CN103926344B

CN103926344B - 夏枯草指纹图谱的检测方法

Info

Publication number: CN103926344B
Application number: CN201410158067.8A
Authority: CN
Inventors: 蒋莉娟; 姚江雄; 许招懂; 方铁铮; 林丽美; 黎志坚
Original assignee: GUANGZHOU XINGQUN PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: GUANGZHOU WANGLAOJI MAJOR HEALTH INDUSTRY CO., LTD.
Priority date: 2014-04-18
Filing date: 2014-04-18
Publication date: 2015-12-30
Anticipated expiration: 2034-04-18
Also published as: CN103926344A

Abstract

本发明公开了一种夏枯草指纹图谱的检测方法，采用超高效液相色谱进行检测，包括以下步骤：供试品溶液的制备：将夏枯草粉碎，精密称量，加60%-100%的甲醇溶液，超声溶解，放凉，定容，摇匀，过滤，得滤液，作为供试品溶液；对照品溶液的制备：精密称量迷迭香酸对照品，加60%-100%的甲醇溶液溶解，作为对照品溶液；分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入超高效液相色谱仪中进行测定，得由15个峰构成的夏枯草指纹图谱。本发明经发明人的大量实验和研究，得出夏枯草指纹图谱的检测方法，并确定了制备供试品溶液和对照品溶液，及超高效液相色谱仪的色谱条件的最优参数；所述检测方法结果准确，精密度高，且节约试剂。

Description

夏枯草指纹图谱的检测方法

技术领域

本发明涉及药材检测领域，特别是涉及夏枯草指纹图谱的检测方法。

背景技术

夏枯草为唇形目唇形科植物，其性寒，味甘、辛、微苦，具有清泄肝火、散结消肿、清热解毒、祛痰止咳、凉血止血的功效，适用于淋巴结核、甲状腺肿、乳痈、头目眩晕、口眼歪斜、筋骨疼痛、肺结核、血崩、带下、急性传染性黄疸型肝炎及细菌性痢疾等。现代药理研究表明，夏枯草还具有降低血压的作用。

目前，市场中存在一些已经丧失夏枯草原本形态的夏枯草粉末和种类繁多的含有夏枯草的复方药，而现有技术中对于检测这些物质是否为夏枯草或是否含有夏枯草的方法较为复杂，且结果误差较大；另外，虽然夏枯草可全草使用，但果穗的药效优于其他部位，而目前对于区分果穗和其他部位的检测方法却相对较少。

发明内容

基于此，本发明的目的在于提供一种夏枯草指纹图谱的检测方法。

解决上述技术问题的具体技术方案如下：

一种夏枯草指纹图谱的检测方法，采用超高效液相色谱进行检测，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：将夏枯草粉碎，精密称量，加体积分数为60%-100%的甲醇水溶液，超声溶解，放凉，定容，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液，所述供试品溶液中夏枯草的浓度为0.005-0.2g/mL；

(2)对照品溶液的制备：精密称量迷迭香酸对照品，加体积分数为60%-100%的甲醇水溶液溶解，作为对照品溶液,所述对照品溶液中迷迭香酸的浓度为14-16μg/mL；

(3)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入超高效液相色谱仪中进行测定，得由15个峰构成的夏枯草指纹图谱；

色谱条件为：色谱柱：C₁₈柱，检测器：紫外检测器，流速0.2-0.6mL·min^-1，检测波长250-380nm，柱温20-40℃，进样量1-10μL，以乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱，所述梯度洗脱为：0→5min，(5-6)%乙腈→(5-6)%乙腈，5→15min，(5-6)%乙腈→(14-16)%乙腈，15→30min，(14-16)%乙腈→(44-46)%乙腈。

在其中一些实施例中，步骤(3)所述色谱条件中：流速0.25-0.6mL·min^-1，检测波长250-260nm，柱温20-40℃，进样量1-3μL，以乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱，所述梯度洗脱为：0→5min，5%乙腈→5%乙腈，5→15min，5%乙腈→15%乙腈，15→30min，15%乙腈→45%乙腈。

在其中一些实施例中，步骤(1)中所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数为74-76%。

在其中一些实施例中，步骤(1)中所述超声处理的功率为240-260W，频率30-35kHz，时间为25-35min。

在其中一些实施例中，步骤(1)中所述供试品溶液中夏枯草的浓度为0.005-0.01g/mL。

在其中一些实施例中，步骤(2)中所述对照品溶液中迷迭香酸的浓度为15μg/mL。

在其中一个实施例中，步骤(1)中所述粉碎的粒度为55-65目。

本发明所述夏枯草指纹图谱的检测方法具有以下优点和有益效果：

本发明经发明人的大量实验和研究，以迷迭香酸为主要指标得出夏枯草指纹图谱的检测方法，并确定了制备供试品溶液和对照品溶液，及超高效液相色谱仪的色谱条件的最优参数；所述检测方法可快速准确地鉴定出夏枯草，还可区分夏枯草果穗和其他部位，有效的防止了用夏枯草其他部位冒充果穗入药；该方法结果准确，精密度高，且节约试剂。

附图说明

图1为实施例4中共有模式指纹图谱；

图2为实施例4中不同产地夏枯草的指纹图谱；

图3为实施例4中对照品溶液的色谱图。

具体实施方式

以下将结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

一种夏枯草指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：将夏枯草粉碎过60目筛，精密称量0.5g，置于100mL三角瓶中，加体积分数为75%的甲醇水溶液，超声溶解（功率250W，频率33kHz），30min，放凉，定容至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：精密称量迷迭香酸对照品，加体积分数为75%的甲醇溶液溶解，制成每1mL中含迷迭香酸15μg的溶液，作为对照品溶液；

(3)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入超高效液相色谱仪中，测定，得夏枯草的指纹图谱，（其15个共有峰，经指认7号峰为迷迭香酸）；

色谱条件为：色谱柱：ACQUITYUPLCBEHC₁₈(2.1mm×50mm，1.7μm)，检测器：紫外检测器，流速0.4mL·min^-1，检测波长254nm，柱温30℃，进样量1μL，以乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱，所述梯度洗脱为：0→5min，5%乙腈→5%乙腈，5→15min，5%乙腈→15%乙腈，15→30min，15%乙腈→45%乙腈。

实施例2

一种夏枯草指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：将夏枯草粉碎过55目筛，精密称量1g，置于100mL三角瓶中，加体积分数为60%的甲醇水溶液，超声溶解（功率240W，频率30kHz），25min，放凉，定容，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：精密称量迷迭香酸对照品，加体积分数为60%的甲醇溶液溶解，制成每1mL中含迷迭香酸14μg的溶液，作为对照品溶液；

(3)分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入超高效液相色谱仪中，测定，得夏枯草的指纹图谱（其15个共有峰，经指认7号峰为迷迭香酸）；

色谱条件为：色谱柱：ACQUITYUPLCBEHC₁₈(2.1mm×50mm，1.7μm)，检测器：紫外检测器，流速0.2mL·min^-1，检测波长250nm，柱温20℃，进样量3μL，以乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱，所述梯度洗脱为：0→5min，5%乙腈→5%乙腈，5→15min，5%乙腈→14%乙腈，15→30min，14%乙腈→44%乙腈。

实施例3

(1)供试品溶液的制备：将夏枯草粉碎过65目筛，精密称量2g，置于10mL三角瓶中，加甲醇，超声溶解（功率240W，频率30kHz），35min，放凉，定容，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：精密称量迷迭香酸对照品，加甲醇溶解，制成每1mL中含迷迭香酸16μg的溶液，作为对照品溶液；

色谱条件为：色谱柱：ACQUITYUPLCBEHC₁₈(2.1mm×50mm，1.7μm)，检测器：紫外检测器，流速0.6mL·min^-1，检测波长380nm，柱温40℃，进样量10μL，以乙腈-0.2%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱，所述梯度洗脱为：0→5min，6%乙腈→6%乙腈，5→15min，6%乙腈→16%乙腈，15→30min，16%乙腈→46%乙腈。

实施例4夏枯草指纹图谱的构建方法

一、实验目的

夏枯草指纹图谱的构建方法。

二、实验方法

1、实验试剂盒药材

甲醇（色谱纯，TEDIA公司），乙腈（色谱纯，TEDIA公司），水为哇哈哈纯净水，磷酸（色谱纯，北京化工厂)。

对照品迷迭香酸（中国食品药品检定研究院，批号：111871-201102）；

不同产地的夏枯草药材13批，均由湖南中医药大学生药学教研室潘清平教授鉴定夏枯草为唇形科植物夏枯草PrunellavulgarisL.的干燥果穗。

表1夏枯草药材来源

2、精密度考察

取同一批夏枯草供试品（表1中湖南长沙），按照实施例1所述检测方法制备供试品溶液，按照其色谱条件，连续进样6次，获得指纹图谱。以7号峰(图1)的保留时间和峰面积为参照，计算样品中所含15个共有峰的相对保留时间和峰面积。

3、重复性考察

按实施例1所述检测方法平行制备同一夏枯草样品溶液6份（表1中湖南长沙），获得指纹图谱。考察样品中所含有15个共有峰的相对保留时间和相对峰面积。

4、稳定性考察

按实施例1所述检测方法制备一份供试品溶液（表1中湖南长沙），分别于0，2，4，6，8，12，24h共7个时间点进样测定，以各峰的相对保留时间和相对峰面积进行考察。

5、指纹图谱共有模式的建立

取表1所述不同产地的13批夏枯草样品，实施例1制备供试品溶液，分别进样1μL，记录UPLC色谱图。采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2.0版)进行分析，生成共有模式指纹图谱。

6、不同产地的夏枯草药材共有峰的确定

采用实施例1所述方法，对表1中的13种不同产地的夏枯草进行图谱分析。

7、指纹图谱的相似度评价

采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件（2.0版）进行分析。

三、实验结果

1、精密度考察结果：各共有峰的相对保留时间的RSD在0.01%～0.05%，相对峰面积的RSD在0.31%～1.12%，表明仪器的精密度良好。

2、各色谱峰的相对保留时间的RSD在0.02%～0.04%，相对峰面积的RSD在0.37%～1.46%，提示方法的重复性良好。

3、夏枯草样品24h各色谱峰的相对保留时间的RSD在0.02%～0.43%，相对峰面积的RSD在1.09%～4.31%，结果表明夏枯草样品溶液在24h内稳定性良好。

4、生成共有模式指纹图谱，参见图1，以峰7（S峰）为参照物，其余各共有峰与峰10的相对保留时间与相对保留面积见表2和表3，其中，表2为表1中编号1-6不同产地的夏枯草UPLC指纹图谱共有峰相对保留时间和相对峰面积，表3为表1中编号7-13不同产地的夏枯草UPLC指纹图谱共有峰相对保留时间和相对峰面积。

表2夏枯草UPLC指纹图谱共有峰相对保留时间和相对峰面积

注：a，相对保留时间；b，相对峰面积。

表3夏枯草UPLC指纹图谱共有峰相对保留时间和相对峰面积

注：a，相对保留时间；b，相对峰面积。

5、上述13批夏枯草样品生成的对照指纹图谱，有15个共有峰，见图2，对照品溶液的色谱图见图3，经与对照品对照，指认7号峰为迷迭香酸。

6、上述13批夏枯草样品相似度计算结果见表4，从表4中可知除开编号3的夏枯草药材相似度较低之外，其他不同产地夏枯草药材相似性均较好。

表413批夏枯草样品相似度计算结果表

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种夏枯草指纹图谱的检测方法，其特征在于，采用超高效液相色谱进行检测，包括以下步骤：

(1)供试品溶液的制备：将夏枯草粉碎，精密称量，加体积分数为74-76％的甲醇水溶液溶解，超声处理，放凉，定容，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液，所述供试品溶液中夏枯草的浓度为0.005-0.2g/mL；所述超声处理的功率为240-250W，频率为30-33kHz，时间为25-35min；所述粉碎的粒度为55-65目；

(2)对照品溶液的制备：精密称量迷迭香酸对照品，加体积分数为60％-100％的甲醇水溶液溶解，作为对照品溶液,所述对照品溶液中迷迭香酸的浓度为14-16μg/mL；

(3)分别精密吸取步骤(1)所述供试品溶液和步骤(2)所述对照品溶液，注入超高效液相色谱仪中进行测定；

色谱条件为：色谱柱：C₁₈柱，检测器：紫外检测器，流速0.25-0.6mL·min^-1，检测波长250-260nm，柱温20-40℃，进样量1-3μL，以乙腈-0.2％磷酸水溶液为流动相梯度洗脱，所述梯度洗脱为：0→5min，5％乙腈→5％乙腈，5→15min，5％乙腈→15％乙腈，15→30min，15％乙腈→45％乙腈。

2.根据权利要求1所述的夏枯草指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤(1)中所述供试品溶液中夏枯草的浓度为0.005-0.01g/mL。

3.根据权利要求1或2所述的夏枯草指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述对照品溶液中迷迭香酸的浓度为15μg/mL。