CN101469322A - 一种用于肝脏损伤和肝硬化的细胞制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种细胞制剂及其制备方法,具体公开了一种用于治疗肝脏损伤疾病的胎盘、脐带组织来源的干细胞制剂及其制备方法。该细胞制剂包含肝细胞样细胞和PBS溶液,其肝细胞样细胞是由胎盘、脐带组织来源的干细胞经体外诱导培养而成。其制备方法包括以下步骤:(1)从脐带和胎盘中将组织干细胞分离纯化、培养,制成细胞悬液;(2)将步骤(1)中的组织干细胞在体外诱导,分化成肝细胞样细胞;(3)将步骤(2)中的肝细胞样细胞用无菌PBS缓冲溶液稀释,制成细胞制剂。该细胞制剂移植到体内不仅能分化为肝细胞而且能分化为内皮细胞,同时分泌多种生长因子,修复肝脏微血管,参与肝细胞增生,改善肝功能。
Description
技术领域
本发明涉及一种细胞制剂及其制备方法,具体地,这种细胞制剂中的细胞来自脐带、胎盘组织的干细胞,移植入人体后可以用于治疗肝组织损伤性的疾病。
背景技术
肝纤维化是许多肝脏疾病的共同病理变化,晚期肝纤微化可以进展为肝硬化、门脉高压、肝功能衰竭,最终需要进行肝移植。目前的治疗手段主要包括支持治疗、对证治疗和抗纤维化治疗,然而目前的抗纤维化治疗的缺点是抗纤维化药物对激活的肝脏卫星细胞引起的纤维化无效,会产生多种副作用。可是最近研究表明即使是晚期肝纤维化也是可以逆转的,这已经引起许多研究者的兴趣。
近年来,关于干细胞制剂的研究不断深入,干细胞制剂对某些疾病的独特疗效逐步受到重视。干细胞是人体各种组织器官的起源细胞,具有自我复制和多向分化的特征。目前研究表明骨髓来源的干细胞可以跨胚层分化为多种细胞类型包括肝细胞、胆管细胞、血管内皮细胞和心肌细胞。干细胞移植治疗对许多慢性疾病和退化性疾病有很好的治疗前景,可以分化为多种组织细胞从而重建损伤组织和器官。由于从人脐带中分离纯化的组织干细胞,具有增殖能力强、来源丰富、采集方便等优点,引起研究者的很大重视。目前已经有报道人脐带组织干细胞移植治疗心脏病,血液血管疾病有一定疗效。尽管有学者证明脐带组织干细胞能够减轻肝纤维化,但是尚无应用来源于脐带细胞移植促进肝细胞再生同时修复肝脏微血管治疗肝损伤性疾病和改善肝功能的先例。因此,开发用于治疗肝组织损伤的细胞制剂及其制备方法具有特别重要的临床意义。
发明内容
为了克服上述现有技术中的不足,本发明的目的是提供一种新型的用于治疗肝脏损伤和肝硬化等疾病的细胞制剂及其制备方法,能够克服上述肝损伤、肝纤维化、肝硬化等肝脏疾病治疗方法的缺点,以及目前已有的治疗肝纤维化干细胞制剂的局限性,移植进体内后可参与肝细胞的再生和微血管的修复。
为实现上述发明目的,本发明采用的技术方案是提供一种用于肝脏损伤和肝硬化的细胞制剂,所述的细胞制剂包含肝细胞样细胞和PBS溶液。
所述肝细胞样细胞是由胎盘、脐带来源的组织干细胞制剂经体外诱导培养而成。
所述胎盘、脐带来源的组织干细胞制剂是由从胎盘、脐带分离得到的组织制成的细胞制剂。
所述组织干细胞呈成纤维细胞样贴壁生长,该细胞群表达(阳性率≧50%)OCT3/4,SSEA-4,CD13,CD73、CD105,不表达或低表达(阳性率≦2%)CD34,CD45,CD117,CD133,CD31,vWF,FLK-1以及HLA-DR。
所述肝细胞样细胞的浓度为每毫升0.5-2×107个细胞。
一种用于肝脏损伤和肝硬化的细胞制剂的制备方法,包括以下步骤:
(1)从胎盘和脐带中将组织干细胞分离纯化、培养,制成细胞悬液,制成胎盘、脐带来源的组织干细胞制剂;
(2)将步骤(1)中的组织干细胞在体外诱导,分化成肝细胞样细胞;
(3)将步骤(2)中的肝细胞样细胞用无菌PBS缓冲溶液稀释,制成细胞制剂。
所述步骤(1)具体包括以下步骤:
第一,将脐带和胎盘机械剪切成1mm3小组织块,采用浓度为1mg/mL胶原酶I在37℃消化1小时,再用浓度为0.25%胰酶37℃消化30分钟,期间温和震荡;
第二,加胎牛血清(FBS)中和胰酶后将组织悬液通过细胞筛,离心收集细胞悬液;
第三,将所得细胞悬液接种于包被4μg/cm2纤连蛋白的T75cm2培养瓶中,在添加了10ng/ml表皮生长因子的D/F12+10%胎牛血清(FBS)体系中培养5到7天;
第四,将得到的呈成纤维样细胞的组织干细胞再消化传代纯化、扩增,浓缩成单个核细胞混悬液,得到胎盘、脐带来源的组织干细胞制剂。
所述步骤(2)具体包括以下步骤:
第一,取5-10代分离的组织干细胞,采用D/F12培养体系,血清饥饿24小时;
第二,第一阶段培养采用IMDM补充20ng/mL肝细胞生长因子和10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子,nicotinamide 20ng/L培养体系持续14天;
第三,第二阶段处理IMDM加入20ng/mL oncostatin M,1μmol/Ldexamethasone,and 50mg/mL ITS+premix培养体系持续14天,每周换液两次。
本发明的有益效果是:
1、按照本发明提供的制备技术,可以将所需细胞从脐带、胎盘组织中分离出来,制备成单个核细胞悬液,该细胞制剂在合适的体外诱导条件下可以分化为肝细胞样细胞;
2、按照本发明技术制备的细胞制剂可以通过病变局部注射或静脉全身移植治疗肝损伤、肝纤维化、肝硬化肝损伤性疾病;
3.按照本发明制备技术制备的细胞制剂移植到体内不仅能分化为肝细胞而且能分化为内皮细胞,同时分泌多种生长因子,修复肝脏微血管,参与肝细胞增生,改善肝功能。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步的详细说明,以下各实施方式仅仅是用于说明而不是限制本发明。
从脐带和胎盘中分离细胞的方法是:将脐带和胎盘机械剪切成1mm3小组织块,采用胶原酶I(1mg/mL)37℃消化1小时,胰酶(0.25%)37℃消化30分钟,期间温和震荡数次,加胎牛血清(FBS)来中和胰酶后将组织悬液通过细胞筛,离心收集细胞悬液,接种于包被4μg/cm2纤连蛋白(Fibronectin)的T75培养瓶中,在添加了10ng/mL表皮生长因子(简称EGF)的D/F12+10%胎牛血清(FBS)体系中培养5到7天,呈成纤维样细胞为组织干细胞,消化传代纯化、扩增细胞。收获浓缩成单个核细胞混悬液,供移植用;根据细胞数将多余的细胞按每袋3×109细胞数,严格按低温保存步骤,贮存于液氮中供多次使用。
所述的细胞呈成纤微样贴壁生长,流式细胞仪检测该细胞群表达(阳性率≧50%)OCT3/4,SSEA-4,CD13,CD73、CD105;但不表达或低表达(阳性率≦2%)造血和内皮细胞的标志:CD34,CD45,CD117,CD133,CD31,vWF,FLK-1,HLA-DR;RT-PCR证明表达特征性标志OCT-4和REX-1;体外在合适的诱导条件下可以向骨,脂肪分化。体内移植后可快速到达损伤的肝脏组织。本发明专利中所述的细胞群表达是指阳性率≧50%,不表达或低表达是指阳性率≦2%。
上述制备所得的细胞制剂在体外适当的诱导条件下可以分化为肝细胞,该诱导条件是:取5-10代培养的细胞,采用D/F12培养体系,血清饥饿24小时后,第一阶段培养采用IMDM补充20ng/mL肝细胞生长因子和10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子,nicotinamide 20ng/mL,持续14天,接下来第二阶段处理IMDM加入20ng/mL oncostatin M,1μmol/Ldexamethasone,and 50mg/mL ITS+premix14天,每周换液两次。
本发明从基因表达和蛋白质两个水平证明该细胞在肝纤维化动物模型中分化为肝细胞和内皮细胞。体内移植后表达人特异性白蛋白,甲胎蛋白,CD31,FLK-1。将该细胞培养扩增后酶消化收集细胞,移植前用无菌的PBS缓冲液稀释至每毫升0.5-2×107个细胞,优选为每毫升1×107个细胞,移植到体内后:①能分化为肝细胞,表现为经CCl4损伤的肝脏组织细胞移植后移植的细胞表达人源性的甲胎蛋白和白蛋白;②能分化为内皮细胞:表现为移植细胞表达FLK-1,VEGF和CD31蛋白;③分泌多种生长因子:包括IGF、VEGF、FGF、BB-肝细胞生长因子等,参与肝脏细胞增生和肝脏窦内皮修复;④肝功能的恢复:表现为接受细胞移植动物的血浆AST、ALT和TBIL水平的有效降低。
目前细胞移植在治疗肝脏疾病中,国内外都没有促进肝细胞再生的同时,改善肝脏血液微循环的细胞制剂。所以该发明在肝脏的细胞治疗方面均具有广阔的应用前景。
初步的的肝功能检查表明,移植组较未移植组有显著改善。
动物试验实例
对NOD/SCID小鼠移植脐带来源细胞制剂的试验:
1)、按照上述实施方式所述的制备方法,制成脐带来源细胞制剂备用。
2)、小鼠肝纤维化模型的建立及细胞移植:将NOD/SCID小鼠(雄性,8-9周,18-21g)饲养于SPF级层流架中;动物模型的制作过程为:应用CCl4 0.5ml/kg体重皮下注射,每周一和四注射两次;当注射8次后第二天,0.25%胰酶消化培养的脐带组织干细胞,1,000rpm离心8min,PBS重悬细胞1×107个细胞/mL;实验组动物经尾静脉移植0.1mL细胞悬液即1×106脐带组织干细胞,对照组注射0.1mlPBS。为跟踪注射入体内的细胞去向,取10只小鼠,其移植细胞先用荧光染料CM-Dil标记,即细胞在消化离心后重悬于2μg/ml CM-Dil PBS溶液中,37℃下孵育8分钟,4℃下孵育20分钟,PBS洗两遍后,PBS重悬细胞1×107个细胞/ml。
3)、肝脏标本的采集及制备:在手术后第7天、14天、21天、28天,每组各取2~4只NOD/SCID小鼠,用摘除眼球法取小鼠外周血500ul,8,000rpm离心20min分离收集血浆检测肝功能;脱臼处死后取动物肝脏,一部分组织用作4%多聚甲醛固定,制备常规石蜡切片;另一部分肝脏组织用OCT胶固定常规制备冰冻切片。
4)、肝脏标本的免疫化学染色:组织常规脱蜡水化,兔抗人Alb多克隆抗体(DAKO)和兔抗人AFP多克隆抗体(Neo Markers),兔抗人VEGF、CD31和Flk-1多克隆抗体(1:100,Santa Cruz biotechnology)作一抗,按PV6000组化试剂盒说明进行二抗孵育,DAB显色,2%苏木精复染胞核,常规脱水封片。在光学显微镜下,细胞膜或细胞质为棕色表示阳性。
5)肝脏标本的免疫荧光染色:冰冻切片复温,PBS浸泡,兔抗人VEGF、CD31和Flk-1多克隆抗体(1:100,Santa Cruz biotechnology)作一抗,FITC连接羊抗兔二抗孵育,激光共聚焦荧光显微镜观察,绿色为抗体染色阳性,红色为DIL标记的脐带组织干细胞。黄色为脐带组织干细胞阳性细胞。
6)、小鼠肝脏血管新生的监测:小鼠肝脏血管密度被计数由计数连续10张肝组织切片上(每只小鼠)vWF和CD31(兔抗人和小鼠多克隆抗体)免疫组化染色阳性血管数目。
7)、肝功能测定:8,000rpm离心20min分离血浆,用生理盐水稀释(血浆:生理盐水=1:4),用生化检测仪连续监测法检测谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST),用矾酸氧化法检测总胆红素(TBil)。
8)、统计学分析:所有计量型资料以均值±标准误表示,进行ANOVA分析,计数型资料用Fisher’s精确概率检验分析。
试验结果表现为:
1)、按照上述实施方式所述的制备方法制备细胞呈成纤微样贴壁生长,流式细胞仪检测发现该细胞群表达(阳性率≧50%)OCT3/4,SSEA-4,CD13,CD73、CD105;但不表达或低表达(阳性率≦2%)造血和内皮细胞的标志:CD34,CD45,CD117,CD133,CD31,vWE,FLK-1,HLA-DR;RT-PCR证明表达(阳性率≧50%)胚胎干细胞特征性标志OCT-4、SSEA-4和REX-1。体内移植后可快速到达损伤的肝脏组织。
2)、在体外诱导培养过程中,这些细胞在肝细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子作用下1周后失去成纤微样细胞的两极,细胞逐渐回缩呈扁平样形态,2周后细胞继续回缩呈立方形,到4周后逐渐呈多角形成熟肝细胞样细胞。贴壁细胞消化后流式检测,发现这些细胞不同程度上表达肝卵原细胞特异性抗原:CD-117(18.5±3.4%),Thy-1的表达亦明显增强,但不表达内皮细胞的特异标志vWF,CD31。免疫荧光研究也表明面分化2周后的细胞高表达(阳性率≧50%)ALB蛋白。RT-PCR分析表明诱导分化后细胞表达(阳性率≧50%)AFP、AK-19和ALB。这表明诱导出的多角形贴壁细胞是分化中的肝细胞样细胞。
3)、细胞移植后的小鼠肝脏组织免疫学分析显示:移植上述脐带组织细胞的小鼠肝组织表达(阳性率≧50%)人的肝细胞特异性抗原AFP。同时也表达(阳性率≧50%)人的内皮细胞特异性标志CD31。肝脏冰冻组织切片在荧光显微镜下观察,发现血管周围有散布的能激发出红色(代表CM-Dil)和绿色(代表FITC-CD31、FITC-VEGF或FITC-FLT-1)双荧光的细胞。RT-PCR表明了人肝细胞特异性蛋白Alb和AFP转录,同时也表明了人内皮细胞特异性标志蛋白CD31、FLT-1、VEGF的转录。这些结果说明移植的脐带细胞能整合到损伤肝组织中去。
4)、观察小鼠肝脏血管新生程度发现,细胞移植组第四周血管密度较对照组明显增加。细胞移植组vWF阳性血管密度均较对照组明显增加。同时发现小鼠肝组织CD31阳性血管密度和vWF阳性血管密度二者变化不一致,移植后第一周CD31阳性血管密度高于vWF阳性血管密度。而晚期第四周则相反。
5)、参见表1:为该细胞制剂移植到肝纤维化模型的NOD/SCID小鼠后肝功能测定结果。肝功能恢复情况:
细胞移植组血浆谷丙转氨酶(ALT)(对照组:205.00±60.00U/l,细胞移植组:138.50±34.16U/l,P<0.05),血浆谷草转氨酶(AST)(对照组:AST271.50±51.64U/l、细胞移植组:193.00±37.8U/l,P<0.01),血浆总胆红素(TBil)(对照组:14.00±2.67umol/l,细胞移植组:9.1±2.83umol/l,P<0.01)较对照组明显降低。表明细胞移植后动物的肝功能有明显的改善。
上述动物试验证明:体内移植该细胞可以快速到达损伤的肝组织,应用RT-PCR技术表明损伤的肝组织有人特异性肝细胞标志AFP、Alb和肝细胞生长因子mRNA和人特异性内皮细胞标志CD31、Flt-1、IGF、和VEGF mRNA的表达(阳性率≧50%)。免疫组织化学和免疫荧光方法分析表明移植的细胞在损伤的肝组织不仅分化为肝细胞样细胞而且可以分化为内皮细胞样细胞,修复肝脏微血管,参与肝细胞增生,改善肝功能,表明该细胞制剂的移植是有效的。
Claims (8)
1、一种用于肝脏损伤和肝硬化的细胞制剂,其特征在于,所述的细胞制剂包含肝细胞样细胞和PBS溶液。
2、根据权利要求1所述的一种用于肝脏损伤和肝硬化的细胞制剂,其特征在于,所述肝细胞样细胞是由胎盘、脐带来源的组织干细胞制剂经体外诱导培养而成。
3、根据权利要求2所述的一种用于肝脏损伤和肝硬化的细胞制剂,其特征在于,所述胎盘、脐带来源的组织干细胞制剂是由从胎盘、脐带分离得到的组织干细胞制成的细胞制剂。
4、根据权利要求3所述的一种用于肝脏损伤和肝硬化的细胞制剂,其特征在于,所述细胞呈成纤维细胞样贴壁生长,该细胞群表达OCT3/4,SSEA-4,CD13,CD73、CD105,不表达或低表达CD34,CD45,CD117,CD133,CD31,vWF,FLK-1以及HLA-DR。
5、根据权利要求1、2、3或4所述的一种用于肝脏损伤和肝硬化的细胞制剂,其特征在于,所述细胞制剂的肝细胞样细胞浓度为每毫升0.5-2×107个细胞。
6、权利要求1、2、3或4所述的一种用于肝脏损伤和肝硬化的细胞制剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)从胎盘和脐带中将组织干细胞分离纯化、培养,制成细胞悬液,得到胎盘、脐带来源的组织干细胞;
(2)将步骤(1)中的组织干细胞在体外诱导,分化成肝细胞样细胞;
(3)将步骤(2)中的肝细胞样细胞用无菌PBS缓冲溶液稀释,制成细胞制剂。
7、根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(1)具体包括以下步骤:
第一,将脐带和胎盘机械剪切成1mm3小组织块,采用浓度为1mg/mL胶原酶I在37℃消化1小时,再用浓度为0.25%胰酶37℃消化30分钟,期间温和震荡;
第二,加胎牛血清(FBS)中和胰酶后将组织悬液通过细胞筛,离心收集细胞悬液;
第三,将所得细胞悬液接种于包被4μg/cm2纤连蛋白的T75cm2培养瓶中,在添加了10ng/mL表皮生长因子的D/F12+10%胎牛血清(FBS)体系中培养5到7天;
第四,将得到的呈成纤维样细胞的组织干细胞再消化传代纯化、扩增,浓缩成单个核细胞混悬液,得到胎盘、脐带来源的组织干细胞。
8、根据权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述步骤(2)具体包括以下步骤:
第一,取5-10代分离的组织干细胞,采用D/F12培养体系,血清饥饿24小时;
第二,第一阶段培养采用IMDM补充20ng/mL肝细胞生长因子和10ng/mL碱性成纤维细胞生长因子,nicotinamide 20ng/L培养体系持续14天;
第三,第二阶段处理IMDM加入20ng/mL oncostatin M,1μmol/Ldexamethasone,and 50mg/mL ITS+premix培养体系持续14天,每周换液两次。
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CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20120711 Termination date: 20121227 |