CN105319300A - 元胡止痛滴丸的质量控制方法 - Google Patents

Abstract

一种元胡止痛滴丸的质量控制方法，是采用去氢延胡索甲素为参照物，共有峰有25个的高效液相色谱标准指纹图谱的质量控制方法。该指纹图谱的测定：色谱柱：Diamonsil？C₁₈（4.6？mm×250mm，5μm），采用梯度洗脱，流动相A为乙腈，流动相B为用冰醋酸调pH为3.5的0.4‰乙酸铵溶液，检测波长：245？nm，柱温：35℃；流速：1.0mL/min。采用本发明的测定方法，能有效的控制元胡止痛滴丸的内在质量，方法具有精密度、稳定性、重复性高的特点，确保产品质量的稳定一致，从而保证产品的安全有效<b>。</b>

Description

元胡止痛滴丸的质量控制方法

技术领域

本发明涉及中成药的质量控制方法，特别是涉及采用高效液相色谱（HPLC）指纹图谱测定来控制元胡止痛滴丸质量的控制方法。

背景技术

中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂半成品质量的真实性、优良性和稳定性。由于中药及其制剂均为多组分复杂体系，尤其是复方中药成分复杂，其中所含的任意成分含量的高低都不能代表其整体的疗效。如果只用其中一、两种成分来说明其内在质量，具有一定的片面性，更无法判断无药效的指标成分。因此，评价其质量应采用与之相适应的，能提供鉴别其准确可靠的检测方法。目前，国际上多采用指纹图谱对植物，中草药的各种成分进行质量控制。中药质量控制正从简单的单个成分含量测定转向以先进技术为手段，对多组分、多指标进行含量控制。采用中药指纹图谱方式，一方面可以通过指纹图谱的特征性，有效的鉴别样品的真伪和产地；另一方面通过对主要指纹图谱特征峰的面积或比例的控制，能有效控制产品的质量，确保产品质量的稳定一致，进一步可使中药质量与其药效真正结合起来，有助于阐明中药作用机理。从而达到保证产品服用安全有效的目的。

元胡止痛滴丸由延胡索（CorydalisRhizoma）和白芷（AngelicaedahuricaeRadix）两味药组成。方中延胡索为君药，具活血、利气、止痛之功，辅以白芷为臣，可散风寒，宣湿痹，行气血以除头痛、身痛。二药汇方，具有理气、活血、止痛的作用，用于气滞血瘀的胃痛、胁痛、头痛及月经痛等。本品现已被列入国家医保甲类药品、国家中药保护品种目录。元胡止痛滴丸现行质量标准收载于《中国药典》（2010年版）第二增补本，仅规定白芷和延胡索的薄层色谱鉴别方法和高效液相色谱测定延胡索乙素及欧前胡素含量的方法，而本品成分复杂，现有质量控制手段和质控指标尚处在较简单的初级阶段，严重制约了本产品的市场拓展、临床应用以及国际化进程，为此对本品进行质量标准提升研究。

发明内容

本发明提供一种元胡止痛滴丸的质量控制方法，通过此方法提升元胡止痛滴丸的质量标准，从而加快元胡止痛滴丸的市场拓展、临床应用以及国际化进程。

为达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

一种元胡止痛滴丸的质量控制方法，该方法是采用去氢延胡索甲素为参照物，共有峰有25个的高效液相色谱标准指纹图谱的质量控制方法。

所述标准指纹图谱的测定方法，包括如下步骤：

（1）色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为乙腈，流动相B为冰醋酸调pH为3.0～4.5的0.4‰乙酸铵溶液；检测波长为210～400nm；柱温：20～40℃；流速：0.5～1.5mL/min；进样量：10μL。

（2）参照物溶液的制备：取去氢延胡索甲素对照品适量，加甲醇配制成浓度为0.1mg/ml溶液，摇匀，即得参照物溶液；

（3）供试品溶液的制备：取研细后的元胡止痛滴丸1g，置于10mL量瓶中，加入适量60%乙醇，超声1h使溶解，冷却，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得供试品溶液；

（4）以去氢延胡索甲素为参照物的标准指纹图谱的制定：精密吸取参照物溶液和供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，依据所测得的图谱，制定元胡止痛滴丸标准指纹图谱;

（5）将元胡止痛滴丸待测产品指纹图谱与所述标准指纹图谱进行比较，当相似度为0.90～1.00时待测产品合格。

所述色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为乙腈，流动相B为冰醋酸调pH为4.0的0.4‰乙酸铵溶液；检测波长为245nm；柱温：35℃；流速：1mL/min；进样量：10μL。

所述梯度洗脱程序按如下，其中流动相比例均为体积百分比：0～30min，流动相A为10～25%，流动相B为90%～75%；30～40min，流动相A为25%，流动相B为75；40～75min，流动相A为25%～80%，流动相B为75%～20%；75～80min，流动相A为80%～100%，流动相B为20%～0%。

所述标准指纹图谱中的1、2、3、4、5、7、8、10、11、12、14、15号峰来自于延胡索，12号峰为去氢延胡索甲素；6、9、13、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25号峰来自于白芷，21号峰是欧前胡素。

本发明通过药效作用及作用机理研究—药效物质基础研究—血中移行成分研究—网络药理学研究—有效成分体内代谢研究，阐明了元胡止痛滴丸的药效物质基础和作用机理。元胡止痛滴丸由延胡索和白芷两味药组成。延胡索主要成分为生物碱，目前已从延胡索中分离得到并经结构鉴定的生物碱类成分有60多种，主要包括原小檗碱类，原阿片碱类、阿朴啡类等，其中去氢延胡索甲素、延胡索乙素、延胡索甲素等原小檗碱类生物碱为该药物中主要的生物活性成分。白芷主要的化学成分为香豆素类，主要为呋喃香豆素如欧前胡素、异欧前胡素等，此外还含有线性二氢香豆素、角型香豆素、角型二氢香豆素、简单香豆素等。元胡止痛滴丸血清药物化学研究结果表明，元胡止痛滴丸入血成分中大多数化合物如生物碱类的巴马汀、黄连碱、延胡索甲素、延胡索乙素、去氢延胡索甲素等和香豆素类的欧前胡素、氧化前胡素、白当归脑、白当归素、补骨脂素等都能作用于脑啡肽酶，据此推测元胡止痛滴丸可能是通过多个化合物与体内脑啡肽酶结合，抑制其生物活性，进而延缓脑啡肽的降解过程，延长镇痛时间和效果，从而起到通过中枢镇痛来缓解原发性痛经的作用。并且，通过网络药理学研究结果提示，与激素调节相关通路作用以及与免疫相关通路作用均与去氢延胡索甲素相关。在此基础上，选择与药效相关的主要活性成分去氢延胡索甲素为参照物进行特征指纹图谱研究，并对指纹图谱中共有峰进行指认。通过建立从原料药材到成品的全过程的质量控制体系，对元胡止痛滴丸质量标准进行了全面的提升。

（1）本发明采用高效液相色谱（HPLC）指纹图谱对元胡止痛滴丸质量进行控制方法能更加完善的控制元胡止痛滴丸成品的质量。以去氢延胡索甲素为参照物的HPLC指纹图谱中25个共有峰的选择更注重药材指标性化学成分与制剂药效学研究结果的关联性和指纹图谱的整体面貌特征，避免了因只测定其中一个或两个化学成分而判断制剂整体质量的片面性，减少人为处理产品质量达标的可能性。为完整、准确评价制剂的质量提供了新的控制标准，从而能更好的控制制剂质量。

（2）本发明所涉及的元胡止痛滴丸，由于各药材之间所含的化学成分复杂，对指纹图谱的制定造成干扰，导致各部分指纹图谱特征不稳定，所以必须严格控制流动相的色谱条件，才能得到良好的指纹图谱。也就是说，本发明涉及制剂的指纹图谱不是将延胡索和白芷药材或制剂的指纹图谱简单叠加就能得到的，由于处方中延胡索和白芷药材所含成分相互之间的干扰影响，导致本发明涉及制剂中延胡索和白芷部分的指纹图谱特征峰发生改变，而只有采用本发明经过反复实验加以确定的条件，才能得到理想的指纹图谱。

（3）以元胡止痛滴丸中主要有效成分延胡索和白芷为指标建立起来的高效液相色谱指纹图谱，代表了元胡止痛滴丸的药理活性，不仅能有效地表征元胡止痛滴丸的内在质量，更适合于生产过程中产品质量的有效控制。

（4）通过实验证明，本发明质量控制方法对元胡止痛滴丸成品的质量控制更为有效，方法精密度、稳定性、重复性均较高。能有效控制产品的质量，确保产品质量的稳定一致，从而保证产品的安全有效。

附图说明

图1为12批元胡止痛滴丸的HPLC指纹图谱（叠加显示）；

图2为元胡止痛滴丸的HPLC标准指纹图谱；

图3为元胡止痛滴丸总离子流图谱；

图4为元胡止痛滴丸指纹图谱中色谱峰归属延胡索药材图谱；

图5为元胡止痛滴丸指纹图谱中色谱峰归属白芷药材图谱。

具体实施方式

为了更充分的解释本发明的实施，提供下述测定方法的实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。下面通过典型的实施例对本发明做进一步的说明。

以下各实施例中所使用的实验材料情况如下：

Agilent1100-高效液相色谱仪，配置自动进样器、柱温箱、UV检测器、Agilent1100色谱工作站；电子天平：AB204-N(METTLERTOLEDO)；超声仪：AutoscienceAS3120。

乙腈(色谱纯，天津市康科德科技有限公司)；乙醇(分析纯，天津市凯信化学工业有限公司)；甲酸（分析纯，天津市光复科技发展有限公司）；其他试剂均为分析纯。

去氢延胡索甲素（批号131220）购自上海融禾医药科技有限公司。元胡止痛滴丸样品12批，由甘肃陇神戎发制药有限公司提供。来源及产地见表1。

实施例1元胡止痛滴丸标准指纹图谱建立

1、色谱条件Agilent1100高效液相色谱仪；

色谱柱：DiamonsilC₁₈(250mm×4.6mm，5μm)柱；流动相：乙腈（A）-冰醋酸调pH为3.5的0.4‰乙酸铵溶液（B）；洗脱方式：梯度洗脱（见表2）；流速：1mL/min；柱温：35℃；检测波长：245nm；进样量：10μL；分析时间：80min。该色谱条件的选取原因：

由于本实验样品成分复杂，采用等度洗脱时各组份峰分离不理想，不能有效检测样品中各成分峰，故采用梯度洗脱的方式，先后尝试了甲醇-水、甲醇-醋酸、甲醇-乙酸铵、乙腈-醋酸和乙腈-乙酸铵等不同流动相系统，并且尝试了多种不同梯度条件，最后确定梯度洗脱方式。经比较，乙腈和冰醋酸调pH为3.0-4.5的0.4‰乙酸铵溶液一起组成流动相进行梯度洗脱分离效果较好，能较好地使样品中各色谱峰分离且出峰最多。因此最终确定用乙腈和冰醋酸调pH为4.0的0.4‰乙酸铵溶液进行梯度洗脱。

取供试品溶液，在210～400nm波长范围进行全梯度扫描，并对各波长下的色谱图进行分析比较。结果表明，在245nm波长处，从图谱中可以尽可能地获取色谱组分信息以反映体系组成的全貌，因此选择245nm作为检测波长。

2、参照物溶液的制备

取去氢延胡索甲素对照品适量，置10mL量瓶中，加甲醇溶解至刻度，配制成浓度为0.1mg/ml溶液，摇匀，即得参照物溶液。

3、供试品溶液的制备

本实验对不同提取溶剂（50%甲醇、甲醇、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇）、不同提取方法（超声和热回流）和不同提取时间（1/2h、1h和2h）进行了优化考察。实验结果表明，采用60%乙醇超声提取1h作为供试品的制备方法，所得指纹图谱出峰数较多。因此，取元胡止痛滴丸适量，置于研钵中研成粉末状，称取1.000g药粉，置于10mL量瓶，加入60%乙醇溶液，超声1h，冷却，加60％乙醇溶液至刻度，摇匀，滤过，即得。

4、以去氢延胡索甲素为参照峰的标准指纹图谱的制定：精密吸取参照物溶液和供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪，依据所测得的图谱，制定标准指纹图谱。以上述方法作为待测定元胡止痛滴丸样品中延胡索和白芷中一种或几种成分指纹图谱的测试手段。将待测定元胡止痛滴丸样品指纹图谱与上述标准指纹图谱对比，计算相似度，应为0.90～1.00。

5、方法学考察

1）精密度实验在所述优化后的色谱条件下，分析同一批的供试品溶液，连续进样6次，记录指纹图谱，以去氢延胡索甲素（附表3和4中峰号13）色谱峰面积为参照，计算出各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果见附表3、4。实验结果表明，各色谱峰的相对保留时间及峰面积的比值基本没有明显变化，各色谱峰的相对保留时间和单峰面积大于或等于5%的色谱峰的比值基本一致(RSD在5.0%以下)，符合指纹图谱的要求。

2）稳定性实验在所述优化后的色谱条件下，分析同一批的供试品溶液，分别在0，3，6，12，24h时间间隔下检测指纹图谱，以去氢延胡索甲素（附表5和6中峰号13）的保留时间和色谱峰面积为参照，计算出各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果见附表5和6。结果表明，各色谱峰的相对保留时间及峰面积的比值基本没有明显变化，各色谱峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均不大于5%，符合指纹图谱的要求。样品溶液在24h内稳定。

3）重复性实验取同一批的样品，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液6份，检测指纹峰。以去氢延胡索甲素（附表7和8中峰号13）的保留时间和色谱峰面积为参照，计算出各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果见附表7和8。结果表明，各色谱峰的相对保留时间及峰面积的比值基本没有明显变化，各共有峰的相对保留时间和单峰面积占总峰面积大于或等于5%的色谱峰面积比值基本一致(RSD在5.0%以下)，符合指纹图谱要求。

上述实验以同一批号的元胡止痛滴丸制备供试品溶液，按色谱条件采集指纹图谱共有30个色谱峰，并以这30个色谱峰的相对保留时间和相对色谱峰面积进行方法学考察。结果表明，均符合指纹图谱的要求。

6、元胡止痛滴丸标准指纹图谱的建立

本发明收集不同批次元胡止痛滴丸样品12批，由甘肃陇神戎发制药有限公司提供，来源及产地见表1。取上述12批元胡止痛滴丸（编号依次为S1至S12号），按供试品溶液制备方法制备供试品溶液。采用HPLC法对元胡止痛滴丸进行分析，记录各色谱图。

上述实验条件下测定所有样品的HPLC色谱图，见图2。对12批样品进行测定，经比较样品的色谱图和计算相对保留时间，以12号峰去氢延胡索甲素为参照峰，有25个峰确定为共有指纹峰，详见图3。其中单峰面积超过总峰面积5%的吸收峰有3个，分别为：4、12、21号峰；计算相对保留时间和相对峰面积，结果如下所示：相对保留时间：4(0.72±0.05)，12(1.00)，21(1.64±0.10)；占总峰面积大于5%共有峰的相对峰面积：4(0.64±0.10)，12(1.00)，21(0.58±0.10)。其中4号峰为药根碱，其与元胡止痛滴丸的药效关系尚不明确；12号峰为去氢延胡索甲素，是元胡止痛滴丸药效主要活性成分；21号峰为欧前胡素，其遇热不稳定，易分解；故选择12号峰去氢延胡索甲素为参照物；选择12号峰去氢延胡索甲素为参照物其优势在于：去氢延胡索甲素是元胡止痛滴丸药效主要活性成分，其单峰面积超过总峰面积5%，以其为参照物对指纹图谱液相条件方法学进行考察，精密度、稳定性、重复性均良好，该分析方法具有较高的灵敏度和准确度，该方法稳定可靠。25个峰中1、2、3、4、5、7、8、10、11、12、14、15号峰来自于延胡索，12号峰为去氢延胡索甲素；6、9、13、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25号峰来自于白芷，21号峰是欧前胡素。

以去氢延胡索甲素（12号）色谱峰为内参照峰，计算各共有指纹峰保留时间、峰面积的相对比值，计算结果见表9、表10。

7、相似度评价

用《中药色谱图的指纹图谱评价系统》（2004A）软件计算12批元胡止痛滴丸的相似度，结果见表11。12批元胡止痛滴丸的指纹图谱与标准指纹图谱的相似度均大于0.9，相似度良好，标准指纹图谱能有效表征其质量，应用本方法有利于全面控制元胡止痛滴丸的质量。

实施例2元胡止痛滴丸色谱峰指认及归属

采用液质联用法对元胡止痛滴丸标准指纹图谱中的主要特征峰进行了指认，并结合延胡索和白芷药材指纹图谱对25个共有峰进行色谱峰归属。

1、色谱条件

色谱柱：DiamonsilC18(4.6mm×250mm,5μm)；A相：乙腈，B相：冰醋酸调pH为4.0的0.4‰乙酸铵溶液；柱温35℃；进样量10μL；波长245nm；流速：1mL/min。流动相梯度见表2。

2、Q-TOF实验条件

本实验使用Bruker质谱仪，正、负两种模式扫描测定，仪器参数如下：

采用电喷雾离子源；V模式；毛细管电压正模式3.0kV，负模式2.5kV；锥孔电压30V；离子源温度110℃；脱溶剂气温度350℃；脱溶剂氮气流量600L/h；锥孔气流量50L/h；检测器电压正模式1900V，负模式2000V；采样频率0.1s，间隔0.02s；质量数检测范围50~1500Da；柱后分流，分流比为1:5；内参校准液采用甲酸。

3、供试品溶液的制备

元胡止痛滴丸溶液的制备：准确称取元胡止痛滴丸1g，精密称定，置于10mL量瓶中，加入适量60%乙醇，超声1h，冷却至室温后稀释至刻度，滤过，取续滤液，即得。

药材溶液的制备：取醋制延胡索5.0g、白芷2.5g，分别置于两个50mL圆底烧瓶中，精密加入60%乙醇30mL，精密称定，加热回流3h，冷却至室温，用60%乙醇补足减失的重量，摇匀滤过，取续滤液，即得延胡索药材溶液及白芷药材溶液。

4、试验结果

元胡止痛滴丸指纹图谱中25个共有色谱峰归属实验表明，12个色谱峰来源于醋延胡索药材，13个色谱峰归属于白芷药材，通过液质联用从元胡止痛滴丸中指认出20个化合物，有助于全面明确样品的化学信息，能同时对多种成分进行定量分析，可进一步对元胡止痛滴丸的质量进行控制，结果见图4、图5及表12。

Claims (5)

1.一种元胡止痛滴丸的质量控制方法，其特征在于：该方法是采用去氢延胡索甲素为参照物，共有峰有25个的高效液相色谱标准指纹图谱的质量控制方法。

2.如权利要求1所述的一种元胡止痛滴丸的质量控制方法，其特征在于：所述标准指纹图谱的测定方法，包括如下步骤：

（1）色谱条件：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为乙腈，流动相B为冰醋酸调pH为3.0～4.5的0.4‰乙酸铵溶液；检测波长为210～400nm；柱温：20～40℃；流速：0.5～1.5mL/min；进样量：10μL；

（2）参照物溶液的制备：取去氢延胡索甲素对照品适量，加甲醇配制成浓度为0.1mg/ml溶液，摇匀，即得参照物溶液；

（3）供试品溶液的制备：取研细后的元胡止痛滴丸1g，置于10mL量瓶中，加入适量60%乙醇，超声1h使溶解，冷却，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得供试品溶液；

（4）以去氢延胡索甲素为参照物的标准指纹图谱的制定：精密吸取参照物溶液和供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪，照高效液相色谱法测定，依据所测得的图谱，制定元胡止痛滴丸标准指纹图谱;

（5）将元胡止痛滴丸待测产品指纹图谱与所述标准指纹图谱进行比较，当相似度为0.90～1.00时待测产品合格。

3.根据权利要求2中所述的一种元胡止痛滴丸的质量控制方法，其特征在于：所述色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，流动相A为乙腈，流动相B为冰醋酸调pH为4.0的0.4‰乙酸铵溶液；检测波长为245nm；柱温：35℃；流速：1mL/min；进样量：10μL。

4.根据权利要求2中所述的一种元胡止痛滴丸的质量控制方法，其特征在于：所述梯度洗脱程序按如下，其中流动相比例均为体积百分比：0～30min，流动相A为10～25%，流动相B为90%～75%；30～40min，流动相A为25%，流动相B为75；40～75min，流动相A为25%～80%，流动相B为75%～20%；75～80min，流动相A为80%～100%，流动相B为20%～0%。

5.如权利要求2所述的一种元胡止痛滴丸的质量控制方法，其特征在于：所述标准指纹图谱中的1、2、3、4、5、7、8、10、11、12、14、15号峰来自于延胡索，12号峰为去氢延胡索甲素；6、9、13、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25号峰来自于白芷，21号峰是欧前胡素。