CN104237440B - 独一味的hplc检测方法及指纹图谱检测技术 - Google Patents

Abstract

本发明提供了独一味的HPLC检测方法。本发明还提供了独一味的HPLC指纹图谱检测技术。本发明检测方法中，出峰数量较多，分离度良好，基线平稳，指认了8种成分，专属性好，能够对独一味进行有效检测，为保障药材质量提供给了新的选择。

Description

独一味的HPLC检测方法及指纹图谱检测技术

技术领域

本发明涉及独一味的HPLC检测方法及指纹图谱检测技术。

背景技术

独一味Lamiophlomis rotata(Benth.)Kudo系大宗常用藏药，功能活血止血，祛风止痛，临床广泛用治外科手术后的刀口疼痛、出血、风湿痹痛等症，疗效确切，镇痛作用尤其显著^[1]，具有广阔的应用前景。

独一味药材来源全部依靠野生资源，由于其需求量剧增，资源紧缺，被列为一级濒危藏药。为了保护日益减少的独一味野生资源，2010年版中国药典将其入药部位由全草修订为地上部分^[2]。然而，现有关于独一味药材质量控制的报道主要集中在根及根茎^[3]或全草^[4]，较少涉及地上部分^[5]。现代研究表明，独一味的活性成分主要有3大类^[6，7]：环烯醚萜苷类化合物，具有很好的止血、促凝血作用，是止血活性成分；苯乙醇苷类化合物，具有抗炎、抗氧化活性；黄酮类化合物，具有镇痛止血、抗炎、抗肿瘤活性。现有报道多为采用HPLC法测定其中1～2类成分^[5，8]，尚无同时检测3类以上成分的相关报道。

发明内容

为了进一步完善独一味的质量控制标准，本发明拟采用HPLC法对独一味地上部分样品进行分析评价，并希望指认涵盖环烯醚萜苷、苯乙醇苷、黄酮、咖啡酰4类成分的化合物，能更加全面反映该独一味药材的成分特征，可为该药材的质量控制提供科学依据。

本发明提供了独一味的HPLC检测方法，它包括如下操作步骤：

(1)取待检药材，以甲醇或含水甲醇提取，制备供试品溶液；

(2)将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，检测即可，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料

检测波长：235nm±5nm

流动相：A：乙腈，B：0.1～0.5％磷酸水溶液，梯度洗脱程序为：0～10min，5％～8％A；10～27min，8％～12％A；27～35min，12％～12％A；35～70min，12％～17％A；70～80min，17％～19％A；80～110min，19％～36％A；110～120min，36％～50％A。

进一步地，步骤(1)中，所述含水甲醇中甲醇浓度为50～90％，优选为65～75％，更优选为70％。

更进一步地，步骤(1)中，提取的方法选自回流、超声、浸渍或渗漉。

进一步地，步骤(2)中，磷酸水溶液浓度为0.1％～0.3％，优选为0.1％。

进一步地，所述色谱柱的尺寸为4.6mm×250mm，5μm。

更进一步地，色谱柱柱温为30±2℃。

进一步地，所述检测方法中，选用胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、马钱苷、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷、麦角甾苷中的一种或两种以上的组合物为对照品。

本发明还提供了独一味的HPLC指纹图谱检测方法，它包括如下操作步骤：

(1)取待检药材，以甲醇或含水甲醇提取，制备供试品溶液；

(2)将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，检测即得供试品指纹图谱，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料

检测波长：235nm±5nm

流动相：A：乙腈，B：0.1～0.5％磷酸水溶液，梯度洗脱程序为：0～10min，5％～8％A；10～27min，8％～12％A；27～35min，12％～12％A；35～70min，12％～17％A；70～80min，17％～19％A；80～110min，19％～36％A；110～120min，36％～50％A；

(3)将供试品指纹图谱与对照指纹图谱比较，各共有峰保留时间相似度在0.9以上的药材即为独一味；其中，对照指纹图谱中，共有峰14个，以山栀苷甲酯为参照峰，各共有峰相对保留时间如下：0.65、0.68、0.77、1、1.20、1.26、1.50、1.58、2.44、3.16、3.28、3.39、3.72、4.13。

本发明中需要指出，由于独一味中所含的黄酮类成分和苯乙醇苷类具有相似的色谱保留行为，将这两大类成分完全分离具有较大难度，梯度条件变化时，这两类成分的多个色谱峰相对保留时间变化较大，甚至出现色谱峰位置的互换，因此在同一色谱条件下实现独一味中的黄酮类成分和苯乙醇苷类成分全部达到基线分离是难点。目前公开的独一味色谱条件，尚无法实现同时对这两类成分的完全分离，更没有同时将环烯醚萜苷、苯乙醇苷、黄酮及咖啡酰4类成分有效分离检测的方法。

本发明检测方法中，出峰数量较多，分离度良好，基线平稳，能够对独一味进行有效检测，为保障药材质量提供给了新的选择。本发明首次在同一色谱条件下检测出了上述环烯醚萜苷、苯乙醇苷、黄酮及咖啡酰4类成分，共指认了8个具体化合物，可更全面更准确地用于独一味药材的质量控制。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

图1样品及对照品色谱图(A、B独一味样品HPLC指纹图谱，C.对照品色谱图)，其中，3.胡麻属苷、4.山栀苷甲酯、5.绿原酸、8.马钱苷9.8-O-乙酰山栀苷甲酯、10.连翘酯苷B、11.木犀草苷、12.麦角甾苷

图2主成分投影图

图3不同部位指纹图谱比较(A.果序B.地下部分C.地上部分与13号样品来源相同)

图4不同生长期独一味指纹图谱比较(A.成株B.幼苗与11号样品来源相同)

图5不同贮存时间样品指纹图谱比较(A.贮存1年样-23号样品B.新采样-5号样品)

图6对比条件1的色谱图

图7对比条件2的色谱图，其中，1.山栀苷甲酯；2.绿原酸；3.8-O-乙酰山栀苷甲酯；4.连翘酯苷B；5.芦丁；6.麦角甾苷；7.木犀草苷

图8迪马钻石C₁₈柱色谱图

图9Hypersil ODS2C₁₈柱色谱图

具体实施方式

实施例1本发明检测方法

(1)供试品溶液的制备

取独一味(中粉)约0.6g，精密称定，精密加入70％甲醇30mL，称定重量，回流提取90min，放冷，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

(2)对照品溶液的制备

取胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、马钱苷、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷、麦角甾苷对照品适量，精密称定，加75％甲醇配制成含胡麻属苷0.0576mg/mL、山栀苷甲酯0.0695mg/mL、绿原酸0.0502mg/mL、马钱苷0.0408mg/mL、8-O-乙酰山栀苷甲酯0.0524mg/mL、连翘酯苷B0.0790mg/mL、木犀草苷0.0486mg/mL、麦角甾苷0.0861mg/mL的混合对照品溶液。

(3)将对照品和供试品溶液分别注入液相色谱仪中，采用外标法计算出独一味药材中各对照品成分的含量即可，色谱条件如下：

色谱柱：色谱柱为Welchrom C₁₈柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为A：乙腈-B：0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱(0～10min，5％～8％A；10～27min，8％～12％A；27～35min，12％～12％A；35～70min，12％～17％A；70～80min，17％～19％A；80～110min，19％～36％A；110～120min，36％～50％A)；检测波长：235nm；柱温：30℃；进样量：10μL。

实施例2本发明检测方法考察

1仪器与材料

1.1仪器Utimate3000高效液相色谱仪(包括四元梯度泵，在线脱气机，自动进样器，柱温箱，VWD3400紫外检测器，Chromeleon色谱工作站，德国戴安)，Sartorius BS224S电子分析天平(德国赛多利斯)，MILLIQ超纯水机(美国Millipore)

1.2材料独一味自采或购买(见表1)

表1独一味样品来源

共计30批样品，其中23批为地上部分样品，用于独一味药材指纹图谱的建立，另3批地下部分样品和4批全草样品用于比较分析。由成都中医药大学古锐副研究员鉴定为独一味Lamiophlomis rotata(Benth.)Kudo。胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、马钱苷、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷、麦角甾苷对照品均购自成都曼思特生物科技有限公司(供含量测定用，纯度≥98％)。乙腈(色谱纯，Fisher)，水为超纯水，其余试剂为分析纯。

(注：地上部分包括独一味的茎叶、果序或花序；地下部分包括独一味的根茎和根；全草包括地上和地下部分)

2方法与结果

2.1色谱条件色谱柱：色谱柱为Welchrom C₁₈柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相为A：乙腈-B：0.1％磷酸水溶液，梯度洗脱(0～10min，5％～8％A；10～27min，8％～12％A；27～35min，12％～12％A；35～70min，12％～17％A；70～80min，17％～19％A；80～110min，19％～36％A；110～120min，36％～50％A)；检测波长：235nm；柱温：30℃；记录色谱图120min；进样量：10μL。

2.2对照品溶液的制备取胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、马钱苷、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷、麦角甾苷对照品适量，精密称定，加75％甲醇配制成含胡麻属苷0.0576mg/mL、山栀苷甲酯0.0695mg/mL、绿原酸0.0502mg/mL、马钱苷0.0408mg/mL、8-O-乙酰山栀苷甲酯0.0524mg/mL、连翘酯苷B0.0790mg/mL、木犀草苷0.0486mg/mL、麦角甾苷0.0861mg/mL的混合对照品溶液。

2.3供试品溶液的制备取独一味(中粉)约0.6g，精密称定，精密加入70％甲醇30mL，称定重量，回流提取90min，放冷，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4方法学考察

2.4.1精密度试验：取7号样品制备的同一供试品溶液，连续进样5次，结果各主要共有峰相对峰面积的RSD在0.85％～2.09％，相对保留时间的RSD在0.05％～0.46％，经相似度软件处理，相似度均大于0.999，表明仪器的精密度良好。

2.4.2重复性试验：取7号样品0.6g，共6份，按2.3项下方法制备各供试品溶液，进样测定，结果各主要共有峰相对峰面积的RSD在1.71％～2.82％，相对保留时间的RSD在0.06％～0.59％，经相似度软件处理，相似度均大于0.999，表明方法重复性较好。

2.4.3稳定性试验：取7号样品制备的同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24h进样测定，结果各主要共有峰相对峰面积的RSD在0.78％～1.51％，相对保留时间的RSD在0.09％～0.68％，经相似度软件处理，相似度均大于0.999，表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.5独一味指纹图谱的建立及分析

2.5.1独一味指纹图谱及共有峰的标定

取不同来源的独一味样品(表1)，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样分析，记录色谱图。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》软件，对23批独一味地上部分样品的指纹图谱进行分析(图1)。共标定14个共有峰，经与对照品色谱图相对照，结合二级管阵列检测器对色谱峰的光谱图进行分析，指认了独一味指纹图谱中的第3、4、5、8、9、10、11、12号色谱峰分别对应为胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、马钱苷、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷、麦角甾苷。

其中4号峰为山栀苷甲酯，是独一味中的主要活性成分之一，含量高且较稳定，将其作为参照峰(保留时间和峰面积为1)，计算其它各峰的相对保留时间和相对峰面积，23批地上部分样品的测定结果见表2、表3。

表2地上部分样品共有峰的相对保留时间

表3地上部分样品共有峰的相对保留峰面积

由图1、表2和表3可知，不同来源的独一味指纹图谱差异较大，共有峰相对保留时间基本一致，峰面积比值存在显著差异，不同产地的样品之间差别较大。

2.5.2独一味指纹图谱相似度评价

采用“matlab6.0软件”对23批独一味地上部分样品进行相似度评价，计算各色谱图的整体相似度(表4)。

表4地上部分样品指纹图谱相似度

相似度计算结果表明，23批地上部分样品的相似度在0.640～0.981之间，相同产地样品的相似度较接近。其中13批阿坝州样品(1～13号)和3批甘肃省碌曲县样品(14～16号)相似度较高，共有13批样品相似度>0.90；5批甘孜州样品(17～21号)相似度较接近；而22号云南样品和贮存1年的23号样品相似度最低。

2.5.3独一味指纹图谱主成分分析(PCA)

应用matlab6.0软件对30批独一味样品(23批地上，3批地下，4批全草)进行了PCA分析(图2)。

从以上投影图可知，1～17号样品聚为一类，除17号样品来源于甘孜州外，其余样品均来源于阿坝州及与阿坝县临近的甘肃省禄曲县；3批地下部分样品(24～26号)单独聚为一类，投影在右上方；2批2012年样品(23、27号)和3批2010年样品(28、29、30号)投影于右下方，22号云南样品分布在最右方。

2.5.4不同部位独一味指纹图谱分析

分析相同来源的地上部分、果序、地下部分等不同部位样品。结果显示，不同部位图谱差异明显，其中地上部分的色谱峰较多，峰面积较大；果序的图谱面貌与地上部分相似，但峰面积较小，提示叶中含量较高；地下部分的图谱色谱峰相对较少，绿原酸色谱峰极小，无木犀草苷色谱峰。

2.5.5不同生长期独一味指纹图谱分析

对来源于相同样地的独一味成株与幼苗(以叶片大小划分，叶片长度≥10.0cm为成株，叶片长度≤3.0cm为幼苗)进行指纹图谱分析。

结果显示，二者的指纹图谱基本面貌相似，但幼苗地上部分中的色谱峰较多，峰面积较大。

2.5.6不同贮存时间独一味指纹图谱分析(见图5)

对采自相同地点的贮存1年样品(23号，采自2012年)与新采集样品(5号，采自2013年)进行指纹图谱分析。

结果显示，存贮1年后样品的色谱峰面积均较小，其中8-O-乙酰山栀苷甲酯色谱峰消失。

3讨论

3.12010年版中国药典将独一味的药用部位由全草修订为地上部分，建立了同时测定山栀苷甲酯和8-O-乙酰山栀苷甲酯含量的方法。经查阅文献和预实验，独一味地上部分样品中，除了环烯醚萜苷、苯乙醇苷和黄酮3大类主要活性成分之外，还具含量较高的绿原酸，未见其在独一味中的相关测定报道。因此，本实验拟建立HPLC指纹图谱能同时分离检测上述成分，所建立的方法能更全面更整体的对独一味药材进行质量控制，是对现有含测方法的完善和补充。建立指纹图谱的23批独一味地上部分样品，除2批为产地购买样品，其余21批样品均为自采对口药材，产地涵盖3省7县独一味主产地，样品具有代表性。

3.2提取条件的选择

首先对提取溶剂进行了筛选，考察表明70％甲醇能使上述成分提取总量最大，确定为提取液；亦对甲醇浓度、提取方式、料液比、时间等因素分别进行了考察，筛选出了最佳提取条件。

3.2.1提取溶剂(甲醇)浓度考察

分别精密称取7号药材粉末约0.6g，各以30％、50％、60％、70％、75％、80％、90％的甲醇溶剂25ml，回流提取30min，精密吸取10μl注入高效液相色谱仪，色谱条件同2.1项，结果如表5所示。

表5提取溶剂(甲醇)浓度考察表

结果表明，溶剂为70％的甲醇溶液时总峰面积最大，故选择70％作为甲醇溶液的浓度。

3.2.2提取方式的考察

精密称取7号药材粉末约0.6g，2份，各以回流30min和超声提取30min作为提取方法，以70％甲醇25ml作为提取溶剂，精密吸取10μl注入高效液相色谱仪，色谱条件同2.1，结果如表6所示。

表6提取方式考察表

结果表明，比较回流提取和超声提取方式，前者得到的总峰面积较大。故选择回流提取方法。

3.2.3提取溶剂量的考察

精密称取7号药材粉末约0.6g，4份，各以70％甲醇25ml、30ml、40ml、50ml回流提取30min，精密吸取10μl注入高效液相色谱仪，色谱条件同2.1，

结果如表7所示。

表7提取溶剂量考察表

结果表明，提取溶剂量为30ml总峰面积最大，故确定加入溶剂量为30ml。

3.2.4提取时间的考察

精密称取7号药材粉末约0.6g，4份，以70％的甲醇30ml作为提取溶剂，各回流提取30min、60min、90min、120min，精密吸取10μl注入高效液相色谱仪，色谱条件同2.1，结果如表8所示。

表8提取时间考察表

结果表明，提取90min时总峰面积较大，且不再随提取时间延长而增大，故确定提取时间为90min。

综上，独一味指纹图谱分析的提取方法为：取独一味(中粉)约0.6g，精密称定，精密加入70％甲醇30mL，称定重量，回流提取90min，放冷，再称定重量，用溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

3.3色谱条件的选择

3.3.1比较了磷酸水溶液，醋酸水溶液，磷酸盐缓冲液与乙腈或甲醇的二元梯度洗脱系统，最终确定以乙腈-0.1％磷酸水溶液作为流动相的效果最好，色谱峰数目较多且峰形较好。

同时，本发明前期试验中，还对不同的梯度条件进行了考察，证明本发明前述的梯度条件最佳：

对比条件1：

如图6所示，为相同色谱柱(Welchrom C₁₈柱)；流动相亦为A：乙腈-B：0.1％磷酸水溶液，但梯度洗脱条件不同(0～25min，5％～13％A；25～35min，13％～15％A；35～45min，15％～15％A；45～60min，15％～23％A；60～100min，23％～95％A)，多个色谱峰未达到完全分离。

对比条件2：

如图7所示，为相同色谱柱(Welchrom C₁₈柱)；流动相亦为A：乙腈-B：0.1％磷酸水溶液，调整梯度洗脱条件(0～15min，12％～12％A；15～20min，

12％～20.5％A；20～30min，20.5％～20.5％A)，可同时指认7个色谱峰，其中，与本发明条件相比，有6个相同色谱峰，另测定了芦丁，但色谱图中未能指认胡麻属苷、马钱苷。

3.3.2分别比较了迪马钻石C₁₈柱(4.6mm×250mm，5μm)(见图8)、Hypersil ODS2C₁₈柱(4.6mm×250mm，5μm，大连伊利特)(见图9、WelchromC₁₈柱(4.6mm×250mm，5μm)，3种色谱柱均能分离样品，其中以Welchrom C₁₈柱色谱峰较多，分离度好，遂选择该柱用作独一味指纹图谱分析。经光谱图指认，本文所建立的独一味指纹图谱中，环烯醚萜苷类成分较多，此类成分在235nm左右有最大吸收，同时，经DAD检测器进行210～400nm波段扫描，此波长下色谱峰的数目较多、峰面积较大，因此选择235nm作为独一味指纹图谱的测定波长。

3.4独一味指纹图谱共有峰分析

对23批独一味地上部分样品进行了HPLC指纹图谱共有峰分析。根据各色谱峰的波谱特征，结合文献报道可知，该指纹图谱中主要成分为以山栀苷甲酯为代表的环烯醚萜苷类、以连翘酯苷B为代表的苯乙醇苷类及以木犀草苷为代表的黄酮类成分，绿原酸亦含量较高。

指认了第3、4、5、8、9、10、11、12号色谱峰分别对应为胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、马钱苷、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷、麦角甾苷。除马钱苷外，其余7种成分在样品指纹图谱中均为较大色谱峰。

3.5对不同产地、不同部位、不同生长期、不同贮存时间的样品进行了指纹图谱分析。

对2013年新采的不同产地样品分析表明，相同产地的样品图谱相似度较高。其中13批四川省阿坝县样品(1～13号)和3批甘肃省碌曲县样品(14～16号)具有较高的相似度；而5批四川省甘孜州样品(17～21号)中除17号外，其余样品相似度均较低。其中阿坝县和碌曲县这两个产地距离较近，生态环境较为相似，独一味的成分积累与生态环境的关系值得探索。

不同部位样品分析表明，地上、地下部分图谱区别明显，后者图谱中色谱峰相对较少，绿原酸色谱峰极小或无，无木犀草苷色谱峰；地上部分图谱中色谱峰较多，且上述两个成分均有较大色谱峰。仅从有效成分含量的角度，独一味地上部分质量优于地下部分，入药部位修订为地上部分具有合理性。

比较了来源于相同样品产地的独一味成株与幼苗样品的指纹图谱，二者较相似，但幼苗图谱中的色谱峰较多，峰面积较大，尤其山栀苷甲酯和8-O-乙酰山栀苷甲酯峰面积显著大于成株。对不同贮存时间的样品分析表明，贮存1年后样品中色谱峰面积较小，且不含8-O-乙酰山栀苷甲酯。独一味生长过程中成分积累规律和贮存过程中成分减少规律尚待进一步研究。

参考文献：

[1]张凤，孙连娜，陈万生.独一味的化学成分及其药理作用[J].药学实践杂志，2008，26(3)：169-171.

[2]国家药典委员会.中国药典一部[S].北京：化学工业出版社，2010，245.

[3]潘正，高运玲，张涛，等.HPLC法测定独一味根中环烯醚萜苷和苯乙醇苷[J].中草药，2011,42(2)：279-281.

[4]罗米娜，赵亮，刘霞，等.藏药独一味中槲皮素、木犀草素和芹菜素的HPLC测定[J].药物分析杂志，2006,26(12)：1773-1776.

[5]尉丽力，李茂星，樊鹏程，等.独一味药材中环烯醚萜苷类成分指纹图谱研究[J].中药新药与临床药理，2010，21(4)：403-406.

[6]郝延军，李琳，陈沉，等.独一味化学成分及其活性的研究[J].中国中药杂志，2011，36(4)：465-467.

[7]张爱军，任凤霞，赵毅民.藏药独一味化学成分的研究[J].中国药学杂志，2011,46(2)：102-104.

[8]何映霞，张来，沈昱翔，等.独一味4种药用成分含量的测定[J].贵州农业科学，2013，4(8)，73.

Claims (10)

1.独一味的HPLC检测方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：

(1)取待检药材，以甲醇或含水甲醇提取，制备供试品溶液；

(2)将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，检测即可，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料

检测波长：235nm±5nm

流动相：A：乙腈，B：0.1～0.5％磷酸水溶液，梯度洗脱程序为：0～10min，5％～8％A；10～27min，8％～12％A；27～35min，12％～12％A；35～70min，12％～17％A；70～80min，17％～19％A；80～110min，19％～36％A；110～120min，36％～50％A。

2.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述含水甲醇中甲醇浓度为65～75％v/v。

3.根据权利要求2所述的HPLC检测方法，其特征在于：步骤(1)中，所述含水甲醇中甲醇浓度为70％v/v。

4.根据权利要求1或2所述的HPLC检测方法，其特征在于：步骤(1)中，提取的方法选自回流、超声、浸渍或渗漉。

5.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于：步骤(2)中，磷酸水溶液浓度为0.1％～0.3％。

6.根据权利要求5所述的HPLC检测方法，其特征在于：步骤(2)中，磷酸水溶液浓度为0.1％。

7.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于：所述色谱柱的尺寸为4.6mm×250mm，5μm。

8.根据权利要求1或7所述的HPLC检测方法，其特征在于：色谱柱柱温为30±2℃。

9.根据权利要求1所述的HPLC检测方法，其特征在于：所述检测方法中，选用胡麻属苷、山栀苷甲酯、绿原酸、马钱苷、8-O-乙酰山栀苷甲酯、连翘酯苷B、木犀草苷、麦角甾苷中的一种或两种以上的组合物为对照品。

10.独一味的HPLC指纹图谱检测方法，其特征在于：它包括如下操作步骤：

(1)取待检药材，以甲醇或含水甲醇提取，制备供试品溶液；

(2)将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，检测即得供试品指纹图谱，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶为填料

检测波长：235nm±5nm

流动相：A：乙腈，B：0.1～0.5％磷酸水溶液，梯度洗脱程序为：0～10min，5％～8％A；10～27min，8％～12％A；27～35min，12％～12％A；35～70min，12％～17％A；70～80min，17％～19％A；80～110min，19％～36％A；110～120min，36％～50％A；

(3)将供试品指纹图谱与对照指纹图谱比较，各共有峰保留时间相似度在0.9以上的药材即为独一味；其中，对照指纹图谱中，共有峰14个，以山栀苷甲酯为参照峰，各共有峰相对保留时间如下：0.65、0.68、0.77、1、1.20、1.26、1.50、1.58、2.44、3.16、3.28、3.39、3.72、4.13。