝蒂明目片特征图谱分析方法进行了专属性和整体性考察，特征峰不受溶剂峰干扰，延长洗脱时间无明显色谱峰；进行了精密度、稳定性、重复性考察，各色谱峰相对保留时间的RSD<3％，供试品溶液在25小时内稳定；进行了中间精密度考察，不同分析人员在不同日期和不同色谱仪下操作，各色谱峰相对保留时间的RSD<3％；进行了耐用性考察，不同流速，小范围的柱温变动和不同批次色谱柱，对各色谱峰相对保留时间波动较小，能满足系统适用性要求。
最后，需要说明的是，上述实施例仅例示性说明本发明的原理、性能及功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (9)
1.一种十五味萝蒂明目片特征图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、供试品溶液的制备：取十五味萝蒂明目片0.45～0.55g，研细，精密称定，精密加入70％甲醇，密塞，称定重量，回流提取，取出，放冷，再称定重量，用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
S2、参照物溶液的制备：分别取柯里拉京、丁香酚，精密称定，置于容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，混匀，即得；
S3、高效液相色谱测定：分别精密吸取参照物溶液与供试品溶液，注入高效液相色谱仪，测定，得到具有特征峰的特征图谱。
2.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S3所述高效液相色谱仪测定条件包括：以Waters CORTECS UPLC T3色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B进行洗脱；柱温：28～32℃；进样体积：0.8～1μL；流速：0.18～0.22mL/min，检测波长为237nm。
3.如权利要求2所述的构建方法，其特征在于，步骤S3所述的洗脱程序具体如下表所示。
4.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤S3最终得到的特征图谱中共包含10个特征峰。
5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，获得的10个特征峰中，峰1为没食子酸，峰4为柯里拉京，峰6为诃黎勒酸，峰7为鞣花酸，峰8为诃子酸参，峰9为丁香酚，峰10为甘草酸铵。
6.如权利要求5所述的构建方法，其特征在于，所述十五味萝蒂明目片的高效液相色谱图中各共有峰的相对保留时间变化范围为±10％。
7.如权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述十五味萝蒂明目片的高效液相色谱图中，以柯里拉京为S1峰，以丁香酚为S2峰，算峰1、峰2、峰3、峰5与S1峰的相对保留时间，计算峰6、峰7、峰8、峰10与S2峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。
8.如权利要求7所述的构建方法，其特征在于，所述规定值分别为：峰1-0.182，峰2-0.542，峰3-0.674，峰5-1.128，峰6-0.643，峰7-0.658，峰8-0.756，丁香酚峰10-1.082。
9.一种如权利要求1-8任一项所述的十五味萝蒂明目片特征图谱的构建方法在评价十五味萝蒂明目片的药品质量方面的应用。
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