CN103969360B - 川芎的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了利用HPLC指纹图谱对川芎进行的检测方法。本发明还提供川芎合格品、虫蛀品、烤焦品的鉴定方法。本发明检测方法能够有效分辨川芎的质量优劣，能够准确区分川芎正伪品、合格品、虫蛀品和烤焦品，为保障川芎的质量提供了新的方法。

Description

川芎的检测方法

技术领域

本发明涉及川芎的检测方法。

背景技术

川芎，原名芎藭。一种中药植物，常用于活血行气，祛风止痛，主要栽培于四川、云南、贵州、广西、湖北等地。川芎辛温香燥，走而不守，既能行散，上行可达巅顶；又入血分，下行可达血海。活血祛瘀作用广泛，适宜瘀血阻滞各种病症；祛风止痛，效用甚佳，可治头风头痛、风湿痹痛等症。昔人谓川芎为血中之气药，殆言其寓辛散、解郁、通达、止痛等功能。

目前川芎药材质量控制多以藁本内酯、阿魏酸和川芎嗪等为指标性成分，采用HPLC、GC、TLS-S等现代分析方法测定药材中相关成分含量。总内酯类成分、总生物碱、总酚酸类成分等的测定多采用分光光度法测定。纵览研究结果，虽对药材质量控制具有一定的意义，但存在的问题亦不容回避。藁本内酯在生药的含量约为0.6%，约占挥发油总量58%，该成分含量高低对区分是否出自道地产区有一定意义，但藁本内酯在室温下可发生脱氢、氧化、水解、降解等异构化反应，药材在贮藏过程中含量变化较大，以其作为质控指标，其稳定性问题引人关注；阿魏酸在生药中含量约为0.1%～0.2%，但阿魏酸是多种药用植物共有成分，作为定量指标其专属性较差；而川芎嗪在生药中的含量低于万分之一，不宜作为药材质量控制的指标性成分。

目前市售的川芎药材中，由于炮制和保存不当的因素，存在大量的虫蛀、焦枯等川芎次品，并且，市场上也有将藁本混为川芎销售的现象，然而，藁本药材中也存在蒿本内酯等成分，较难以区分。若能够提供一种检测方法，可以同时将川芎合格品与川芎次品、川芎正品与藁本区分鉴别，将会大幅提高川芎药材的监管力度。

发明内容

本发明的目的在于提供川芎的检测方法。本发明的另一个目的在于提供川芎合格品、虫蛀品的鉴定方法。

本发明提供了川芎的检测方法，它是以HPLC指纹图谱进行测定的，它包括如下操作步骤：

（1）取川芎，粉碎后，以50～95%v/v乙醇提取，制备供试品溶液；

（2）将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，测定即可，色谱条件如下：

检测波长：280±5nm；

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填充剂；

流动相：以甲醇-水系统梯度洗脱，梯度条件如下：

进一步地，步骤（1）中，所述乙醇浓度为75%。

进一步地，HPLC指纹图谱中以阿魏酸为参照物。

进一步地，步骤（2）中，检测波长为280nm。

进一步地，步骤（2）中，检测柱温为30℃，流速0.8ml/min。

其中，步骤（2）中，将供试品所得HPLC指纹图谱与标准指纹图谱对照，相似度在0.9以上的待测药材为川芎合格品；所述标准指纹图谱中，有14个特征峰，以阿魏酸为参照峰，各特征峰的相对保留时间为：

进一步地，所述标准指纹图谱如图5所示。

更进一步地，待测药材的HPLC色谱图与标准指纹图谱对照，相似度在0.9以上的待测药材为川芎正品、合格品。

进一步地，待测药材的HPLC色谱图中，藁本内酯峰面积大于洋川芎内酯峰面积时，待测药材即为川芎正品。若藁本内酯峰面积小于洋川芎内酯峰面积，则待测药材可能是藁本。本发明还提供了川芎合格品的鉴定方法，采用上述HPLC指纹图谱检测方法测定，待测药材的HPLC图谱中，阿魏酸松柏酯的峰面积为阿魏酸的0.2倍以上，即为川芎合格品。

进一步地，阿魏酸松柏酯的峰面积为阿魏酸的3倍以上。

进一步地，藁本内酯的峰面积为阿魏酸的10倍以上。

更进一步地，藁本内酯的峰面积为阿魏酸的12倍以上。

其中，所述高效液相色谱法采用上述的检测方法。

本发明还提供了川芎虫蛀品的鉴定方法，采用上述HPLC指纹图谱检测方法测定，待测药材的HPLC图谱中，阿魏酸松柏酯的峰面积在阿魏酸的20%以下，藁本内酯的峰面积在阿魏酸的10倍以下，即为川芎虫蛀品。

进一步地，藁本内酯的峰面积在阿魏酸的6倍以下。

进一步地，洋川芎内酯A的峰面积在阿魏酸的3倍以下。

本发明还提供了川芎烤焦品的鉴定方法，采用上述HPLC指纹图谱检测方法测定，待测药材的HPLC色谱图中，欧当归内酯A的峰面积大于阿魏酸峰面积时，待测药材即为川芎烤焦品。

本发明检测方法，不仅可以有效分辨川芎近似品种，还能够有效分辨川芎药材的质量优劣，能够准确区分川芎合格品、虫蛀品和烤焦品，为保障川芎的质量提供了新的方法。

附图说明

图1不同波长下川芎HPLC色谱图，其中，A-230nm波长下色谱图，B-254nm波长下色谱图，C-280nm波长下色谱图，D-321nm波长下色谱图

图2稳定性试验色谱图

图3重复性试验色谱图

图4仪器精密度试验色谱图

图5川芎HPLC标准指纹图谱，其中，1.阿魏酸，5.洋川芎内酯A，10.藁本内酯，13.欧当归内酯A，7.阿魏酸松柏酯

图615批川芎HPLC指纹图谱

图7红川芎、藁本与川芎HPLC标准指纹图谱，其中，S1:川芎标准指纹图谱S2：藁本HPLC指纹图谱S3：红川芎HPLC指纹图谱

图8虫蛀川芎、焦枯川芎与川芎HPLC标准指纹图谱，其中，S1:川芎对照，S2：市售虫蛀川芎S3：彭州虫蛀川芎S4：都江堰虫蛀川芎S5：彭山虫蛀S6：新都虫蛀川芎，S7：焦枯品川芎

图9各样品HPLC图谱聚类分析图

具体实施方式

实施例1本发明检测方法

（1）取各川芎样品细粉约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇20ml，密塞，超声处理40min，过滤，滤液浓缩定容至5ml容量瓶中，即得。

（2）精密量取供试液20μL，注入高效液相色谱仪中，在280nm下检测，色谱条件如下：

在上述检测方法下，可以分离得到多个共有峰，且各峰分离度良好，为测定各指标成分的含量以及指纹图谱相似度对照提供了便利。采用上述方法，对不同品种或质地药材进行检测，不仅可以有效分辨川芎近似品种，还能够有效分辨川芎药材的质量优劣，能够准确区分川芎合格品、虫蛀品和烤焦品，为保障川芎的质量提供了新的方法。

实施例2本发明指纹图谱检测方法的考察

①供试品溶液的制备方法考察以乙醇为提取溶剂，考察了超声提取30min与回流提取（共提取两次，第一次1.5h，第二次1h）对色谱峰面积影响，结果表明，超声提取与回流提取相比色谱图相差不大，故选择更为简便的超声提取法。在此基础上比较了乙醇、甲醇对色谱峰影响，结果乙醇提取液中色谱峰数目明显多于甲醇提取液，故确定提取溶媒为乙醇。以上研究确定供试品溶液制备方法如下：

取各川芎样品细粉约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇20ml，密塞，超声处理40min，过滤，滤液浓缩定容至5ml容量瓶中，即得。

②流动相的选择分别以甲醇－水系统、乙腈－水系统为流动相，对供试品进行HPLC分析，对所获取的供试品色谱图中所呈现色谱峰的个数、保留时间、分离度、峰对称性等进行比较，以确定最适流动相。试验结果表明以甲醇－水为流动相时，各峰分离度最好，峰对称性更好，因此确定以甲醇－水为流动相。并对梯度洗脱程序、柱温、流速等进行了考察，确定柱温选择30℃，流速0.8l/min。

③检测波长和分析时间的选择

精密量取供试液20μL，以甲醇－水为流动相按上述时间程序梯度洗脱，记录125min色谱图，结果在70min后几无色谱峰出现，故确定检测时间为75min。分别选取230nm、254nm、280nm、321nm波长下的色谱图进行比较分析。结果在230nm处峰最多，但基线漂移严重，杂质干扰最大；321nm下峰较少；254nm、280nm下峰数量较多，杂质干扰较小，但在280nm各主要峰吸收度较均匀，因此通过比较不同波长下色谱图中峰的数目、图谱质量，综合考虑选择280nm为检测波长。不同波长下供试品的色谱图见图1。

通过上述研究，确定川芎HPLC指纹图谱获取色谱条件见表1。

表1梯度洗脱程序

柱温：30℃流速：0.8ml/min波长：245nm分析时间：125min

测定法：分别吸取各供试品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，测定。

④稳定性试验取彭山谢家一等川芎供试品溶液，分别在0h、4h、8h、24h、48h于上述色谱条件下测定色谱图，在各时间点测得的色谱指纹图谱与所得标准指纹图谱的相似度分别为0.981、0.982、0.995、0.987、0.995，RSD％为0.68％，表明供试品溶液在48h内稳定。

⑤重复性试验取都江堰一等川芎样品5份，按上述样品制备方法制成供试品溶液，吸取各供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，用相似度计算，结果各供试品溶液的色谱指纹图谱与其所得标准指纹图谱的相似度分别为0.989、0.998、0.978、0.995、0.994RSD%为0.79％，表明方法重复性良好。

⑥仪器精密度试验取彭州敖平一等川芎样品供试品溶液，连续进样5次，所得图谱用相似度计算，结果各次进样色谱指纹图谱与其所得标准指纹图谱的相似度分别为0.988、0.988、0.999、0.996、0.989、RSD%为0.52％，表明仪器精密度良好。

⑦耐用性试验分别选用Hypersil BDS C₁₈（250mm×4.6mm，5μm,大连依利特公司），Diamonsil C₁₈（250mm×4.6mm，5μm，迪马公司），Comtex C₁₈（250mm×4.6mm，5μm，天津琛航科技仪器有限公司）三种色谱柱，按上述色谱条件获取色谱图谱，结果表明在3种不同品牌色谱柱上均能得到较理想的色谱指纹图谱，表明该方法耐用性良好。

（2）川芎HPLC标准指纹图谱的建立

运用国家药典委员会发布的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”对不同产地、不同规格的15批川芎样品指纹图谱进行了分析，提取共有峰生成对照图谱，见图5，根据数据分析最终标定14个共有峰，从各批样品色谱峰峰面积可看出，1号共有峰（阿魏酸）在各批样品中峰面积差异最小，因此为更好的比较各样品差异，确定以1号峰为参照峰。各批样品共有峰峰面积占总峰面积比的90%以上，非共有峰在总峰面积中所占比例均小于2%，所选择的共有峰可以较为全面的反映样品中化学成分的信息。共有指纹峰标定结果见表2。

表2川芎标准指纹图谱共有峰标定结果

（3）不同商品规格川芎与标准指纹图谱相似度评价分析

取彭山、彭州、都江堰、新都、市售等不同产地、不同规格的15批川芎样品，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”，以标准指纹图谱为参照，分别对15批川芎药材进行相似度评价，相似度评价结果见表3，图谱见图6。

表3图谱对应样品编号

表415批不同规格川芎指纹图谱与标准指纹图谱的相似度

由上表可知，15批川芎指纹图谱与标准指纹图谱的相似度均>0.9。表明，彭山、彭州、都江堰、新都这4个不同产地川芎样品HPLC指纹图谱无差异，同产地、不同规格HPLC川芎指纹图谱也无差异。

（4）红川芎、藁本与川芎标准指纹图谱相似度评价分析

取红川芎、藁本样品，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”，以川芎标准指纹图谱为参照进行相似度评价，结果见表5，图谱见图7。

表5红川芎、藁本指纹图谱与川芎标准指纹图谱的相似度

从上表可知，红川芎与川芎标准指纹图谱的相似度为0.958，表明红川芎化学成分种类、含量与川芎相比无显著性差异。而藁本与川芎对照指纹谱的相似度为0.608＜0.9，表明藁本所含化学成分种类、含量与川芎相比存在较大的差异。各样品主要色谱峰面积对比数据见表6。

表6红川芎、藁本主要峰峰面积与川芎标准指纹图谱的比较

从上表可以看出，藁本与川芎所含主要化学成分种类相近，但在含量及比例上具有较大差异，两者相比最大的不同在于5号峰（洋川芎内酯A）和10号峰（藁本内酯）。川芎中藁本内酯和洋川芎内酯A峰面积比值达3.498：1，而藁本中两者之比为0.523：1，表明在川芎中苯酞类成分以藁本内酯为主，而藁本中苯酞类成分以洋川芎内酯A为主。这一结果与前面化学成分含量测定结果一致。

（5）虫蛀川芎、焦枯川芎与川芎标准指纹图谱相似度评价分析

取各川芎虫蛀品和焦枯品，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）”，以川芎标准指纹图谱为参照进行相似度评价，结果见表7，图谱见图8。

表7虫蛀川芎、焦枯川芎与川芎标准指纹图谱的相似度

从上表可以看出，虫蛀品、焦枯品与川芎标准指纹图谱的相似度均＜0.9，表明川芎虫蛀、烤焦后其所含化学成分种类和含量都发生了显著性变化。结合谱图比较，表明虫蛀主要是降低川芎中某些化学成分含量，而对化学成分种类基本无影响。焦枯品与川芎对照及各虫蛀品之间相似度均＜0.7，结合图谱比较发现，焦枯品HPLC图谱在5-10min出现2个大的馒头峰，表明川芎烤焦后化学成分含量、种类都发生了显著性变化。根据出峰时间及前面化学成分测定中焦枯品总酚酸含量升高的结果推测，其应为酚酸类成分。

表8虫蛀川芎、焦枯川芎与川芎标准指纹图谱的峰面积比较

表9虫蛀川芎、焦枯川芎与川芎标准指纹图谱的相对峰面积比较

从表8、9可看出，川芎虫蛀后，5号峰（洋川芎内酯A）、7号峰（阿魏酸松柏酯）、10号峰（藁本内酯）含量均显著降低，尤其是阿魏酸松柏酯在虫蛀品中几乎降为零。川芎烤焦后，洋川芎内酯含量基本不变，而藁本内酯、阿魏酸松柏酯含量显著降低，阿魏酸松柏酯变化与虫蛀品一致，而4、6、12、13号峰（欧当归内酯A）含量增加，欧当归内酯A尤其明显。与化学成分含量测定结果一致。

（6）各样品系统聚类分析

采用SPSS软件，对各样品进行系统聚类分析，组间联接法作为聚类方法，平方欧式距离作为度量标准。对各批样品HPLC指纹图谱进行系统聚类分析，系统聚类分析图见图9。

从聚类分析结果可以看出，所有样品可分为3大类，焦枯品和藁本各为一类，其余川芎样品聚为一类，在这一类中所有虫蛀品聚为一类，而红川芎与其余不同规格川芎样品聚为一类。聚类分析结果也表明藁本与川芎所含化学成分种类及含量相差较大，而红川芎与川芎化学成分种类及含量相同，以现有标准划分川芎各商品规格之间HPLC指纹图谱无明显差异。虫蛀和烤焦对川芎化学成分也有较大影响。

3.6.3小结

（1）从HPLC指纹图谱相似度分析和聚类分析结果均表明，按现有标准划分的不同川芎商品规格之间无显著性差异，而虫蛀和焦枯等劣质川芎样品与正常川芎相比HPLC指纹图谱有显著差异。结合化学成分含量测定结果，表明从已测内在化学成分品质指标看目前川芎应用中不分等按统货应用，及传统川芎品质评价认为虫蛀品、焦枯品等不能入药的情况具有一定的科学内涵。

（2）作为川芎不同栽培品系的红川芎样品，HPLC指纹图谱与川芎样品基本一致，结合化学成分含量测定结果，表明红川芎在内在化学品质指标上与川芎基本一致。

（3）HPLC指纹图谱比较结果表明，藁本与川芎在内在化学成分上存在异同，两者所含主要化学成分种类大体相同，在个别成分及含量上有较大差异，其主要表现为：川芎中苯酞内酯类成分主要为藁本内酯，而藁本中苯酞类成分主要为洋川芎内酯A，从化学指标看，藁本不能作川芎入药。而两者在阿魏酸及总酚酸含量上并无显著差异，《中国药典》2010年版川芎和藁本均以阿魏酸作为含量测定指标，其合理性值得商榷。

（4）HPLC指纹图谱及化学成分含量测定结果表明，焦枯川芎在化学成分种类和含量上均与正常川芎有较大差异，表明在高温烘烤过程中川芎中所含成分可发生分解、转化，生成新成分，提示在以后的生产加工及炮制过程中，应注意川芎成分变化，这种成分变化是否与川芎功效变化相关有待进一步深入研究。

（5）作为新产地的彭山川芎，从HPLC指纹图谱与其他产地及标准指纹图谱比较相似度均＞0.9，表明彭山川芎样品内在化学成分从整体上与传统道地产区川芎具有一定等同性。

Claims (16)

1.川芎的检测方法，其特征在于：它是以HPLC指纹图谱进行测定的，它包括如下操作步骤：

(1)取待测药材，粉碎后，以50～95％v/v乙醇提取，制备供试品溶液；

(2)将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，测定即可，色谱条件如下：检测波长：280±5nm；

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填充剂；

流动相：以甲醇-水系统梯度洗脱，梯度条件如下：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(1)中，乙醇浓度为75％v/v。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：HPLC指纹图谱中以阿魏酸为参照物。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)中，检测柱温为30℃，流速0.8ml/min。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)中，将供试品所得HPLC指纹图谱与标准指纹图谱对照，相似度在0.9以上的待测药材为川芎合格品；所述标准指纹图谱中，有14个特征峰，以阿魏酸为参照峰，各特征峰的相对保留时间为：

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：所述标准指纹图谱如图5所示。

7.根据权利要求5或6所述的检测方法，其特征在于：待测药材的HPLC色谱图与标准指纹图谱对照，相似度在0.9以上的待测药材为川芎正品、合格品。

8.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：待测药材的HPLC色谱图中，藁本内酯峰面积大于洋川芎内酯峰面积时，待测药材即为川芎正品。

9.川芎合格品的鉴定方法，其特征在于：经权利要求1-4任意一项所述的检测方法测定，待测药材的HPLC色谱图中，阿魏酸松柏酯的峰面积为阿魏酸的0.2倍以上，即为川芎合格品。

10.根据权利要求9所述的鉴定方法，其特征在于：所述阿魏酸松柏酯的峰面积为阿魏酸的3倍以上。

11.根据权利要求9所述的鉴定方法，其特征在于：待测药材的HPLC色谱图中，藁本内酯的峰面积为阿魏酸的10倍以上。

12.根据权利要求11所述的鉴定方法，其特征在于：所述藁本内酯的峰面积为阿魏酸的12倍以上。

13.川芎虫蛀品的鉴定方法，其特征在于：经权利要求1-4任意一项所述的检测方法测定，待测药材的HPLC色谱图中，阿魏酸松柏酯的峰面积在阿魏酸的20％以下，藁本内酯的峰面积在阿魏酸的10倍以下，即为川芎虫蛀品。

14.根据权利要求13所述的鉴定方法，其特征在于：所述藁本内酯的峰面积在阿魏酸的6倍以下。

15.根据权利要求14所述的鉴定方法，其特征在于：待测药材的HPLC色谱图中，洋川芎内酯A的峰面积在阿魏酸的3倍以下。

16.川芎烤焦品的鉴定方法，其特征在于：经权利要求1-4任意一项所述的检测方法测定，待测药材的HPLC色谱图中，欧当归内酯A的峰面积大于阿魏酸峰面积时，待测药材即为川芎烤焦品。