KR20170017497A - 질량분석 스펙트럼을 이용한 안토시아닌의 정성 및 정량 분석 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 질량 분석 스펙트럼을 이용한 안토시아닌의 분석방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 외부조건에 민감하게 반응하는 안토시아닌을 짧은 용매구배 조건에서 분석을 수행하고, 안토시아닌 분석을 위한 추출, 여과 등과 같은 전 처리 단계를 간소화함으로써 안토시아닌의 변성 없이 분석이 가능함이 확인되었다. 또한, 크로마토그램 내 확인되지 않은 넓은 피크로부터 얻은 안토시아닌 집중된 MS 스펙트럼(ACMS)을 통하여 정확하고 간단하게 정성적 및 정량적 분석이 가능함을 확인하였다.

Description

질량분석 스펙트럼을 이용한 안토시아닌의 정성 및 정량 분석 방법 {Qualitative and quantitative analysis method of anthocyanins based on mass spectrometry}

본 발명은 질량분석 스펙트럼을 이용한 안토시아닌의 정성 및 정량 분석 방법에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 외부 자극에 매우 불안정하여 통상적인 방법으로는 정성적 및 정량적 분석이 불가능한 안토시아닌을 위하여 질량분석 스펙트럼, 그 중에서도 특히 안토시아닌이 농축된 질량분석 스펙트럼(Anthocyanin-concentrated MS spectrum; ACMS)을 통하여 빠르고 간단한 분석을 위한 안토시아닌을 분석할 수 있는 방법에 관한 것이다.

안토시아닌은 식물 내의 액포에 존재하는 수용성의 색소 그룹이고 UV 방사로부터의 방어체로서, 꽃가루 매개자를 위한 유인 물질 및 초식동물을 격퇴하기 위한 경고 색으로서의 핵심 역할을 한다(H.O. Gutzeit et al., Wiley Blackwell, 2014). 아글리콘(aglycone) 그룹(안토시아니딘) 및 기능성 하이드록실 그룹에서 플라빌륨(flavylium) 이온 또는 2-페닐크로메닐륨(2-phenylchromenylium)의 구조는 쉽게 자유 라디칼 및 킬레이트 금속 이온을 빛 및 UV 방사로부터 보호하기 위해 소거할 수 있다(S. Kumar et al., Scientific world journal 2013 162750). 구조적 안정성은 글리코실화, pH, 온도, 금속 이온 및 다른 성분과의 분자 내외의 연관성에 쉽게 영향을 받을 수 있는데, 이는 생산 및 저장하는 동안 색깔의 변화에 기여할 수 있다(K. Gould et al., Springer Science & Business MEDIA, 2008; R. Veberic et al., J Agric Food Chem 62(2014) 6926-6935). 그러므로 유동 상의 pH 및 샘플 용매는 격리 및 분리 과정 동안 조절될 필요가 있다(O.M. Anderson et al., CRC Press, 2005).

MS 크로마토그램은 MS 분광계로부터 얻은 스펙트럼을 시간별로 측정되어 얻어진 그래프이다. 일반적으로, x축은 크로마토그래피의 수행 시간을 나타내고, y 축은 MS 스펙트럼 내의 이온 수의 총 합의 신호 강도를 나타낸다. 혼합물 내에서 다양한 구성성분이 완벽히 분리가 되면, 크로마토그램 내 각각의 구성성분은 완벽하게 구분되고 정량화될 수 있다. 그러나, 컬럼의 해결 수용력 및 혼합물의 복잡성으로 인하여 모든 개개의 구성성분을 완벽하게 분리하는 것은 거의 불가능 하다. 안토시아닌의 구조적 특징은 다른 작은 분자들보다 외부조건의 조심스러운 조절 없이는 개개의 구성성분으로 완벽하게 분리하는 것을 더 어렵게 한다(예를 들면 pH, 온도 및 빛 강도 뿐만 아니라 염료, 금속 이온, 촉매, 산소, 아스코르빈산 및 설탕의 존재)(J. Valls et al., J Chromatogr A 1216(2009); F.J. Fracis, Crit Rev Food Sci Nutr 28(1989) 273-314; C.F. Timberlake et al., Prog Clin Biol Res 280(1988) 107-121).

이에 본 발명자들은 안토시아닌-함유 소스에서 안토시아닌의 간단한 정성적 및 정량적 분석을 위한 새롭고 빠른 대체적인 분석적 방법론을 개발하고자 실험을 거듭한 끝에 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명은 안토시아닌의 변성 없이 빠르고 간단하게 안토시아닌의 정성적 및 정량적 분석이 가능한 질량분석 스펙트럼을 이용한 안토시아닌의 정성 및 정량 분석 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 a) 안토시아닌 함유 식물 추출물을 제공하는 단계; b) 상기 a) 단계에서 제조한 추출물을 초고성능 액체 크로마토그래피-4중극 비행시간 질량분석기(Ultra Performance Liquid chromatography - A Quadrupole time-of-flight/Mass Spectrometer; UPLC-QTOF/MS)를 이용하여 분석하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계의 분석으로부터 안토시아닌이 농축된 MS 스페트럼(anthocyanin-concentrated MS spectrum; ACMS)을 추출하여 분석하는 단계를 포함하는 안토시아닌의 분석방법을 제공한다.

본 발명에 있어서 상기 안토시아닌은 아래 화학식을 갖는 플라보노이드계 색소군으로, 아글리콘의 R3, R5의 수산기의 1개 혹은 양쪽에 당과 산(글루코즈, 갈락토즈, 자일로즈, 아라비노즈, 람노오즈, 다시 그 일부에 말릭산, P-하이드록시 벤조산, 호박산, p-쿠마르산, 커피산, 페롤산)이 배당체로 결합한 색소배당체를 안토시아닌이라고 부른다.

아그리콘의 R3', R5'의 차이에 의해서, 페라고니딘(R3'＝R5'＝H), 시아니딘(R3'＝OH, R5'＝H), 델피니딘(R3'＝R5'＝OH), 페오니딘(R3'＝OCH₃, R5'＝H), 페튜니딘(R3'＝OCH₃, R5'＝OH), 말비딘(R3'＝R5'＝OCH₃)의 6개의 그룹이 있다. 주된 안토시아닌은 사과, 블랙베리, 서양배, 복숭아, 아스파라거스는 시아니딘, 딸기, 석류는 펠라고니딘, 가지는 델피딘, 망고는 페오니딘이다. 포도는 품종에 따라 6개의 그룹 모든 안토시아닌을 함유하고 그 색소의 비율과 함량으로 포도 과즙, 포도주의 색깔이 결정된다.

본 발명에 있어서, 상기 UPLC-QTOF/MS는 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC)와 4중극 비행시간 질량분석기(QTOF/MS)가 결합된 시스템으로 이성분 용매와 연결된 UPLC 시스템 및 자동 견본기(autosampler) 로 구성된다. 기존의 안토시아닌 분석에 사용되는 UV 또는 MS 분광계와 함께 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)를 사용할 경우 실험용 샘플의 준비 등과 같이 많은 단계와 시간을 요구하여 외부 조건에 민감한 안토시아닌의 분석으로는 적합하지 않았다. 그러나 본 발명에 따른 UPLC-QTOF/MS 시스템을 사용할 경우 안토시아닌의 변성 없이 빠른 분석이 가능하다.

본 발명에 있어서, 상기 UPLC-QTOF/MS 시스템으로부터 안토시아닌 성분들로만 이루어진 질량스펙트럼(ACMS)을 추출하였다. 이때 짧은 용매구배 조건(short-gradient solvent system)을 통하여 5분 이내의 짧은 분석 시간에서 다른 성분들로부터 안토시아닌 성분들을 분리하였다. 각 성분을 나타내는 질량스펙트럼 내의 성분피크의 질량 대 전하의 비(m/z) 값과 이온 강도(intensity) 값을 따로 추출하여, 안토시아닌의 정성적, 정량적 분석에 사용하였다(실시예 3 참조). 그 결과 기존의 크로마토그램 기반의 분석과 비교하여 훨씬 짧은 시간, 간단한 시료 전처리를 통하여 이온 변동계수(CV%)=3.5% 이내로 안토시아닌의 정량적 정성적 분석이 가능하였다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 a) 단계의 안토시아닌 함유 식물은 빌베리(Bilberry), 블랙베리(Vaccinium myrtillus), 블랙 커런트(Ribes nigrum), 라즈베리(Rubus idaeus), 라즈베리(Rubus coreanus), 블루베리(Highbush blueberry), 멀베리(Morus alba), 포도(Vitis vinifera) 및 딸기(Fragaria spp)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 b) 단계의 UPLC-QTOF/MS는 산성용매일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 산성용매는 0.2 내지 10 %의 염화수소 희석 용액 또는 10%의 포름산의 희석 용액일 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 희석 용액은 희석 용매로서 50% 아세토나이트릴(acetonitrile)을 사용한 것으로, 50%의 아세토나이트릴 용매에 염화수소를 0.2 내지 10% 농도로 희석하거나, 50% 아세토나이트릴 용매에 포름산을 10% 농도로 희석한 것을 나타낸다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 b) 단계 및 c) 단계의 분석은 양이온 모드(positive ion mode)에서 이루어질 수 있다.

본 발명에 있어서 질량분석기는 기본적으로 물질을 이온화 시킨 후 측정하는 원리를 바탕으로 하는데, 이때 물질을 양이온이나 음이온으로 이온화시키는 방법이 두 가지가 있다. 본 발명에서는 양이온 모드에서 질량분석을 실시하였다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 b) 단계에서 추출물은 0.25 - 5mg/ml의 농도로 질량분석기에 주입될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 안토시아닌은 산성용매에서 플라빌리움 이온으로 존재하기 때문에 양이온 모드에서 분자 이온 피크로 검출되고 부가 생성물 이온 피크로는 검출되지 않는다. 즉, 이온 부가물(ion adduct)이 생성되지 않기 때문에 분자량을 확인하는 것을 용이하게 한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 b) 단계 및 c) 단계의 분석은 0.1 - 20 분의 짧은 용매구배(short gradient) 조건에서 수행될 수 있으나, 바람직하게는 5-15 분의 조건에서 수행될 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 짧은 용매구배 조건에서 수행하는 것은 안토시아닌의 물리화학적 성질에 기초한 것으로, 짧은 시간 동안 용매농도의 변화를 주어 다른 성분들로부터 안토시아닌 성분들만 쉽게 분리함으로써 짧은 시간 동안 분석이 가능하였다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 b) 단계 및 c) 단계의 분석은 0.1 - 50 V의 전압에서 수행될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 전압은 콘 전압(cone voltage)를 의미하는 것으로, 질량분석기에서는 물질의 이온화정도를 조절할 수 있는 전압을 의미한다. 전압이 높을수록 물질의 이온화가 용이하지만, 지나치게 높은 전압은 원래 물질의 구조를 파괴할 수 있다. 또한 지나치게 낮은 전압 조건에서는 안토시아니딘을 위한 피크가 검출되지 않은 반면, 일정 전압 이상에서는 안토시아닌 및 안토시아니딘의 모든 전구체 이온 및 조각 이온 피크가 검출되었다. 따라서, 안토시아닌의 분석에 있어, 적절한 전압조건을 유지하는 것이 중요하다.

본 발명에 따르면 외부조건에 민감하게 반응하는 안토시아닌을 짧은 용매구배 조건에서 분석을 수행하고, 안토시아닌 분석을 위한 추출, 여과 등과 같은 전 처리 단계를 간소화함으로써 안토시아닌의 변성 없이 분석이 가능함이 확인되었다. 또한, 크로마토그램 내 확인되지 않은 넓은 피크로부터 얻은 안토시아닌 집중된 MS 스펙트럼(ACMS)을 통하여 정확하고 간단하게 정성적 및 정량적 분석이 가능함을 확인하였다.

도 1은 각각 다른 산성 용매의 농도에 따른 BSEs의 MS 크로마토그램이다. 각각 0.2%(A), 2%(B), 10%(C)의 HCl 및 10% 포름산(D)를 나타낸다. 안토시아닌 피크는 점선 표시된 박스에 해당된다.
도 2는 각각 짧은 용매구배 조건에서의 BSEs의 MS 크로마토그램이다. 각각 5(A), 15(B), 15(C) 및 25(D)분을 나타낸다. 안토시아닌 피크는 점선 표시된 박스에 해당된다.
도 3은 각각 짧은 용매구배 용매조건에서의 BSEs의 MS 크로마토그램이다. 각각 5(도 a 및 b), 15(도 c 및 d)분을 나타낸다. 안토시아닌 피크는 점선 표시된 박스에 해당된다.
도 4는 BSE 샘플의 ACMS 스펙트럼에서 안토시아닌 및 안토시아니딘의 이온 피크를 나타낸다. 각각 시아니딘 (1), 피오니딘 (2), 델피니딘 (3), 페튜니딘 (4), 말비딘 (5) 시아니딘 3-O-아라비노사이드 (6), 델피니딘 3-O-아라비노사이드 (7), 시아니딘 3-O-갈락토사이드, 시아니딘 3-O-글루코사이드 및 페튜니딘 3-O-아라비노사이드 (8), 피오니딘 3-O-갈락토사이드, 피오니딘 3-O-글루코사이드 및 말비딘 3-O-아라비노사이드 (9), 델피니딘 3-O-갈락토사이드 및 델피니딘 3-O-글루코사이드, 페튜니딘 3-O-갈락토사이드 및 페튜니딘 3-O-글루코사이드 (11), 말비딘 3-O-갈락토사이드 및 말비딘 3-O-글루코사이드 (12)를 나타낸다.
도 5는 각각 다른 짧은 농도구배 용매(5(A 및 B), 15(C 및 D)분)에서 BSE의 안토시아닌-집중된 MS 스펙트럼을 나타낸다. B 및 D에서 총 이온 크로마토그램은 각각 기본 피크 강도 크로마토그래피인 A 및 C에 중첩되었다.
도 6은 각각 45(도 6a), 35(도 6b), 30(도 6c), 20(도 6d) 및 10(도 6e)V에서 측정된 BSE의 ACMS 스펙트럼이다. 안토시아닌 및 안토시아니딘에 해당하는 피크는 각각 점선 표시 된 박스와 실선 표시된 박스에 해당된다.
도 7은 각각 P3G 표준(A) 및 P3G 및 안토시아닌 혼합물(B)의 안토시아닌-집중된 MS 스펙트럼이다. m/z 433 and 271에서의 이온 피크는 페라고니딘-3-O-a-D-글루코피라노즈 및 페라고니딘이고, m/z 449에서는 시아니딘-3-O-a-D-글루코피라노즈 및 시아니딘-3-O-a-D-갈락토피라노즈이며, m/z 271 는 시아니딘이다.
도 8은 각각 블랙베리(Vaccinium myrtillus. A), 라즈베리(Rubus fruticosus ,B), 블랙 커런트(Ribes nigrum ,C), 칠레산 라즈베리(Rubus idaeus ,D), 멀베리(Morus alba ,E) 및 라즈베리(Rubus coreanus ,F)의 안토시아닌-함유 상업 베리의 MS 크로마토그램을 나타낸다.
도 9는 은 각각 블랙베리(Vaccinium myrtillus. A), 라즈베리(Rubus fruticosus ,B), 블랙 커런트(Ribes nigrum ,C), 칠레산 라즈베리(Rubus idaeus ,D), 멀베리(Morus alba ,E) 및 라즈베리(Rubus coreanus ,F)의 안토시아닌-함유 상업 베리의 ACMS 스펙트럼을 나타낸다. *표시는 각각 종에서 검출된 안토시아니딘 및 안토시아닌을 대표하는 구분 마커로서의 피크를 나타내고 이는 표 4에 나타나 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 실험 재료 준비

1.1 빌베리 표준화 추출물 및 다른 열매 샘플 준비

Ningbo Green-Health Pharmaceutical Co., Ltd.(저장, 중국)으로부터 수급된 빌베리 표준화 추출물(Bilberry standardized extracts; BSEs)은 Richwood Inc로부터 받았다. Richwood Inc.는 다른 배치(batch)에서 생산된 21 BSE를 공급하였다. 통상적인 분광광도법적 방법을 사용하여 결정된 BSE 내 총 안토시아닌 함량은 시아니딘-3-모노글루코사이드(cyanidin-3-monoglucoside) 함량으로 표현된 32.4-39.6%이었다(C.o. Europe European Pharmacopoeia 8.0, Council of Europe, 2013).

여섯 가지 종류의 냉동 베리(예를 들면, 미국산 블루베리, 칠레산 블랙베리(Vaccinium myrtillus), 폴란드산 블랙 커런트(Ribes nigrum), 칠레산 라즈베리(Rubus idaeus) 및 한국 멀베리(Morus alba)와 한국 라즈베리(Rubus coreanus))는 지역 마트(남양주, 한국)에서 구입하였고 분석 전에 -20℃에서 보관하였다.

BSE는 5mg/ml 농도로 샘플 준비를 위한 조건을 최적화하기 위하여 0.2, 2, 5, 10%의 HCl 및 10%의 포름산이 50%의 아세토나이트릴에 용해되었다. 이러한 샘플은 분석에 앞서 0.2㎛ 멤브레인 필터(Millipore Co ., Billerica, MA, USA)를 통하여 여과 되었다. 정성 분석을 위하여 BSE 중 하나는 임의로 선택되었고 0.25 내지 5mg/ml 범위의 농도로 0.2%의 HCl에 용해되었다. 6개의 냉동 베리 샘플은 하룻밤 동안 동결건조 되었고 막자사발과 막자를 사용하여 가루로 만들어졌다. 5mg/ml의 농도로 50%의 아세토나이트릴 내의 0.2% HCl에 용해되고 0.2㎛ 멤브레인 필터를 통하여 여과된 후 BSE 샘플은 예를들면 추출 및 분획과 같은 추가 준비 과정 없이 분석에 사용될 수 있었다. 모든 샘플은 분석 바로 직전에 준비되었고 빛으로부터 보호하기 위하여 황색 바이알(amber vial)에 보관되었다. 그렇지 않으면 샘플은 분석 전에 -80℃에서 다루어졌다. 이후, 1㎕의 샘플은 3번 반복된 UPLC-QTOF/MS(Ultra Performance Liquid chromatography-A Quadrupole time-of-flight/Mass Spectrometer) 분석을 위하여 주입되었다. 수행 순서는 임의로 조절되었고, 1㎕의 빈(50% 아세토나이트릴) 용액이 컬럼 상태를 안정화하기 위하여 5회의 수행 마다 한 번씩 주입되었다.

1.2 페라고니딘-3-O-β-D-글루코피라노오스의 분리

페라고니딘-3-O-D-글루코피라노오스(pelargonidin-3-O-β-D-glucopyranose; P3G)는 고속 역상 전류 크로마토그래피(high-speed counter current chromatography; HSCCC)를 사용하여 대한민국에서 널리 경작되는 허니 베리로(Lonicera caerulea var. edulis의 과일)부터의 이전 조건의 약간의 수정과 함께 분리되었다(L. Chen et al., Food Chem 152(2014) 386-390).

<실시예 2> 실험 방법

2.1 UPLC-QTOF/MS 분석

UPLC-QTOF/MS 시스템은 이성분 용매와 연결된 Waters Acquity UPLC 시스템(Waters Co., Milford, MA, USA) 및 자동 견본기(autosampler)로 구성된다. UPLC 컬럼은 Waters Acquity UPLC BEH C18(150mm x 2.1 mm, 1.7㎛)이다. 이동상은 H₂O 내(A) 및 아세토나이트릴 내(B)에 0.1%의 포름산의 혼합물로 구성되었는데, 이는 다음의 농도 변화를 따른다: (A) 5-20% B (0 - 2 분), 20-95% B (2 - 3 분), 95% B (3 - 3.2 분), 그리고 5% B(3.2 - 5 분)에서 재-평형되었다. (B) 5-20% B (0 - 5 분), 20-95% B (5 - 6.5 분), 95% B (6.5 - 8 분), 그리고 5% B(8 - 15 분)에서 재-평형되었다. (C) 5-20% B (0 - 10 분), 20-95% B (10 - 11.5 분), 95% B (11.5 - 13 분), 그리고 5% B (13 - 20 분)에서 재-평형 되었다. (D) 5-20% B (0 - 15 분), 20-95% B (15 - 16.5 분), 95% B (16.5 - 18 분), 그리고 5% B (18 - 25 분)에서 재-평형 되었다.

흐름 속도는 310 μl/분으로 설정되었다. 자동 견본기 및 컬럼 오븐 내의 온도는 각각 10℃ 및 45℃로 유지되었다. QTOF/MS 분석은 Waters Xevo G2 QTOF 질량 분광계(Waters MS Technologies, Manchester, UK)에서 수행되었다. 모든 샘플은 다음의 ESI 조건에 따라 측정되었다: 양이온 모드(positive ion mode), 3.2 kV의 캐필러리 전압(capillary voltage), 10-45V로부터의 콘 저압(cone volatage), 120℃의 소스 온도, 350℃의 탈용매화 온도, 0 l/h의 콘 가스(cone gas) 흐름 및 500 l/h의 탈용매화 가스 흐름. 20,000 FWHM를 초과한 해상도와 함께 이온 습득 속도는 0.2 s였다. 기구는 제조사에서 제시한 소듐 포르메이트(sodium formate) 용액을 보정 표준으로 사용하여 < 5ppm의 질량 정확도를 달성하도록 보정되었다. 최적화된 MS 조건의 질량 정확도 및 재현성을 확실히 하기 위하여, 로이신 엔케팔린(leucine enkephalin)(양성 모드에서 m/z 556.2767)이 200 pg/μl의 농도 및 10 μl/분의 흐름 속도에서 록 매스(lock mass)으로써 사용되었다. 로이신 엔케팔린은 10초마다 MS 기구 내에 분사 되었다.

2.2 데이터 수집 및 처리

BSE 및 6가지의 상업적인 베리 샘플을 위한 ACMS를 수득한 후에, 정확하고 재현 가능한 MS 데이터는 MassLynx^TM software(Ver.4.1, WatersCo.,Milford,MA,USA)를 사용하여 가공되었다. 크로마토그램에서 1.75에서 3.00 분로부터의 안토시아닌에 상응하는 피크의 범위는 ACMS로 추출되었다. 각각의 안토시아닌에 상응하는 m/z 값 및 피크의 강도는 스펙트럼 리스트의 형태로 수득되었고 나아가 연구를 위하여 Microsoft Excel^ㄾ로 수출되었다.

피크의 확인을 위하여 ACMS내의 어미 이온(parent ions) 및 토막 이온(fragmented ions)은 제조사로부터 제공된 원소 성분 분석 소프트웨어를 사용하여 추출된 가능한 분자식을 제안하였다(원소C,H,O은 5ppm, 적어도 2개의 탄소를 수용한다). 이러한 단계 이후에 문헌적으로 또는 온라인 화합물 데이터베이스(SciFinderㄾ; )를 사용하여 적절한 질량에 해당하는 검색으로 얻은 제시된 식의 비교가 이어졌다.

2.3 통계적 분석

통계적 분석은 Microsoft Excel (Microsoft Co. Richmond, WA, USA)를 사용하여 수행되었다.

<실시예 3> 안토시아닌-함유 소스의 분석 시스템 개발

순수한 및 가공된 안토시아닌-함유 소스의 질의 평가는 주로 UV 또는 MS 분광계와 함께 HPLC를 사용하여 수행되었다(C.T. da Costa et al., J Chromatogr A 881(2000) 403-410). 이러한 통상적인 분석에서 C18 수지를 사용하는 RPLC는 염산(hydrochloric acid), 포름산 또는 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)의 이동용매를 포함하는 산성화된 버퍼 시스템을 사용하는 안토시아닌의 분리를 위해 사용되는 주된 방법이었다(M.A. Rostagno et al., J Chromatogr A 1216(2009) 2-29). 안토시아닌-함유 소스 내의 안토시아닌의 완벽한 함량은 각각의 피크의 머무른 시간과 근거 표준과의 비교로 결정되었다(D. Muller et al., J food sci 77(2012) C340-C345). 그러나, 컬럼 크로마토그래피 중에 안토시아닌은 pH, 온도, 빛 및 수분 함량과 같은 실험 조건에 민감하였다(A. Castaneda-Ovando et al., Food chem 113(2009) 859-871). 또한, 긴 분석 시간 및 비싸고 불안정한 근거 표준과 같은 다양한 결점으로 인하여, 대체적인 방법은 총 안토시아닌 함량을 결정하기 위해 소개되어졌고 사용되어왔다(Z. Zhang et al., J Agric Food Chem 52 (2004) 688-691; C. S. Ku et al., Bioresour Technol 99(2008) 4503-4509). 이에 더하여, 이러한 통상적인 방법은 HPLC 시스템의 모든 안토시아닌 피크를 분리하기 위하여, 뿐만 아니라 추출, 여과 및 산 가수분해에 사용하기 위한 샘플을 준비하기 위하여 많은 시간을 요구하여 안토시아닌의 변성을 초래한다. 그러므로, 본 발명자들은 안토시아닌-함유 소스의 질을 평가하기 위한 대체적인 기술을 LC-MS를 사용하여 개발하였다. UV 또는 MS 크로마토그램에 기반을 둔 통상적인 분석 대신에 추출된 안토시아닌의 혼합물에 상응하는 해결되지 않은 크로마토그램으로부터 대표되는 MS 스펙트럼이 더 분석되었다.

본 발명자들은 컬럼 크로마토그래피 중에 안토시아닌의 변성을 최소화하기 위하여 안토시아닌의 물리화학적 성질을 활용하였다. 이러한 분자는 RPLC에서 잘 유지되지 않았고 극성의 작은 분자(예를들면 설탕 및 아미노산)들 및 조금 극성인 작은 분자(예를 들면 페놀류, 플라보노이드류 및 휘발성 화합물)로 구성된 그룹으로부터 최적화된 짧은 용매구배 조건 하에서 독립적으로 분리될 수 있었다. 게다가, 이온 억제 효과는 피할 수 있는데, 이는 다른 요소의 우위성으로 인하여 안토시아닌의 약한 검출 또는 무검출 때문일 것이다. 직접적인 주입 또는 등용매용리(isocratic dlution) 분석은 MS 분광계 내에서 이온화 억제로 인하여 타겟 분석물의 검출을 방해할 것이다(A. Delcambre et al., Anal Chem 85 (2013) 9736-9741).

3.1 안토시아닌-함유 소스의 MS 분석

본 발명에서, 유럽 약전으로부터의 에탄올 추출법을 사용하여 준비된 BSE는 LC-MS 분석을 위한 실험적인 조건을 최적화하기 위한 모델 샘플로 사용되었다(C.o. Europe Council of Europe, 2013). 우선, 안토시아닌을 위한 모든 LC-MS 분석은 양성 이온 모드에서 수행되었다. 왜냐하면 산성 용매에서 안토시아닌은 플라빌리움(flavylium) 이온으로 존재하기 때문에, 이러한 이온은 양이온 모드에서 분자 이온 피크(예를 들면 [M]⁺)로 검출되고 부가 생성물 이온 피크(예를 들면 [M+X]⁺)로는 검출되지 않았다.

두 번째로, 본 발명자들은 샘플 준비의 조건을 최적화하기 위하여 다른 산성 용매를 사용하는 시도를 하였다(예를 들면 0.2, 2 및 10%의 HCl과 10%의 포름산)(도 1). 0.2%HCl에서 준비된 BSE의 ACMS의 모양 및 이온 갯수는 HCl 및 10% 포름산의 비율이 증가한; 더 산성인 용매에서와 비교하여 효과적으로 얻어졌고, ACMS 스펙트럼은 더 분해되었고 적은 이온이 검출되었다.

다음으로 LC-MS 분석은 다른 성분과 오버랩(overlap) 되지 않은 ACMS 스펙트럼을 수득하기 위하여 각각 다른 수행 시간(5-25분)을 사용하여 짧은 용매구배 용매 시스템을 최적화하기 위해 수행되었다. 수행 시간이 길어지면, 안토시아닌에 해당되는 대체되는 넓은 피크가 잘 관찰되었다(도 2 참조). 흥미롭게도, 20분 수행 동안 측정된 크로마토그램은 심하게 분해되었다. 5 및 15분의 분석 시간과 함께, BSE 안에서 모든 14 안토시아닌에 상응하는 해결되지 않은 피크는 다른 피크로부터 선명하게 분리되었다(도 3). 이러한 피크는 BPI모드에서 TIC 모드에서보다 더 쉽게 구분되었다. 몇몇의 안토시아닌은 같은 분자 식을 갖고 있음으로 인하여, 하나의 이온 피크로 관찰되었고(예를들면., 시아니딘 3-O-갈락토즈(cyanidin 3-O-glucose), 시아니딘 3-O-글루코스(cyanidin 3-O-glucose) 및 페튜니딘 3-O-아라비노스(petunidin 3-O-arabinose)는 모두 C₂₁H₂₁O₁₁이다), 빌베리 종에서 보고된 모든 안토시아닌은 이론적인 질량과 비교하여 5ppm의 질량 수용능력인 것으로 결정되었다(도 4 및 아래 표 1)(D. Burdulis et al., Medicina(Kaunas) 43 (2007) 971-977).

5-분의 수행시간 내 1.75-3.00 mm범위 및 15-분 수행시간 내 2.60-5.10분범위의 안토시아닌의 혼합물에 상응하는 MS 스펙트럼은 더 나아간 연구를 위하여 ACMS로 전환되었다.

3.2 안토시아닌-함유 소스의 ACMS 분석

상기 실시예 3.1로부터 얻은 MS 스펙트럼을 바탕으로 ACMS를 실시하였다. ACMS 내에서 각각 피크의 m/z 값 사이의 패턴은 두 가지 다른 수행 시간으로 일관되게 유지되었다(도 5 참조). 그러므로 더 짧은 분석 시간 및 더 적은 용매의 사용으로 인한 더 짧은 용매구배 조건(5 분)이 분석을 위하여 사용되었다.

최적화된 조건 하에서, ACMS에서 각각의 안토시아닌(안토시아닌의 아글리콘(aglycone))에 상응하는 패턴 및 MS 피크의 부분은 다른 콘 전압(cone voltage)(10-45 V) 측정되었다(도 4). 그러므로, 최적화된 조건을 사용할 경우, 본 발명자들은 안토시아닌과 안토시아니딘 피크 사이의 이온 비율은 지리학적 기원, 종 및 재배 년수에 근거한 베리의 다양성을 구분하는데 뿐만 아니라 안토시아닌-함유 소스의 질적 조절을 위하여 사용될 수 있음을 결정하였다.

3.3 전압에 따른 안토시아닌-함유 소스 분석

더 높은 소스 전압(예를 들면, 30V 이상)에서, 각각 안토시아닌 및 안토시아니딘으로 할당된 모든 전구체 이온 및 조각 이온이 검출되었다(도 6). 그러나, 안토시아니딘을 위한 MS 피크는 단지 추적으로 검출되거나 소스 전압이 20V보다 낮은 때엔 검출되지 않았다. ACMS에서 피크의 이온 비율은 본 발명에 따른 시스템의 재현 가능성 및 견고성을 확인하기 위하여 3일의 다른 날에 3배로 분석되었다. 추출 후에 ACMS로부터의 피크의 이온 개수는 10, 20 및 45V에서 측정되었다. 각각 피크의 m/z 449에서의 이온 피크에 대한 이온 비율이 계산되었고 이온은 모든 소스 에너지 범위에서 검출되었다(표 2).

이온 종류의 변동게수(coefficients of variance; CV%) 비율은 각각 2일 째의 6.2% 및 3일 째의 4.2% 가장 약한 피크 7을 제외하고는 3.5% 이하였다. 이러한 결과는 강한 피크 사이의 비율은 한결같고 변종을 위한 판별 마커로 사용될 수 있다는 것을 확실히 하였다.

3.4 BSE의 농도에 따른 분석

본 발명자들은 또한 본 발명에 따른 접근의 적용 가능성을 정량 분석을 위하여 시험하였다. 임의적으로 선택된 다른 농도의 BSE는 본 발명에 따른 최적화된 시스템에 주입되었고, 이의 10, 20 및 45V에서의 선형성(linearities)이 조사되었다(표 3).

모든 곡선(curve)은 R²=0.97 또는 이 이상의 우수한 선형성을 나타냈다. 흥미롭게도, m/z 287(시아니딘), 303(델피니딘(delphinidin)), 449(시아니딘 3-O-갈락토사이드, 시아니딘 3-O-글루코사이드, 및 페튜니딘 3-O-아라비노사이드) 및 465(델피니딘 3-O-갈락토사이드, 델피니딘 3-O-글루코사이드)에서 네 개의 강한 피크에 상응하는 안토시아닌 및 안토시아니딘은 빌베리 종 내에서 가장 풍부한 구성성분이었다(D. Muller et al., J Food Sci 77 (2012) C340-C345; Z.Zhang et al., J agric Food Chem 52 (2004) 688-691). 페라고니딘-3-O-β-D-글루코피라노스(P3G)는 허니 베리(Lonicera caerulea var. edulis의 과일)로부터 분리되었고, 이의 아글리콘, 페라고니딘은 31.25-1000 ng/㎕범위의 농도와 함께 R²=0.9968 및 0.9915의 우수한 선형성을 가졌으며, 이는 ACMS에서 단일 안토시아닌의 정량적 가능성을 제공하였다(표 4 참조).

또한, 시아니딘 유도체로 구성된 안토시아닌 혼합물로의 P3G 표준 용액을 첨가한 후, 본 발명자들은 추출물의 매트릭스에 의한 이온 억제 효과를 시험하였다(도 7 참조). P3G의 이온 피크를 위한 곡선의 높은 선형성은 이의 이온 개수가 이온 억제 없이 비례한다는 것을 나타냈다. 이러한 결과는 시험 적으로 이온 개수는 안토시아닌-함유 소스에서 안토시아닌 및 안토시아니딘의 함량을 나타내고, 이러한 접근이 안토시아닌-함유 생성물의 간단한 정량 분석을 위해 사용될 수 있음을 나타냈다.

<실시예 4> 안토시아닌-함유 상업 소스를 위한 개발된 방법론의 적용

다른 상업 베리(예를 들면., 블루베리(Vaccinium myrtillus), 블랙 베리(Rubus fruticosus), 블랙 커런트(Ribes nigrum), 라즈베리(Rubus idaeus), 한국 오디(Morus alba) 및 한국 라즈베리(Rubus coreanus))는 본 발명에 따른 방법론의 적용 가능성 및 견고성을 평가하기 위하여 시험되었다. 냉동 베리의 하룻밤 동안의 동결건조 후, 샘플은 추출 또는 증발과 같은 다른 전-준비 과정 없이 분석 전에 0.2% HCl에 용해된 후 멤브레인 여과로 간단히 준비되었다. 비록 BSE와 비교하여 안토시아닌을 제외한 모든 다른 구성성분이 풍부하게 검출되었으나(도 8), 1.75-3.00 분에서 안토시아닌에 상응하는 모든 피크는 ACMS 스펙트럼에서 다른 피크로부터 성공적으로 분리되었다(도 9). 각각 베리의 피크의 특징은 ACMS 스펙트럼에서 목록화 되었다(표 5).

베리에서, 대표하는 안토시아닌 피크는 검출되지 않거나 아주 낮은 노이즈 시그널로 측정되었고 이는 설탕 및 섬유소와 같은 다른 구성성분으로 인한 매트릭스 효과로부터 초래되었다(Z. Zhang et al., J Agric Food Chem 52 (2004) 688-691). 게다가, 각각의 베리에서 0.5 보다 낮은 평균값을 포함하는 강한 피크와 비교되는 비주류의 피크(분 또는 피크)는 8% 초과의 높은 CV%값을 가졌는데, 이는 낮은 강도의 피크가 종류의 구분을 위하여 바람직하지 않다는 것을 나타내었다. 그러나, 높은 강도와 함께 특정 안토시아닌의 종류 및 부분은 변종을 구분하기 위하여 및 질 조절의 마커로 사용될 수 있다.

천연색소이고 항산화 활성을 가지며 다양한 베리의 주요 구성성분인 안토시아닌은 안토시아닌-함유 생성물의 질 조절을 위하여 관찰되어야 한다. 그러나, 안토시아닌은 플라빌리움 또는 2-페닐크로메닐륨(2-phenylchromenylium) 이온으로 존재하고 외부 자극에 대하여 매우 불안정하여 통상적인 분석 방법론으로는 정성적 및 정량적 분석을 불가능하게 한다. 이에 본 발명자들은 복잡한 샘플 준비 과정 또는 분석적인 조건을 요구하지 않는 대체적인 기술을 개발하였다. MS 스펙트럼을 사용하는 개념 증명적인 접근은 간단하고 신뢰할 수 있는 안토시아닌-함유 생성물의 분리 방법으로 적용될 수 있고 이러한 샘플의 질을 비싸지 않고 빠른 분석법을 사용하여 평가하여 식품 산업에 적합할 수 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (8)

1. 하기 단계를 포함하는 안토시아닌의 분석방법:
   a) 안토시아닌 함유 식물 추출물을 제공하는 단계;
   b) 상기 a) 단계에서 제조한 추출물을 초고성능 액체 크로마토그래피-4중극 비행시간 질량분석기(Ultra Performance Liquid chromatography - A Quadrupole time-of-flight/Mass Spectrometer; UPLC-QTOF/MS)를 이용하여 분석하는 단계; 및
   c) 상기 b) 단계의 분석으로부터 안토시아닌-집중된 MS 스페트럼(anthocyanin-concentrated MS spectrum; ACMS)을 추출하여 분석하는 단계.
2. 제1항에 있어서, 상기 a) 단계의 안토시아닌 함유 식물은 빌베리(Bilberry), 블랙베리(Vaccinium myrtillus), 블랙 커런트(Ribes nigrum), 라즈베리(Rubus idaeus), 라즈베리(Rubus coreanus), 블루베리(Highbush blueberry), 멀베리(Morus alba), 포도(Vitis vinifera) 및 딸기(Fragaria spp)로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 안토시아닌의 분석방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계의 UPLC-QTOF/MS는 산성용매를 사용한 것을 특징으로 하는 안토시아닌의 분석방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 산성용매는 0.2 내지 10 %의 염화수소 희석 용액 또는 10%의 포름산의 희석 용액인 것을 특징으로 하는 안토시아닌의 분석방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계 및 c) 단계의 분석은 양이온 모드(positive ion mode)에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 안토시아닌의 분석방법.
6. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계에서 추출물은 0.25 - 5mg/ml의 농도로 질량분석기에 주입되는 것을 특징으로 하는 안토시아닌의 분석방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계 및 c) 단계의 분석은 0.1 - 20 분의 용매구배(short gradient) 조건에서 수행되는 것을 특징으로 하는 안토시아닌의 분석방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 b) 단계 및 c) 단계의 분석은 0.1 - 50 V의 전압에서 수행되는 것을 특징으로 하는 안토시아닌의 분석방법.

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