CN111398505A - 同时检测一种治疗小儿遗尿症中药的五种成分含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了同时检测一种治疗小儿遗尿症中药的五种成分含量的方法,所述治疗小儿遗尿症中药由麻黄、肉桂、益智、白果、菟丝子、鸡内金共六味中药材制成,所述五种成分为盐酸麻黄碱、桂皮醛、肉桂酸、槲皮素、银杏内脂C,所述检测方法包括将中药用提取溶剂提取,然后上高效液相色谱仪进行检测的步骤。本发明与现有技术相比具有检测灵敏度高,速度快,操作简单等优点,大幅提高了检测效率和检测准确率,能更加全面地控制中药内在质量。
Description
技术领域
本发明属于药物检测领域,涉及同时检测一种治疗小儿遗尿症中药的五种成分含量的方法。
背景技术
CN 1593496A公开了一种治疗小儿遗尿症的中药,它由麻黄、肉桂、益智、白果、菟丝子、鸡内金共六味中药材制成,具有温肾宣肺、运化脾胃、缩尿止遗的功效,主要用于治疗小儿遗尿肾气不足证。该中药是健民药业集团股份有限公司独家品种,商品名小儿益麻颗粒。
小儿益麻颗粒为小儿遗尿常用药品,临床疗效确切,市场需求量大,但其质量标准简单,仅对菟丝子、肉桂、益智、白果4味药材进行了薄层定性鉴别,另外还采用HPLC法对盐酸麻黄碱进行了含量测定。以上质量控制方法存在以下缺陷:(1)需要对产品分别进行提取和检测,导致检测周期长,需要大量人力物力和检测设备;(2)仅对盐酸麻黄碱进行了定量检测,其它成分均只能定性,无法全面控制产品内在质量,不能客观反映和评价中药质量的一致性。因此,迫切需要建立一种针对小儿益麻颗粒的新的质量控制方法,以建立可溯源的全程质量控制体系。
发明内容
本发明的目的是建立一种同时检测小儿益麻颗粒中五种成分含量的方法,旨在更高效、可靠地控制产品质量。
为实现上述目的,本发明采用如下技术手段:
同时检测一种治疗小儿遗尿症中药的五种成分含量的方法,所述治疗小儿遗尿症中药由麻黄、肉桂、益智、白果、菟丝子、鸡内金共六味中药材制成,所述五种成分为盐酸麻黄碱、桂皮醛、肉桂酸、槲皮素、银杏内脂C,所述检测方法包括将所述中药用提取溶剂提取,然后上高效液相色谱仪进行检测的步骤,所述高效液相色谱仪含有紫外检测器,所述紫外检测器的设定检测波长为205-230nm,所述高效液相色谱仪的固定相为氨基色谱柱,流动相A为含0.05-0.5%四氢呋喃的乙腈,流动相B为0.05-0.5%三乙胺溶液,梯度洗脱,流速为0.5-2ml/min,柱温为25~35℃。
优选地,所述提取溶剂为乙醇或甲醇或正丁醇。
进一步优选地,所述提取溶剂中还含有0.5-2%三乙胺。
优选地,所述检测波长为210nm。
优选地,所述流动相A为含0.1%四氢呋喃的乙腈。
优选地,所述流动相B为0.1%三乙胺溶液。
优选地,所述梯度洗脱的时间为70min,分为5个时间段,各时间段流动相A和B的体积变化见下表,
时间min | 流动相A(体积%) | 流动相B(体积%) |
0-20 | 20-30 | 80-70 |
20-30 | 30-40 | 70-60 |
30-40 | 40-50 | 60-50 |
40-60 | 50-60 | 50-40 |
60-70 | 60-70 | 40-30 |
优选地,所述流速为1ml/min。
本发明的有益效果是:
(1)本发明能通过一次样品制备和进样同时检测出小儿益麻颗粒中五种物质的含量,检测时间不超过2小时,与现有技术相比具有检测灵敏度高,速度快,操作简单等优点,大幅提高了检测效率,能更加全面地控制中药内在质量。
(2)本发明实现了小儿益麻颗粒中五种成分的定量检测,与现有的单一成分定量结合其它成分定性检测相比,本发明能更加全面地控制中药内在质量,更好地杜绝中药掺假、伪劣现象,更客观地反映中药质量的一致性,更有利于对中药生产的各个阶段包括药材投料等环节进行监控,从而建立可溯源的、与临床疗效高度关联的全程质量控制体系。
(3)本发明通过对HPLC的样品提取、固定相、流动相、检测波长、洗脱程序等条件进行大量筛选,不仅建立该方法,而且使待测成分的色谱峰分离度高、干扰少、出峰时间短、峰面积大,从而提高了检测结果的准确度和灵敏性。
附图说明
图1是五种混合对照品的HPLC图谱(1.盐酸麻黄碱;2.桂皮醛;3.肉桂酸;4.槲皮素;5.银杏内酯C)。
图2是小儿益麻颗粒的HPLC标准图谱。
图3是待测样品用含1%磷酸的甲醇提取后得到的HPLC图谱。
图4是待测样品用水饱和正丁醇提取后得到的HPLC图谱。
图5是以C18色谱柱为固定相得到的HPLC图谱。
图6是以乙腈-0.1%三乙胺为流动相得到的HPLC图谱。
图7是以含0.1%四氢呋喃的乙腈-水为流动相得到的HPLC图谱。
图8是乙腈-水为流动相得到的待测样品HPLC图谱。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行详细地说明。
以下实施例中所用到的小儿益麻颗粒由健民药业集团股份有限公司生产。
处方:益智600g、麻黄450g、肉桂150g、菟丝子1000g、白果1200g、鸡内金150g。
制法:以上六味,取益智、肉桂水蒸气蒸馏提取挥发油并用β-环糊精包合,蒸馏后的药渣与菟丝子、麻黄、白果、鸡内金混合加水煎煮二次,滤过,滤液浓缩至相对密度为1.35~1.38(50~60℃)的稠膏。将稠膏与挥发油β-环糊精包合物以及适量蔗糖粉、糊精、枸橼酸粉、阿斯巴甜、橙味香精混匀,制粒,干燥,制成1000g,即得。
试药:小儿益麻颗粒(批号:191001-191005,由健民药业集团股份有限公司提供);对照品盐酸麻黄碱(供含测用,批号:171241-201809)、桂皮醛(供含测用,批号:110710-201821)、肉桂酸(供含测用,批号:110786-201604)、槲皮素(供含测用,批号:100081-201610)、银杏内脂C(供含测用,批号:110864-201809)均购自中国食品药品检定研究院;乙腈为色谱纯,磷酸为分析纯,三乙胺为分析纯,甲醇为分析醇,水为超纯水。
实施例1供试品溶液的制备
在进行HPLC含量测定前,需要对待测药物进行提取,提取的目的一是减少制剂中的检测杂质,包括中药中与检测成分无关的提取成分,以及制剂中的辅料,从而尽可能地减少杂质对待测对象特征峰峰形的干扰,使特征峰具有更好的分离度;二是为了将待测成分尽可能充分地从药物中提取出来,从而提高特征峰的峰面积,保证检测的准确度。我们根据小儿益麻颗粒的处方和制剂特点,结合药物成分的溶解性、极性、稳定性,分别考察了四种提取溶剂对检测效果的影响。
供试品溶液制备方法:1.取装量差异项下的本品,混匀,研细,取1.0g,精密称定,精密加入含1%(体积)三乙胺的甲醇50ml,超声处理(功率250W,频率20kHz)40分钟,滤过,取续滤液,即得。
2.取装量差异项下的本品,混匀,研细,取1.0g,精密称定,精密加入含1%(体积)磷酸的甲醇50ml,超声处理(功率250W,频率20kHz)40分钟,滤过,取续滤液,即得。
3.取装量差异项下的本品,混匀,研细,取1.0g,精密称定,精密加入水饱和正丁醇50ml,超声处理(功率250W,频率20kHz)40分钟,滤过,取续滤液,即得。
仪器:Agilent 1100高效液相色谱仪,四元泵,在线真空脱气系统,自动进样器,柱温箱,紫外检测器;AB204-E电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)。
固定相:InertSustain NH2色谱柱(5μm,250×4.6mm)
流动相:含0.1%四氢呋喃的乙腈为流动相A;0.1%三乙胺为流动相B。
梯度洗脱条件:见表1。
柱温:30℃;检测波长:210nm;流速:0.9ml/min;进样量:10ul
结果:如图2、3、4所示,含1%三乙胺的甲醇提取所得供试品溶液能够较全面反映成品中的主要成分,且峰面积大,分离度较好(图2);图3中无肉桂酸吸收峰出现,且槲皮素、银杏内酯C的峰面积太小,无法实现5种成分的准确测定;图4中色谱峰面积略小于图2中色谱峰面积,最终确定以含1%三乙胺的甲醇作为最佳提取溶剂。图2-图4色谱峰的峰面积和峰分离度如下表2:
表2图2-图4色谱峰面积及峰分离度
实施例2色谱柱选择
(1)色谱柱为InertSustain NH2(5μm,250×4.6mm)
(2)色谱柱为Kromasil C18(5μm,250×4.6mm)
检测波长:210nm
其它条件与实施例1相同。
结果:由图2、5比较可看出,图5中,盐酸麻黄碱和肉桂酸明显未与相邻峰完全分开,且桂皮醛峰周围存在较多的杂质干扰。故选择氨基色谱柱为固定相,所得的液相色谱图基线较平稳、色谱峰峰形较对称、峰分离度较好。
实施例3流动相的选择
(1)A为含0.1%(体积)四氢呋喃的乙腈-B为0.1%(体积)三乙胺溶液
(2)A为乙腈-B为0.1%三乙胺溶液
(3)A为含0.1%四氢呋喃的乙腈-B为水
(4)A为乙腈-B为水
检测波长:210nm
其它条件与实施例1相同。
结果:由图2、6、7、8可看出,图6和图7无盐酸麻黄碱色谱峰,且图7流动相基线漂移;图8流动相基线漂移,且色谱峰检出成分少,故选择流动相0.1%四氢呋喃的乙腈-0.1%三乙胺溶液系统,所得液相色谱图基线较平稳、对照品色谱峰峰形较对称、峰面积大、峰分离度较好。
实施例4方法验证
1.五种物质的定位与系统适应性试验
仪器:Agilent 1100高效液相色谱仪,四元泵,在线真空脱气系统,自动进样器,柱温箱,紫外检测器;AB204-E电子天平(上海梅特勒-托利多仪器有限公司)。
固定相:InertSustain NH2色谱柱(5μm,250×4.6mm)
流动相:0.1%四氢呋喃的乙腈A-0.1%三乙胺溶液为流动相B
梯度洗脱条件:
柱温:30℃;检测波长:210nm;流速:0.9ml/min;进样量:10ul
混合对照品溶液的配制:精密称取盐酸麻黄碱、桂皮醛、肉桂酸、槲皮素、银杏内酯C的对照品适量,配成每1ml分别含盐酸麻黄碱、桂皮醛、肉桂酸、槲皮素、银杏内酯C10ug、30ug、10ug、15ug、20ug的混合对照品溶液。
测定结果见表3,混合对照品的HPLC图谱见图1。
表3五种物质的定位与系统适应性试验结果表
物质名称 | 对应的峰 | 保留时间 | 分离度 |
盐酸麻黄碱 | 1峰 | 26.708 | 9.77 |
桂皮醛 | 2峰 | 32.125 | 12.95 |
肉桂酸 | 3峰 | 38.783 | 6.56 |
槲皮素 | 4峰 | 51.125 | 19.54 |
银杏内酯C | 5峰 | 60.675 | 19.72 |
2.线性
精密称取盐酸麻黄碱1.25mg、桂皮醛3.75mg、肉桂酸1.25mg、槲皮素1.875mg、银杏内酯C2.5mg的对照品适量,置25ml量瓶中,加入1%三乙胺的甲醇使溶解并定容至刻度,摇匀得混合对照品母液。分别精密吸取上述对照品母液0.5,1,2,3,4,10ml,置10ml量瓶中,加溶剂稀释至刻度,摇匀,按上述色谱条件测定,以峰积分面积(Y:mAU*min)对进样量(X:ug)进行线性回归,在定量限浓度至不高于150%指标浓度的范围内取6个浓度点进行研究。线性关系以测得的响应信号(峰面积)对被分析物浓度的函数作图,用最小二乘法进行线性回归,由相关系数R2证实良好的线性关系,要求该线性回归系数R2的数值应不小于0.990,结果见表4。
表4五种物质的标准曲线、相关系数
有关物质 | 标准曲线 | 相关系数 |
盐酸麻黄碱 | Y=2.5011x+0.2335 | R<sup>2</sup>=0.9992 |
桂皮醛 | Y=5.6225x+2.2551 | R<sup>2</sup>=0.9993 |
肉桂酸 | Y=3.2058x-1.0087 | R<sup>2</sup>=0.9986 |
槲皮素 | Y=4.6989x+2.0233 | R<sup>2</sup>=0.9994 |
银杏内酯C | Y=5.0016x+0.0279 | R<sup>2</sup>=0.9991 |
3.重复性
配制6个相同浓度的样品(批号:191001),溶液并进行测试,每个溶液进样2针,要求6次含量测定结果的相对标准差应不大于2.0%,结果见表5。
表5五种物质含量测定的重复性试验结果
样品 | 盐酸麻黄碱 | 桂皮醛 | 肉桂酸 | 槲皮素 | 银杏内酯C |
RSD | 1.32% | 0.98% | 1.02% | 1.27% | 0.68% |
结果表明:各成分的RSD值在要求范围内,表明检测方法的重复性结果良好。
4.准确度
取已知含量的小儿益麻颗粒(191001批,已知量按重复性结果计算)0.5g,共五份,精密称定,分别置具塞锥形瓶中,精密加入对照品混合溶液(盐酸麻黄碱0.01mg/ml、桂皮醛0.03mg/ml、肉桂酸0.01mg/ml、槲皮素0.015mg/ml、银杏内酯C0.02mg/ml)各50ml,称定重量,加入含1%三乙胺的甲醇超声处理(功率250W,频率20kHz)20分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,即得准确度测定用样品溶液;按正文样品含量测定方法进行测定,计算准确度。结果表明:本方法的准确度较好,各成分的回收率在95.0%-105.0%之间,结果见表6。
表6五种物质的回收率测定结果
样品 | 盐酸麻黄碱 | 桂皮醛 | 肉桂酸 | 槲皮素 | 银杏内酯C |
平均回收率 | 98.38% | 99.14% | 97.69% | 98.65% | 98.87% |
结果表明:该方法测定各有关物质的准确度良好。
实施例5样品测定一
(1)供试品溶液制备:取装量差异项下的本品,混匀,研细,取1.0g,精密称定,精密加入含1%(体积)三乙胺的甲醇50ml,超声处理(功率250W,频率20kHz)40分钟,滤过,取续滤液,即得。
(2)对照品溶液的配制:分别精密称取盐酸麻黄碱、桂皮醛、肉桂酸、槲皮素、银杏内酯C的对照品适量,配成每1ml分别含盐酸麻黄碱、桂皮醛、肉桂酸、槲皮素、银杏内酯C10ug、30ug、10ug、15ug、20ug的混合对照品溶液。
(3)色谱条件与系统适应性:仪器:Agilent 1100高效液相色谱仪,四元泵,在线真空脱气系统,自动进样器,柱温箱,紫外检测器;
固定相:InertSustain NH2色谱柱(5μm,250×4.6mm)
流动相:0.1%四氢呋喃的乙腈A-0.1%三乙胺溶液为流动相B
梯度洗脱条件:
柱温:30℃;
检测波长:210nm;
流速:1ml/min;
进样量:10ul
(4)测定:分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl注入液相色谱仪,测定。
(5)计算公式:
C对为对照品溶液的浓度(mg/ml)
A对为对照品溶液的峰面积
A样为样品峰面积
W样为样品称样量(g)
(6)结果:所测得的各有关成分的含量见表7。
表7 5批样品中五种成分的含量
批次 | 盐酸麻黄碱 | 桂皮醛 | 肉桂酸 | 槲皮素 | 银杏内酯C |
191001 | 0.12% | 0.62% | 0.11% | 0.39% | 0.54% |
191002 | 0.13% | 0.66% | 0.12% | 0.38% | 0.56% |
191003 | 0.12% | 0.63% | 0.14% | 0.31% | 0.54% |
191004 | 0.14% | 0.64% | 0.13% | 0.34% | 0.46% |
191005 | 0.13% | 0.65% | 0.12% | 0.37% | 0.45% |
实施例6样品测定二
流动相:0.05%四氢呋喃的乙腈A-0.3%三乙胺溶液为流动相B
梯度洗脱条件:
柱温:35℃;
检测波长:230nm;
其它条件与实施例5相同。
结果见表8。
表8 5批样品中五种成分的含量
批次 | 盐酸麻黄碱 | 桂皮醛 | 肉桂酸 | 槲皮素 | 银杏内酯C |
191001 | 0.10% | 0.55% | 0.13% | 0.35% | 0.51% |
191002 | 0.11% | 0.58% | 0.15% | 0.33% | 0.52% |
191003 | 0.11% | 0.55% | 0.16% | 0.27% | 0.50% |
191004 | 0.13% | 0.57% | 0.16% | 0.31% | 0.43% |
191005 | 0.12% | 0.59% | 0.14% | 0.33% | 0.43% |
Claims (8)
1.同时检测一种治疗小儿遗尿症中药的五种成分含量的方法,所述治疗小儿遗尿症中药由麻黄、肉桂、益智、白果、菟丝子、鸡内金共六味中药材制成,其特征在于:所述五种成分为盐酸麻黄碱、桂皮醛、肉桂酸、槲皮素、银杏内脂C,所述检测方法包括将所述中药用提取溶剂提取,然后上高效液相色谱仪进行检测的步骤,所述高效液相色谱仪含有紫外检测器,所述紫外检测器的设定检测波长为205-230nm,所述高效液相色谱仪的固定相为氨基色谱柱,流动相A为含0.05-0.5%四氢呋喃的乙腈,流动相B为0.05-0.5%三乙胺溶液,梯度洗脱,流速为0.5-2ml/min,柱温为25~35℃。
2.如权利要求1所述同时检测一种治疗小儿遗尿症中药的五种成分含量的方法,其特征在于:所述提取溶剂为乙醇或甲醇或正丁醇。
3.如权利要求2所述同时检测一种治疗小儿遗尿症中药的五种成分含量的方法,其特征在于:所述提取溶剂中含有0.5-2%三乙胺。
4.如权利要求1所述同时检测小儿益麻颗粒五种成分含量的方法,其特征在于:所述检测波长为210nm。
5.如权利要求1所述同时检测小儿益麻颗粒五种成分含量的方法,其特征在于:所述流动相A为含0.1%四氢呋喃的乙腈。
6.如权利要求1所述同时检测小儿益麻颗粒五种成分含量的方法,其特征在于:所述流动相B为0.1%三乙胺溶液。
8.如权利要求1所述同时检测小儿益麻颗粒五种成分含量的方法,其特征在于:所述流速为1ml/min。
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