CN116769725A - 一种过表达RANK的MSCs细胞外囊泡载体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种过表达RANK的MSCs细胞外囊泡载体及其制备方法和应用，该载体包括过表达RANK蛋白的细胞外囊泡，以及细胞外囊泡中的miRNA，可用于制备抗骨质疏松的治疗药物。本发明通过与破骨前体细胞表面的RANK竞争性结合RANKL，减少游离RANKL进而抑制破骨细胞分化；同时细胞外囊泡可将内含的具有促进成骨功能的miRNA递送至受体细胞，促进MSC的成骨分化，恢复骨形成与骨吸收的内稳态，改善骨质疏松。此外，本发明具有靶向骨组织的天然特性，免疫原性低，具有良好的生物安全性，后期可通过体外细胞培养扩大生产，制备方便，具有广阔的应用前景。

Description

一种过表达RANK的MSCs细胞外囊泡载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于骨质疏松治疗药物技术领域，具体涉及一种过表达RANK的MSCs细胞外囊泡载体及其制备方法和应用。

背景技术

骨质疏松症是由多种原因导致的慢性系统性骨病，其特征是骨量下降和骨微结构破坏，表现为骨脆性增加，骨折风险升高。尽管目前针对骨质疏松发病机制的药物研发已取得重要进展，但这些药物仍存在较多不足和副作用；研发升级治疗药物与优化治疗方案是临床亟待解决的难题。

目前临床治疗骨质疏松的药物效果显著，但依然存在诸多副作用。如双膦酸盐类药物在临床应用最广泛，然而，双磷酸盐仅仅抑制骨吸收，对促进成骨几乎没有作用，同时双磷酸盐常引起肌肉疼痛、胃肠道不良反应和吞咽困难，其中最严重的副作用是药物相关的下颌骨坏死。特立帕肽具有良好的促进成骨效果，但不能抑制骨吸收，同时有增加骨肉瘤发生风险。地舒单抗作为RANKL单抗类药物能够靶向RANKL并拮抗其活性，抑制破骨细胞成熟，降低用药期间骨质疏松患者的骨折发生率；但停药后，骨质流失的“反弹”，导致骨折风险显著增高。最新研制的罗莫珠单抗兼具抑制破骨，促进成骨的作用，被认为是治疗骨质疏松的理想药物，但由于潜在的增加心血管相关事件的风险，限制了其更广泛使用。因此，迫切需要开发一种疗效更好、副作用更少的治疗药物。

发明内容

解决的技术问题：针对上述技术问题，本发明提供了一种过表达RANK的MSCs细胞外囊泡载体及其制备方法和应用，该载体可用于骨质疏松治疗的给药系统，相比于目前主流抗骨质疏松治疗方法，具有显著的促进骨形成和抑制骨吸收的功能，同时载体制备工艺简单成熟，生物安全性好。

技术方案：一种过表达RANK的间充质干细胞来源的细胞外囊泡载体，包括过表达RANK蛋白的细胞外囊泡，以及细胞外囊泡中的miRNA分子。

优选的，所述细胞外囊泡通过慢病毒转染、质粒转染或基因编辑的方式过表达RANK蛋白。

优选的，所述RANK蛋白为RANKL配体的受体蛋白。

优选的，所述间充质干细胞为人源、鼠源、猪源或兔源骨髓间充质干细胞。

所述过表达RANK的间充质干细胞来源的细胞外囊泡载体的制备方法步骤如下：

（1）从骨髓中分离纯化得到骨髓源间充质干细胞；

（2）利用载有RANK质粒的慢病毒转染步骤（1）所得的间充质干细胞，筛选获得稳定高表达RANK的间充质干细胞；

（3）将步骤（2）所得的间充质干细胞置于无血清的低糖DMEM中培养48h，收集培养液上清，通过超速离心获得过表达RANK的间充质干细胞来源的细胞外囊泡。

优选的，所述步骤（2）中利用8 µg/mL 嘌呤霉素进行筛选。

优选的，所述步骤（3）中超速离心操作具体如下：依次进行300 g离心15 min，2000 g离心15 min，10000 g离心30 min和120000 g离心70 min。

所述过表达RANK的间充质干细胞来源的细胞外囊泡载体在制备骨吸收抑制剂中的应用。

所述过表达RANK的间充质干细胞来源的细胞外囊泡载体在制备骨形成促进剂中的应用。

所述过表达RANK的间充质干细胞来源的细胞外囊泡载体在制备抗骨质疏松治疗药物中的应用。

有益效果：间充质干细胞（MSCs）在多种疾病的治疗中发挥有益作用，基于间充质干细胞的细胞疗法主要通过旁分泌效应发挥作用。而细胞外囊泡（EVs）通过携带旁分泌因子，在组织修复及再生过程中主导旁分泌效应的调节。细胞外囊泡是由细胞分泌的天然膜包裹的纳米颗粒，是细胞间通信的重要介质，细胞外囊泡以蛋白质、脂质、核酸、甚至细胞器的形式向周围或远处的细胞传递信息。细胞外囊泡在各种疾病中的诊断和治疗应用越来越受到关注，这些天然纳米颗粒受益于良好的安全性和独特的生物分布能力，比人工合成的其他治疗载体在药物传递上更具有优势。因此，细胞外囊泡在经过工程化的装载和靶向修饰后，可以作为精准治疗的运载系统。

骨质疏松症是由于成骨和破骨功能失衡引起骨代谢稳态失调的疾病，单纯的促进骨形成或者抑制骨吸收，难以取得令人满意的临床治疗效果。在本发明中先通过获得纯度较高的间充质干细胞，并将间充质干细胞基因工程化，使其高表达RANK，提取其细胞培养上清中的细胞外囊泡。间充质干细胞具有骨髓归巢效应，经验证，静脉注射过表达RANK的间充质干细胞来源的细胞外囊泡后，其展现出较强的骨靶向能力。因此本发明将其应用于重塑骨质疏松内环境稳态，并作为一种“活的药物”清除多余RANKL，递送具有成骨能力的miRNA，进而维持骨吸收与骨形成的内环境稳态，实现逆转骨质疏松的作用。

具体的：

（1）本发明提供的高表达RANK的间充质干细胞来源的细胞外囊泡，通过RANK/RANKL途径，竞争性结合RANKL，抑制破骨细胞的分化，免疫原性低，生物安全性好。

（2）本发明提供的高表达RANK的间充质干细胞来源的细胞外囊泡，可靶向递送至骨髓腔，减少对其他组织器官的副作用。

（3）本发明提供的高表达RANK的间充质干细胞来源的细胞外囊泡，通过递送miRNA至受体细胞，调节间充质干细胞的细胞功能，促进间充质干细胞向成骨分化。

附图说明

图1为本发明的过表达RANK的间充质干细胞的细胞形态及RANK表达量；

图2为本发明过表达RANK的间充质干细胞在慢病毒转染后，细胞上表达RANK的免疫荧光分析图；

图3为本发明过表达RANK的间充质干细胞的细胞外囊泡的粒径大小及粒径分布情况；

图4为本发明中免疫印迹分析慢病毒转染后，间充质干细胞细胞外囊泡中CD9、CD63的表达及RANK蛋白的表达；

图5为本发明过表达RANK的间充质干细胞的细胞外囊泡体外清除RANKL的能力；

图6为本发明过表达RANK的间充质干细胞的细胞外囊泡体外抑制破骨细胞分化及破骨分化相关基因的表达；

图7为本发明过表达RANK的间充质干细胞的细胞外囊泡体外被间充质干细胞摄取；

图8为本发明过表达RANK的间充质干细胞的细胞外囊泡体外促进间充质干细胞成骨诱导分化；

图9为本发明过表达RANK的间充质干细胞的细胞外囊泡体内miRNA的表达量排序；

图10为本发明过表达RANK的间充质干细胞的细胞外囊泡促进成骨相关基因和蛋白的表达上调；

图11为本发明过表达RANK的间充质干细胞的细胞外囊泡在全身主要组织器官及骨组织中的分布；

图12为本发明中骨质疏松模型小鼠静脉注射过表达RANK的间充质干细胞的细胞外囊泡后，小鼠左侧股骨松质骨的micro-CT的三维重建图；

图13本发明中骨质疏松模型小鼠静脉注射过表达RANK的间充质干细胞的细胞外囊泡后，小鼠左侧股骨松质骨的micro-CT的定量统计值；

图14 本发明中骨质疏松模型小鼠静脉注射过表达RANK的间充质干细胞的细胞外囊泡后，小鼠股骨切片的苏木精-伊红（HE）染色

图15本发明中骨质疏松模型小鼠静脉注射过表达RANK的间充质干细胞的细胞外囊泡后，小鼠股骨切片的抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色；

图16本发明中骨质疏松模型小鼠静脉注射过表达RANK的间充质干细胞的细胞外囊泡后，小鼠股骨切片的骨钙蛋白（OCN）染色；

图17本发明中骨质疏松模型小鼠静脉注射过表达RANK的间充质干细胞的细胞外囊泡后，小鼠股骨切片的钙黄绿素染色；

图18本发明中骨质疏松模型小鼠静脉注射过表达RANK的间充质干细胞的细胞外囊泡后，小鼠股骨切片的组织蛋白酶K（CTSK）的免疫荧光染色；

图19本发明中骨质疏松模型小鼠静脉注射过表达RANK的间充质干细胞的细胞外囊泡后，小鼠股骨切片的成骨细胞特异性转录因子（Osterix）的免疫荧光染色；

图20本发明中骨质疏松模型小鼠静脉注射过表达RANK的间充质干细胞的细胞外囊泡后，小鼠血清中骨转换标记物Ⅰ型胶原蛋白的C端肽（CTX-Ⅰ）、Ⅰ型胶原蛋白的N端前肽（PⅠNP）的水平；

图21本发明中骨质疏松模型小鼠静脉注射过表达RANK的间充质干细胞的细胞外囊泡后，小鼠心、肝、脾、肺、肾的HE染色。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。

本发明中：6-8周龄的C57BL/6雌性小鼠购于常州卡文斯实验动物有限公司。所有小鼠实验按照苏州大学实验动物中心批准的动物实验方案进行。

骨髓来源的间充质干细胞按照既定方法从6-8周龄C57BL/6小鼠骨髓腔提取。贴壁法纯化后，第3-10代用于本发明的各实施例。GFP-RANK慢病毒购自吉凯基因。

实施例1 过表达RANK的间充质干细胞的构建

（1）从C57BL/6小鼠骨髓中分离出间充质干细胞。C57BL/6小鼠安乐死后，收集双侧股骨，21号注射器针头冲洗股骨髓腔。将收集的骨髓细胞在4℃、300 g离心5分钟后，按照密度为4 × 10⁶/孔接种于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM培养基中，置于5% CO²，37℃培养箱中。24 小时后，去除非贴壁细胞，更换新鲜培养基。此后，每3天更换一次培养基直至细胞达到80-90%融合度。

（2）纯化后的间充质干细胞与慢病毒载体在 37°C 下共孵育24小时，其中，慢病毒载体上连接有编码RANK的基因Tnfrsf11a。同时，为方便识别，该慢病毒载体上连接有GFP绿色荧光识别标记。然后，用8 µg/mL 嘌呤霉素筛选以获得稳定表达RANK的间充质干细胞。

（3）通过体外培养扩增细胞，收集细胞培养上清液，依次在4°C条件下，300 g离心15 min， 2000 g离心15 min，10000 g离心30 min，120000 g离心70 min， 获得过表达RANK的间充质干细胞的囊泡。结果如图1、图2 所示。

（4）对步骤（3）获得的细胞外囊泡进行透射电镜分析其粒径大小及分布（图3），免疫印迹分析外泌体上RANK的表达（图4）。

实施例2 过表达RANK 的间充质干细胞来源的细胞外囊泡的体外抑制破骨细胞形成及下调破骨分化相关基因及蛋白表达

（1）过表达RANK 的间充质干细胞的细胞外囊泡清除RANKL

通过cy5.5标记RANKL蛋白，然后配置含有50ng/mL RANKL的DMEM培养基培养破骨前体细胞，体外模拟诱导破骨细胞分化。接着，将过表达RANK 的间充质干细胞的细胞外囊泡加入培养基中，用于检测其清除RANKL的能力。24小时后，弃去上清液，PBS清洗2遍，洗去游离未结合的RANKL。留下的细胞用hoechst33342染色，结果如图5所示，过表达RANK 的间充质干细胞的细胞外囊泡更有效的清除培养基中的RANKL，其清除能力与抗RANKL抗体相当。

（2）过表达RANK 的间充质干细胞的细胞外囊泡对破骨细胞分化抑制的效果

收集小鼠股骨骨髓细胞，接种于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的α-MEM培养基中过夜，收集悬浮细胞，接种于96孔板，用30 ng/mL MCSF培养3天，得到骨髓来源的单核巨噬细胞。接种用50 ng/mL RANKL和30 ng/mL MCSF诱导向破骨细胞分化。使用过表达RANK 的间充质干细胞的细胞外囊泡处理细胞，7天后，进行TRAP染色。如图6所示，过表达RANK 的间充质干细胞的细胞外囊泡处理显著抑制破骨细胞的分化，其效果与加入抗RANKL抗体处理类似。

实施例3 过表达RANK 的间充质干细胞的细胞外囊泡被间充质干细胞摄取并促进成骨分化

将间充质干细胞以1× 10⁶/孔铺12孔板，置于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的DMEM培养基中培养24小时。后更换为成骨诱导培养基。每3天更换一次培养基，至14天后进行碱性磷酸酶染色，培养至21天时进行茜素红染色。如图8所示，过表达RANK 的间充质干细胞的细胞外囊泡处理后，碱性磷酸酶染色和茜素红染色明显强于对照组，证明其促进间充质干细胞成骨分化，成骨分化相关基因和蛋白也发生明显上调（图10）。

实施例4 过表达RANK 的间充质干细胞的细胞外囊泡的骨靶向能力

过表达RANK 的间充质干细胞的细胞外囊泡在含有 PBS 的亲脂性羰花青染料（DiD） 中孵育 30 分钟，以获得 DiD 标记的细胞外囊泡，游离的DiD作为对照组。6小时后，小鼠安乐死，通过体内成像系统进行荧光成像，如图11所示，过表达RANK 的间充质干细胞的细胞外囊泡的骨髓归巢能力明显强于游离DiD。收集其股骨进行冰冻切片，组织用DAPI染色后置于荧光显微镜下观察。过表达RANK 的间充质干细胞的细胞外囊泡定植在骨小梁上。

实施例5 过表达RANK 的间充质干细胞的细胞外囊泡通过抑制破骨形成和促进成骨分化逆转骨质疏松小鼠骨量丢失

（1）6-8周龄雌性C57BL/6小鼠称重，随机分为4组，分别为对照组、卵巢摘除模型组（OVX）、细胞外囊泡组和RANK过表达囊泡组，除对照组仅仅去除卵巢周围部分脂肪组织外，其余各组小鼠自背部作手术切口，切除双侧卵巢并缝合，6周后建立去卵巢骨质疏松模型；

（2）造模6周后，给与小鼠静脉注射治疗，其中，对照组和OVX组给与等量PBS（体积约100 μl），治疗组分别给与100 μg间充质干细胞细胞外囊泡和过表达RANK的细胞外囊泡尾静脉注射治疗8周。治疗8周后对小鼠安乐死，收集各组小鼠血清、双侧股骨及主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）。

（3）取右侧股骨置于4%多聚甲醛中固定24小时后，进行micro-CT扫描分析。结果显示，与OVX组相比，RANK过表达囊泡治疗有效缓解小鼠松质骨骨量丢失（图12），定量数据进一步表面表明，松质骨的骨密度、骨小梁数目、骨小梁厚度均显著增加，同时骨小梁分离度降低（图13）。这些数据表明，过表达RANK分子的细胞外囊泡可以有效逆转骨质疏松进展。

（4）将获取的小鼠股骨置于EDTA中脱钙后，进行骨组织HE染色，结果如图14所示，RANK过表达囊泡治疗组中骨小梁形态较OVX组完整，同时脂肪细胞较OVX组显著减少。对脱钙的骨组织进行TRAP染色，如图15所示，RANK过表达囊泡治疗组破骨细胞数量较OVX组明显减少，表明该囊泡显著抑制破骨细胞的形成。

（5）将脱钙的骨组织切片后进行OCN免疫组织化学染色，结果如图16所示，RANK过表达囊泡治疗组中骨小梁周围的成骨细胞数目较OVX组明显增加，表明该囊泡具有促进成骨的能力。

（6）在对各组小鼠安乐死前的第10天和第3天，腹腔注射钙黄绿素，安乐死后获取小鼠右侧股骨，进行无脱钙的硬组织切片，通过荧光显微镜观察两次钙黄绿素条带之间的厚度，发现RANK过表达囊泡治疗组的矿化沉积率较OVX组显著增加，表面该囊泡具有促进成骨能力（图17）。

（7）获取小鼠股骨组织后，使用包埋剂包埋，迅速置于-80℃保存，将其制成10mm冰冻切片，使用CTSK和Osterix的抗体进行组织免疫荧光染色，结果进一步证实，该囊泡具有抑制破骨形成，促进成骨分化的能力（图18和图19）。

（8）治疗8周后，获取小鼠静脉血，2000rpm离心30分钟后收集血清，使用Elisa试剂盒测定血清中骨转换标记物CTX-Ⅰ和PⅠNP。结果如图20显示，RANK过表达囊泡治疗组的CTX-Ⅰ水平较OVX组降低，而PⅠNP水平较OVX组升高，表明RANK过表达囊泡能够抑制骨吸收，促进骨形成。

（9）收集各治疗组小鼠主要脏器进行HE染色分析，未见有明显组织及细胞坏死改变。表明过表达RANK的间充质干细胞的细胞外囊泡具有良好的生物安全性（图21）。

综上，本发明的基于过表达RANK的间充质干细胞来源的细胞外囊泡载体通过与破骨前体细胞竞争性结合RANKL，实现与RANKL的无效结合，抑制破骨细胞的分化和成熟，从而抑制骨吸收。此外，该囊泡可靶向递送至骨髓，并被骨髓腔内的间充质干细胞摄取，将囊泡内具有成骨功能的miRNA递送至间充质干细胞胞内，调节间充质干细胞功能，促进其成骨分化。此外，由于细胞外囊泡不具备增殖能力，不会产生致瘤风险，且具有易于制备、可塑性、可行性和生物安全性特点，这项新技术可能具有广阔的临床转化潜力。

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (10)

1.一种过表达RANK的间充质干细胞来源的细胞外囊泡载体，其特征在于，包括过表达RANK蛋白的细胞外囊泡，以及细胞外囊泡中促进成骨分化的miRNA。

2.根据权利要求1所述的一种过表达RANK的间充质干细胞来源的细胞外囊泡载体，其特征在于，所述细胞外囊泡通过慢病毒转染、质粒转染或基因编辑的方式过表达RANK蛋白。

3.根据权利要求1所述的一种过表达RANK的间充质干细胞来源的细胞外囊泡载体，其特征在于，所述RANK蛋白为RANKL配体的受体蛋白。

4.根据权利要求1所述的一种过表达RANK的间充质干细胞来源的细胞外囊泡载体，其特征在于，所述间充质干细胞为人源、鼠源、猪源或兔源骨髓间充质干细胞。

5.权利要求1所述的过表达RANK的间充质干细胞来源的细胞外囊泡载体的制备方法，其特征在于，步骤如下：

（1）从骨髓中分离纯化得到骨髓源间充质干细胞；

（2）利用载有RANK质粒的慢病毒转染步骤（1）所得的间充质干细胞，筛选获得稳定高表达RANK的间充质干细胞；

（3）将步骤（2）所得的间充质干细胞置于无血清的低糖DMEM中培养48h，收集培养液上清，通过超速离心获得过表达RANK的间充质干细胞来源的细胞外囊泡。

6.根据权利要求5所述的过表达RANK的间充质干细胞来源的细胞外囊泡载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中利用8 µg/mL 嘌呤霉素进行筛选。

7.根据权利要求5所述的过表达RANK的间充质干细胞来源的细胞外囊泡载体的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中超速离心操作具体如下：依次进行300 g离心15 min， 2000g离心15 min，10000 g离心30 min和120000 g离心70 min。

8.权利要求1所述的过表达RANK的间充质干细胞来源的细胞外囊泡载体在制备骨吸收抑制剂中的应用。

9.权利要求1所述的过表达RANK的间充质干细胞来源的细胞外囊泡载体在制备骨形成促进剂中的应用。

10.权利要求1所述的过表达RANK的间充质干细胞来源的细胞外囊泡载体在制备抗骨质疏松治疗药物中的应用。