CN114441685A - 一种重楼标准汤剂质量检测方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种重楼标准汤剂质量检测方法，包括通过对重楼标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ和重楼皂苷Ⅶ含量测定，将标准汤剂含量标准限定为每1g含重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ和重楼皂苷Ⅶ的总含量为2.0‑22.0mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ含量测定均采用液相色谱法测定。本申请的重楼标准汤剂质量检测方法，通过多方面测量，来评定重楼标准汤剂的质量，为产品的质量稳定奠定坚实的基础，能够建立重楼汤剂可行的质量标准，实现重楼标准汤剂质量的有效控制。

Description

一种重楼标准汤剂质量检测方法
技术领域
本申请涉及中药材质量控制技术领域，具体涉及一种重楼标准汤剂质量检测方法。
背景技术
现代药物需要具有稳定均一、安全和有效的三大特性，中成药在这几个方面难以比拟西药，因此，更需要采用多种手段进行检测，保证检测结果的可靠性和稳定性。重楼为百合科植物云南重楼或七叶一枝花的干燥根茎，味苦，性微寒，有小毒，有清热解毒，消肿止痛，凉肝定惊之功效，常用于疔疮痈肿，咽喉肿痛，蛇虫咬伤，跌扑伤痛，惊风抽搐。目前，关于重楼药材的标准汤剂还未形成一个系统的质量检测方法，仅采用现有的检测手段来检测重楼汤剂是不够全面的，无法达到中药配方颗粒质量控制要求。因此，建立一种用于药材质量控制的重楼标准汤剂质量检测方法是十分必要的。
发明内容
本申请的目的就是要解决现有技术的不足，提供一种重楼标准汤剂质量检测方法，以更好的控制重楼汤剂的质量，表征药物质量，提高药物稳定性。
为达到上述目的，本申请的技术方案是这样实现的：
本申请提供一种重楼标准汤剂质量检测方法，包括如下检测方法，
通过对重楼标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ和重楼皂苷Ⅶ含量测定，将标准汤剂含量标准限定为每1g含重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ和重楼皂苷Ⅶ的总含量为2.0-22.0mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ含量测定均采用液相色谱法测定；
采用液相色谱法测定特征图谱包括：进行液相色谱仪分析，以重楼对照药材制成的溶液作为参照物溶液，以重楼皂苷Ⅰ对照品、重楼皂苷Ⅱ对照品、重楼皂苷Ⅶ对照品分别制成的三种溶液作为对照品溶液，以重楼标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液，分别精密吸取参照物溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：岛津Shim-pack GIST C18-AQ(250mmx4.6mm，5um)；流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表a的规定进行梯度洗脱；
表a梯度洗脱程序
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～5 10 90
5～78 10→80 90→20
流速：0.8mL/min；柱温：35℃；进样量：10μL；检测波长：0～25min为220nm，25-78min为203nm。
在其中一实施例中，所述煎煮法包括：取重楼饮片加水浸泡30-40min，煎煮两次，第一次煎煮时长为30-40min，第二次煎煮时长为25-30min，趁热进行固液分离，合并滤液，浓缩干燥，制得重楼标准汤剂干膏粉。
在其中一实施例中，所述照薄层色谱法包括如下步骤：
(1)制备供试品溶液a：取重楼标准汤剂样品0.5g，加乙醇10mL，经加热回流30min，放冷滤过，滤液作为供试品溶液a；
(2)制备对照药材溶液a：取重楼对照药材0.5g，加乙醇10ml，加热回流30min，放冷滤过，滤液作为对照药材溶液a；
(3)制备对照品溶液a：取重楼皂苷Ⅰ对照品、重楼皂苷Ⅱ对照品、重楼皂苷Ⅶ对照品适量，加甲醇溶解，制成每1ml含重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ各0.4mg的混合溶液，作为对照品溶液a；
(4)进行薄层色谱分析：薄层色谱条件为，薄层板：硅胶G薄层板；点样量：吸取供试品溶液5μl、对照药材溶液10μl、对照品溶液10μl；展开剂：体积比为15:5:1的三氯甲烷-甲醇-水的下层溶液；显色剂：喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
在其中一实施例中，所述热浸法以乙醇为溶剂，按照醇溶性浸出物测定法下的热浸法测定浸出物范围。
在其中一实施例中，采用液相色谱法测定特征图谱还包括如下步骤：
(1)制备参照物溶液b：取重楼对照药材0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％乙醇15mL，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用30％乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液作为参照物溶液b；
(2)制备对照品溶液b：分别取重楼皂苷Ⅰ对照品、重楼皂苷Ⅱ对照品、重楼皂苷Ⅶ对照品适量，精密称定，分别加甲醇溶解，分别制得浓度为20μg/mL的对照品溶液b1、对照品溶液b2、对照品溶液b3；
(3)制备供试品溶液b：取重楼标准汤剂样品粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％乙醇15mL，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用30％乙醇补足减失重量，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液b。
在其中一实施例中，制备供试品溶液b所取的重楼标准汤剂样品粉末为过三号筛的粉末
在其中一实施例中，采用液相色谱法测定重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ含量包括：进行液相色谱仪分析，以重楼皂苷Ⅰ对照品、重楼皂苷Ⅱ对照品、重楼皂苷Ⅶ对照品制成的溶液作为对照品溶液c，以重楼标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液c，分别精密吸取对照品溶液c和供试品溶液c，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：岛津Shim-pack GIST C18-AQ(250mmx4.6mm，5um)，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按规定进行梯度洗脱；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；检测波长：203nm。
在其中一实施例中，采用液相色谱法测定重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ含量还包括如下步骤：
(1)制备对照品溶液：取重楼皂苷Ⅰ对照品、重楼皂苷Ⅱ对照品、重楼皂苷Ⅶ对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每1ml含重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ各0.4mg的混合溶液，摇匀，作为对照品溶液c；
(2)制备供试品溶液：取重楼标准汤剂样品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇25mL，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液c。
与现有技术相比，本申请的有益效果是：
(1)通过对重楼标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ含量测定进行研究，通过多方面测量，来评定重楼标准汤剂的质量，为产品的质量稳定奠定坚实的基础，能够建立重楼汤剂可行的质量标准，实现重楼标准汤剂质量的有效控制，并且，采用本申请的色谱条件进行液相分析，可以得到分离度更好更清晰的色谱图。
(2)重楼饮片依方案煎煮制得重楼饮片标准汤剂，重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ总含量平均转移率为7.19％，转移率范围为5.20％～8.62％，SD为1.10，依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ含量转移率允许范围按转移率均值的70％～130％计算，含量转移率允许范围为5.03～9.35％，按照±3SD来算，含量转移率允许范围为3.89～11.20％；重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ的总含量的平均含量为11.77mg/g，测得含量范围为2.76～15.06mg/g，SD为3.42；按均值±3SD计算，含量允许范围为1.51～22.03mg/g，故拟定重楼标准汤剂的重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ总含量的含量范围为：2.0mg/g～22.0mg/g，本申请多个批次标准汤剂中重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ含量及其转移率均在允许范围之内，因此本申请可为重楼配方颗粒质量标准研究提供参考依据。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请一实施例中重楼饮片标准汤剂薄层鉴别图谱；其中，A组图谱为阴性对照样品薄层图谱，S1组为对照品溶液薄层图谱，S2组为重楼对照药材溶液薄层图谱，1～15组为重楼饮片15批次标准汤剂薄层图谱。
图2为本申请提取方法考察中不同提取方法对比图；其中，S1为超声提取供试品溶液特征图谱；S2为回流提取供试品溶液特征图谱。
图3为本申请提取时间考察中不同提取时间对比图；其中，S1为超声提取30min供试品溶液特征图谱；S2为超声提取20min供试品溶液特征图谱；S3为超声提取40min供试品溶液特征图谱。
图4为本申请提取溶剂考察中不同提取溶剂对比图；其中，S1为95％乙醇提取制备的供试品溶液特征图谱；S2为95％甲醇提取制备的供试品溶液特征图谱；S3为30％乙醇提取制备的供试品溶液特征图谱。
图5为本申请样品取用量考察中不同样品量对比图；其中，S1为样品取用量0.4g的供试品溶液特征图谱；S2为样品取用量0.5g的供试品溶液特征图谱；S3为样品取用量0.7g的供试品溶液特征图谱。
图6为本申请专属性考察中空白溶剂对比图；其中，S1为空白溶剂(30％乙醇溶液)特征图谱；S2为供试品溶液特征图谱；S3为重楼皂苷Ⅰ对照品溶液特征图谱。
图7为本申请重复性试验共有峰叠加特征图谱；其中，S1为重复性1下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S2为重复性2下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S3为重复性3下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S4为重复性4下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S5为重复性5下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S6为重复性6下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱。
图8为本申请精密度试验共有峰叠加特征图谱；其中，S1为精密度1下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S2为精密度2下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S3为精密度3下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S4为精密度4下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S5为精密度5下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S6为精密度6下的供试品溶液共有峰叠加特征图谱。
图9为本申请稳定性试验共有峰叠加特征图谱；其中，S1为于0h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S2为于2h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S3为于4h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S4为于8h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S5为于12h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱；S6为于24h测定的供试品溶液共有峰叠加特征图谱。
图10为本申请标准汤剂特征图谱测定中重楼皂苷Ⅰ对照品图谱。
图11为本申请标准汤剂特征图谱测定中重楼皂苷Ⅱ对照品图谱。
图12为本申请标准汤剂特征图谱测定中重楼皂苷Ⅶ对照品图谱。
图13为本申请标准汤剂特征图谱测定中重楼(云南重楼)对照药材图谱。
图14为本申请标准汤剂特征图谱测定中15批重楼(云南重楼)中药饮片叠加图谱；其中，S1-S15表示1-15批重楼中药饮片叠加图谱。
图15为本申请标准汤剂特征图谱测定中15批重楼(云南重楼)中药饮片共有峰图谱。
图16为本申请15批重楼(云南重楼)标准汤剂叠加图谱；其中，S1-S15表示1-15批重楼标准汤剂叠加图谱。
图17为本申请标准汤剂特征图谱测定中15批重楼(云南重楼)标准汤剂共有峰图谱。
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本申请进一步详细说明。
本申请提供一种重楼标准汤剂质量检测方法，包括如下检测方法，通过对重楼标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ和重楼皂苷Ⅶ含量测定，将标准汤剂含量标准限定为每1g含重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ和重楼皂苷Ⅶ的总含量为2.0-22.0mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ含量测定均采用液相色谱法测定。
本实施例中：
制备重楼(云南重楼)标准汤剂：参照《医疗机构中药煎药室管理规范》(国中医药管理局[2009]3号)中的固定前处理方法、煎煮次数、加水量、煎煮时间等相关参数进行煎煮，再进行固液分离、浓缩干燥。具体的，取15批次重楼(云南重楼)饮片加水至没过药材约4-5cm，浸泡30-40min，煎煮两次，第一次煎煮时长为30-40min，第二次煎煮时长为25-30min，趁热进行固液分离，合并滤液，浓缩干燥，制得15批次重楼(云南重楼)标准汤剂干膏粉。
1.性状考察
根据15批次重楼(云南重楼)标准汤剂的实物性状特征，描述为浅黄色至黄色的粉末，气微，味微苦麻。
2.干浸膏出膏率测试
取15批次重楼(云南重楼)饮片，按上述制法制得15批次标准汤剂干膏粉，以干膏粉计算干浸膏得率(见表1)，并计算平均得率为13.587％，按照标准汤剂出膏率允许范围(均值70％～130％)计算，出膏率允许范围为9.51％～17.66％，故拟定本品出膏率为9.5％～17.5％。
表1：出膏率
Figure BDA0003497792630000061
上述结果表明，15批次标准汤剂干浸膏出膏率为11.2％～15.2％，均符合拟定限度范围9.5％～17.5％。
3.薄层鉴别
本品为单味饮片重楼的干燥提取物，参考《中国药典》2020年版重楼“薄层鉴别”项下的方法，用重楼对照药材作对照，建立了本品薄层鉴别方法，经15批次样品试验，供试品斑点清晰，阴性对照样品无干扰，故拟定为本品鉴别项。试验方法和结果如下：
试验方法：照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验
供试品溶液制备：取本品0.5g，加10ml乙醇，加热回流30分钟，放冷，滤过，滤液作为供试品溶液。
对照药材溶液制备：取重楼对照药材0.5g，加10ml乙醇，加热回流30分钟，放冷，滤过，滤液作为对照药材溶液。
对照品溶液制备：取重楼皂苷Ⅰ对照品、重楼皂苷Ⅱ对照品、重楼皂苷Ⅶ对照品适量，加甲醇溶解，制成每1ml含重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ各0.4mg的混合溶液，作为对照品溶液。
薄层色谱条件：薄层板：硅胶G薄层板；点样量：吸取供试品溶液5μl、对照药材溶液10μl、对照品溶液10μl；展开剂：体积比为15:5:1的三氯甲烷-甲醇-水的下层溶液；显色剂：喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
结果：供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，详见图1。
4.浸出物测定
取15批次标准汤剂，以乙醇为溶剂，照醇溶性浸出物测定法(中国药典2020年版通则2201)项下的热浸法测定，结果详见表2。
表2：浸出物测定结果
Figure BDA0003497792630000071
上述结果表明，15批次标准汤剂浸出物均值为20.721％，参考标准限度允许范围(均值70％～130％)的下限，拟定本品醇溶性浸出物不得少于14.5％，15批次标准汤剂测定结果均符合拟定限度要求。
5.特征图谱测试
5.1液相色谱法
色谱条件：色谱柱：岛津Shim-pack GIST C18-AQ(250mmx4.6mm，5um)；流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表3中的规定进行梯度洗脱；流速：0.8mL/min；柱温：35℃；进样量：10μL；检测波长：0～25min为220nm，25-78min为203nm。
表3：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～5 10 90
5～78 10→80 90→20
(1)制备参照物溶液：取重楼对照药材0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％乙醇15mL，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用30％乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液作为参照物溶液；
(2)制备对照品溶液：分别取重楼皂苷Ⅰ对照品、重楼皂苷Ⅱ对照品、重楼皂苷Ⅶ对照品适量，精密称定，分别加甲醇溶解，分别制得浓度为20μg/mL的三种对照品溶液；
(3)制备供试品溶液：取重楼标准汤剂样品粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％乙醇15mL，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用30％乙醇补足减失重量，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。
测定法：分别精密吸取参照物溶液、对照品溶液及供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。
5.2方法学考察
提取方法的考察：分别以不同的提取方法制备供试品溶液，包括超声30min提取、回流30min提取，按上述5.1试验方法进行测定。结果表明，超声30min与回流30min的主峰个数一致，样品提取完全，如图2所示，样品加超声处理时主峰总峰面积较大，故选择样品提取方式为超声处理。
提取时间的考察：分别以不同的超声提取时间制备供试品溶液，按上述5.1试验方法进行测定。结果表明，主峰个数一致，样品提取完全，如图3所示，提取时间为30min时，主峰总峰面积最大，故确定供试品提取时间为超声30分钟。
提取溶剂的考察：分别以不同提取溶剂制备供试品溶液，按5.1试验方法进行测定。详见表5，结果表明，主峰个数一致，样品提取完全，如图4所示，提取溶剂为30％乙醇时，主峰总峰面积最大，故确定以30％乙醇为提取溶剂。
样品取用量考察：分别以不同取样量(0.3g、0.5g、0.7g)超声制备供试品溶液，按5.1试验方法进行测定。结果表明，主峰个数一致，如图5所示，取样量为0.5g时，主峰总峰面积最大，故确定供试品取样量为0.5g。
综上所述，确定供试品溶液制备方法的主要参数如下：取重楼标准汤剂样品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％乙醇15mL，密塞，称定重量，超声处理30min，放冷，再称定重量，用30％乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
5.3特征图谱分析方法验证
专属性考察：取供试品用溶剂30％乙醇10μL，按5.1色谱条件进行测定，试验表明，如图6所示，空白溶剂无干扰。
重复性试验：取同批样品(批号T210901)约0.5g，共6份，按5.1色谱条件进行测定，结果显示，6份供试品特征图谱中有4个共有峰，采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对指定的4个共有特征峰进行相似度评价，相对保留时间及保留时间的RSD均在合格范围内，表明该方法重现性良好(详见图7、表4、表5)。
表4：重复性试验特征图谱相对保留时间
峰号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 RSD(％)
1 0.863 0.863 0.863 0.863 0.863 0.863 0.00
2(S) 1 1 1 1 1 1 0.00
3 1.027 1.027 1.027 1.027 1.027 1.027 0.00
4 1.047 1.047 1.047 1.047 1.047 1.046 0.04
表5：重复性试验特征图谱相对峰面积
峰号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 RSD(％)
2 1.233 1.343 1.354 1.354 1.356 1.356 3.68
3(S) 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 1.000 0.00
4 0.334 0.377 0.374 0.370 0.363 0.376 4.52
5 0.775 0.866 0.858 0.846 0.840 0.888 4.52
精密度试验：取一批样品(批号：T210901)约0.5g，按5.1色谱条件进行测定，连续进样6针测定，峰形、峰数基本一致，并采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对指定的4个共有特征峰进行相似度的评价，相对保留时间RSD及保留时间的RSD均在合格范围内(详见图8、表6、表7)，表明该方法精密度良好表明仪器精密度良好。
表6：精密度试验特征图谱相对保留时间
峰号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 RSD(％)
1 0.863 0.864 0.864 0.864 0.864 0.864 0.05
2(S) 1 1 1 1 1 1 0.00
3 1.027 1.027 1.027 1.027 1.027 1.027 0.00
4 1.046 1.046 1.046 1.046 1.046 1.046 0.00
表7：精密度试验特征图谱相对峰面积
峰号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 RSD(％)
1 1.1553 1.1413 1.1304 1.1243 1.1339 1.1576 1.19
2(S) 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 0.00
3 0.3225 0.3179 0.3171 0.3418 0.3420 0.3230 3.51
4 0.7693 0.7287 0.7450 0.7684 0.7694 0.7960 3.05
稳定性试验：取一批样品(批号：T210901)约0.5g，按5.1色谱条件进行测定，分别于0h、2h、4h、8h、12h、24h进样测定，特征图谱的峰形、峰数基本稳定，并采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对指定的4个共有特征峰进行相似度评价,相对保留时间及保留时间的RSD均在合格范围内(详见表8、表9及图9)，表明供试品溶液在24小时内较稳定。
表8：稳定性试验特征图谱相对保留时间
峰号 0 2h 4h 8h 12h 24h RSD(％)
1 0.863 0.864 0.864 0.864 0.863 0.863 0.06
2(S) 1 1 1 1 1 1 0.00
3 1.027 1.027 1.027 1.027 1.027 1.027 0.00
4 1.046 1.046 1.046 1.046 1.047 1.046 0.04
表9：稳定性试验特征图谱相对峰面积
峰号 S1 S2 S3 S4 S5 S6 RSD(％)
1 1.1553 1.1413 1.1304 1.1339 1.2334 1.1976 3.55
2(S) 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 1.0000 0.00
3 0.3225 0.3179 0.3171 0.3420 0.3336 0.3252 2.98
4 0.7693 0.7287 0.7450 0.7694 0.7752 0.7601 2.35
5.4标准汤剂特征图谱表征分析
标准汤剂特征图谱测定
按照5.3拟定的特征图谱分析方法，测定15批重楼饮片标准汤剂及其制备使用的15批次中药饮片特征图谱，结果显示，标准汤剂及其制备使用的中药饮片特征色谱图中有4个共有峰，并应与对照药材参照物色谱中的4个特征峰保留时间相对应，其中与重楼皂苷Ⅱ对照品参照物相对应的峰为峰2，共有峰特征图谱详见图10至图17。
特征色谱图相似度评价
采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”，对选定的4个共有特征峰进行相似度的评价，结果显示，15批重楼(云南重楼)饮片标准汤剂特征色谱图相似度均在0.9以上，表明本标准汤剂质量相对稳定。以重楼皂苷Ⅱ参照物峰相对应的峰(2)为S峰，计算共有峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间及范围见表10。
表10：15批标准汤剂共有峰相对保留时间
Figure BDA0003497792630000111
综上所述，采用高效液相色谱法建立的标准汤剂特征图谱测定方法，按照《中国药典》2020年版四部“分析方法验证指导原则(通则9101)”对建立的方法进行了精密度、重复性、稳定性验证，均符合要求。采用“中药色谱指纹图相似度评价系统(2012版)”对15批标准汤剂样品的特征图谱进行相似度评价，标定了4个共有特征峰，其中峰2为重楼皂苷Ⅱ。以重楼皂苷Ⅱ参照物相对应的峰为S峰，计算另3个特征峰相对保留时间，以15批次样品峰相对保留时间均值拟定为规定值分别为：0.86(峰1)、1.03(峰3)、1.05(峰4)，考虑试验操作、仪器、试剂等多因素误差，其相对保留时间允许范围拟定为±10％。
6.含量测定
6.1试验方法
2020版《中国药典》中重楼(云南重楼)含量测定项下含量测定成分为重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ。故重楼(云南重楼)配方颗粒选择其作为含测成分。
试验方法如上述特征图谱测试中的液相色谱法。
采用液相色谱法测定重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ含量，包括：进行液相色谱仪分析，以重楼皂苷Ⅰ对照品、重楼皂苷Ⅱ对照品、重楼皂苷Ⅶ对照品制成的溶液作为对照品溶液，以重楼标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，测定，即得
色谱条件为：色谱条件与系统适用性实验，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂。流动相：以乙腈为流动相A，以水溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速：每分钟1.0ml；柱温：30℃；检测波长：203nm，按表11中的规定进行梯度洗脱。
表11：
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～40 30→60 70→40
40～50 60→30 40→70
制备对照品溶液：取重楼皂苷Ⅰ对照品、重楼皂苷Ⅱ对照品、重楼皂苷Ⅶ对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每1ml含重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ各0.4mg的混合溶液，摇匀，作为对照品溶液。
制备供试品溶液：取重楼标准汤剂样品粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇25mL，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。
测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
6.2标准汤剂及中药材含量测定
照上述拟定的含量分析方法，测定15批重楼(云南重楼)标准汤剂及其制备使用的15批次重楼(云南重楼)饮片及药材的重楼皂苷Ⅰ对照品、重楼皂苷Ⅱ对照品、重楼皂苷Ⅶ对照品的总含量，结果见表12、表13、表14。
表12：15批重楼(云南重楼)药材含量测定结果
Figure BDA0003497792630000121
表13：15批重楼(云南重楼)饮片含量测定结果
Figure BDA0003497792630000122
Figure BDA0003497792630000131
表14：15批重楼(云南重楼)标准汤剂含量测定结果
Figure BDA0003497792630000132
含量转移率：依据标准汤剂方法学研究确定的检测方法，对15批标准汤剂及其制备用中药饮片测定结果，计算重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ含量转移率，掌握其量质传递情况，为制定物料内控标准及其表征参数允许范围提供依据。重楼饮片标准汤剂由重楼饮片加水煎煮2次，滤液浓缩、冷冻干燥制得。其重楼皂苷总含量转移率见表15。
表15：15批重楼标准汤剂重楼皂苷含量转移率
Figure BDA0003497792630000133
由以上数据可知，重楼饮片依方案煎煮制得重楼饮片标准汤剂，本品重楼皂苷总含量平均转移率为7.19％，测得转移率范围为5.20％～8.62％，SD为1.10。依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，对照品含量转移率允许范围按转移率均值的70％～130％计算，为5.03～9.35％；按照±3SD来算，为3.89～11.2％。结果表明，15批次标准汤剂中重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ的总含量转移率均在设定的允许范围之内。
本品重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ的总含量的平均含量为11.77mg/g，测得含量范围为2.76～15.06mg/g，SD为3.42；按均值±3SD计算，含量允许范围为1.51～22.03mg/g，故拟定本标准汤剂的重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ的总含量的含量范围为：2.0mg/g～22.0mg/g。结果表明，15批次标准汤剂中含量及其转移率均在允许范围之内，可为重楼配方颗粒质量研究提供参考依据。
本申请提供的重楼标准汤剂质量检测方法，通过对重楼标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ含量测定进行研究，通过多方面测量，来评定重楼标准汤剂的质量，为产品的质量稳定奠定坚实的基础，能够建立重楼汤剂可行的质量标准，实现重楼标准汤剂质量的有效控制，并且，采用本申请的色谱条件进行液相分析，可以得到分离度更好更清晰的色谱图。重楼饮片依方案煎煮制得重楼饮片标准汤剂，重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ总含量平均转移率为7.19％，转移率范围为5.20％～8.62％，SD为1.10，依据《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》，重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ含量转移率允许范围按转移率均值的70％～130％计算，含量转移率允许范围为5.03～9.35％，按照±3SD来算，含量转移率允许范围为3.89～11.20％；重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ的总含量的平均含量为11.77mg/g，测得含量范围为2.76～15.06mg/g，SD为3.42；按均值±3SD计算，含量允许范围为1.51～22.03mg/g，故拟定重楼标准汤剂的重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ总含量的含量范围为：2.0mg/g～22.0mg/g，本申请多个批次标准汤剂中重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ含量及其转移率均在允许范围之内，因此本申请可为重楼配方颗粒质量标准研究提供参考依据。
所述领域技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本申请的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本申请的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本申请的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本申请的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本申请的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种重楼标准汤剂质量检测方法，其特征在于，包括如下检测方法，
通过对重楼标准汤剂的性状、干浸膏出膏率、薄层鉴别、浸出物、特征图谱及重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ和重楼皂苷Ⅶ含量测定，将标准汤剂含量标准限定为每1g含重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ和重楼皂苷Ⅶ的总含量为2.0-22.0mg，其中，干浸膏出膏率测定采用煎煮法进行测定；薄层鉴别采用照薄层色谱法进行鉴别；浸出物采用热浸法测定；特征图谱及重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ含量测定均采用液相色谱法测定；
采用液相色谱法测定特征图谱包括：进行液相色谱仪分析，以重楼对照药材制成的溶液作为参照物溶液，以重楼皂苷Ⅰ对照品、重楼皂苷Ⅱ对照品、重楼皂苷Ⅶ对照品分别制成的三种溶液作为对照品溶液，以重楼标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液，分别精密吸取参照物溶液、对照品溶液和供试品溶液，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：岛津Shim-pack GIST C18-AQ(250mmx4.6mm，5um)；流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按表a的规定进行梯度洗脱；
表a梯度洗脱程序
时间(min) 流动相A(％) 流动相B(％) 0～5 10 90 5～78 10→80 90→20
流速：0.8mL/min；柱温：35℃；进样量：10μL；检测波长：0～25min为220nm，25-78min为203nm。
2.如权利要求1所述的重楼标准汤剂质量检测方法，其特征在于，所述煎煮法包括：取重楼饮片加水浸泡30-40min，煎煮两次，第一次煎煮时长为30-40min，第二次煎煮时长为25-30min，趁热进行固液分离，合并滤液，浓缩干燥，制得重楼标准汤剂干膏粉。
3.如权利要求1所述的重楼标准汤剂质量检测方法，其特征在于，所述照薄层色谱法包括如下步骤：
(1)制备供试品溶液a：取重楼标准汤剂样品0.5g，加乙醇10mL，经加热回流30min，放冷滤过，滤液作为供试品溶液a；
(2)制备对照药材溶液a：取重楼对照药材0.5g，加乙醇10ml，加热回流30min，放冷滤过，滤液作为对照药材溶液a；
(3)制备对照品溶液a：取重楼皂苷Ⅰ对照品、重楼皂苷Ⅱ对照品、重楼皂苷Ⅶ对照品适量，加甲醇溶解，制成每1ml含重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ各0.4mg的混合溶液，作为对照品溶液a；
(4)进行薄层色谱分析：薄层色谱条件为，薄层板：硅胶G薄层板；点样量：吸取供试品溶液5μl、对照药材溶液10μl、对照品溶液10μl；展开剂：体积比为15:5:1的三氯甲烷-甲醇-水的下层溶液；显色剂：喷以10％硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰。
4.如权利要求1所述的重楼标准汤剂质量检测方法，其特征在于，所述热浸法以乙醇为溶剂，按照醇溶性浸出物测定法下的热浸法测定浸出物范围。
5.如权利要求1所述的重楼标准汤剂质量检测方法，其特征在于，采用液相色谱法测定特征图谱还包括如下步骤：
(1)制备参照物溶液b：取重楼对照药材0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％乙醇15mL，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用30％乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液作为参照物溶液b；
(2)制备对照品溶液b：分别取重楼皂苷Ⅰ对照品、重楼皂苷Ⅱ对照品、重楼皂苷Ⅶ对照品适量，精密称定，分别加甲醇溶解，分别制得浓度为20μg/mL的对照品溶液b1、对照品溶液b2、对照品溶液b3；
(3)制备供试品溶液b：取重楼标准汤剂样品粉末0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％乙醇15mL，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，用30％乙醇补足减失重量，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液b。
6.如权利要求5所述的重楼标准汤剂质量检测方法，其特征在于，制备供试品溶液b所取的重楼标准汤剂样品粉末为过三号筛的粉末。
7.如权利要求1所述的重楼标准汤剂质量检测方法，其特征在于，采用液相色谱法测定重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ含量包括：进行液相色谱仪分析，以重楼皂苷Ⅰ对照品、重楼皂苷Ⅱ对照品、重楼皂苷Ⅶ对照品制成的溶液作为对照品溶液c，以重楼标准汤剂样品制成的溶液作为供试品溶液c，分别精密吸取对照品溶液c和供试品溶液c，分别注入液相色谱仪，测定，即得；其中，采用的色谱条件为，色谱柱：岛津Shim-pack GIST C18-AQ(250mmx4.6mm，5um)，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按规定进行梯度洗脱；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；进样量：10μL；检测波长：203nm。
8.如权利要求7所述的重楼标准汤剂质量检测方法，其特征在于，采用液相色谱法测定重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ含量还包括如下步骤：
(1)制备对照品溶液：取重楼皂苷Ⅰ对照品、重楼皂苷Ⅱ对照品、重楼皂苷Ⅶ对照品适量，精密称定，加甲醇溶解，制成每1ml含重楼皂苷Ⅰ、重楼皂苷Ⅱ、重楼皂苷Ⅶ各0.4mg的混合溶液，摇匀，作为对照品溶液c；
(2)制备供试品溶液：取重楼标准汤剂样品粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇25mL，称定重量，加热回流30min，放冷，再称定重量，用乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液c。
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