CN104597153A - 一种川芎指纹图谱的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种川芎指纹图谱的测定方法，包括：(1)取川芎药材研细成中粉，精密称定，加入乙醇，超声提取，放冷，补足减失的溶剂重量，过微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液；(2)制备对照品溶液；(3)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，即得川芎指纹图谱。本发明对于指导在临床用药及生产过程中对于原料药有效的投料指导、确保质量的可靠具有积极作用；操作方便、快捷，以其得出的相似度结果，对中药材川芎质量进行评价，结论较为客观、准确。
Description
技术领域
本发明属于中药指纹图谱领域，特别涉及一种川芎指纹图谱的测定方法。
背景技术
川芎是中国药典收载的一味中药。川芎是伞形科植物川芎(Ligusticum chuanxiong)的干燥根茎。川芎中含有多种化学成分：(1)生物碱，川芎嗪(四甲基吡嗪，Tetramethyl-pyrazine)、黑麦草灵(Perlolyrine)亮氨酰苯丙酸内酰胺(Leucylphenylalanine anhydri-de)、腺嘧啶(Adenine)、三甲胺(Trimethylamine)、胆碱(Choline)等；(2)挥发油，十五酸乙酯(Ethylpentadecanoate)、十六酸乙酯(Ethyl palmitate)、十七酸乙酯(Ethyl heptadecanoate)、异十七酸乙酯(Ethyl isoheptadecanoate)、十八酸乙酯(Ethyl octadecanoate)等；(3)内酯类化合物，丁基酜内酯(Butylphtha-lide)、丁烯基酜内酯(Butylidene phthalide)、藁本内酯(Ligustilide)、新蛇床内酯(Neocnidilide).洋川芎内酯(senkyunolide)A、B、C、E、F、I等；(4)有机酸，如阿魏酸(Ferulic acid)、瑟丹酸(Sedanonic acid)、叶酸(Folic acid)、香草酸(Vanillic acid)、咖啡酸(Caffeic acid)、原儿茶酸(Protocatechuic acid)、棕榈酸(Palmitic acid)、亚油酸(Linolenic acid)、4-羟基苯甲酸(4-Hydroxybenzoic acid)等；亦含苯酞类化合物4-羟基-3-丁基苯酞(4-Hydroxy-3-butylphthalide)以及苯酞衍生物，如川芎内酯(Cnidiumlactone)、川芎酚(Chuanxingol)等以及双苯酞衍生物。
川芎主要分布区域：四川、云南、贵州、广西、湖北、湖南、江西、浙江、江苏、陕西、甘肃等功能与主治：活血行气，祛风止痛。用于胸痹心痛，胸胁刺痛，跌扑肿痛，月经不调，经闭痛经，癥瘕腹痛，头痛，风湿痹痛。
中国药典2010年版一部川芎项下收载了薄层色谱的方法以川芎对照药材和欧当归内酯A为参照物鉴别川芎药材；采用液相色谱法测定了川芎中成分阿魏酸的含量；近年来对于川芎指纹图谱研究也有报道，如中医药学报2011年第2期报道了刘旭等人采用色谱技术建立了8种成分的指纹色谱分析方法；中国药事2011年10期发表了王英婷等对川芎药材HPLC法指纹图谱研究，所建立的方法共分离出12个共有峰。实验中所用药材购自本地区药店，产地不详，由于药材产地的信息可反映其代表性。南京中医药大学学报2009年2期报道了徐兰兰等人的研究成果“川芎药材的HPLC指纹图谱研究”，文中仅识别出阿魏酸1个化合物；从上述研究情况可以看出仅从一个成分或一类成分进行监控，尚不能真实反映其内在质量。川芎中所含有的成分不仅含有极性较小的挥发油类化合物，也含有较大极性的生物碱类化合物，建立一种有效的分离检视测试方法，以全面地识别川芎中主要成分。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种川芎指纹图谱的测定方法，该方法在控制川芎的质量，有效的指导临床和生产中使用、保证用药的有效、安全和可靠具有积极作用。
本发明的一种川芎指纹图谱的测定方法，包括：
(1)取川芎药材研细成中粉，精密称定，加入乙醇，35KHz超声提取60min，放冷，补足减失的溶剂重量，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液；
(2)取盐酸川芎嗪对照品、阿魏酸对照品、洋川芎内酯I对照品、洋川芎内酯A对照品、藁本内酯对照品、蛇床子素对照品、欧当归内酯A对照品，精密称定，分别加入甲醇制成对照品溶液；
(3)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，即得川芎指纹图谱；其中，色谱条件为：色谱柱：Kromasil 100-5C18色谱柱；柱温：20℃；检测波长：278nm；进样体积：10μl；流速：1ml·min-1；流动相：流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序：0～60min：15％B→40％B，60～85min：40％B→55％B，85～90min：55％B→75％B，90～100min：75％B→80％B。
所述步骤(1)中的川芎中粉与乙醇的比例为0.2g:20ml，川芎来源为伞形科植物川芎Ligusticunm chuanxiong Hort干燥根茎，受试样品川芎产地为四川、云南、贵州、广西、湖北、湖南、江西、浙江、江苏、陕西、甘肃等区域。
所述步骤(1)中的乙醇的体积百分数为70％。
所述步骤(1)中的微孔滤膜的孔径为0.22μm。
所述步骤(2)中的对照品溶液具体为：每1ml各含盐酸川芎嗪50ng、阿魏酸50ng、洋川芎内酯I 40ng、洋川芎内酯A 80ng、藁本内酯20ng、蛇床子素10ng、欧当归内酯A 30ng的混合溶液。
所述步骤(3)中的Kromasil 100-5C18色谱柱规格为4.6mm×250mm，填料粒度大小为5μm。
所述步骤(3)中的川芎指纹图谱中18个色谱峰被确定为共有色谱峰，通过与对照品保留时间的比较，确定1号为川芎嗪、3号为阿魏酸、12号洋川芎嗪内酯A、14号为藁本内酯，15号为蛇床子素、18号为欧当归内酯A。
所述步骤(3)中的梯度洗脱具体为从15vol％乙腈开始以线性洗脱方式经60min洗脱达到40vol％，以线性洗脱的方式经15min达到55vol％乙腈，以线性洗脱的方式经15min达到75vol％乙腈，以线性洗脱的方式经10min达到80vol％乙腈，最后以80vol％乙腈等度洗脱10min。
有益效果
本发明对制剂指纹图谱进行了研究，建立了液相色谱指纹图谱测定条件，并进行了方法学考察，根据采自于川芎主要产地10个批次的样本，制订了川芎相色谱指纹图谱标准，在临床应用和生产过程中可有效的指导用药和投料、规范生产操作，以确保用药的安全、有效、可靠，对所测得的指纹图谱的辨认，采用国家药典委员会提供的中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.130723版本)计算，操作方便、快捷，以其得出的相似度结果，对指纹图谱进行评价，结论较为客观、准确。
附图说明
图1为对照品指纹图谱；其中，1为盐酸川芎嗪；2为阿魏酸；3为洋川芎内酯I；4为洋川芎内酯A；5为藁本内酯；6为蛇床子素；7为欧当归内酯A；
图2为10个批次川芎指纹图谱；
图3为川芎标准指纹图谱；其中，1为盐酸川芎嗪；3为阿魏酸；7为洋川芎内酯I；12为洋川芎内酯A；14为藁本内酯；15为蛇床子素；18为欧当归内酯A。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
1、名称
名称：川芎
2、供试品采集信息：见下表：
川芎采集信息表
| 编号 | 产地 | 批号 | 来源 |
| 1 | 四川 | 130122 | 上海康桥药业有限公司 |
| 2 | 四川彭州敖平镇 | 120801 | 湖北金新龙中药饮片有限公司 |
| 3 | 四川 | 120701 | 河北安国药材批发市场 |
| 4 | 四川新都 | 20120929 | 四川成都荷花池中药材专业市场 |
| 5 | 四川 | 281258 | 安徽省亳州市兄弟药业 |
| 6 | 四川 | 120902 | 安国中药养生会馆 |
| 7 | 安徽 | 120809 | 亳州市中药饮片厂 |
| 8 | 四川 | 20110801-1 | 河北祁新中药颗粒饮片有限公司 |
| 9 | 河北 | 120802 | 河北安国药材批发市场 |
| 10 | 四川彭州 | 20111101 | 甘肃森源药业科技有限责任公司 |
3、供试品溶液的制备
取川芎中粉0.2g，精密称定，分别加入70％乙醇20ml超声(35KHz，280W)提取30min，放冷，补足减失的溶剂重量，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得。
4、对照品溶液的制备
川芎中主要含有的成分为洋川芎内酯A(Senkyunolide A)、洋川芎内酯I(Senkyunolide I)、川芎嗪、阿魏酸、藁本内酯对照品、蛇床子素、欧当归内酯A。经过试验研究，选择出峰时间稳定且峰面积适中的峰7作为参照色谱峰(S)作为参照物。
5、检测方法的建立
5.1仪器、试剂和色谱条件
仪器：Agilent1200液相色谱；Agilent LC色谱工作站。
试剂：乙腈、甲酸为色谱纯(Spectrum)，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
色谱柱：Kromasil 100-5C18(4.6mm×250mm，5μm)；测定波长：278nm；柱温：20℃；流速：1ml·min-1；进样10μl。
5.2流动相的选择
经比较、筛选，发现(A)0.1vol％甲酸水-(B)乙腈系统以线性梯度洗脱，所得液相色谱图基线较平稳、色谱峰峰形对称、分离度较好，因此选择0.2vol％甲酸水-乙腈系统为流动相。
5.3梯度洗脱程序的优化
经系统摸索、优化、现发现如下线性梯度洗脱程序既能较全面的检出制剂中的化学成分，又可使这些成分获得较为理想的分离效果：洗脱程序为从15％B开始洗脱，先以线性洗脱方式经60min达到40％B后以线性方式经15min洗脱达到55％B，再以线性洗脱方式经15min达到75％B；最后以线性洗脱方式经10min达到85％B；记录时间为100min。
5.4最佳测定波长的确定
参考文献报道川芎中主要含有成分紫外吸收情况，阿魏酸最大吸收波长为300nm，洋川芎内酯I和欧当归内酯A最大吸收波长为278nm，藁本内酯最大吸收波长为278nm、330nm，选定250nm～330nm波段内5个波长254nm、322nm、274nm、284nm和294nm分别进行全波长扫描，经液相色谱-紫外光谱三维图谱的比较和综合分析，发现278nm的川芎图谱中基线较平，上述四种成分等均能较好的检出外，其它成分指纹峰分离度也较好，综合考虑色谱峰的数目、基线及信号相应强弱，确定278nm为川芎指纹图谱的最佳检测波长。
5.5川芎液相色谱指纹图谱中主要色谱峰的指认
根据与对照品的保留时间、UV谱对照，可指认色谱图中主要色谱峰：S为洋川芎内酯，是川芎中的主要有效成分；1号为川芎嗪、3号为阿魏酸、12号洋川芎嗪内酯A、14号为藁本内酯，15号为蛇床子素、18号为欧当归内酯A，在该指纹图谱测定条件下，所测得的川芎指纹图谱能够反映其中的主要有效成分。
6、检测方法的验证
6.1滞后峰检测
为了验证最佳线性梯度洗脱程序是否能较全面的检出制剂中的化学成分，延长测试时间至2h，即：所述步骤(3)中的梯度洗脱具体为从洗脱梯度程序为：0～60min：15％B→40％B，60～85min：40％B→55％B，85～90min：55％B→75％B，90～100min：75％B→80％B，最后以80％B等度洗脱50min，记录时间为150min，结果150min之后未见滞后峰出现。说明最佳线性梯度洗脱程序能较全面的检出川芎中的化学成分。
6.2系统适应性试验
不同的仪器，由于梯度曲线质量和滞后时间的不同，可能影响方法的重现性及选择性，通常可通过调整进样和梯度起始时间减少这种影响，必要时可调整梯度程序。所以我们测定了系统梯度滞后时间，方法如下：用一零死体积连接器代替色谱柱，以甲醇为溶剂A，含0.1％丙酮的甲醇为溶剂B，检测波长为260nm，运行0～100％B的线性梯度，梯度时间20min，流速0.8ml·min-1，记录梯度图形，测定梯度曲线中间点的时间，减去10min，即得。
检测结果为0.8min，可见Agilent 1200HPLC系统梯度滞后时间较小，基本不影响方法的重现性。
6.3仪器精密度试验
取产地为四川批号为130122的川芎，按步骤3(下同)制备供试品溶液，连续进样6次进行测定，根据色谱峰的相对保留时间、相对峰面积比值的一致性，考察仪器的精密度，测定结果见表1、2。
表1 川芎液相指纹图谱精密度考察结果
(主要峰的相对保留时间)
川芎指纹图谱方法学考察精密度试验结果(相对保留时间)
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD(％) |
| 峰1 | 0.233 | 0.233 | 0.233 | 0.233 | 0.233 | 0.233 | 0.053 |
| 峰2 | 0.374 | 0.374 | 0.374 | 0.374 | 0.374 | 0.374 | 0.061 |
| 峰3 | 0.658 | 0.658 | 0.658 | 0.658 | 0.658 | 0.658 | 0.020 |
| 峰4 | 0.794 | 0.795 | 0.794 | 0.795 | 0.795 | 0.795 | 0.043 |
| 峰5 | 0.814 | 0.814 | 0.814 | 0.815 | 0.815 | 0.815 | 0.041 |
| 峰6 | 0.889 | 0.890 | 0.889 | 0.890 | 0.890 | 0.890 | 0.061 |
| 峰7 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.000 |
| 峰8 | 1.093 | 1.093 | 1.092 | 1.092 | 1.093 | 1.092 | 0.004 |
| 峰9 | 1.714 | 1.712 | 1.713 | 1.712 | 1.712 | 1.713 | 0.044 |
| 峰10 | 2.632 | 2.627 | 2.632 | 2.628 | 2.627 | 2.628 | 0.082 |
| 峰11 | 2.782 | 2.779 | 2.782 | 2.778 | 2.778 | 2.779 | 0.072 |
| 峰12 | 2.891 | 2.888 | 2.892 | 2.887 | 2.887 | 2.888 | 0.071 |
| 峰13 | 3.060 | 3.057 | 3.061 | 3.056 | 3.056 | 3.057 | 0.066 |
| 峰14 | 3.213 | 3.211 | 3.214 | 3.209 | 3.209 | 3.210 | 0.065 |
| 峰15 | 3.264 | 3.262 | 3.265 | 3.260 | 3.260 | 3.261 | 0.064 |
| 峰16 | 3.646 | 3.647 | 3.649 | 3.643 | 3.644 | 3.644 | 0.069 |
| 峰17 | 3.668 | 3.670 | 3.672 | 3.665 | 3.666 | 3.666 | 0.069 |
| 峰18 | 3.685 | 3.686 | 3.688 | 3.682 | 3.682 | 3.683 | 0.069 |
表2 川芎指纹图谱方法学考察精密度试验结果(相对峰面积)
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD(％) |
| 峰1 | 0.176 | 0.174 | 0.175 | 0.176 | 0.176 | 0.176 | 0.415 |
| 峰2 | 0.233 | 0.233 | 0.234 | 0.234 | 0.234 | 0.234 | 0.205 |
| 峰3 | 0.360 | 0.367 | 0.369 | 0.362 | 0.358 | 0.363 | 1.209 |
| 峰4 | 0.146 | 0.146 | 0.146 | 0.146 | 0.146 | 0.146 | 0.150 |
| 峰5 | 0.051 | 0.051 | 0.052 | 0.052 | 0.052 | 0.052 | 0.415 |
| 峰6 | 0.126 | 0.126 | 0.126 | 0.127 | 0.127 | 0.128 | 0.560 |
| 峰7 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.000 |
| 峰8 | 0.179 | 0.179 | 0.179 | 0.179 | 0.179 | 0.179 | 0.129 |
| 峰9 | 0.061 | 0.061 | 0.061 | 0.061 | 0.061 | 0.061 | 0.117 |
| 峰10 | 0.761 | 0.756 | 0.728 | 0.742 | 0.741 | 0.726 | 1.917 |
| 峰11 | 0.754 | 0.755 | 0.754 | 0.754 | 0.755 | 0.754 | 0.030 |
| 峰12 | 0.055 | 0.056 | 0.055 | 0.056 | 0.057 | 0.057 | 1.009 |
| 峰13 | 0.071 | 0.071 | 0.071 | 0.070 | 0.070 | 0.069 | 1.003 |
| 峰14 | 3.218 | 3.218 | 3.219 | 3.218 | 3.218 | 3.211 | 0.089 |
| 峰15 | 0.090 | 0.090 | 0.089 | 0.089 | 0.090 | 0.089 | 0.216 |
| 峰16 | 0.084 | 0.084 | 0.084 | 0.083 | 0.083 | 0.083 | 0.741 |
| 峰17 | 0.099 | 0.098 | 0.098 | 0.098 | 0.098 | 0.098 | 0.441 |
| 峰18 | 0.228 | 0.228 | 0.228 | 0.228 | 0.228 | 0.228 | 0.080 |
结果表明，供试品溶液中各共有峰的保留时间及主要峰(占总峰面积5％以上)的峰面积基本一致(RSD<2％)，以第1次进样所得指纹图谱作为参照，用中药指纹图谱相似度评价系统计算后4次进样所得指纹图谱的相似度，结果相似度均符合指纹图谱的技术要求，该液相色谱仪的精密度良好。
6.5样品稳定性试验
取同一产地批次(产地为四川，批号为130122)的川芎的供试品溶液，分别在0h、4h、8h、12h、16h、24h进行检测，以考察样品的稳定性，结果如表3、表4所示，。结果表明，各共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积比值的RSD值均小于3％，表明样品溶液在24h内基本稳定。
表3.川芎指纹图谱方法学考察稳定性试验结果(相对保留时间)
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD(％) |
| 峰1 | 0.233 | 0.233 | 0.233 | 0.233 | 0.233 | 0.233 | 0.097 |
| 峰2 | 0.374 | 0.375 | 0.375 | 0.375 | 0.374 | 0.375 | 0.078 |
| 峰3 | 0.658 | 0.658 | 0.658 | 0.658 | 0.657 | 0.658 | 0.072 |
| 峰4 | 0.795 | 0.795 | 0.795 | 0.795 | 0.794 | 0.794 | 0.063 |
| 峰5 | 0.815 | 0.815 | 0.815 | 0.815 | 0.814 | 0.815 | 0.061 |
| 峰6 | 0.890 | 0.891 | 0.891 | 0.892 | 0.890 | 0.891 | 0.057 |
| 峰7 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.000 |
| 峰8 | 1.093 | 1.093 | 1.093 | 1.093 | 1.093 | 1.093 | 0.003 |
| 峰9 | 1.713 | 1.713 | 1.714 | 1.714 | 1.713 | 1.713 | 0.024 |
| 峰10 | 2.631 | 2.631 | 2.633 | 2.632 | 2.633 | 2.632 | 0.043 |
| 峰11 | 2.781 | 2.782 | 2.784 | 2.783 | 2.784 | 2.782 | 0.039 |
| 峰12 | 2.890 | 2.891 | 2.893 | 2.892 | 2.893 | 2.892 | 0.041 |
| 峰13 | 3.059 | 3.060 | 3.063 | 3.061 | 3.062 | 3.061 | 0.042 |
| 峰14 | 3.213 | 3.214 | 3.216 | 3.215 | 3.216 | 3.215 | 0.046 |
| 峰15 | 3.264 | 3.265 | 3.268 | 3.267 | 3.267 | 3.266 | 0.046 |
| 峰16 | 3.648 | 3.649 | 3.651 | 3.650 | 3.650 | 3.648 | 0.037 |
| 峰17 | 3.670 | 3.671 | 3.673 | 3.672 | 3.672 | 3.670 | 0.036 |
| 峰18 | 3.686 | 3.687 | 3.690 | 3.688 | 3.688 | 3.687 | 0.036 |
表4.川芎指纹图谱方法学考察稳定性试验结果(相对峰面积)
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD(％) |
| 峰1 | 0.169 | 0.171 | 0.169 | 0.171 | 0.170 | 0.170 | 0.460 |
| 峰2 | 0.233 | 0.234 | 0.234 | 0.234 | 0.234 | 0.235 | 0.252 |
| 峰3 | 0.276 | 0.286 | 0.274 | 0.285 | 0.272 | 0.273 | 2.229 |
| 峰4 | 0.129 | 0.130 | 0.130 | 0.130 | 0.130 | 0.130 | 0.139 |
| 峰5 | 0.053 | 0.053 | 0.053 | 0.053 | 0.053 | 0.053 | 0.415 |
| 峰6 | 0.109 | 0.114 | 0.114 | 0.114 | 0.114 | 0.114 | 1.795 |
| 峰7 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.000 |
| 峰8 | 0.179 | 0.174 | 0.174 | 0.174 | 0.178 | 0.174 | 1.278 |
| 峰9 | 0.062 | 0.062 | 0.062 | 0.062 | 0.062 | 0.062 | 0.092 |
| 峰10 | 0.757 | 0.751 | 0.744 | 0.761 | 0.734 | 0.722 | 1.991 |
| 峰11 | 0.745 | 0.745 | 0.751 | 0.749 | 0.749 | 0.748 | 0.310 |
| 峰12 | 0.053 | 0.052 | 0.053 | 0.053 | 0.053 | 0.053 | 0.843 |
| 峰13 | 0.107 | 0.107 | 0.107 | 0.107 | 0.106 | 0.106 | 0.386 |
| 峰14 | 3.078 | 3.073 | 3.077 | 3.071 | 3.070 | 3.066 | 0.144 |
| 峰15 | 0.087 | 0.087 | 0.087 | 0.087 | 0.086 | 0.086 | 0.548 |
| 峰16 | 0.083 | 0.084 | 0.085 | 0.085 | 0.084 | 0.086 | 1.220 |
| 峰17 | 0.105 | 0.106 | 0.108 | 0.108 | 0.107 | 0.108 | 1.184 |
| 峰18 | 0.229 | 0.229 | 0.232 | 0.232 | 0.232 | 0.232 | 0.658 |
6.5方法重复性试验
取同一产地批次(产地为四川，批号为130122)的川芎6份，分别制备供试品溶液并按照选定的色谱条件进行检测，表5、表6结果表明各共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积RSD值均小于3％，表明重复性良好。
表5 川芎指纹图谱方法学考察重现性试验结果(相对保留时间)
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD(％) |
| 峰1 | 0.233 | 0.233 | 0.233 | 0.233 | 0.233 | 0.233 | 0.086 |
| 峰2 | 0.374 | 0.375 | 0.375 | 0.374 | 0.374 | 0.374 | 0.064 |
| 峰3 | 0.658 | 0.658 | 0.658 | 0.658 | 0.657 | 0.657 | 0.067 |
| 峰4 | 0.795 | 0.795 | 0.795 | 0.795 | 0.794 | 0.795 | 0.038 |
| 峰5 | 0.815 | 0.815 | 0.815 | 0.815 | 0.814 | 0.815 | 0.046 |
| 峰6 | 0.891 | 0.891 | 0.891 | 0.891 | 0.891 | 0.891 | 0.033 |
| 峰7 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.000 |
| 峰8 | 1.093 | 1.093 | 1.093 | 1.093 | 1.093 | 1.093 | 0.008 |
| 峰9 | 1.713 | 1.713 | 1.714 | 1.714 | 1.713 | 1.712 | 0.037 |
| 峰10 | 2.631 | 2.631 | 2.632 | 2.632 | 2.630 | 2.629 | 0.041 |
| 峰11 | 2.781 | 2.782 | 2.782 | 2.782 | 2.780 | 2.779 | 0.045 |
| 峰12 | 2.890 | 2.891 | 2.892 | 2.892 | 2.890 | 2.889 | 0.045 |
| 峰13 | 3.059 | 3.061 | 3.061 | 3.061 | 3.058 | 3.057 | 0.049 |
| 峰14 | 3.213 | 3.214 | 3.215 | 3.215 | 3.212 | 3.211 | 0.050 |
| 峰15 | 3.264 | 3.265 | 3.266 | 3.266 | 3.263 | 3.262 | 0.050 |
| 峰16 | 3.647 | 3.649 | 3.649 | 3.649 | 3.644 | 3.643 | 0.073 |
| 峰17 | 3.669 | 3.671 | 3.671 | 3.671 | 3.666 | 3.665 | 0.073 |
| 峰18 | 3.686 | 3.687 | 3.688 | 3.687 | 3.682 | 3.682 | 0.073 |
表6 川芎指纹图谱方法学考察重现性试验结果(相对峰面积)
| 编号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | RSD(％) |
| 峰1 | 0.167 | 0.166 | 0.172 | 0.169 | 0.168 | 0.169 | 1.211 |
| 峰2 | 0.233 | 0.234 | 0.236 | 0.235 | 0.235 | 0.235 | 0.339 |
| 峰3 | 0.286 | 0.285 | 0.294 | 0.291 | 0.297 | 0.303 | 2.395 |
| 峰4 | 0.127 | 0.127 | 0.136 | 0.129 | 0.133 | 0.133 | 2.790 |
| 峰5 | 0.052 | 0.052 | 0.052 | 0.053 | 0.052 | 0.053 | 0.514 |
| 峰6 | 0.112 | 0.116 | 0.114 | 0.118 | 0.112 | 0.113 | 2.171 |
| 峰7 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 1.000 | 0.000 |
| 峰8 | 0.179 | 0.174 | 0.174 | 0.174 | 0.178 | 0.179 | 1.360 |
| 峰9 | 0.061 | 0.062 | 0.063 | 0.062 | 0.061 | 0.061 | 0.900 |
| 峰10 | 0.756 | 0.758 | 0.753 | 0.754 | 0.763 | 0.760 | 0.487 |
| 峰11 | 0.744 | 0.745 | 0.744 | 0.749 | 0.745 | 0.750 | 0.331 |
| 峰12 | 0.053 | 0.052 | 0.054 | 0.053 | 0.053 | 0.053 | 0.858 |
| 峰13 | 0.097 | 0.096 | 0.092 | 0.097 | 0.098 | 0.098 | 2.217 |
| 峰14 | 3.071 | 3.070 | 3.099 | 3.069 | 3.088 | 3.086 | 0.402 |
| 峰15 | 0.087 | 0.087 | 0.086 | 0.086 | 0.086 | 0.086 | 0.350 |
| 峰16 | 0.084 | 0.084 | 0.084 | 0.084 | 0.087 | 0.086 | 1.469 |
| 峰17 | 0.106 | 0.107 | 0.104 | 0.106 | 0.108 | 0.106 | 1.122 |
| 峰18 | 0.230 | 0.231 | 0.232 | 0.231 | 0.233 | 0.231 | 0.436 |
取批号为111001的川芎，按步骤3平行制备6份供试品溶液，依法测定，结果见表5、6。
以上方法学考察结果表明，用本方法测定川芎的指纹图谱，样品稳定性、仪器精密度、方法重复性均较好，能准确测定该制剂的指纹图谱。
7、川芎标准指纹图谱的获得及相似限度的确定
7.110批川芎的测定和标准指纹图谱的建立
10批川芎采集于川芎的主要产地及主要分布地区。
按步骤3制备供试品溶液，依法测定，十批成品的液相指纹图谱叠加图谱；用中药色谱指纹图谱相似度评价系统以10批川芎指纹图谱为基础获得标准指纹图谱；并经计算得标准指纹图谱。
7.2川芎相似度限度的确定
以相似度计算软件生成的川芎标准指纹图谱为参照，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统计算每批川芎指纹图谱的相似度，结果相似度均大于0.90(见表7)为了有效、全面控制产品质量，规定川芎药材指纹图谱与标准指纹图谱经相似度软件计算，相似度应大于0.90。
表7 十批川芎药材指纹图谱相似度考察结果
将十批川芎药材指纹图谱中各特征峰相对保留时间和相对峰面积的平均值，分别作为标准指纹图谱各特征峰的相对保留时间和相对峰面积值，根据生产实际，为了有效、全面控制产品质量，对各特征峰相对保留时间和相对峰面积的波动范围进行了限定，见表8。
表8 川芎标准指纹图谱相对保留时间波动范围
注：S为参照峰
8、川芎指纹图谱稳定性初步考察
以标准指纹图谱为参照，用中药色谱指纹图谱相似度评价系统，考察了10批川芎的指纹图谱相似度变化情况，以验证其稳定性，结果见表9。
表9 十批川芎室温留样指纹图谱相似度稳定性考察结果
试验结果表明，川芎在室温留样30个月内，其指纹图谱变化不大，相似度均在0.90以上，证明该药材质量较稳定，指纹图谱标准能够有效的控制成品质量。
Claims (7)
1.一种川芎指纹图谱的测定方法，包括：
(1)取川芎药材研细成中粉，精密称定，加入乙醇，35KHz超声提取60min，放冷，补足减失的溶剂重量，过微孔滤膜，取续滤液，即得供试品溶液；
(2)取盐酸川芎嗪对照品、阿魏酸对照品、洋川芎内酯I对照品、洋川芎内酯A对照品、藁本内酯对照品、蛇床子素对照品、欧当归内酯A对照品，精密称定，分别加入甲醇制成对照品溶液；
(3)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入高效液相色谱仪测定，即得川芎指纹图谱；其中，色谱条件为：色谱柱：Kromasil 100-5C18色谱柱；柱温：20℃；检测波长：278nm；进样体积：10μl；流速：1ml·min-1；流动相：流动相A为0.1％甲酸水，流动相B为乙腈；梯度洗脱程序：0～60min：15％B→40％B，60～85min：40％B→55％B，85～90min：55％B→75％B，90～100min：75％B→80％B。
2.根据权利要求1所述的一种川芎指纹图谱的测定方法，其特征在于：所述步骤(1)中的川芎中粉与乙醇的比例为0.2g:20ml。
3.根据权利要求1所述的一种川芎指纹图谱的测定方法，其特征在于：所述步骤(1)中的乙醇的体积百分数为70％。
4.根据权利要求1所述的一种川芎指纹图谱的测定方法，其特征在于：所述步骤(1)中的微孔滤膜的孔径为0.22μm。
5.根据权利要求1所述的一种川芎指纹图谱的测定方法，其特征在于：所述步骤(2)中的对照品溶液具体为：每1ml各含盐酸川芎嗪50ng、阿魏酸50ng、洋川芎内酯I 40ng、洋川芎内酯A 80ng、藁本内酯20ng、蛇床子素10ng、欧当归内酯A 30ng的混合溶液。
6.根据权利要求1所述的一种川芎指纹图谱的测定方法，其特征在于：所述步骤(3)中的Kromasil 100-5C18色谱柱规格为4.6mm×250mm，填料粒度大小为5μm。
7.根据权利要求1所述的一种川芎指纹图谱的测定方法，其特征在于：所述步骤(3)中的川芎指纹图谱中18个色谱峰被确定为共有色谱峰，通过与对照品保留时间的比较，确定1号为川芎嗪、3号为阿魏酸、12号洋川芎嗪内酯A、14号为藁本内酯、15号为蛇床子素、18号为欧当归内酯A。
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