CN115639291A - 一种刺五加脑灵合剂指纹图谱的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于中药分析领域，尤其涉及一种中药成方制剂产品刺五加脑灵合剂指纹图谱的构建方法。本发明提供的刺五加脑灵合剂的构建方法及其标准指纹图谱。通过十八烷基键合硅胶为填充料的色谱柱对刺五加脑灵合剂样品进行高效液相色谱分析，以紫丁香苷为参照峰构建指纹图谱，在此基础上对指纹图谱进行评价。得到的刺五加脑灵合剂指纹图谱能够全面、系统、特征性的反应刺五加脑灵合剂中各组分，能够全面有效的评价刺五加脑灵合剂的质量，客观反映产品的真伪优劣，有利于产品质量监控。该方法简便、稳定、精密度高、重现性好。

Description

一种刺五加脑灵合剂指纹图谱的构建方法

技术领域

本发明属于中药分析领域，尤其涉及一种中药成方制剂产品刺五加脑灵合剂指纹图谱的构建方法。

背景技术

中药指纹图谱是指某些中药材或中药制剂经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂产品质量的真实性、优良性和稳定性。

刺五加脑灵液原收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第十八册，现已收载于《中华人民共和国药典》，其主要成分包括五味子和刺五加。具有健脾补肾，宁心安神。用于心脾两虚、脾肾不足所致的心神不宁，失眠多梦，健忘，倦怠乏力，食欲不振的功效。目前在青少年和中老年人群中使用较为广泛。

因用于刺五加脑灵液生产的刺五加和五味子药材产地基源广泛，药材质量控制难以统一。因药材产地不同，其疗效也存在一定的差异。

目前为止，刺五加脑灵液及其生产所用的中药材质量标准，除了必要的鉴别、检查项外，仅要求对其有效化学成分含量进行测定，缺乏有效控制所用药材基源和产地的有效措施，也缺乏全面反映刺五加脑灵液作为中药制剂的真实性、优良性和稳定性质控方法。

发明内容

针对现有技术中存在的研究空白，本发明所要解决的技术问题在于提供一种刺五加脑灵合剂指纹图谱的构建方法，本发明提供的指纹图谱能够全面、有效的评价刺五加脑灵合剂的产品质量。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种刺五加脑灵合剂的指纹图谱的构建方法，包括以下步骤：

（1）对照品溶液的制备：分别精密称取紫丁香苷、刺五加苷E、异嗪皮啶、五味子醇甲对照品适量，用30～100％甲醇溶液稀释，分别配制成对照品溶液；

（2）供试品溶液的制备：精密称取刺五加脑灵合剂，稀释后，稀释液滤过，滤液作为供试品溶液；

（3）采用高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。

进一步的，步骤（1）中，所述甲醇溶液的体积浓度为30-100%；所述对照品溶液的浓度为5～1000μg/mL。

进一步的，步骤（2）中，所述供试品溶液具体制备方法为：精密称取刺五加脑灵合剂5～20ml，用甲醇-水或甲醇稀释，稀释液滤过，滤液作为供试品溶液；所述稀释比例1:1、1:2、1:5；所述甲醇水溶液的体积分数为60％～100％。

进一步的，步骤（3）中，所述色谱柱为250mm×4.6mm,5μm，以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；所述高效液相色谱检测的进样量为0.5～40μl，流速为0.2—1.5ml/min，检测的波长为200~270nm以有机相作为A相，以水相作为B相，进行梯度洗脱。

进一步的，所述流动相A为乙腈，流动相B为0.01％～3％（体积百分比）磷酸水溶液或0.01％～2％（体积百分比）甲酸水溶液或水。

进一步的，所述梯度洗脱的洗脱程序为：0～10min，8%A；10～20min，8～20%A；20～30min，20～50%A；30～45min，50～70%A；45～60min,，70%A。

进一步的，所述刺五加脑灵合剂的指纹图谱以紫丁香苷作为参照峰，其相对保留时间为1.00，其它共有峰的相对保留时间依次为0.541±0.08、0.616±0.08、1.032±0.08、1.088±0.08、1.352±0.08、1.584±0.08、2.127±0.08；以紫丁香苷作为参照峰，其相对峰面积为1.00，其它共有峰的相对峰面积依次为0.210～0.311、0.356～0.476、0.411～0.517、0.308～0.405、0.241～0.312、2.605～2.679、0.297～0.385。

本发明的有益效果为：（1）与现有技术相比，本发明提供的刺五加脑灵合剂指纹图谱的构建方法，即通过十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱对刺五加脑灵合剂样品进行高效液相色谱分析，以紫丁香苷作为参照峰构建指纹图谱，在此基础上对指纹图谱进行评价。该方法符合刺五加脑灵合剂组成成分的特点，供试品溶液制备简单，色谱条件容易实现。得到的刺五加脑灵合剂指纹图谱能够全面、系统、特征性地反应刺五加脑灵合剂中的组成成分，能够全面有效的评价刺五加脑灵合剂的质量，可客观地反映产品的真伪优劣，有利于产品质量监控。该方法简便、稳定、精密度高、重现性好。

（2）本发明提供的标准指纹图谱以紫丁香苷作为参照峰，即使其相对保留时间为1.00，进而确定指纹图谱中其它共有峰的相对保留时间依次为0.541±0.08、0.616±0.08、1.032±0.08、1.088±0.08、1.352±0.08、1.584±0.08、2.127±0.08，以紫丁香苷作为参照峰，其相对峰面积为1.00，指纹图谱中其它共有峰的相对峰面积依次为0.210～0.311、0.356～0.476、0.411～0.517、0.308～0.405、0.241～0.312、2.605～2.679、0.297～0.385，使得得到的指纹图谱能够全面有效的评价刺五加脑灵合剂的质量。

附图说明

图1为本发明提供的13批刺五加脑灵合剂指纹图谱；

图2为本发明提供的刺五加脑灵合剂的标准指纹图谱；

图3为紫丁香苷对照品、刺五加苷E对照品、异嗪皮啶对照品、五味子醇甲对照品与刺五加脑灵合剂供试品色谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种刺五加脑灵合剂指纹图谱的建立方法，包括：

将刺五加脑灵合剂制备的供试品溶液通过高效液相色谱检测，以紫丁香苷作为参照峰，得到刺五加脑灵合剂指纹图谱；其中，所述高效液相色谱检测的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料。

按照本发明，所述刺五加脑灵合剂制备的供试品溶液优选按照以下方法制备：将刺五加脑灵合剂经甲醇稀释，滤膜过滤后，得到供试品溶液。并无特殊的限制，本发明中优选稀释溶剂为甲醇水溶液或甲醇；所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数优选为60％～100％，更优选为70％～85％，再优选为80％；所述甲醇优选为分析纯甲醇或色谱纯甲醇，更优选为色谱纯甲醇；所述所述稀释比例，优选为1:1、1:2、1:5，更优选为1:1、1:2，再优选为1:1；所述薄膜过滤的方法为本领域技术人员熟知的方法即可，并无特殊的限制。本发明提供的供试品溶液制备简单。

将刺五加脑灵合剂的供试品溶液通过高效液相色谱检测，以紫丁香苷作为参照峰，得到刺五加脑灵合剂指纹图谱；其中，所述高效液相色谱检测的色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料，优选为Aglient 5 HC-C18（2）column、PhenomenexLunaSuC18（2）column或AgilentZORBAXEclipsePlusC18column；所述色谱柱的规格优选为250mm×4.6mm,5μm；所述高效液相色谱检测的进样量优选为0.5～40μl，更优选为1～20μl，再优选为5～20μl，再优选为5～15μl，最优选为5～10μl。

在本发明中，所述高效液相色谱检测的流动相优选包括有机相与水相；所述有机相为乙腈；所述水相为磷酸水溶液、甲酸水溶液或水。其中，所述磷酸水溶液中磷酸的体积分数优选为0.01％～5％，更优选为0.01％～3％，再优选为0.05％～3％，再优选为0.05％～0.2％，最优选为0.1％～0.2％；在本发明提供的一些实施例中，所述磷酸水溶液中磷酸的体积分数优选为0.1％；所述甲酸水溶液中甲酸的体积分数优选为0.01％～2％，更优选为0.01％～1％，再优选为0.05％～1％，再优选为0.05％～0.5％，最优选为0.1％～0.5％。

所述流动相的洗脱优选为梯度洗脱；所述梯度洗脱的时间优选为0～120min，更优选为0～100min，再优选为0～80min，再优选为0～700min，最优选为0～60min；在本发明中，所述梯度洗脱中，以有机相作为A相，以水相作为B相，洗脱程序优选为：0～10min，8%A；10～20min，8～20%A；20～30min，20～50%A；30～45min，50～70%A；45～60min,，70%A；所述检测的流速优选为0.2～1.5ml/min，更优选为0.5～1.5ml/min，再优选为0.8～1.5ml/min，再优选为0.8～1.2ml/min，最优选为1.0ml/min；所述检测优选采用紫外检测器检测；所述检测的波长优选为220～280nm，更优选为220～270nm，更优选为220～246nm，更优选为220～233nm，最优选为223nm；所述检测时色谱柱的柱温优选为10℃～45℃，更优选为10℃～40℃，再优选为20℃～35℃，再优选为20℃～30℃，最优选为25℃～30℃；在本发明提供的一些实施例中，所述检测时色谱柱的柱温优选为30℃。

其中，洗脱程序中，％A指的是体积比，如15～20％A是指每100ml洗脱剂中含有15～20ml的A。

按照本发明，所述参照峰紫丁香苷的确定优选为与紫丁香苷对照品溶液色谱图对照保留时间的方法确定；所述紫丁香苷对照品溶液优选按照以下方法制备：将紫丁香苷与甲醇水溶液混合，得到紫丁香苷对照品溶液；所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数优选为30％～100％，更优选为40％～80％，再优选为50％～75％，再优选为50％～60％，最优选为50％；所述紫丁香苷对照品溶液中紫丁香苷的浓度优选为5～500μg/ml，更优选为5～300μg/ml，再优选为50～200μg/ml，再优选为60～150μg/ml，再优选为70～100μg/ml，最优选为80μg/ml。

为提高刺五加脑灵合剂指纹图谱的准确性，优选还加入刺五加苷E对照品溶液、异嗪皮啶对照品溶液和/或五味子醇甲对照品溶液。

所述刺五加苷E对照品溶液优选按照以下方法制备：将刺五加苷E与甲醇水溶液混合，得到刺五加苷E对照品溶液；所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数优选为30％～100％，更优选为40％～80％，再优选为50％～75％，再优选为50％～60％，最优选为50％；所述刺五加苷E对照品溶液中刺五加苷E的浓度优选为5～500μg/ml，更优选为5～300μg/ml，再优选为50～200μg/ml，再优选为60～150μg/ml，再优选为70～100μg/ml，最优选为80μg/ml。

所述异嗪皮啶对照品溶液优选按照以下方法制备：将异嗪皮啶与甲醇水溶液混合，得到异嗪皮啶对照品溶液；所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数优选为50％～100％，更优选为50％～90％，再优选为60％～80％，再优选为70％～80％，最优选为75％；所述异嗪皮啶对照品溶液中异嗪皮啶的浓度优选为10～1000μg/ml，更优选为10～800μg/ml，再优选为50～500μg/ml，再优选为50～200μg/ml，再优选为80～150μg/ml，最优选为120μg/ml。

所述五味子醇甲对照品溶液优选按照以下方法制备：将五味子醇甲与甲醇水溶液混合，得到五味子醇甲对照品溶液；所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数优选为50％～100％，更优选为50％～90％，再优选为60％～80％，再优选为70％～80％，最优选为80％；所述五味子醇甲对照品溶液中五味子醇甲的浓度优选为10～500μg/ml，更优选为10～200μg/ml，再优选为10～100μg/ml，再优选为10～80μg/ml，再优选为10～50μg/ml，最优选为20μg/ml。

此外，本发明优选根据10批次以上代表性供试品的检测结果，采用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）》生成刺五加脑灵合剂的标准指纹图谱；本发明优选将供试品指纹图谱采用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》进行相似度评价。

按照本发明，优选地，所述刺五加脑灵合剂指纹图谱按照以下方法建立：

（1）对照品溶液的制备：

紫丁香苷对照品溶液的制备：精密称取紫丁香苷对照品适量，用30％～100％甲醇（体积百分比，以下甲醇浓度均为体积百分比），优选50％甲醇，配制成每1ml含紫丁香苷5～500μg的溶液，优选每1ml含紫丁香苷80μg。

刺五加苷E对照品溶液的制备：精密称取刺五加苷E对照品适量，用30％～100％甲醇，优选50％甲醇，配制成每1ml含和刺五加苷E 5～500μg的溶液，优选每1ml含刺五加苷E80μg。

异嗪皮啶对照品溶液的制备：精密称取异嗪皮啶对照品适量，用50％～100％甲醇，优选75％甲醇，配制成每1ml含异嗪皮啶10～1000μg的溶液，优选每1ml含异嗪皮啶120μg。

五味子醇甲对照品溶液的制备：精密称取五味子醇甲对照品适量，用50％～100％甲醇，优选80％甲醇，配制成每1ml含五味子醇甲10～500μg的溶液，优选每1ml含五味子醇甲20μg。

（2）供试品溶液的制备：精密称取刺五加脑灵合剂5～20ml，用甲醇-水或甲醇稀释，所述甲醇水溶液中甲醇的体积分数优选为60％～100％，更优选为70％～85％，再优选为80％；所述甲醇优选为分析纯甲醇或色谱纯甲醇，更优选为色谱纯甲醇；所述所述稀释比例，优选为1:1、1:2、1:5，更优选为1:1、1:2，再优选为1:1；稀释液滤过，滤液作为供试品溶液。

（3）高效液相色谱仪进样量0.5～40μl，采用高效液相色谱法测定，得到指纹图谱；其中色谱条件为：色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；采用梯度洗脱，梯度洗脱的流动相A为乙腈，流动相B为0.01％～3％（体积百分比）磷酸水溶液或0.01％～2％（体积百分比）甲酸水溶液或水；梯度洗脱时间为0～120min，流速0.3～1.5ml/min；柱温10℃～45℃；紫外检测波长220～280nm。

（4）标准指纹图谱的建立：根据10批次以上代表性供试品的检测结果，采用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）》生成刺五加脑灵合剂的标准指纹图谱。所述的代表性供试品需为检验质量合格且相互独立的制剂样本。

（5）相似度评价：供试品指纹图谱与标准指纹图谱的相似度需大于0.90。

更优选地，上述步骤（2）按照以下方法进行：取刺五加脑灵合剂置具塞锥形瓶中，按照刺五加脑灵合剂与稀释液1:1的体积比例精密加入甲醇，混匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

更优选地，上述步骤（3）中梯度洗脱程序如表1所示进行。

表1梯度洗脱程序表

更优选地，所述刺五加脑灵合剂指纹图谱按照以下方法建立：

（1）对照品溶液的制备：

紫丁香苷对照品溶液的制备：精密称取紫丁香苷对照品适量置于棕色容量瓶中，用50%甲醇溶解并稀释配制成每1ml含80µg的溶液，即为紫丁香苷对照品溶液。

刺五加苷E对照品溶液的制备：精密称取虎杖苷对照品适量置于棕色容量瓶中，用50％甲醇溶解并稀释配制成每1ml含80µg的溶液，即为刺五加苷E对照品溶液。

异嗪皮啶对照品溶液的制备：精密称取异嗪皮啶对照品适量置于棕色容量瓶中，用75％甲醇溶解并稀释配制成每1ml含120µg的溶液，即为异嗪皮啶对照品溶液。

五味子醇甲对照品溶液的制备：精密称取五味子醇甲对照品适量置于棕色容量瓶中，用80%甲醇溶解并稀释配制成每1ml含20µg的溶液，即为五味子醇甲对照品溶液。

（2）供试品溶液的制备：精密称取刺五加脑灵合剂5ml，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇5ml，摇匀，0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

（3）采用高效液相色谱法进行测定：分别精密吸取各对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录60分钟色谱图，即得。色谱条件：色谱柱：Aglient 5 HC-C18（2）column（50mm×4.6mm,5μm）；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸水溶液为流动相B；流速：1.0ml/min；紫外检测波长：223nm；柱温：30℃；按表1的洗脱程序进行梯度洗脱。

用前述刺五加脑灵合剂指纹图谱的实验方法建立12批次代表性刺五加脑灵合剂样品的HPLC指纹图谱，采用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》生成刺五加脑灵合剂标准指纹图谱，其中有8个共有峰，峰号依次记为1～8号。在标准指纹图谱中，以3号峰（紫丁香苷）为参照峰S峰，计算各共有峰与S峰的相对保留时间，所述相对保留时间在第一规定值的±0.08之内，所述第一规定值分别为：0.541（1号峰）、0.616（2号峰）、1.000（3号峰）、1.032（4号峰）、1.088（5号峰）、1.352（6号峰）、1.584（7号峰）、2.127（8号峰）。其中3号峰为紫丁香苷，6号峰为刺五加苷E，7号峰为异嗪皮啶，8号峰为五味子醇甲。这些共有特征峰构成了刺五加脑灵合剂的HPLC指纹图谱，可作为刺五加脑灵合剂的标准指纹图谱。

本发明提供的刺五加脑灵合剂指纹图谱的构建方法，通过在高效液相色谱检测时以十八烷基硅烷键合硅胶为填料的色谱柱，以紫丁香苷作为参照峰构建指纹图谱，使得得到的刺五加脑灵合剂指纹图谱能够全面、系统、特征性地反应刺五加脑灵合剂中的组成成分，能够全面有效的评价刺五加脑灵合剂的质量，可客观的反映产品的真伪优劣，有利于产品质量监控。该方法简便、稳定、精密度高、重现性好。

本发明还提供了一种刺五加脑灵合剂标准指纹图谱，以紫丁香苷作为参照峰，其相对保留时间为1.00，指纹图谱中其它共有峰的相对保留时间依次为0.541±0.08、0.616±0.08、1.032±0.08、1.088±0.08、1.352±0.08、1.584±0.08、2.127±0.08；优选的，指纹图谱中其它共有峰的相对保留时间依次为0.541±0.05、0.616±0.05、1.032±0.05、1.088±0.05、1.352±0.05、1.584±0.05、2.127±0.05；更优选的，指纹图谱中其它共有峰的相对保留时间依次为0.541±0.02、0.616±0.02、1.032±0.02、1.088±0.02、1.352±0.02、1.584±0.02、2.127±0.02；在本发明的一些实施例中，指纹图谱中其它共有峰的相对保留时间依次为0.541、0.616、1.032、1.088、1.352、1.584、2.127。

以紫丁香苷作为参照峰，其相对峰面积为1.00，指纹图谱中其它共有峰的相对峰面积依次为0.210～0.311、0.356～0.476、0.411～0.517、0.308～0.405、0.241～0.312、2.605～2679、0.297～0.385；优选的，指纹图谱中其它共有峰的相对峰面积依次为0.220～0.301、0.366～0.456、0.421～0.507、0.318～0.395、0.251～0.302、2.615～2.669、0.307～0.375；更优选的，指纹图谱中其它共有峰的相对峰面积依次为0.230～0.291、0.376～0.456、0.431～0.507、0.328～0.393、0.261～0.302、2.622～2.659、0.313～0.368；在本发明的一些实施例中，指纹图谱中其它共有峰的相对峰面积依次为0.230～0.291、0.376～0.456、0.431～0.507、0.328～0.393、0.261～0.302、2.622～2.659、0.313～0.368。

优选的，所述相对保留时间为1.352±0.05、1.584±0.05与2.127±0.05的峰对应的化合物依次为刺五加苷E、异嗪皮啶和五味子醇甲。

本发明提供的指纹图谱通过选择以紫丁香苷作为参照峰，即使其相对保留时间为1.00，进而确定指纹图谱中其它共有峰的相对保留时间依次为0.541±0.08、0.616±0.08、1.032±0.08、1.088±0.08、1.352±0.08、1.584±0.08、2.127±0.08，以紫丁香苷作为参照峰，其相对峰面积为1.00，指纹图谱中其它共有峰的相对峰面积依次为0.210～0.311、0.356～0.476、0.411～0.517、0.308～0.405、0.241～0.312、2.605～2.679、0.297～0.385，使得得到的指纹图谱能够全面有效的评价刺五加脑灵合剂的质量。

下面将结合本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1仪器与材料

1.1主要仪器

SHIMADZU SPD-20A高效液相色谱仪（包括在线脱气单元、二元高压输液单元、自动进样器、紫外检测器）（岛津公司）。

1.2实验材料

试剂：色谱纯甲醇（德国默克股份两合公）、甲酸（分析纯）、磷酸（分析纯）、超纯水、紫丁香苷（中国食品药品检定研究院，纯度≥98％）、刺五加苷E（中国食品药品检定研究院，纯度≥98％）、异嗪皮啶（中国食品药品检定研究院，纯度≥98％）、五味子醇甲（中国食品药品检定研究院，纯度≥98％）。

色谱柱：

Aglient 5 HC-C18（2）column（250mm×4.6mm,5μm）

NanoChrom ChromCore120 C18 column（250mm×4.60mm,5μm）

Thermo BDS HYPERSIL C18 column（250mm×4.60mm,5μm）

数据处理软件：

国家药典委员会推荐的中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A版）。

2药材的收集与鉴定

共收集刺五加脑灵合剂制剂13批，样品情况见表2。

表2 13批刺五加脑灵合剂药材信息表

3供试品溶液和对照品溶液的制备

以主要色谱峰的检出率和峰形为指标，对稀释溶剂（60%甲醇、70％甲醇、75％甲醇、90％甲醇、甲醇）进行了考察，结果表明用甲醇作为稀释溶剂的检出率较高，色谱峰的峰形最优，优选甲醇作为稀释溶剂。

以主要色谱峰的检出率和峰形为指标，对稀释比例（1:1、1:2、1:5）进行了考察，结果表明三种不同稀释比例得到的结果无明显差异，为确保最优检出率，优选稀释比例为1:1。

基于以上研究，规定供试品溶液制备条件如下：

精密称取刺五加脑灵合剂5ml，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇5ml，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

对照品溶液的制备：紫丁香苷、刺五加苷E、异嗪皮啶、五味子醇甲可溶于不同比例的50％～100％甲醇，考虑到与药材稀释溶剂一致，优选甲醇。不同对照品溶液浓度（5～1000μg/ml）配合不同进样量（0.5～40μl）均可满足分析要求。兼顾信号强度与对照品用量，优选紫丁香苷、虎杖苷、去氧土大黄苷对照品溶液浓度依次为80μg/ml、80μg/ml、120μg/m、20μg/ml，稀释溶剂依次为50%甲醇、50%甲醇、75%甲醇、80%甲醇。紫丁香苷、刺五加苷E、异嗪皮啶、五味子醇甲对光照敏感，优选棕色容量瓶。因此规定对照品溶液的制备方法：精密称取紫丁香苷对照品适量置于棕色容量瓶中，用50％甲醇溶解并稀释配制成每1ml含80μg的溶液，即为紫丁香苷对照品溶液。精密称取刺五加苷E对照品适量置于棕色容量瓶中，用50％甲醇溶解并稀释配制成每1ml含80μg的溶液，即为刺五加苷E对照品溶液。精密称取异嗪皮啶对照品适量置于棕色容量瓶中，用75％甲醇溶解并稀释配制成每1ml含120μg的溶液，即为去氧土大黄苷对照品溶液。精密称取五味子醇甲对照品适量置于棕色容量瓶中，用80％甲醇溶解并稀释配制成每1ml含20μg的溶液，即为五味子醇甲对照品溶液。

4色谱条件

色谱柱考察：为保证分析方法的通用性，本发明采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的（C18）色谱柱，对多个厂家（Aglient、Nano、Thermo等）的C18色谱柱进行了考察，结果显示不同厂家的C18色谱柱均能满足分析要求，方法重现性良好，以Aglient 5 HC-C18（2）column（250mm×4.6mm，5μm）为最佳。

流动相选择：对流动相组成进行了考察（乙腈-水、乙腈-磷酸-水、乙腈-甲酸-水），因刺五加脑灵合剂成分复杂，梯度洗脱效果好于等度洗脱，磷酸和甲酸的加入有利于改善峰形。在此基础上，考察了不同浓度（0.01％～5％，体积百分比）的磷酸-水和（0.01％～2％，体积百分比）甲酸-水对分离效果的影响，以0.1％磷酸-水为最佳。

检测波长的选择：本研究采用二极管阵列紫外检测器对检测波长（220～280nm）进行了考察，220～270nm各主要色谱峰均有一定的吸收，223nm的色图谱中峰面积普遍较大，色谱峰较多，同时各色谱峰分离较好，因此优选223nm作为检测波长。

此外对流速（0.2～1.5ml/min）、柱温（10℃～45℃）、进样量（0.5～40μl）进行了考察和优化。

综合以上研究，规定色谱条件为：

Aglient 5 HC-C18（2）column（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱，以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸为流动相B；流速：1.0ml/min；紫外检测波长：223nm；柱温：30℃；按表1的洗脱程序进行梯度洗脱。

分别精密吸取各对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，记录60分钟色谱图，即得。

5方法学考察

5.1精密度考察

取同一批号样品（批号：S10），根据供试品溶液制备方法的规定制备供试品溶液，按照色谱条件规定的分析方法连续进样6次，将所得的色谱图输入相似度评价软件进行相似度比较，采用中数法生成参照指纹图谱（R），以参照指纹图谱计算各色谱图的相似度。各色谱图的相似度均大于0.98，且RSD小于0.5％，方法的精密度良好。

5.2重复性考察

取同一批号样品（批号：S10），根据供试品溶液制备方法的规定平行制备6份供试品溶液，按照色谱条件规定的分析方法进样分析，将所得的色谱图输入相似度评价软件进行相似度比较，采用中数法生成参照指纹图谱（R），以参照指纹图谱计算各色谱图的相似度，各色谱图的相似度均大于0.98，且RSD小于0.5％，方法的重复性良好。

5.3稳定性考察

取同一份批号样品（批号：S10），根据供试品溶液制备方法的规定制备供试品溶液，分别于制备后的0、1、2、3、9、12、24h，按照色谱条件规定的分析方法进样分析，采将所得的色谱图输入相似度评价软件进行相似度比较，采用中数法生成参照指纹图谱（R），以参照指纹图谱计算各色谱图的相似度，各色谱图的相似度均大于0.98，且RSD小于0.5％，样品于24h内稳定。

以上方法学考察表明：目前建立的指纹图谱操作方法可行，适合刺五加脑灵合剂指纹图谱的建立和分析。

6刺五加脑灵合剂对照图谱的建立

取不同批次刺五加脑灵合剂药材共13批（样品详情见表2），分别按照已建立的刺五加脑灵合剂指纹图谱分析方法进行分析，得到各批药材的HPLC指纹图谱，结果见图1。

上述13批刺五加脑灵合剂均来源确切，经检验质量合格，且为相互独立的样本，可作为代表性样品。因此以上述13批次样品的色谱指纹图谱为基础，使用药典会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）》进行数据处理得到共有模式指纹图谱，即为刺五加脑灵合剂标准指纹图谱，如图2所示。

通过比较13批刺五加脑灵合剂的色谱图，确定了8个共有峰。在标准指纹图谱中，以3号峰（紫丁香苷）为参照峰S峰，计算各共有峰与S峰的相对保留时间，分别为：0.541（1号峰）、0.616（2号峰）、1.000（3号峰）、1.032（4号峰）、1.088（5号峰）、1.352（6号峰）、1.584（7号峰）、2.127（8号峰）。通过与对照品对照保留时间，确定3号峰为紫丁香苷，6号峰为刺五加苷E，7号峰为异嗪皮啶、8号峰为五味子醇甲。

13批刺五加脑灵合剂指纹图谱共有峰的相对保留时间和相对峰面积分别见表3和表4。

表3 13批刺五加脑灵合剂药材指纹图谱共有峰的相对保留时间

表4 13批刺五加脑灵合剂药材指纹图谱共有峰的相对峰面积

以刺五加脑灵合剂标准指纹图谱为参照，分别计算13批药材的相似度，结果见表5。所有代表性样品（共13批）与标准指纹图谱的相似度均在0.90以上。

表5 13批刺五加脑灵合剂药材指纹图谱的相似度分析结果

R为刺五加脑灵合剂标准指纹图谱。

以上研究表明本发明有良好的精密度、重复性和稳定性，有良好的实用性，能够用于刺五加脑灵合剂的综合质量控制。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (7)

1.一种刺五加脑灵合剂的指纹图谱的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）对照品溶液的制备：分别精密称取紫丁香苷、刺五加苷E、异嗪皮啶、五味子醇甲对照品适量，用30～100％甲醇溶液稀释，分别配制成对照品溶液；

（2）供试品溶液的制备：精密称取刺五加脑灵合剂，稀释后，稀释液滤过，滤液作为供试品溶液；

（3）采用高效液相色谱法测定，得到指纹图谱。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（1）中，所述甲醇溶液的体积浓度为30-100%；所述对照品溶液的浓度为5～1000μg/mL。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，所述供试品溶液具体制备方法为：精密称取刺五加脑灵合剂5～20ml，用甲醇-水或甲醇稀释，稀释液滤过，滤液作为供试品溶液；所述稀释比例1:1、1:2、1:5；所述甲醇水溶液的体积分数为60％～100％。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，步骤（3）中，所述色谱柱为250mm×4.6mm,5μm，以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；所述高效液相色谱检测的进样量为0.5～40μl，流速为0.2—1.5ml/min，检测的波长为200~270nm以有机相作为A相，以水相作为B相，进行梯度洗脱。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述流动相A为乙腈，流动相B为0.01％～3％（体积百分比）磷酸水溶液或0.01％～2％（体积百分比）甲酸水溶液或水。

6.根据权利要求4或5所述的构建方法，其特征在于，所述梯度洗脱的洗脱程序为：0～10min，8%A；10～20min，8～20%A；20～30min，20～50%A；30～45min，50～70%A；45～60min,，70%A。

7.根据权利要求1-6所述的构建方法，其特征在于，所述刺五加脑灵合剂的指纹图谱以紫丁香苷作为参照峰，其相对保留时间为1.00，其它共有峰的相对保留时间依次为0.541±0.08、0.616±0.08、1.032±0.08、1.088±0.08、1.352±0.08、1.584±0.08、2.127±0.08；以紫丁香苷作为参照峰，其相对峰面积为1.00，其它共有峰的相对峰面积依次为0.210～0.311、0.356～0.476、0.411～0.517、0.308～0.405、0.241～0.312、2.605～2.679、0.297～0.385。

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