CN102228475A

CN102228475A - 预防和/或治疗肝硬化的干细胞复合药物及其制备方法

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Publication number: CN102228475A
Application number: CN2011101536582A
Authority: CN
Inventors: 曹卫; 焦阳; 焦守恕; 李戍
Original assignee: WUXI RENHUAN BIOLOGICAL MEDICAL TECHNOLOGY CO LTD
Current assignee: Zhenjing Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd.; Zhenjing Biotechnology (Wuxi) Co., Ltd.
Priority date: 2011-06-09
Filing date: 2011-06-09
Publication date: 2011-11-02

Abstract

本发明公开了一种预防和/或治疗肝硬化的干细胞复合药物及其制备方法。该预防和/或治疗肝纤维化和/或肝硬化的干细胞复合物，它的活性成分为离体的人脐带间充质干细胞和低抗凝肝素组成的组合物；所述低抗凝肝素的抗凝效价为(27-33)×10³U/g；所述离体的人脐带间充质干细胞和所述低抗凝肝素的配比为10⁶-10⁸个人脐带间充质干细胞和(70-80)U低抗凝肝素。本发明的由人脐带间充质干细胞和低抗凝肝素组成的干细胞复合物可以显著缓解慢性肝病患者的临床症状，显著降低患者血清中谷丙转氨酶、透明质酸、IV型胶原和层粘连蛋白的含量。

Description

预防和/或治疗肝硬化的干细胞复合药物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种干细胞复合药物、其制备方法及其在治疗肝硬化上的应用，特别是采用从人脐带组织提取的间充质干细胞，复合低抗凝肝素制备的干细胞的复合药物，其制备方法及其在转化成新生肝细胞发挥正常肝细胞功能和干预肝纤维化形成方面的应用。

背景技术

肝硬化是由于各种病因长期损害肝脏，引起肝脏慢性、进行性、弥漫性纤维性病变，是常见的慢性肝病之一。近年来，由于人们生活饮食习惯以及环境因素的改变，肝硬化的发病呈上升趋势。从肝脏组织学上来看，仅有大量的纤维化组织增生和沉积，而肝小叶结构尚未被破坏称为肝纤维化。如果病情进一步发展，在纤维化的基础上，出现再生结节，正常的肝小叶结构遭到破坏而形成假小叶，即称肝硬化。作为末期慢性肝病，肝硬化导致持久性和复发性扩散肝损伤，在肝细胞中引起纤维症和形成结节。

肝纤维化、肝硬化是各种慢性肝病演变至肝坏死、肝衰竭的必经阶段，其病理学特征一是肝细胞变性造成功能性肝细胞大量减少，出现严重的肝功能障碍。二是，肝组织纤维化，质地变硬，出现结节，导致肝组织结构进一步的破坏，肝窦状隙变窄，使得进出肝脏的血液循环受阻而产生肝门脉高压、腹水、肝昏迷等一系列严重后果。肝纤维化是由于肝细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)过度增生和/或ECM降解减少造成沉积形成的，是造成肝硬化不可逆转的重要病因。目前肝移植被认为是一种有效的替代无功能肝细胞的临床治疗方法，但因供体缺乏、手术损伤、排斥反应及价格昂贵等缺点而应用受限。肝内干细胞移植具有来源广泛、创伤性小及可重复进行等优点，新生的肝细胞还能有效地代偿肝功能。然而具有大量增生的纤维和结节的硬化肝脏，造成肝脏缺乏血液供应，使得移植入肝脏的新生细胞缺乏合适的生存环境而逐渐凋亡。

人脐带沃顿胶质(Wharton′s Jelly)组织中含有大量的具有极强的分化和转化人脐带间充质干细胞(human umbilical mesenchymal stem cells，HUMSCs)。许多研究证明HUMSCs在体外培养中能分化成多种干细胞(Fu，Y. S.et al.，Conversion ofHumanUmbilical Cord Mesenchymal Stem Cells in Wharton′s Jelly to Dopaminergic Neurons inVitro-Potential Therapeutic Application for Parkinsonism.Stem Cells 2004；24：115-124；Wang，H.S.，Hung，S.C.，and Pong，S.T.，Mesenchymal Stem Cells in Wharton Jelly oftheHuman Umbilical Cord.Stem Cells 2004；22：1330-1337)。

肝素属于ECM中蛋白质聚糖成分，除了有抗凝活性外，对ECM产生细胞(肾小球系膜细胞，3T3成纤维母细胞)和潜在ECM产生细胞(血管平滑肌细胞)和肝星状细胞均有明显的抑制增生和调节ECM合成的生物学效应。然而肝素的强抗凝活性能导致血凝时间延长，对本来已有出血倾向的肝病更易发生大出血而不宜使用。但是低抗凝肝素与肝素具有相同的抑制肝星状细胞合成前胶原蛋白的功效，能有效地干预肝纤维化生成过程，并能降解已形成的肝纤维，给新生的肝细胞提供生存的空间(CastellotJJ Jr，et al.Heparin and glomerular epithelial cell-secreted heparin-like species inhibitmesangial cell proliferation.Am J Pathol，1985，120；427；Hoover RL，et al.Inhibition of ratarterial smooth muscle cell proliferation by heparin，II，in vitro studies.Circ Res，1980，47：578)。

发明内容

本发明的目的是提供一种预防和/或治疗肝纤维化和/或肝硬化的产品及其制备方法。

本发明所提供的预防和/或治疗肝纤维化和/或肝硬化的产品，它的活性成分为下述a)或b)：

a)由离体的人脐带间充质干细胞和低抗凝肝素组成的组合物；所述低抗凝肝素的抗凝效价为(27-33)×10³U/g；所述离体的人脐带间充质干细胞和所述低抗凝肝素的配比为10⁶-10⁸个人脐带间充质干细胞和(70-80)U低抗凝肝素；

b)由离体的人脐带间充质干细胞和低抗凝肝素可溶性盐组成的组合物；所述低抗凝肝素可溶性盐的抗凝效价为(27-33)×10³U/g；所述离体的人脐带间充质干细胞和所述低抗凝肝素可溶性盐的配比为10⁶-10⁸个人脐带间充质干细胞和(70-80)U低抗凝肝素可溶性盐。

所述低抗凝肝素可溶性盐具体可为低抗凝肝素钠。

上述低抗凝肝素的抗凝效价具体可为30.33×10³U/g，如来自Sigma-Aldrich Inc，N/2/3DS的低抗凝肝素。

所述a)中，所述离体的人脐带间充质干细胞和低抗凝肝素可独立包装，也可混合在一起；

所述b)中，所述离体的人脐带间充质干细胞和低抗凝肝素可溶性盐可独立包装，也可混合在一起。

上述产品的制备方法也属于本发明的保护范围。

上述产品的制备方法具体可包括下述1)或2)或3)或4)的步骤：

1)将所述离体的人脐带间充质干细胞和所述低抗凝肝素按照所述配比混合，得到所述产品；

2)将所述离体的人脐带间充质干细胞和所述低抗凝肝素可溶性盐按照所述配比混合，得到所述产品；

3)将所述离体的人脐带间充质干细胞和所述低抗凝肝素按照所述配比分别独立包装，得到所述产品；

4)将所述离体的人脐带间充质干细胞和所述低抗凝肝素可溶性盐按照所述配比分别独立包装，得到所述产品。

需要的时候，在上述预防和/或治疗肝纤维化和/或肝硬化产品中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂等。

本发明还提供了一种预防和/或治疗肝纤维化和/或肝硬化的注射液。

本发明所提供的预防和/或治疗肝纤维化和/或肝硬化的注射液，由上述产品和注射用生理盐水组成。

所述注射液中，所述产品的含量以所述人脐带间充质干细胞计为10⁶-10⁸个人脐带间充质干细胞每0.25ml注射用生理盐水，具体可为10⁷个人脐带间充质干细胞每0.25ml注射用生理盐水。

本发明还提供了一种预防和/或治疗肝纤维化和/或肝硬化的成套产品。

本发明所提供的预防和/或治疗肝纤维化和/或肝硬化的成套产品，活性成分为上述产品和治疗肝纤维化和/或肝硬化的中药，所述产品和治疗肝纤维化和/或肝硬化的中药分别独立包装；所述治疗肝纤维化和/或肝硬化的中药可为中成药，如乙肝宁。乙肝宁的剂型可为冲剂或颗粒，如乙肝宁颗粒(九芝堂股份有限公司生产，国药准字Z43020152)。

所述预防和/或治疗肝纤维化和/或肝硬化具体体现为下述1)至5)中的至少一种：

1)降低肝纤维化和/或肝硬化患者的血清中的谷丙转氨酶含量；

2)降低肝纤维化和/或肝硬化患者的血清中的透明质酸含量；

3)降低肝纤维化和/或肝硬化患者的血清中的IV型胶原含量；

4)降低肝纤维化和/或肝硬化患者的血清中的层粘连蛋白含量；

5)降低肝纤维化和/或肝硬化患者的血清中的PIIIP(血清III型前胶原肽)含量。

本发明的由人脐带间充质干细胞和低抗凝肝素组成的产品可以显著缓解慢性肝病患者的临床症状，显著降低患者血清中谷丙转氨酶、透明质酸、IV型胶原、血清III型前胶原肽和层粘连蛋白的含量。

附图说明

图1为实施例1中两组的血清透明质酸(HA)的变化情况。*p＜0.05，**p＜0.01，One Way ANOVA统计分析

图2为实施例1中两组血清IV型胶原(IV-C)的变化情况。**p＜0.01，One WayANOVA统计分析

图3为实施例1中两组示血清层粘连蛋白(LN)的变化情况。**p＜0.01，One WayANOVA统计分析

图4为实施例1中两组示血清III型前胶原肽(PIIIP)的变化情况。**p＜0.01，One Way ANOVA统计分析

图1-4中的2月、4月和6月分别表示第4次注射后的60天、120天和180天。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所用的人脐带间充质干细胞来自Sciencell，7530。

下述实施例中所用的抗凝效价为30.33×10³U/g的低抗凝肝素来自Sigma-AldrichInc，N/2/3DS。

本专利申请的发明人所在实验室先前的研究中证明HUMSCs可以分化为肝样细胞，并利用肝细胞生长因子、成纤维生长因子和抑瘤素等细胞因子将HUMSCs向肝细胞诱导分化，分化的细胞表达出肝细胞表面标志物ALB、AFP、CK18和CK19，糖原染色呈现阳性。将HUMSCs移植入大鼠肝脏内，HUMSCs能发育并呈现出肝细胞样形态，储藏肝糖原，产生尿素，成为具有功能的肝细胞，达到恢复和提高肝功能的目的。

本专利申请的发明人还发掘出低抗凝肝素(low anticoagulant activity heparin，LAAH)及其衍生物的新用途，尤其是阻止ECM的纤维化进程，并能降解ECM形成的纤维。动物实验证实，低抗凝肝素通过抑制肝星状细胞内转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta1，TGF-β1)、α-平滑肌肌动蛋白(smooth musclealpha-actin，α-SMA)及I、IV型前胶原蛋白的表达，大大降低透明质酸和层粘连蛋白水平，能明显减少肝组织内的胶原沉积和羟脯氨酸含量，从而减轻肝纤维化程度。

实施例1、人脐带间充质干细胞和抗凝效价为30.33×10³U/g的低抗凝肝素治疗肝纤维化和肝硬化

一、预防和/或治疗肝纤维化和/或肝硬化的注射液的制备

将10⁷个人脐带间充质干细胞和2.5mg抗凝效价为30.33×10³U/g的低抗凝肝素加入0.25ml注射用生理盐水(0.9％的氯化钠水溶液)，得到一个注射剂量的预防和/或治疗肝纤维化和/或肝硬化的注射液(干细胞药物复合剂)。

二、临床实验

将确诊的慢性乙型肝炎肝纤维化(S1、S2、S3期)及早期肝硬化(S4期)病人42例分为治疗组28例，对照组14例。

系统观察了每例患者治疗前后的临床症状、体征、肝功、血清纤维化指标检测。治疗组28例在服用常规药物乙肝宁颗粒(九芝堂股份有限公司生产，国药准字Z43020152)基础上，按计划接受一个疗程共四次的步骤1的预防和/或治疗肝纤维化和/或肝硬化的注射液肝内动脉注射治疗。一个疗程共21天，第一次注射给药后7天进行第2次注射，第2次注射给药后7天进行第3次注射，第3次注射给药后7天进行第4次注射给药。每次注射给药的方法均为右肝叶上注射6个点，左肝叶上注射4个点，各点一个注射量0.25ml(含人脐带间充质干细胞10⁷个细胞，低抗凝肝素为2.5mg)。合计每次每人的肝脏共接受了人脐带间充质干细胞10⁸个，低抗凝肝素25mg。对照组14例病人在服用常规药物乙肝宁基础上，接受与治疗组相同的注射量和次数，但注射液为注射用生理盐水。常规药物乙肝宁颗粒的服用方式为每天口服17g乙肝宁，一日三次。

一个疗程后2个月、4个月和6个月时以及治疗前分别对患者进行临床症状和体征检查、并检测血清学肝功能指标谷丙转氨酶(ALT)和血清肝纤维化指标，包括透明质酸(HA)、血清IV型胶原(IV-C)、血清PIIIP及血清层粘连蛋白(LN)等四项指标。

肝细胞外基质成份(ECM)的增加是慢性肝病向肝纤维化、肝硬化进展的中心问题。利用各种肝病时血清HA、LN、IV-C(均为ECM)水平的动态变化来判断慢性肝病纤维化形成及转变的观察指标，对临床诊断肝纤维化有着重要的意义。层粘连蛋白(LN)是细胞外间质中非胶原糖蛋白的主要成份，广泛分布于基底膜的透明层中，是细胞外骨架中的支持结构，并对细胞外ECM的其它成份有粘附作用。在正常肝脏肝窦内无基底膜存在，LN含量较少，当肝内发生慢性炎症时，肝细胞、内皮细胞以及上皮细胞均参与合成LN，并在肝窦内大量沉积。透明质酸(HA)是一种大分子氨基多糖，由间质细胞合成，在体内参与基质的构成，主要由肝窦内皮细胞摄取和分解。当肝细胞受损时，肝内皮细胞亦同时受损，数量、功能减退，导致HA分解减少，此外肝间质细胞合成HA增加，门一腔分流，使HA逃逸肝脏的降解，故血清HA水平升高。IV型胶原(IV-C)是一种胶原蛋白，是构成基底膜的主要成份，胶原蛋白在肝脏内约占蛋白总量的5％～10％。当肝脏发生纤维化时，基底膜遭受破坏，胶原蛋白可增加50％左右，在胶原增生过程中，IV型胶原大量沉积。

检测患者下述五个临床症状：

(1)易出血的症状，多是牙龈出血，鼻出血等，和肝脏的造血凝血能力下降有关系。

(2)神经反应：反酸、呃逆、上腹隐痛、肝区隐痛、嗳气等胃肠症状。

(3)上消化道反应：恶心呕吐、厌油腻、食欲不振。肝脏纤维化后肝脏代谢能力下降，同时也伴随一定的胃肠不适。

(4)消化能力减弱：腹胀、腹泻、纳差等，与胃肠的消化分泌物和吸收功能紊乱有关系。

(5)全身反应：四肢乏力，易疲劳。肝纤维化早日症状之一，对判断慢性肝纤维化的判断十分的灵敏。

根据上述五个症状组的临床症状对步骤1的预防和/或治疗肝纤维化和/或肝硬化的注射液的疗效予以评估，每个症状组设0-2分，0分为正常，没有该组所述的症状；1分为轻度，即出现该组所述轻微的症状；2为重度，即出现该组所述明显的症状，总分共10分。上述五个症状组评分下降50％以上说明症状显著缓解即视为好转。

接受注射半年后(一个疗程结束后6个月时)，治疗组症状好转率为81％，而对照组仅为27％。

接受注射半年后(一个疗程结束后6个月时)，检测肝功能。结果表明两组患者ALT复常率比较有显著性差异。治疗组的肝功能ALT复常率为90.3％，而对照组的肝功能ALT复常率为9％。

说明通过本发明的干细胞药物复合剂治疗可以显著缓解慢性肝病患者的临床症状，降低血清谷丙转氨酶。

肝纤维化血清指标变化：

分别测定血清透明质酸、血清IV型胶原、血清PIIIP及血清层粘连蛋白等四项纤维化指标。对所得数据进行单因素方差分析(One Way ANOVA统计分析)。

如图1-图4所示，治疗组患者的血清透明质酸、血清IV型胶原、血清层粘连蛋白及血清PIIIP等四项纤维化指标均显著下降，而对照组则无明显改变，表明使用本发明的干细胞药物复合剂治疗有效抑制肝纤维化活动性及纤维化程度明显减轻。

图1-4中的数值为所有病例的平均值±标准差。

Claims

1.一种预防和/或治疗肝纤维化和/或肝硬化的产品，它的活性成分为下述a)或b)：

2.下述a)或b)的物质在制备预防和/或治疗肝纤维化和/或肝硬化产品中的应用：

3.根据权利要求1所述的产品、权利要求2所述的应用，其特征在于：所述低抗凝肝素可溶性盐为低抗凝肝素钠；所述离体的人脐带间充质干细胞和所述低抗凝肝素的配比为10⁷个人脐带间充质干细胞和76U低抗凝肝素；所述离体的人脐带间充质干细胞和所述低抗凝肝素可溶性盐的配比为10⁷个人脐带间充质干细胞和76U低抗凝肝素可溶性盐。

4.根据权利要求1或3所述的产品，根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述a)中，所述离体的人脐带间充质干细胞和所述低抗凝肝素独立包装或混合在一起；

所述b)中，所述离体的人脐带间充质干细胞和所述低抗凝肝素可溶性盐独立包装或混合在一起。

5.权利要求1或3所述的产品的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括下述1)-4)中的任一步骤：

6.一种预防和/或治疗肝纤维化和/或肝硬化的注射液，由权利要求1或3或4所述的产品和注射用生理盐水组成。

7.根据权利要求6所述的注射液，其特征在于：所述注射液中权利要求1或3或4所述的产品的含量以所述人脐带间充质干细胞计为10⁶-10⁸个人脐带间充质干细胞每0.25ml注射用生理盐水；所述注射液中权利要求1或3或4所述的产品的含量以所述人脐带间充质干细胞计，具体为10⁷个人脐带间充质干细胞每0.25ml注射用生理盐水。

8.一种预防和/或治疗肝纤维化和/或肝硬化的成套产品，活性成分为权利要求1或3或4所述的产品和治疗肝纤维化和/或肝硬化的中药，所述产品和治疗肝纤维化和/或肝硬化的中药分别独立包装。

9.根据权利要求8所述的注射液，其特征在于：所述治疗肝纤维化和/或肝硬化的中药为中成药，如乙肝宁。

10.根据权利要求1-9所述的产品、应用、制备方法、注射液或成套产品，其特征在于：所述预防和/或治疗肝纤维化和/或肝硬化体现为下述1)至5)中的至少一种：

2)降低肝纤维化和/或肝硬化患者的血清中的透明质酸含量；

3)降低肝纤维化和/或肝硬化患者的血清中的IV型胶原含量；

5)降低肝纤维化和/或肝硬化患者的血清中的血清III型前胶原肽含量。