CN100535655C - 头花蓼药材的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了头花蓼药材，它具有如图1D所示的HPLC指纹图谱，含有13个特征峰，其中，色谱条件为：色谱柱：依利特Hypersil ODS色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；柱温：25℃；流动相：乙腈(A)-0.4%磷酸(B)溶液二元梯度洗脱，重量百分比为：0-30%∶100-70%；流速：0.8mL·min^-1；检测波长：310nm；进样量20μl。本发明还提供了提取物及其质量控制方法。本发明质控制方法对不同产地头花蓼进行了考察比较，构建了头花蓼HPLC的指纹图谱，利用HPLC指纹特征可全面监控头花蓼药材的质量，保证其稳定、均一、可控，有效地控制药材的质量，达到控制整个药物制剂的目的。

Description

头花蓼药材的检测方法

技术领域

本发明涉及头花蓼药材及其提取物和质量控制方法。

背景技术

头花蓼为蓼科植物头花蓼(Polygonum capitatum Buch.-Han.ex D.Don)的干燥全草或地上部分。头花蓼作为药用，最早收载于1963年版《广西中药志》称其为石莽草、石辣蓼，“味辛，微涩，性温，散瘀止痛，治风湿，跌打。”《广西中草药》记载其味“苦，辛，性平”，解毒消炎，治痢疾，皮肤溃疡，无名肿毒。《云南中草药》称其为太阳草，味酸，性凉。清热利尿，通淋，治血尿，膀胱炎。《文山中草药》称其为满地红、火溜草，治疗布疹、黄水疮。《贵州中草药名录》称其为省丁草、四季红，其味酸，性凉，清热解毒，利水消肿，治肾炎水肿、腮腺炎、跌打肿痛、无名肿毒。《全国中草药汇编》治“泌尿系统感染、痢疾、腹泻、血尿；尿布疹、黄水疮”。《贵州省中药材、民族药材质量标准》：味苦，辛，性凉，清热利湿，解毒止痛，活血散瘀，利尿通淋。用于痢疾、肾盂肾炎、膀胱炎、尿路结石、盆腔炎、前列腺炎、风湿痛、跌打损伤、疮疡湿疹。近年来，以头花蓼为原料已成功地开发出泌感灵干糖浆，热淋清颗粒，热淋清胶囊，热淋清滴丸，热淋清糖浆，泌淋胶囊，泌淋颗粒，宁泌泰胶囊，通淋舒颗粒，泌淋清胶囊等一系列苗药制剂，在临床上发挥了较好的治疗作用。

经调查发现，同科同属同组植物尼泊尔蓼(头状蓼)Polygonum nepalense Meisn易被认作头花蓼。头状蓼具有清热解毒，收敛固肠，祛湿的功效，与头花蓼功效不同，两者不可混用。但两种药材在性状上很难区别，粉末显微鉴别也难区别。在2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》中是以槲皮素作为质量评价的指标。对于成分复杂的头花蓼仅以槲皮素作为质量控制指标是不全面的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种质量稳定、均一、可控性强的头花蓼药材，本发明所述解决的另一技术问题是提供了该药材的质量控制方法。

本发明提供了一种头花蓼药材，它具有如图1D所示的HPLC指纹图谱，含有13个特征峰，

其中，色谱条件为：色谱柱：依利特Hypersil ODS色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；柱温：25℃；流动相：乙腈(A)-0.4％磷酸(B)溶液二元梯度洗脱，重量百分比为：0-30％∶100-70％；流速：0.8mL·min^-1；检测波长：310nm；进样量20μl。

其中，所述的13个特征峰的相对保留时间分别为：

1号峰：0.083±0.001、2号峰：0.178±0.001、3号峰：0.357±0.001、4号峰：0.388±0.001、5号峰：0.460±0.001、6号峰：0.520±0.001、7号峰：0.544±0.002、8号峰：0.792±0.002、9号峰：0.848±0.002、10号峰：0.888±0.001、11号峰1、12号峰：1.266±0.002、13号峰：1.296±0.002。

本发明还提供了一种头花蓼提取物，它是由头花蓼药材为原料，经水或有机溶剂提取制备而成。

本发明提供了一种药物组合物，它是由所述的头花蓼原生药材或所述的头花蓼提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药剂。

所述的药剂是口服制剂、注射制剂。

本发明还提供了一种控制头花蓼药材的质量控制方法，它包括如下步骤：

a、制备没食子酸参照物溶液：取没食子酸加50％甲醇溶解制成0.0204mg·mL^-1的溶液；

b、制备槲皮素参照物溶液：取槲皮素对照品适量，加甲醇溶解制成0.0216mg·mL^-1的溶液；

c、制备槲皮苷参照物溶液：取槲皮苷对照品适量，加甲醇溶解制成0.0992mg·mL^-1的溶液；

d、供试品溶液的制备：取头花蓼细粉，加100ml80％乙醇，置水浴中加热回流，滤过，残渣再入用80％乙醇回流提取，滤过，合并滤液。滤液置蒸发皿中挥干，残渣加80％乙醇定容，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

e、色谱条件：

色谱条件为：色谱柱：依利特Hypersil ODS色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；柱温：25℃；流动相：乙腈(A)-0.4％磷酸(B)溶液二元梯度洗脱，重量百分比为：0-30％∶100-70％；流速：0.8mL·min^-1；检测波长：310nm；进样量20μl。

f、测定法：取对照品和供试品溶液各15ul，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。

本发明所建立的方法及其得出的指纹图谱，指纹图谱中有三个色谱峰进行了归属，同时指纹图谱中有十三个峰是稳定的，可作为头花蓼的指纹特征峰。色谱指纹图谱具有整体性、模糊性和可以量化的特点，可以充分地、全面地反映中药的整体质量，是目前最佳的控制中药质量的模式，也是比较科学的评价中药质量的方法。为了弥补头花蓼质量控制技术的不足，使其更加完善、科学。本发明质量控制方法对不同产地头花蓼进行了考察比较，构建了头花蓼HPLC的指纹图谱，利用HPLC指纹特征可全面监控头花蓼药材的质量，保证其稳定、均一、可控，建立的HPLC指纹图谱可以明显的区别合格与不合格药材。同时，该质量控制方法能有效地控制药材的质量，达到控制整个药物制剂的目的。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1头花蓼和头状蓼的HPLC指纹图谱(其中，图1A-没食子酸  图1B-槲皮苷 图1C-槲皮素  图1D-头花蓼  图1E-头状蓼)

图2稳定性试验相似度评价结果

图3精密度试验相似度评价结果

图4重复性试验相似度评价结果图

图5头状蓼与头花蓼药材对照指纹图谱的比较图(S1-头花蓼  S2-头状蓼)

图6不同产地头花蓼的HPLC指纹图谱(S₁-贵州贵阳  S₂-贵州剑河  S₃-贵州锦屏  S₄-贵州安顺  S₅-贵州施秉  S₆-四川米易  S₇-四川峨眉(向阳处)  S₈-四川峨眉(阴暗处)  S₉-四川成都  S₁₀-云南昆明  S₁₁-云南大理  S₁₂-西藏墨脱)

图7不同采收期头花蓼的HPLC指纹图谱

图8有机溶剂回流提取色谱图(其中，图8A、甲醇超声提取色谱图；图8B、80％乙醇超声提取色谱图；图8C、80％甲醇超声提取色谱图；图8D、甲醇回流提取色谱图；图8E、80％乙醇回流提取色谱图；图8F、80％甲醇回流提取色谱图)

图9甲醇-0.4％磷酸梯度洗脱头花蓼HPLC色谱图

图10乙腈-0.4％磷酸梯度洗脱头花蓼HPLC色谱图

具体实施方式

实施例1本发明药物的制备

【制法】取头花蓼切段，加水煮二次，每次1.5小时，合并煎液，静置，滤过，滤液浓缩成稠膏，干燥，粉碎，加辅料适量，混匀，装胶囊，即得。

【性状】本品为胶囊剂，内容物为棕褐色粉末；气微，味微涩。

【鉴别】取本品3g加甲醇20ml，水浴回流1小时，滤过，滤液浓缩至约2ml，上氧化铝柱(中性氧化铝3g，100～200目，105℃干燥30分钟，柱内径1cm)，用甲醇50ml洗脱，收集脱液，水浴上浓缩至约1ml，作为供试品溶液。另取头花蓼对照药材1.5g，加水20ml，煮沸30分钟，滤过，滤液浓缩至干，加甲醇2ml溶解，同法制成对照品溶液。照薄层色谱法(附录VI B)。试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一聚酰胺薄层板上，以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，氨气中薰1分钟，置紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点。

【检查】应符合胶囊剂项下有关的各项规定(附录I L)。

【功能与主治】清热泻火，利水通淋。主治热淋。

【用法与用量】口服，一次4～6粒，一日3次。

实施例2本发明药物颗粒剂的制备

【制法】取头花蓼1000g加水煎煮二次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度为1.38(80℃)的稠膏，干燥，粉碎，制成颗粒，干燥，制成400g，或加入适量的蔗糖粉，混匀，制成颗粒，干燥，制成800g，即得。

【性状】本品为棕褐色至深褐色的颗粒；气香，味甜、略涩。

【鉴别】取本品3g(无糖型)或6g(含糖型)，加甲醇20ml，水浴回流1小时，滤过，滤液浓缩至约2ml，加在氧化铝柱(中性氧化铝3g，100～200目，105℃干燥30分钟；柱内径为1cm)上，用甲醇50ml洗脱，收集洗脱液，置水浴上浓缩至干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。

另取头花蓼对照药材1.5g，加水20ml，煮沸30分钟，滤过，滤液浓缩至干，残渣加甲醇2ml使溶解，照供试品溶液制备方法，自加在氧化铝柱上起依法制成对照药材溶液。

照薄层色谱法(附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上，以醋酸乙酯-丁酮-甲酸-水(5∶3∶1∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置氨气中熏1分钟，置紫外光灯(365nm)下检视。

供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

【检查】

应符合颗粒剂项下有关的各项规定(附录I C)。

【功能与主治】

清热解毒，利尿通淋。

用于湿热蕴结，小便黄赤、淋漓涩痛之症，尿路感染，肾盂肾炎见上述证候者。

实施例3本发明控制头花蓼药材的方法

一、实验材料与仪器

1、药材

采自贵州、四川、云南、西藏，  共15批，经成都中医药大学万德光教授鉴定为蓼科植物头花蓼Polygonum capitatum Buch.-Ham.ex D.Don的干燥全草。头状蓼为蓼科植物尼泊尔蓼Polygonum nepalense Meisn的干燥全草，采至四川峨眉山。

2、仪器及试剂

Waters2695高效液相色谱仪，二级管阵列检测器，Empower色谱工作站，SB2200型超声清洗器。没食子酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号：0638-9501)，槲皮素对照品(中国药品生物制品检定所，批号：081-90003)，槲皮苷对照品(自制，纯度＞98％)，乙腈为色谱醇，其它试剂均为分析纯，水为重蒸镏水。

二、方法与结果

1、参照物溶液的制备

1.1没食子酸参照物溶液的制备

精密称取没食子酸对照品适量，加50％甲醇溶解制成0.0204mg·mL^-1的溶液，即得。

1.2槲皮素参照物溶液的制备

精密称取槲皮素对照品适量，加甲醇溶解制成0.0216mg·mL^-1的溶液，即得。

1.3槲皮苷参照物溶液的制备

精密称取槲皮苷对照品适量，加甲醇溶解制成0.0992mg·mL^-1的溶液，即得。

2、供试品溶液的制备

取头花蓼细粉(3号筛)2g，精密称定，置圆底烧瓶中，分别加100ml80％乙醇，置水浴中加热回流2h，滤过，残渣加100ml80％乙醇回流提取1h，滤过，合并滤液。滤液置蒸发皿中挥干，残渣加80％乙醇定容置10ml容量瓶中。用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。

取头状蓼细粉(3号筛)2g，精密称定，置圆底烧瓶中，加100ml80％乙醇，置水浴中加热回流2h，滤过，残渣加100ml80％乙醇回流提取1h，滤过，合并滤液。滤液置蒸发皿中挥干，残渣加80％乙醇定容置10ml容量瓶中。用微孔滤膜(0.45μm)滤过，取续滤液，即得。

3、色谱条件

色谱柱：依利特Hypersil ODS色谱柱(4.6mm×150mm，5μm)；柱温：25℃；流动相：乙腈(A)-0.4％磷酸(B)溶液二元梯度洗脱见表1；流速：0.8mL·min^-1；检测波长：310nm；进样量20μl。

表1  线性梯度洗脱流动相配比变化

4、空白试剂试验

取制备供试品溶液的试剂(80％乙醇)，进样15ul，记录色谱图，从色谱图可知，所用试剂对指纹图谱测定基本无干扰。

5、测定法：取对照品和供试品溶液各15ul，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。见图1。

6、方法学考察

以贵州锦屏产头花蓼药材为样品，对其稳定性、仪器精密度、实验方法、重现性作了相应考察，结果证明稳定性及重现性良好。

6.1稳定性试验取同一份供试品溶液，分别在0、2、6、12、20、30h进行检测，直观观察指纹图谱的全貌无明显差别，用相似度软件计算，在同一台仪器测定色谱指纹图谱的相似度分别为：0.984，0.994，0.995，0.961，0.992，0.982，均大于0.95。以槲皮苷峰为参照峰，考察色谱峰相对保留时间及相对峰面积的一致性，各主要色谱峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均低于3。见表2、表3、见图2。

表2稳定性试验结果

表3稳定性试验结果

6.2精密度试验取同一份供试品溶液，重复进样6次，直观观察指纹图谱的全貌无明显差别，用相似度软件计算，在同一台仪器测定色谱指纹图谱的相似度分别为：0.999，0.996，0.998，0.999，0.996，均大于0.95。以槲皮苷峰为参照峰，考察色谱峰相对保留时间及相对峰面积的一致性，各主要色谱峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均低于3。见表4、5，见图3。

表4精密度试验结果

表5精密度试验结果

6.3重现性试验取同一产地的供试品5份，同法检测，直观观察指纹图谱的全貌无明显差别，用相似度软件计算，在同一台仪器测定色谱指纹图谱的相似度分别为：0.992，0.951，0.995，0.993，0.979，均大于0.95。以槲皮苷峰为参照峰，考察色谱峰相对保留时间及相对峰面积的一致性，各主要色谱峰相对保留时间及相对峰面积的RSD均低于3。见表6、7，见图4。

表6重现性试验结果

表7重现性试验结果

6.4专属性实验头状蓼与头花蓼的指纹图谱相比，相似度为0.304，表明该指纹图谱能区别出其他药材。结果见图5。

6.4指纹图谱建立精密吸取对照品与供试品溶液各20ul，注入高效液相色谱仪，按选定的色谱条件，进行检测。同一实验条件下，测定所有供试品HPLC色谱图。根据不同产地、不同采收时间供试品测定结果所给出的峰数、峰值(积分值)和峰位(相对保留时间)等相关参数进行分析、比较，制定优化的指纹图谱(见图6、7)

6.5指纹图谱分析及数据处理

6.5.1共有指纹峰标定比较不同产地头花蓼及不同采收期头花蓼供试品溶液给出的相关参数，其中13个峰是各批供试品共有，因此确定这13个峰为其共有指纹峰，其中槲皮苷峰较没食子酸峰及槲皮素峰大，选作为参照峰，不同产地及不同采收期头花蓼指纹图谱共有峰的相对保留时间见表8。

表8头花蓼样品的相对保留时间

注：11号为11月采集品；13、14、15号分别为8、10、3月采集品，其它均为9月

6.5.2头花蓼指纹图谱相似度评价：将12个不同产地、4个不同采收期头花蓼样品测定数据导入中药指纹图谱相似度计算软件，经选峰，设定匹配模板，将峰自动匹配，然后设定标准模板，进行谱峰差异性评价和整体相似性评价。通过中药指纹图谱相似度计算软件得出头花蓼HPLC指纹图谱共有模式，与共有模式比较，12个批次不同产地头花蓼的相似度结果见表，4批次不同采收期头花蓼的相似度结果见表9、10。

表9不同产地头花蓼结果

注：7号样为峨眉山向阳处植物；8号样为峨眉山阴凉处植物；

表10不同采收期结果

实施例4本发明药材质量控制方法的条件筛选

1、样品提取条件的选择

为了尽可能地体现头花蓼所含化学成分的特征。根据头花蓼所含成分的性质，选择了80％甲醇、甲醇、80％乙醇为提取溶剂，提取方法考察了热回流、超声提取，其中以80％乙醇回流提取较完全，并且80％乙醇较甲醇安全。见图8。

2、检测波长的选择

采用二极管阵列200～400nm扫描，综合考虑头花蓼中各主要成分的吸收光谱，使各被测组分均有较大吸收，选用310nm为指纹图谱检测波长。

3、流动相的选择

比较了乙腈-0.4％磷酸溶液系统和甲醇-0.4％磷酸溶液系统下的色谱图，发现乙腈-0.4％磷酸溶液系统梯度洗脱的柱压较低，同时发现流动相的改变对其基线影响较小，所以选择乙腈-0.4％磷酸溶液系统为流动相。见图9、10。

4、头花蓼药材的鉴别和评价

本实验确定的样品制备方法和色谱条件测定的指纹图谱同样可以进行头花蓼与头状蓼的鉴别。从图谱中可看出，头状蓼的槲皮苷峰基本检测不出，色谱图的全貌也明显不同于头花蓼，将其色谱图与头花蓼的指纹图谱进行相似度评价，相似度仅为0.304。

5、不同产地头花蓼药材的评价

通过指纹图谱相似度软件对12批不同产地头花蓼进行评价得出，贵州施秉栽培的头花蓼与共有模式比较，相似度仅为0.130，而其他产地头花蓼样品与共有模式比较相似度均大于0.910，说明12批不同产地头花蓼药材中除贵州施秉栽培样品外，其他产地头花蓼之间具有较好的相似性。

Claims (3)

1、一种头花蓼药材的检测方法，它包括如下步骤：

a、制备没食子酸参照物溶液：取没食子酸加50％甲醇溶解制成0.0204mg·mL^-1的溶液；

b、制备槲皮素参照物溶液：取槲皮素对照品适量，加甲醇溶解制成0.0216mg·mL^-1的溶液；

c、制备槲皮苷参照物溶液：取槲皮苷对照品适量，加甲醇溶解制成0.0992mg·mL^-1的溶液；

d、供试品溶液的制备：取头花蓼细粉，加100ml 80％乙醇或甲醇，置水浴中加热回流，滤过，残渣再入用80％乙醇回流提取，滤过，合并滤液。滤液置蒸发皿中挥干，残渣加80％乙醇定容，用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得；

e、色谱条件为：

色谱柱为依利特Hypersil ODS色谱柱；柱温25℃；流动相为乙腈-0.4％磷酸溶液或甲醇-0.4％磷酸溶液二元梯度洗脱，重量百分比为0-30％∶100-70％；流速为0.8mL·min^-1；检测波长310nm；进样量20μl；

f、测定法：取参照物溶液和供试品溶液各15ul，注入高效液相色谱仪，记录色谱图；

其中步骤e中依利特Hypersil ODS色谱柱规格为4.6mm×150mm，5μm。

2、根据权利要求1所述的头花蓼药材的检测方法，其特征在于：步骤d所述的溶剂为80％乙醇。

3、根据权利要求1所述的头花蓼药材的检测方法，其特征在于：步骤e所述的流动相为：乙腈-0.4％磷酸溶液。

Images