CN108680673A - 当归饮片指纹图谱的建立方法及其指纹图谱 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种当归饮片指纹图谱的建立方法及其指纹图谱，涉及中药材的指纹图谱技术领域，该方法包括供试品溶液的制备和高效液相色谱检测条件，用指纹图谱软件对图谱进行处理，即得当归饮片的指纹图谱；将色谱数据导入SPSS19.0版软件进行聚类分析，得标准化自制饮片与市售饮片的聚类结果。本发明的积极效果是：本发明建立了当归饮片HPLC指纹图谱的共有模式，标定了29个共有峰，能有效的表征其质量，克服了原质量控制方法的单一性，具有较高的应用价值。

Description

当归饮片指纹图谱的建立方法及其指纹图谱

技术领域

本发明涉及中药材的指纹图谱技术领域，尤其是当归饮片指纹图谱的建立方法与其指纹图谱。

背景技术

当归Angelica sinensis(Oliv.)Diels是伞形科植物多年生当归的干燥根，又名西归、秦归、云归，始载于《神农本草经》，为低温长日照植物，主产地为甘肃岷县。其生品性温，味甘、辛，归肝、心、脾经，具补血活血，调经止痛，润肠通便的功效，主治月经不调，经闭痛经，血虚萎黄，眩晕心悸等症，为临床常用的一味中药，明代李时珍《本草纲目》中有“当归调血，为女人要药”的记载。文献报道，当归主要含有苯肽类、有机酸及其酯类、糖类等成分，具有造血、抗炎、镇痛、抗血小板聚等多方面药理作用。

目前，我国中药制剂的质量参差不齐，即使是同一厂家生产的不同批次的制剂质量也无法做到稳定均一。而饮片作为制剂的主要原料，炮制方法不统一，在很大程度上使得饮片的物质基础发生变化，最终影响制剂质量。当归饮片作为新生化颗粒的君药，主要用于补血活血，化瘀生新，行滞止痛。目前市场上当归饮片掺假、提取现象层出不穷，仅凭肉眼难以鉴别真伪优劣，提高当归饮片质量，保障制剂质量已迫在眉睫。

现行当归质量标准含量测定项下仅对水溶性成分阿魏酸进行限定，较为单薄。前人虽已有报道岷县当归药材HPLC指纹图谱，但样本量有限，且用当归药材与市售饮片进行质量比对，未考虑投料生产的是饮片而非药材，可比性不大。故本研究对50批岷县不同产区的当归饮片(自制)及15批市售饮片的质量进行比对，建立HPLC指纹图谱，结合主成分分析以更好地评价新生化颗粒原料饮片当归质量，确保当归饮片质量一致性，从而确保新生化颗粒品质一致性，保障临床疗效，促进新生化颗粒标准体系提质增效，推动新生化颗粒标准化进程。

发明内容

本发明要解决的问题是提供当归饮片指纹图谱的建立方法及其指纹图谱，利用该图谱可以较为全面地评价当归饮片的质量，从而更好地保证当归饮片的质量稳定性、一致性、可控性，从而保证制剂新生化颗粒的质量的稳定均一。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

(1)供试品溶液的制备：取当归饮片粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入5％甲酸甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，取出，放冷，补足失重，摇匀，取续滤液，作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：称取适量阿魏酸、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、藁本内酯、正丁基苯酞、丁烯基苯酞对照品，精密称定，加乙腈制成质量浓度分别为0.06mg/mL、0.19mg/mL、0.12mg/mL、0.52mg/mL、0.87mg/mL、0.28mg/mL、0.61mg/mL的混合对照品溶液，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为对照品溶液。

(3)高效液相色谱检测：吸取上述步骤(1)所得供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行高效液相色谱检测，记录65min内的指纹图谱：

其中，前述方法中，所述高效液相色谱测定的色谱条件为：

采用WatersC18色谱柱，4.6×250mm，5μm，流动相：乙腈-0.5％醋酸水，采用梯度洗脱方式：0～25min，5％～45％A；25～35min，45％～55％；35～45min，55％A；45～55min，55％～95％；55～60min，95％A；60～65min，95％～5％A；检测波长：254nm；柱温：30℃；流速：1mL/min；进样量：10μL，分析时间：65min。

如前述当归饮片的指纹图谱检测方法得到的当归饮片指纹图谱，所述图谱中有29个共有峰，当归饮片指纹图谱与对照图谱的相似度均大于0.9。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

(1)本发明确立了当归饮片指纹图谱的建立方法，通过该方法可以获得当归饮片的标准指纹图谱，本发明提供的方法建立的当归饮片HPLC指纹图谱与对照图谱的相似度均大于0.9，能有效的表征其质量，更好地评价控制饮片的相对稳定，完善了当归饮片的质量评价体系，为当归饮片质量的全面、有效控制提供了理论与实践基础。

(2)本发明建立的当归饮片HPLC指纹图谱，标定了29个共有峰，避免了当归饮片质量控制的单一性和片面性。

(3)由于指纹图谱要充分反映各化学成分的信息，因此，本发明选择在254nm波长下进行测定，其出峰数目较多，反映的色谱信息较全面，基线平稳。

附图说明

(1)图1-A、1-B、1-C、1-D、1-E分别为当归饮片提取溶剂为25％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、5％甲酸甲醇、100％乙腈溶液的色谱图。

(2)图2-A、2-B、2-C、2-D分别为提取药材量与提取试剂比值为1:20、1:40、1:50、1:100的色谱图。

(3)图3-A、3-B、3-C分别为提取时间为30min、60min、90min的色谱图

(4)图4-A、4-B、4-C分别为检测波长为254nm、280nm、316nm下的色谱图。

(5)图5-A、5-B分别为色谱柱为WatersC18色谱柱(4.6×250,5μm)和Hanbon Sci&Tech色谱柱(4.6×250,5μm)的色谱图。

(6)图6为65批当归饮片指纹图谱。

(7)图7为50批市售饮片对照图谱(A)和自制饮片对照图谱(B)。

(8)图8为当归饮片供试品溶液(A)与混合对照品HPLC(B)色谱图。

(9)图9为65批当归饮片聚类分析结果图。

具体实施方式

以下结合附图实例，对本发明作进一步详述：

以下实施例为对50批来自不同产区的标准化自制饮片和15批市售饮片的指纹图谱建立方法及据此得到的指纹图谱：

1仪器与材料

1.1实验原料

当归药材为2017年4月采自甘肃岷县不同地区，当归饮片由江苏融煜药业有限公司生产。市售当归饮片于2017年9月购自安徽亳州中药材市场，具体样品信息见表1。

表1当归饮片信息

1.2实验器材

2695型高效液相色谱仪(美国Waters公司)、2998PDA型紫外检测器(美国Waters公司)；电子天平(BP211D型，d＝0.01mg，赛多利斯科学仪器有限公司)；离心机(Anke TGL-16B，上海安亭科学仪器厂)；敞开式烘箱(HX-4，杭州金竺机械有限公司)；数控超声波清洗器(KH-500DB型，昆山禾创超声仪器有限公司)；高速中药粉碎机(XFB-200型，吉首市中诚制药机械厂)；旋料式切片机(ZDS-800，杭州金竺机械有限公司)。

1.3实验试剂

乙腈为色谱纯(美国Tedia公司)；超纯水(Milli-Q超纯水系统制备)；无水甲酸等试剂为分析纯；阿魏酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号110773-201614，纯度≥99％)、藁本内酯、正丁基苯酞对照品(南京金益柏生物科技有限公司，批号分别为CHB160428、CHB160404，纯度≥98％)；洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、阿魏酸松柏酯、丁烯基苯酞对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号分别为P30A8F42692、P30A8F42693、Z02S8B42740、T30A8Z42737，纯度≥98％)。

2实验方法

2.1供试品溶液的制备条件的选择

2.1.1提取溶剂的选择

精密称取3份14号当归饮片各0.5g置于50mL具塞锥形瓶中，分别精密加入25mL的25％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、5％甲酸甲醇、100％乙腈溶液作为提取剂，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，取出，放冷，补足失重，摇匀，取续滤液，得供试品溶液。相同检测条件下分别测得其指纹图谱(图1-A、1-B、1-C、1-D、1-E)，通过比较确定最佳提取溶剂，如图1。在其余检测方法相同的条件下，比较发现，提取溶剂为25％甲醇、100％乙腈时，所得供试品图谱色谱峰响应较低、数目较少，其它各溶剂所得色谱图出峰情况较良好，考量成分阿魏酸松柏酯在乙腈、5％甲酸甲醇中有较好的稳定性，故需在你这5％甲酸甲醇为提取溶剂。

2.1.2提取饮片量与提取溶剂的比值的选择

精密称取4份14号当归饮片各0.5g置于50mL具塞锥形瓶中，分别精密加入10mL、20mL、25mL、50mL的5％甲酸甲醇溶液作为提取剂，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，取出，放冷，补足失重，摇匀，取续滤液，得供试品溶液。相同检测条件下分别测得其指纹图谱(图2-A、2-B、2-C、2-D)，检测发现，如果提取溶剂的量太多会影响色谱图行为，如图2-D；如果提取溶剂的量太少的话则成分提取不完全，色谱峰数目较少，如图2-A。故综合考量，认为料液比为1(g)：50(mL)时供试品分离效果好，色谱峰数目多。

2.1.3提取时间的选择

精密称取3份14号当归饮片各0.5g置于50mL具塞锥形瓶中，精密加入25mL的5％甲酸甲醇溶液作为提取剂，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min、60min、90min，取出，放冷，补足失重，摇匀，取续滤液，得供试品溶液。相同检测条件下分别测得其指纹图谱(图3-A、3-B、3-C)，检测发现，超声时间为60min、90min时，色谱图中部分色谱峰消失且色谱峰响应值稍降低，见图3。故选择超声30min为提取时间。

2.2色谱条件的选择

2.2.1检测波长的选择

比较190nm～400nm扫描的各波长下色谱信息，分析254nm(A)、280nm(B)、316nm(C)下各色谱峰的响应情况，结果表明所选各波长下的色谱图基线平稳，色谱峰藁本内酯在280nm、316nm波长下响应较高，但其余各色谱峰响应不及254nm波长，且254nm波长下色谱峰数目较多，见图4。综合各色谱峰响应结果，选择254nm作为当归饮片HPLC指纹图谱的检测波长。

2.2.2色谱柱的选择

取同一供试品溶液，在其他检测条件一致的条件下，分别使用WatersC18色谱柱(4.6×250,5μm)和Hanbon Sci&Tech色谱柱(4.6×250,5μm)比较当归饮片的色谱图(图5-A、5-B)。由图5可以看出，其他条件相同的情况下，沃特世色谱柱所需的分析时间较短，色谱峰数目多于汉邦色谱柱，所以选择WatersC18色谱柱(4.6×250,5μm)作为分析当归饮片的色谱柱。

综上所述，以下实施例是按照如下方法建立当归饮片指纹图谱：

实施例1：

建立当归饮片指纹图谱

(1)供试品溶液的制备：取当归饮片粉末(过三号筛)约0.5g，精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入5％甲酸甲醇25mL，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30min，取出，放冷，补足失重，摇匀，取续滤液，作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：称取适量阿魏酸、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、藁本内酯、正丁基苯酞、丁烯基苯酞对照品，精密称定，加乙腈制成质量浓度分别为0.06mg/mL、0.19mg/mL、0.12mg/mL、0.52mg/mL、0.87mg/mL、0.28mg/mL、0.61mg/mL的混合对照品溶液，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为对照品溶液。

(3)高效液相色谱检测：吸取上述步骤(1)所得供试品溶液，注入高效液相色谱仪中进行高效液相色谱检测，记录65min内的指纹图谱：

其中，前述方法中，所述高效液相色谱测定的色谱条件为：

采用WatersC18色谱柱，4.6×250mm，5μm，流动相：乙腈-0.5％醋酸水，采用梯度洗脱方式：0～25min，5％～45％A；25～35min，45％～55％；35～45min，55％A；45～55min，55％～95％；55～60min，95％A；60～65min，95％～5％A；检测波长：254nm；柱温：30℃；流速：1mL/min；进样量：10μL，分析时间：65min。在此条件下，进样分析，得到当归饮片的指纹图谱，如图6所示；并生成15批市售饮片(图7-A)和50批自制饮片(图7-B)的对照图谱。结果发现，自制饮片与市售饮片所呈现的色谱信息基本一致，但从纵坐标响应值分析，市售饮片色谱峰的响应值总体上低于自制饮片，可初步辨别饮片质量的优劣。

以S1号图谱作为参照图谱进行匹配，进行相似度评价分析，结果见表2，确定29个色谱峰为65批样品所共有。通过与对照品色谱图中的保留时间比对，指认出7个共有峰，6号峰为阿魏酸，8号峰为洋川芎内酯I，9号峰为洋川芎内酯H，14号峰为阿魏酸松柏酯，17号峰为正丁基苯酞，20号峰为藁本内酯，21号峰为丁烯基苯酞。混合对照品HPLC色谱图与供试品溶液色谱图见图8-A、8-B。其中，9号峰藁本内酯峰面积最大且出峰位置较为合适，选为参比峰。计算各色谱峰与参照峰(藁本内酯)的相对峰面积RSD在1.83～105.55％，RSD值相差较大，说明各批次样品质量存在差异，能很好的成为评价65批饮片质量优劣的变量指标。

表2 65批样品相似度评价表

将65批当归饮片29个共有峰的峰面积导入SPSS19.0版软件，采用质心连接法，选用欧氏距离对65批饮片进行聚类分析，结果见图9。聚类结果表明，65批饮片大致可分为5类，其中，市售饮片分为2类，自制饮片分为3类，可以发现市售饮片与自制饮片存在一定的差异，强调了炮制规范化的重要性。分析自制饮片，清水镇、中寨镇(除S4、S35)、闾井镇、秦许镇S22、梅川镇S12、S45、茶埠镇S50、蒲麻镇S49共22批样品归为一类，茶埠镇(除S50)、蒲麻镇(除S49)、西江镇、梅川镇S5、S11、S29、S49及秦许镇S31共18批样品归为一类，梅川镇S2、中寨镇S4、S35及寺沟镇、秦许镇(除S22、S31)共10批样品归为一类。数据显示，50批自制饮片大致可依据当归地理位置的差异各被聚为一类，与当归药材规格等级并无明显的关联，其分析结果与相似度评价结果基本可认为一致。

当归作为“生化汤”的君药，主要用于补血活血，化瘀生新，行滞止痛。而本实验中得到的29个共有峰中，经对照品比对得出的7个共有峰分别为阿魏酸、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、藁本内酯、正丁基苯酞、丁烯基苯酞，具有一定的补血活血，调经止痛的功效，故认为本文建立的指纹图谱方法可以比较全面客观的反映当归饮片信息。

65批当归饮片指纹图谱信息得出：各共有峰相对峰面积差异较大，RSD在1.83～105.55％之间，表明不同批次的当归饮片中各化学成分的含量差异较大。相似度结果分析，50批自制饮片中来自同一产区药材商品规格不同的当归相似度评价结果较为一致，不同地区饮片相似度整体上存在一定的差异，说明药材分级对饮片相似度评价无显著影响，地理位置对药材质量会造成相关程度的影响。分析市售饮片中参照峰藁本内酯峰面积与饮片相似度的关联，发现藁本内酯峰面积相对较高的样品部分相似度也偏高，藁本内酯峰面积相对较低的样品中也有部分样品相似度偏高，认为共有峰藁本内酯能相对影响指纹图谱相似度分析，但也是与其他各共有峰共同作用的结果。

对65批样品进行聚类分析，市售饮片与自制饮片大致分开，但当判别距离为20时，65批饮片分为两大类，部分市售饮片与部分自制饮片归为一类，其余归为另一类。分析原因，发现共有峰藁本内酯的峰面积是其分类的主要原因，笔者将共有峰藁本内酯除去，选取28个共有峰的峰面积为变量，进一步进行聚类分析验证，发现部分样品依旧归为一类，另有部分样品的归属发生变化，说明共有峰藁本内酯在一定程度上可以评价当归饮片质量，但仍不足以全面概括饮片指纹图谱信息，认为藁本内酯可以作为饮片评价分级的质量标志物之一，评价饮片质量不能局限于单指标成分，需多指标综合评价分析。结合主成分分析中因子载荷矩阵因子正负相关性，可初步提出阿魏酸、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、藁本内酯、丁烯基苯酞作为当归饮片的质量标志物，为后续研究质量标志物奠定基础。

Claims (1)

1.一种当归饮片指纹图谱的建立的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取当归饮片粉末约0.5g，过三号筛精密称定，置50mL具塞锥形瓶中，精密加入5％甲酸甲醇25mL，称定重量，超声处理，超声功率为250W，频率为40kHz，30min，取出，放冷，补足失重，摇匀，取续滤液，作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：称取适量阿魏酸、阿魏酸松柏酯、洋川芎内酯I、洋川芎内酯H、藁本内酯、正丁基苯酞、丁烯基苯酞对照品，精密称定，加乙腈制成质量浓度分别为0.06mg/mL、0.19mg/mL、0.12mg/mL、0.52mg/mL、0.87mg/mL、0.28mg/mL、0.61mg/mL的混合对照品溶液，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液作为对照品溶液；

(3)高效液相色谱测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液10Lμ注入液相色谱仪，记录65分钟内的色谱图；

其中，高效液相色谱测定的色谱条件为：

采用WatersC18色谱柱，4.6×250mm，5μm，流动相：乙腈-0.5％醋酸水，采用梯度洗脱方式：0～25min，5％～45％A；25～35min，45％～55％；35～45min，55％A；45～55min，55％～95％；55～60min，95％A；60～65min，95％～5％A；检测波长：254nm；柱温：30℃；流速：1mL/min；进样量：10μL，分析时间：65min。

(4)供试品指纹图谱进行相似度评价：将多批当归饮片色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012.130723版本》软件，用指纹图谱软件对图谱进行处理，即得当归饮片的指纹图谱，比较待测样品的色谱图和标准指纹图谱相似度；

(5)聚类分析：将待测样品29个共有峰的峰面积导入19.0版软件进行聚类分析，得标准化自制饮片与市售饮片的聚类结果。