CN115327019B - 一种桑枝的质量控制方法 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及药物含量测定技术领域，特别涉及一种桑枝的质量控制方法，其包括以下步骤：S1.对照品溶液的制备；S2.供试品溶液的制备；S3.测定：分别精密吸取所述对照品溶液与所述供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪进行测定；步骤S3中的色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以流动相A为乙腈，流动相C为0.9％～1.1％的冰醋酸溶液进行梯度洗脱，流速为1ml/min，柱温为25℃。精密测定桑枝饮片的质量标准，为临床用药提供指导，为制定桑枝中桑皮苷A、氧化白藜芦醇的含量标准提供依据，该测定方法准确、简便、重复性好；优化供试品制备方法，提取效率高，能够通过具体指标控制桑枝中有效成分的含量。
Description
技术领域
本申请涉及药物含量测定技术领域，特别涉及一种桑枝的质量控制方法。
背景技术
桑枝，为桑树的枝叶、桑条、嫩桑枝的总称。2020年版药典记载其为桑(Morus albaL.)的干燥嫩枝，具有祛风湿，利关节的功效，用于治疗风湿痹病，肩臂、关节酸痛麻木。我国作为桑分布最多的国家，自古就有栽桑养蚕的说法，桑枝具有很高的药用价值、食用价值和化学工业价值。现代药理学研究表明，桑枝具有多种生物活性成分，包括黄酮类、生物碱类、芪类等，具有抗炎、降血糖、降血脂等多种生物活性。
芪类物质属于多酚类次生代谢物，氧化白藜芦醇又称氧化芪三酚，是二苯乙烯衍生物的芪类物质，研究表明，氧化白藜芦醇是一种络氨酸酶抑制剂，抑制黑色素的生成，还具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗糖尿病、神经保护等作用，此外该化合物易溶于水，具有低毒性，适用于药物开发，成为近年来的研究热点。桑皮苷A又称氧化白藜芦醇苷，是氧化白藜芦醇的成苷化合物，现代药理研究表明桑皮苷A具有治疗酒精肝、抗炎、镇痛、止咳等功效。
已有文献分别报道过关于桑皮苷A和氧化白藜芦醇的含量测定，也有文献报道关于桑不同部位中芪类成分的含量测定，但没有研究不同产地桑枝中桑皮苷A和氧化白藜芦醇的含量测定，也没有关于桑枝中桑皮苷A和氧化白藜芦醇薄层鉴别的研究。
发明内容
本申请的主要目的是提供一种桑枝的质量控制方法，旨在解决现有技术中未有关于不同产地桑枝中桑皮苷A和氧化白藜芦醇的含量测定，也没有关于桑枝中桑皮苷A和氧化白藜芦醇薄层鉴别的研究的技术问题。
S1.对照品溶液的制备；
S2.供试品溶液的制备；
S3.测定：分别精密吸取所述对照品溶液与所述供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪进行测定；
其中，步骤S3中的色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以流动相A为乙腈，流动相C为0.9％～1.1％的冰醋酸溶液进行梯度洗脱，流速为0.9～1.1ml/min，柱温为24℃-26℃。
优选地，所述步骤S3中，高效液相色谱条件还包括：色谱柱为XBridege C18色谱柱，4.6×250mm，5μm，桑皮苷A和氧化白藜芦醇的检测波长为320-330nm，理论塔板数不低于3000。
优选地，所述步骤S3中，梯度洗脱条件为：0-10min：流动相A 8％，流动相C 92％；10-15min：流动相A 8～18％，流动相C 92～82％，15min～25min:流动相A 18％，流动相C82％；
或，梯度洗脱条件为：0-10min：流动相A 9％，流动相C 91％；10-15min：流动相A 9～19％，流动相C 91～81％，15min～25min:流动相A 19％，流动相C 81％；
或，梯度洗脱条件为：0-10min：流动相A 10％，流动相C 90％；10-15min：流动相A10～20％，流动相C 90～80％，15min～25min:流动相A 20％，流动相C 80％。
优选地，所述步骤S1中，精密称取桑皮苷A，加入40％甲醇溶液制成每ml含桑皮苷A138.8μg；精密称取氧化白藜芦醇，加入80％乙醇溶液制成每ml含氧化白藜芦醇189.1μg。
优选地，所述步骤S2包括如下步骤：S21.精密称定桑枝粉末0.2g，加入40％甲醇15ml，称定重量后超声处理，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液，作为供试品；
S22.精密称定桑枝粉末0.2g，加入80％乙醇25ml，称定重量后超声处理，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液，作为供试品溶液。
优选地，所述步骤S21中的超声处理的时间为20min；所述步骤S22中的超声处理的时间为30min。
优选地，以所述对照品溶液进样量为横坐标，以桑皮苷A峰面积值和氧化白藜芦醇峰面积值分别为纵坐标，得到桑皮苷A浓度标准曲线的回归方程Y＝24400X-3960(r＝0.9999)，氧化白藜芦醇浓度标准曲线的回归方程Y＝49400X-2250(r＝0.9999)。
优选地，所述步骤S3之后，还包括步骤S4：
供试品溶液的制备：精密称定桑枝粉末，加入80％乙醇25ml，超声30min，摇匀，静置，取上清液过滤，得供试品备用；
对照品溶液制备：精密称取桑皮苷A，加入甲醇溶液制成每ml含桑皮苷A 47.47μg、氧化白藜芦醇50.20μg的混合溶液；
测定：吸取供试品溶液8μl，对照品溶液4μl分别点于聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯：甲醇：冰醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外灯下，在365nm的波长下检视；供试品色谱中，在与对照品药材色谱相应的位置上，显相同的颜色斑点。
优选地，乙酸乙酯、甲醇、冰醋酸的体积比为10：10：1。
优选地，精密称定桑枝粉末前，先将桑枝粉末过四号筛。
本申请的桑枝的质量控制方法具有如下有益效果：采用高效液相色谱法测定桑枝饮片中桑皮苷A和氧化白藜芦醇含量，通过薄层色谱法对桑枝中桑皮苷A和氧化白藜芦醇进行薄层鉴别，该薄层色谱法分离度好，斑点清晰。通过对供试品制备方法进行优选，精密测定桑枝饮片的质量标准，为临床用药提供指导，为制定桑枝中桑皮苷A、氧化白藜芦醇的含量标准提供依据，该测定方法准确、简便、重复性好；优化供试品制备方法，提取效率高，能够通过具体指标控制桑枝中有效成分的含量。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本申请提供的对照品-桑皮苷A和氧化白藜芦醇的化学结构式；
图2为本申请提供的桑皮苷A和氧化白藜芦醇对照品色谱图；
图3为本申请提供的桑皮苷A和氧化白藜芦醇供试品色谱图；
图4为本申请提供的桑皮苷A采用甲醇作为提取溶剂时的色谱图；
图5为本申请提供的桑皮苷A采用乙醇作为提取溶剂时的色谱图；
图6为本申请提供的桑皮苷A在不同提取时间下的色谱图；
图7为本申请提供的桑皮苷A采用40％甲醇提取时不同加入量的色谱图；
图8为本申请提供的桑皮苷A采用不同提取方式时的色谱图；
图9为本申请提供的氧化白藜芦醇采用乙醇作为提取溶剂时的色谱图；
图10为本申请提供的氧化白藜芦醇采用甲醇作为提取溶剂时的色谱图；
图11为本申请提供的氧化白藜芦醇在不同提取时间下的色谱图；
图12为本申请提供的氧化白藜芦醇采用80％乙醇提取时不同加入量的色谱图；
图13为本申请提供的氧化白藜芦醇采用不同提取方式时(均提取30min)的色谱图；
图14为本申请采用甲醇作为提取溶剂下桑皮苷A的峰面积/质量图；
图15为本申请采用乙醇作为提取溶剂下桑皮苷A的峰面积/质量图；
图16为本申请不同提取时间下桑皮苷A的峰面积/质量图；
图17为本申请不同料液比下桑皮苷A的峰面积/质量图；
图18为本申请不同提取方式下桑皮苷A的峰面积/质量图；
图19为本申请采用乙醇作为提取溶剂下氧化白藜芦醇的峰面积/质量图；
图20为本申请采用甲醇作为提取溶剂下氧化白藜芦醇的峰面积/质量图；
图21为本申请不同提取时间下氧化白藜芦醇的峰面积/质量图；
图22为本申请不同料液比下氧化白藜芦醇的峰面积/质量图；
图23为本申请不同提取方式下氧化白藜芦醇的峰面积/质量图；
图24为本申请桑皮苷A的标准曲线；
图25为本申请氧化白藜芦醇的标准曲线；
图26为本申请桑枝中桑皮苷A和氧化白藜芦醇的薄层鉴别图样；
图27为本申请桑枝在不同流动相比例下的色谱图；
图28为本申请桑枝在不同流动相比例下的色谱图；
图29为本申请桑枝在不同类型流动相下的色谱图；
图30为本申请桑枝在不同类型流动相下的指纹图谱。
本申请目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本申请提出一种桑枝的质量控制方法。包括以下步骤：
S1.对照品溶液的制备；
S2.供试品溶液的制备；
S3.测定：分别精密吸取所述对照品溶液与所述供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪进行测定；
其中，步骤S3中的色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以流动相A为乙腈，流动相C为0.9％～1.1％的冰醋酸溶液进行梯度洗脱，流速为0.9～1.1ml/min，柱温为24℃-26℃。
本方案采用高效液相色谱法测定桑枝中桑皮苷A和氧化白藜芦醇含量，并且是分别提取桑皮苷A和氧化白藜芦醇，采用分别制备的原因是在实际操作的过程中，桑皮苷A和氧化白藜芦醇是两种极性相反的化合物，在同一提取溶剂下，无法保证两者的回收率同时达到90％以上。先制备对照品溶液和供试品溶液，本方案中桑枝的质量控制方法优选上述参数和条件，在步骤S3的测定步骤中：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录25min内的色谱峰。其中，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以1％冰醋酸溶液为流动相C进行梯度洗脱；流速为0.9～1.1ml/minn。为了确定最优的流动相，本方案中分别考察乙腈-1％甲酸、乙腈-0.8％甲酸、甲醇-1％冰醋酸溶液、乙腈-体积分数为1％的冰醋酸溶液、作流动相系统时，对色谱峰的影响，具体的检测结果如图29-30所示，相比之下，乙腈-1％冰醋酸对桑皮苷A的分离度更好，桑皮苷A和氧化白藜芦醇与左右的杂峰分离度更好，且冰醋酸是弱酸，对柱子的耐受性要求低，甲醇相比乙腈，乙腈的分离效果更好，且乙腈与高比例的水相混合压力更低。
最终在选用冰醋酸作为流动相，以及采用了最优的流动相梯度等参数后，桑皮苷A和氧化白藜芦醇的峰形尖锐，拖尾因子改善，其中，桑皮苷A的拖尾因子小于1.2，氧化白藜芦醇的拖尾因子小于1，桑皮苷A和氧化白藜芦醇的分离度均大于1.8，桑皮苷A的理论塔板数大于9000，氧化白藜芦醇的理论塔板数大于50000，与此同时，冰醋酸不会像磷酸一样，在高比例有机相下析出，同样适用于质谱检测，因此本实施例中选择乙腈+体积分数为1％的冰醋酸溶液为最终流动相。
本方案在24-26℃范围内的不同柱温条件下均可以获得分离效果较好的色谱图，具如可为24℃、25℃或26℃等，其中，在柱温在25℃时，色谱峰能达到最好的分离效果。
进一步地，所述步骤S3中，高效液相色谱条件还包括：色谱柱为XBridege C18色谱柱，4.6×250mm，5μm，桑皮苷A和氧化白藜芦醇的检测波长为320-330nm，理论塔板数不低于3000。
选择320-330nm的检测波长，主要是在这一波长段基线较平稳，杂质干扰较少，且通过DAD进行全波长扫描，发现桑皮苷A和氧化白藜芦醇的最大吸收波长为324nm。本方案优选色谱柱为XBridege C18色谱柱，4.6×250mm，5μm，色谱峰整体分离效果最好。
进一步地，所述步骤S3中，梯度洗脱条件为：0-10min：流动相A 8％，流动相C92％；10-15min：流动相A 8～18％，流动相C 92～82％，15min～25min:流动相A18％，流动相C 82％；
或，梯度洗脱条件为：0-10min：流动相A 9％，流动相C 91％；10-15min：流动相A 9～19％，流动相C 91～81％，15min～25min:流动相A 19％，流动相C 81％；
或，梯度洗脱条件为：0-10min：流动相A 10％，流动相C 90％；10-15min：流动相A10～20％，流动相C 90～80％，15min～25min:流动相A 20％，流动相C 80％。以上三个洗脱条件均是本实施例中得到的最佳梯度洗脱条件，本方案中的梯度洗脱程序较为特殊，0～10min采用等度洗脱，15～25分钟同样采用等度洗脱，缩短流动相洗脱的时间，采用上述洗脱方式，色谱图的峰形和分离度良好。
本方案采用另一种梯度洗脱方式与上述梯度洗脱条件对比，具体的梯度洗脱过程为：0～10min，流动相A:6～10％，流动相C：94～90％；10～15min，流动相A:8～9％-18～20％，流动相C:92～90％-80～82％；15-25min，流动相A：15～25％，流动相C为85～75％。
如图27-28所示，图27中：A曲线指A相6％，C相94％；B曲线指A相7％，C相93％；C曲线指A相8％，C相92％；D曲线指A相9％，C相91％；E曲线指A相10％，C相90％。图28中：曲线1指A相：25％，C相：75％；曲线2指A相：24％，C相：76％；曲线3指A相：23％，C相：77％；曲线4指A相：22％，C相：78％；曲线5指A相：20％，C相：80％；曲线6指A相：19％，C相：81％；曲线7指A相：18％，C相：82％；曲线8指A相：17％，C相：83％；曲线9指A相：16％，C相：84％；曲线10指A相：15％，C相：85％。从图中结果可以看出，0-10min内A相比例由6～10，C相比例由94～90,桑皮苷A与左右的杂峰分离更好，但峰形变尖锐，保留时间变短，综合考虑，选择A相为9％乙腈，C相为91％的冰醋酸。由图可以看出，15-25min乙腈从25→15，1％冰醋酸从75→85，氧化白藜芦醇左边的峰越来越接近主峰，右边的峰也越来越接近主峰，甚至消失。因此，综合考虑选择A为19％乙腈，C相为81％冰醋酸。
进一步地，所述步骤S1中，精密称取桑皮苷A，加入40％甲醇溶液制成每ml含桑皮苷A 138.8μg；精密称取氧化白藜芦醇，加入80％乙醇溶液制成每ml含氧化白藜芦醇189.1μg。此处的精密称取是指称取重量应准确至所称取重量的十万分之一。
进一步地，所述步骤S2包括如下步骤：S21.精密称定桑枝粉末0.2g，加入40％甲醇15ml，称定重量后超声处理，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液，作为供试品；
S22.精密称定桑枝粉末0.2g，加入80％乙醇25ml，称定重量后超声处理，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液，作为供试品溶液。
桑皮苷A作为氧化白藜芦醇的成苷化合物，如图1所示，其Log P值为-1.16，而氧化白藜芦醇的Log P值为2.68，而Log P值反映了物质在油水两相中的分配情况，本研究在考察桑皮苷A和氧化白藜芦醇的提取溶剂考察时，发现随着提取溶剂比例的不同，二者的提取效果呈反比，因此分别考察了20％甲醇～50％甲醇及10％乙醇～30％乙醇对桑皮苷A的提取效果，如图4-5所示，发现40％甲醇对桑皮苷A的提取效果最好，考察了70％～90％甲醇及60％～90％乙醇对氧化白藜芦醇提取效果，如图9-10所示，发现80％甲醇和80％乙醇对氧化白藜芦醇的提取效果相同，考虑到环保无毒，选择80％乙醇作为氧化白藜芦醇的提取溶剂。根据桑皮苷A和氧化白藜芦醇的化学性质，制备相应的对照品溶液进行定位比对，色谱图能够全面反映桑枝的质量信息，用于桑枝的质量评价。
进一步地，所述步骤S21中的超声处理的时间为20min；所述步骤S22中的超声处理的时间为30min。为了进一步提高指纹图谱的检测效果，本方案选择了两种提取方式进行测定，具体的指纹图谱测试结果如图8和图13所示，同时也选取了多种超声处理时间进行测定，具体的指纹图谱测试结果如图6和图11所示，当选用回流以及超声方式分别进行提取时，桑枝的回流提取效果不理想，超声提取时效果更完全，故本实施例中优选超声提取。在桑皮苷A的超声处理过程中，当分别超声处理10min、15min、20min、25min和30min时，超声处理20分钟的提取效果明显比其他时间的提取效果好，本实施例中桑皮苷A的超声处理时间为20min；同样的，在氧化白藜芦醇的超声处理过程中，当分别超声处理10min、20min、30min和40min时，超声处理30分钟的提取效果明显比其他时间的提取效果好，本实施例中的氧化白藜芦醇超声处理时间为30min。通过以上各个实施例中对供试品溶液制备方法的优化和对色谱条件的优化，使桑枝的色谱峰分离度更好，杂峰更少，出峰时间更快。
进一步地，以所述对照品溶液进样量为横坐标，以桑皮苷A峰面积值和氧化白藜芦醇峰面积值分别为纵坐标，得到桑皮苷A浓度标准曲线的回归方程Y＝24400X-3960(r＝0.9999)，氧化白藜芦醇浓度标准曲线的回归方程Y＝49400X-2250(r＝0.9999)。
进一步地，所述步骤S3之后，还包括步骤S4—采用薄层色谱法同时鉴别桑枝中的桑皮苷A及氧化白藜芦醇，包括步骤如下：
供试品溶液的制备：精密称定桑枝粉末，加入80％乙醇25ml，超声30min，摇匀，静置，取上清液过滤，得供试品备用；
对照品溶液制备：精密称取桑皮苷A，加入甲醇溶液制成每ml含桑皮苷A 47.47μg、氧化白藜芦醇50.20μg的混合溶液；
测定：吸取供试品溶液8μl，对照品溶液4μl分别点于聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯：甲醇：冰醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外灯下，在365nm的波长下检视；供试品色谱中，在与对照品药材色谱相应的位置上，显相同的颜色斑点。
2020版药典中，未确定桑枝的含量测定和薄层鉴别的方法，因此在含量测定的基础上，本方案又对桑枝中桑皮苷A和氧化白藜芦醇进行了薄层鉴别。在此之前，本方案选取了氯仿：甲醇：醋酸：水为展开剂，硅胶G板为固定相，发现桑皮苷A的分离度达不到要求；后对展开剂进行调整，发现以乙酸乙酯-甲醇＝10:2进行展开，此时桑皮苷A拖尾严重；后又加入醋酸，以乙酸乙酯：甲醇：醋酸＝10：4：2，桑皮苷A拖尾情况减轻，考虑两者极性相反，需要同时展开时，展开剂的极性不能过大也不能过小，因此加大甲醇的比例，以乙酸乙酯：甲醇：冰醋酸(10：10：1)进行展开，桑皮苷A和氧化白藜芦醇分离度良好，但桑皮苷A的点不够聚拢，考虑桑皮苷A含有多羟基，改用聚酰胺薄膜板，此时得到的桑皮苷A和氧化白藜芦醇的分离度良好，斑点聚拢，无拖尾。
进一步地，乙酸乙酯、甲醇、冰醋酸的体积比为10：10：1。
进一步地，精密称定桑枝粉末前，先将桑枝粉末过四号筛。桑枝粉末过筛后的粒度为250±9.9μm，当桑枝粉末过筛至这一细度时，整体较为分散，后续的检测过程分离效果更好。
为了验证上述桑枝的质量控制方法的准确性，本方案有进行以下实验：
试药
乙酸(广州化学试剂厂、天津市科密欧化学试剂有限公司)，甲醇、乙酸乙酯、乙醇(广东光华科技股份有限公司)，乙腈(色谱级)(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，屈臣氏水(广州屈臣氏食品饮料有限公司)，桑皮苷A对照品(批号:21081303)、氧化白藜芦醇对照品(批号：20111903)均购自成都格利普生物科技有限公司。
仪器
ACQUITY UPLC Arc型液相色谱仪，色谱柱(XBridge C18 5μm,4.6×250nm)，SQP型1/1万电子天平和BP211D1/10万电子分析天平[赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]，DELTA超声提取器(东莞市大朗速洁超声设备制造厂)，P-1型薄层色谱展开缸(上海信谊仪器厂有限公司)(100mm×200mm)，全自动点样仪(ATS4，瑞士卡玛公司)，薄层色谱数码成像系统(TLC Visualizer 2，瑞士卡玛公司)，HH-6型数显恒温水浴锅(常州荣华仪器制造有限公司)。
色谱条件与系统适应性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以1％的冰醋酸为流动相C，按照下表进行梯度洗脱；流速为1ml/min，检测波长为324nm，柱温为25℃。
洗脱梯度表
| 时间 | 流动相A(％) | 流动相C(％) |
| 0～10 | 9 | 91 |
| 10～15 | 9→19 | 91→81 |
| 15～25 | 19 | 81 |
对照品溶液的制备：精密称取桑皮苷A适量，加40％甲醇溶液制成每ml含桑皮苷A189.1μg；精密称取氧化白藜芦醇适量，加80％乙醇溶液制成每ml含氧化白藜芦醇138.8μg，即得。
供试品溶液的制备：精密称定桑枝(过四号筛)粉末，加入40％甲醇15ml，称定重量，超声20min，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液，作为供试品；精密称定桑枝(过四号筛)粉末，加入80％乙醇25ml，称定重量，超声30min，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液，作为供试品溶液。
色谱条件与系统适应性试验
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈为流动相A，以1％的冰醋酸为流动相C，按照上表进行梯度洗脱；流速为1ml/min，检测波长为324nm，柱温为25℃。
(1)提取溶剂的选择：取桑枝(过四号筛)粉末，每份0.2g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，分别加入30％～60％的甲醇、70％～90％乙醇，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，取上清液，过0.22μm滤膜，取续滤液作为供试品。精密吸取上述两种溶液及对照品10μl，分别注入液相色谱仪中，照上述色谱条件测定桑皮苷A及氧化白藜芦醇的峰面积，计算平均含量。
测定结果如图4、图9-10所示，40％的甲醇对桑皮苷A的提取效果最好，故选择40％的甲醇作为桑皮苷A的提取溶剂，80％甲醇和80％乙醇对氧化白藜芦醇的提取效果相差不大，考虑到乙醇更加环保，确定80％乙醇作为氧化白藜芦醇的提取溶剂。
(2)提取时间的选择：取桑枝(过四号筛)粉末，每份0.2g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入40％的甲醇，密塞，称定重量，分别超声10～30min，放冷，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，取上清液，过0.22μm的滤膜，取续滤液作为供试品；取桑枝(过四号筛)粉末，每份0.2g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入80％的乙醇，密塞，称定重量，分别超声10～40min，放冷，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，取上清液，过0.22μm的滤膜，取续滤液作为供试品。精密吸取上述两种溶液及对照品10μl，分别注入液相色谱仪中，照上述色谱条件测定桑皮苷A及氧化白藜芦醇的峰面积，计算平均含量。
测定结果如图16、图21所示，对于桑皮苷A，超声20min的效果最好，对于氧化白藜芦醇，超声30min的效果最好。
(3)料液比的选择：取桑枝(过四号筛)粉末，精密称定0.2g，置于150ml的具塞锥形瓶中，分别加入40％的甲醇10～25ml，密塞，称定重量，超声20min，放冷，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，取上清液，过0.22μm的滤膜，取续滤液作为供试品；取桑枝(过四号筛)粉末，精密称定0.2g，置于150ml的具塞锥形瓶中，分别加入80％的乙醇10～50ml，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，取上清液，过0.22μm的滤膜，取续滤液作为供试品。精密吸取上述两种溶液及对照品10μl，分别注入液相色谱仪中，照上述色谱条件测定桑皮苷A及氧化白藜芦醇的峰面积，计算平均含量。
测定结果如图17、图22所示，对于桑皮苷A，加入15ml的40％的甲醇，提取效果更好；对于氧化白藜芦醇，加入25ml的80％乙醇，提取效果更好。
(4)提取方式的选择：取桑枝(过四号筛)粉末，精密称定0.2g，置于150ml的具塞锥形瓶中，分别加入40％的甲醇15ml，密塞，称定重量，一份超声20min，一份回流20分钟，放冷，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，取上清液，过0.22μm的滤膜，取续滤液作为供试品；取桑枝(过四号筛)粉末，精密称定0.2g，置于具塞锥形瓶中，分别加入80％的乙醇25ml，密塞，称定重量，一份超声30min，一份回流30min，放冷，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，取上清液，过0.22μm的滤膜，取续滤液作为供试品。精密吸取上述两种溶液及对照品10μl，分别注入液相色谱仪中，照上述色谱条件测定桑皮苷A及氧化白藜芦醇的峰面积，计算平均含量。
测定结果如图18、图23所示，对于桑皮苷A和氧化白藜芦醇，超声的效果更好。
对照品溶液的制备：精密称取桑皮苷A适量，加40％甲醇溶液制成每ml含桑皮苷A189.1μg；精密称取氧化白藜芦醇适量，加80％乙醇溶液制成每ml含氧化白藜芦醇138.8μg，即得。
线性关系的考察
取上述桑皮苷A对照品溶液，配制浓度为3.782μg/ml、5.673μg、9.455μg/ml、15.13μg/ml、28.37μg/ml、94.45μg/ml，取上述氧化白藜芦醇配制浓度为0.6941μg/ml、1.389μg/ml、2.776μg/ml、4.164μg/ml、13.88μg/ml、27.76μg/ml、41.64μg/ml，按色谱条件分析，测定各自峰面积，如图24-25所示，以对照品进样量(μg)为横坐标，峰面积值为纵坐标，计算回归方程:桑皮苷A在3.782～189.1μg的范围内线性良好，回归方程Y＝24400X－3960(r＝0.9999)，氧化白藜芦醇在0.6941μg～41.64μg的范围内线性良好，回归方程Y＝49400X－2250(r＝0.9999)。
精密度考察
精密吸取供试品溶液10μl,连续进样6次，测得桑皮苷A和氧化白藜芦醇的峰面积RSD值分别为0.07％和0.65％，表明仪器的精密度良好。
稳定性考察
取同一供试品溶液，分别于0，2，4，8，12，24h进样10μl，测得桑皮苷A和氧化白藜芦醇峰面积RSD分别为0.26％和0.51％，表明供试品24h内稳定。
重复性考察
取同一批号的样品，分别制备6份供试品溶液，进样10μl，测定桑皮苷A和氧化白藜芦醇的峰面积RSD分别为1.47％和1.86％，结果表明方法的重复性良好。
回收率考察
取桑枝样品约0.1g，精密称定，其中桑皮苷A的浓度分别为5.673μg/ml、9.455μg/ml、15.13μg/ml，氧化白藜芦醇的浓度分别为1.389μg/ml、2.776μg/ml、4.164μg/ml，按照1：0.5、1：1、1：1.5加入对照品，制备供试品溶液，精密吸取10μl进行HPLC分析，记录峰面积，计算回收率。结果表明桑皮苷A的回收率分别为1.62％，氧化白藜芦醇的回收率为2.0％，结果表明回收率符合要求，如表2所示。
表2.桑枝中桑皮苷A和氧化白藜芦醇的加样回收考察
样品含量测定
分别精密吸取15批供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪测定，记录峰面积，代入回归方程计算桑枝中桑皮苷A、氧化白藜芦醇，结果见表3。
表3不同产地桑枝饮片中桑皮苷A和氧化白藜芦醇的含量
薄层色谱法
取桑枝粉末(过四号筛)0.5g，加80％乙醇25ml，超声处理30min，滤过，取滤液作为供试品溶液。取适量桑皮苷A和氧化白藜芦醇对照品,用甲醇溶解，配制成桑皮苷A18.91μg/ml、氧化白藜芦醇13.88μg/ml的对照品溶液。吸取上述溶液各5μl，分别点于同一聚酰胺薄层板上，以乙酸乙酯∶甲醇∶乙酸(10∶10∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，测试结果如图26所示。
以上所述仅为本申请的优选实施例，并非因此限制本申请的专利范围，凡是在本申请的发明构思下，利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本申请的专利保护范围内。
Claims (2)
1.一种桑枝的质量控制方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.对照品溶液的制备：精密称取桑皮苷A，加入40%甲醇溶液制成每ml含桑皮苷A138.8μg；精密称取氧化白藜芦醇，加入80%乙醇溶液制成每ml含氧化白藜芦醇189.1μg；
S2.供试品溶液的制备包括：
S21.精密称定桑枝粉末0.2g，加入40%甲醇15ml，称定重量后超声处理，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液，作为供试品；
S22.精密称定桑枝粉末0.2g，加入80%乙醇25ml，称定重量后超声处理，再称定重量，补足减失的重量，摇匀，离心，取上清液，作为供试品溶液；
所述步骤S21中的超声处理的时间为20min；所述步骤S22中的超声处理的时间为30min；
S3.测定：分别精密吸取所述对照品溶液与所述供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪进行测定；
其中，步骤S3中的色谱条件包括：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以流动相A为乙腈，流动相C为1%的冰醋酸溶液进行梯度洗脱，流速为 0.9~1.1ml/min，柱温为24℃-26℃，色谱柱为XBridege C18 色谱柱，4.6×250mm，5μm，桑皮苷A和氧化白藜芦醇的检测波长为320-330nm，理论塔板数不低于3000；
所述步骤S3中，梯度洗脱条件为：0-10min：流动相 A 8%，流动相C 92%；10-15min：流动相A 8~18%，流动相C 92~82%，15min~25min:流动相A 18%，流动相C 82%；
或，梯度洗脱条件为：0-10min：流动相 A 9%，流动相C 91%；10-15min：流动相A 9~19%，流动相C 91~81%，15min~25min:流动相A 19%，流动相C 81%；
或，梯度洗脱条件为：0-10min：流动相 A 10%，流动相C 90%；10-15min：流动相A 10~20%，流动相C 90~80%，15min~25min:流动相A 20%，流动相C 80%；
以所述对照品溶液进样量为横坐标，以桑皮苷A峰面积值和氧化白藜芦醇峰面积值分别为纵坐标，得到桑皮苷A浓度标准曲线的回归方程 Y = 24400X-3960( r = 0.9999)，氧化白藜芦醇浓度标准曲线的回归方程 Y = 49400X-2250( r = 0.9999)；
所述步骤S3之后，还包括步骤S4：
供试品溶液的制备：精密称定桑枝粉末，加入80%乙醇25ml，超声30min，摇匀，静置，取上清液过滤，得供试品备用；
对照品溶液制备：精密称取桑皮苷A，加入甲醇溶液制成每ml含桑皮苷A 47.47μg、氧化白藜芦醇50.20μg的混合溶液；
测定：吸取供试品溶液8μl，对照品溶液4μl分别点于聚酰胺薄膜上，以乙酸乙酯：甲醇：冰醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，置于紫外灯下，在365nm的波长下检视；供试品色谱中，在与对照品药材色谱相应的位置上，显相同的颜色斑点；乙酸乙酯、甲醇、冰醋酸的体积比为10：10：1。
2.如权利要求1所述的一种桑枝的质量控制方法，其特征在于，精密称定桑枝粉末前，先将桑枝粉末过四号筛。
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