JP2008115089A - 虚血性疾患予防、治療剤及び臓器保存剤 - Google Patents

Abstract

【課題】血管閉塞が原因となって生じる脳梗塞、心筋梗塞、その他重篤な虚血性疾患、臓器移植障害の予防、治療に対して有用な予防、治療剤を提供すること。
【解決手段】１，５−アンヒドロフルクトースまたはその誘導体を含有する虚血性疾患の予防もしくは治療剤または臓器保存剤。
【選択図】なし

Description

本発明は、虚血性疾患の予防又は治療剤、および臓器保存剤に関する。更に詳しくは、１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースおよび／または１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース誘導体を有効成分とする、虚血性疾患の予防、治療剤、及び臓器保存剤に関する。

１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース（以下、１，５−ＡＦという）は、ある種の子嚢菌や紅藻由来の酵素であるα−１，４−グルカンリアーゼを澱粉あるいは澱粉分解物に作用させることで生産することができる。１，５−ＡＦは、その分子間内に二重結合を有しており、他の単糖類と比較して反応性に富む糖である。
１，５−ＡＦは抗酸化活性および抗菌活性を有することから、食品に安全に添加される抗酸化剤（特許文献１参照）、枯草菌および乳酸菌に特に有効な抗菌剤（特許文献２参照）としての用途が開示されている。また、この単糖は抗生物質ミクロテシンの前駆体でもある（特許文献３参照）。
また、最近では、抗う蝕作用（特許文献４参照）、血糖降下作用（特許文献５参照）、抗炎症作用、血小板凝集抑制作用（特許文献６参照）についても報告されており、１，５−ＡＦは、さらに機能性を持った健康食品あるいは医薬品等の様々な分野でもその利用が期待される糖質である。
さらに、１，５−ＡＦ誘導体として１，５−ＡＦを構成糖として含有する糖鎖（Ｇ−（Ｇ）_ｎ−ＡＦ）を製造する技術についても提案されている（特許文献７参照）。

ところで、本邦に限らず世界では虚血性障害による疾患、例えば脳梗塞、心筋梗塞などは増加の一途をたどっており、心臓、脳、腎臓など生命維持に必要不可欠な器官での虚血性障害は、血流が運ぶ酸素の欠乏および／または細胞の呼吸減少が急速にもたらす不可逆的な細胞障害を介して、重篤な疾患、あるいは死亡の一因となりうる。虚血性組織障害は主に低酸素が誘発する細胞壊死による機能障害、さらには虚血後の炎症性反応（壊死細胞からのＡＴＰ、ＨＭＧＢ−１のような炎症伝達物質の放出，または低酸素―再酸素化に伴う酸化ストレスによる生細胞での炎症シグナル、サイトカイン産生）によるものである。後者の機序は、２次的な全身性の炎症性障害の原因になる可能性もある。

現在、心筋梗塞、脳梗塞など虚血性疾患の治療には外科的治療の他、治療剤として抗血小板薬、抗凝固薬などが一般に用いられているが、これらは主に虚血性疾患を引き起こす原因となる血栓を標的としたもので、病状の悪化を防ぐ程度のものであり、直接的な治療剤とは言いがたい。加えて、従来から用いられているアスピリンなどは抗血小板、抗凝固作用を有するため、出血している患者、肝臓障害の患者、白血球減少症の患者では利用できない。またパナルジン（第一製薬（株）、商品名）などは、副作用として無顆粒球症、黄疸などを生じさせる恐れがある。従って、副作用が少なく、虚血（低酸素）条件下で細胞壊死を減少させることは、最も効果的な虚血性疾患の治療法、予防法と考えられ、そのような薬剤の開発が切望されている。虚血状態下における細胞の生存率を向上させる薬剤としてキノロン系、キノン系、アミノグリコシド系又はクロラムフェニコールの抗菌剤を有効成分として含む薬剤が提案されている（特許文献８参照）が、これらは、アスピリンのような抗血小版作用を有する薬剤との併用において、けいれん等の中枢神経系の副作用の可能性も示唆されていることや、効果の面で十分であるとは考えにくいことなどより、さらに安全で、効果的な薬剤が望まれている。

臓器移植においても、臓器提供者より臓器を摘出し、移植するまでの間は虚血状態（低酸素状態）となり、移植後は再潅流（再酸素化）される。また、移植に要する時間が長い程、臓器障害の度合いも大きくなる。この障害は虚血−再潅流により活性酸素が生じ、それが細胞を構成している成分を攻撃することが原因であると考えられている。この現象に対して臓器保存薬として、酸化還元性を示す物質としてペプチド（特許文献９参照）や抗酸化組成物（特許文献１０参照）が提案されている。但し、これらについても、ペプチドにおいては、その抗原性が問題になるであろうし、１，５−ＡＦより複雑な化学構造を有している抗酸化組成物については生体内で毒性の問題点が生じる可能性がある。
特表平９−５０５９８８号公報 特開２００１−８９３７７号公報 仏国特許出願公開第２６１７５０２ 特開２００４−１２３６０４号公報 特表２００３−５１９６６０号公報 特開２００６−１６３０１号公報 特開２００１−２０４４９０号公報 ＷＯ０１／０５１６１４ 特開平５−１３９９９２号公報 特開平８−２６９０２号公報

本発明の目的は、血管閉塞が原因となって生じる脳梗塞、心筋梗塞、その他重篤な虚血性疾患、臓器移植障害の予防、治療に対して１，５−ＡＦおよび／またはその誘導体の使用を提供することにある。

本発明の他の目的は、１，５−ＡＦおよび／または１，５−ＡＦ誘導体を活性成分とし、副作用がなく血管新生を阻害しない虚血性疾患治の予防、治療剤を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、１，５−ＡＦおよび／または１，５−ＡＦ誘導体が血管の再構築を阻害することなく、低酸素が誘導する細胞死に対して細胞保護作用を発揮する方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、１，５−ＡＦおよび／または１，５−ＡＦ誘導体が有意に抗炎症作用（例えば細胞レベルでの低酸素―再酸素化など虚血再灌流によって生じる炎症性組織障害を減弱させるなど）を発揮する方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的は、１，５−ＡＦおよび／または１，５−ＡＦ誘導体が有する血小板凝集抑制作用を発揮する方法を提供することにある。

本発明のさらに他の目的および利点は、以下の説明から明らかになろう。

このように、虚血性疾患の臨床管理に対して、１，５−ＡＦおよび／または１，５−ＡＦ誘導体を用いた治療概念は新しい識見を与えることであろう。

本発明によれば、本発明の上記目的および利点は、第１に、１，５−ＡＦおよび／または１，５−ＡＦ誘導体を含有することを特徴とする虚血性疾患の予防若しくは治療剤または臓器保存剤によって達成される。

１，５−ＡＦおよび／または１，５−ＡＦ誘導体を用いることで、虚血性疾患を予防ないし治療することおよび臓器を保存することが可能である。

本発明において使用される１，５−ＡＦは、既に公知の方法、例えば、特許文献１に記載の方法によって調製可能である。
また、下記式（１）で表される１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース誘導体は、特許文献７に記載の方法によって調製可能である。
Ｇ−（Ｇ）_ｎ−ＡＦ ・・・（１）
上式中、ＡＦは１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース残基を表し、Ｇはグルコース残基を表し、ｎは０〜２０の整数である。
本発明の虚血性疾患治療剤を使用しうる虚血性疾患としては、例えば、虚血性脳血管障害例えば脳卒中、脳梗塞など；虚血性心疾患例えば虚血性心筋症、心筋梗塞、虚血性心不全など；虚血性腎疾患；虚血性肺疾患；四肢の虚血性疾患例えば壊疽など；感染症に関連する虚血性疾患；移植時の拒絶反応；および外傷などが挙げられる。
本発明の虚血性疾患治療剤は、それ自体公知の種々の方法でその剤型に応じて投与することが可能であり、投与量、投与部位、投与する間隔、期間等は、患者の年齢や体重、病状あるいは他の薬剤や治療法と併用した場合などを考慮して決定することができる。投与方法としては、例えば、経口投与あるいは、注射や点滴などの方法によって静脈内や皮下、腹腔内など直接体内に投与する方法や外用とすることができ、特別に制限されない。

本発明における虚血性疾患治療剤の投与量は、その剤型、投与方法、あるいは予防もしくは治療しようとする症状により異なるが、例えば、体重１ｋｇあたりの投与量として有効成分換算で０．１ｍｇ〜１００，０００ｍｇ、好ましくは１０ｍｇ〜１，０００ｍｇとすることができ、１日１回あるいは数回、あるいは数日毎に１回というような、適当な投与頻度によって投与することが可能である。
本発明の虚血性疾患予防治療剤の形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、点滴製剤、散剤、顆粒剤、注射剤等が挙げられるが、特に制限されない。また製剤を調製する上で必要な成分例えば、製剤担体や賦形剤、安定剤等を含有することもできる。

さらに、本発明の効果を奏する限り、他の虚血性疾患の予防ないし治療剤あるいはその他の薬理成分あるいはブドウ糖などの栄養成分を含むことも可能である。
また、本発明の虚血性疾患の予防、治療剤の利用は医薬品用途に限られるものではなく、医薬部外品、食品、飲料等に配合することも可能である。例えば、１，５−ＡＦおよび／または１，５−ＡＦ誘導体を食品に添加して、虚血性疾患の治療・予防を目的とした機能性食品のような形態をとることもできる。
本発明の虚血性疾患の予防、治療剤は、人間以外の哺乳動物にも投与することができる。すなわち、その場合、哺乳動物に対し、１，５−ＡＦおよび／または１，５−ＡＦ誘導体を有効量投与することによって、虚血性疾患の予防、治療を行うことができる。

本発明の臓器保存剤は１，５−ＡＦおよび／または１，５−ＡＦ誘導体が保存液に溶解した状態で使用することができる。この保存液としては生理食塩水、緩衝液、等張化液や従来から使用されてきた臓器保存液などが利用できる。
臓器保存の対照となる臓器としては例えば肺、肝臓、腎臓、心臓などが挙げられる。
以下、実施例により本発明をさらに詳述する。本発明はかかる実施例により何ら制限されるものではない。

虚血性疾患では血流が途絶え、その先の組織・細胞が低酸素状態に陥り、細胞死に至る。低酸素培養モデルは、臨床における急性期の虚血状態を想定したもので、例えば脳神経細胞を用いた場合、脳梗塞等のモデルとして汎用されている。ここでは、１，５−ＡＦの虚血性疾患に対する作用を、種々の細胞における低酸素培養条件下での細胞保護（細胞死抑制）の観点から評価した。尚、細胞は心筋梗塞のモデルとして心筋細胞、脳梗塞のモデルとして脳神経細胞、四肢の虚血性疾患モデルとして筋芽細胞及びケラチノサイトを用いた。

実施例１ （心筋細胞に対する１，５−ＡＦの細胞保護効果）
ラット心筋由来の細胞株であるＨ９ｃ２細胞を２４ウェルマイクロプレート（１×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に播種して２４時間培養後、１，５−ＡＦならびに１，５−ＡＦの生体内代謝産物である１，５−Ｄ−アンヒドログルシトール（以下１，５−ＡＧ）を所定の量加え、直ちにアネロパック・ケンキ／虚血システム（三菱ガス化学（株）製）を用いて７２時間低酸素培養（Ｏ_２濃度１％以下，ＣＯ_２濃度５％前後）を行った｛培地：ＦＢＳ１０％とペニシリン・ストレプトマイシン２％を含むＤ−ＭＥＭ（Ｌｏｗ ｇｌｕｃｏｓｅ）｝。低酸素培養後、接着細胞を８０％エタノールで固定した後、０．４％クリスタルバイオレットで染色した。染色後プレートを水でよく洗浄した後、ｄｙｅ（色素）をメタノールで抽出しマイクロプレートリーダーを用いて５７０ｎｍの波長で吸光度を測定した。なお、細胞生存率は低酸素培養開始前の吸光度を１００％として算出した。
結果を図１に示した。７２時間低酸素培養後の生細胞率は、１，５−ＡＦが０、１２５、２５０μｇ／ｍｌ群、ならびに１，５−ＡＧ群（１，０００μｇ／ｍｌ）では約５％であり、細胞はほとんど死滅していることがわかる。しかしながら、１，５−ＡＦが５００ないし１，０００μｇ／ｍｌの群での生細胞率はそれぞれ２８．８±２．６％と１１．２±１．１％であり、低酸素培養での心筋細胞の壊死を有意に抑制した。このことから、１，５−ＡＦは低酸素培養条件下での心筋細胞に対して、細胞保護効果を有することが認められた。

実施例２ （神経細胞に対する１，５−ＡＦの細胞保護効果の検討）
神経前駆細胞のモデルとして汎用されるＰＣ１２細胞（ラット副腎髄質褐色細胞腫）を２４ウェルマイクロプレートに１×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの割合で播種し、３７℃、ＣＯ_２５％の条件下で培養を行った｛培地：ＦＢＳ１０％とペニシリン・ストレプトマイシン２％を含むＤ−ＭＥＭ（Ｌｏｗ ｇｌｕｃｏｓｅ）｝。次いで、ｄｉｂｕｔｙｌｙｌ ｃｙｃｌｉｃ ｃＡＭＰ ２ｍＭ（ブクラデシンナトリウム：アクトシン注、第一製薬（株）製）を含む同上培地に置換し２４時間培養を行い神経細胞様へ分化させた。その後、上澄を除去し、１，５−ＡＦならびに１，５−ＡＧを所定の量含む培地を加え、直ちにアネロパック・ケンキ／虚血システム（三菱ガス化学（株）製）を用いて４８時間低酸素培養（Ｏ_２濃度１％以下，ＣＯ_２濃度５％前後）を行った。低酸素培養後、接着細胞を８０％エタノールで固定した後、０．４％クリスタルバイオレットで染色した。染色後プレートを水でよく洗浄した後、ｄｙｅ（色素）をメタノールで抽出しマイクロプレートリーダーを用いて５７０ｎｍの波長で吸光度を測定した。なお、細胞生存率は低酸素培養開始前の吸光度を１００％として算出した。
結果を図２に示した。４８時間低酸素培養後の生細胞率は１，５−ＡＦが０、１２５、ならびに１，５−ＡＧ群（１，０００μｇ／ｍｌ）では約１０％であった。しかしながら、１，５−ＡＦが２５０、５００、１，０００μｇ／ｍｌでは生細胞率はそれぞれ４５．９±３．１％、６９．４±４．９％、５４．９±１０．５％であり、低酸素培養での細胞死を有意に抑制した。このことから、１，５−ＡＦは低酸素培養条件下での神経細胞に対して、細胞保護効果を有することがわかった。

実施例３ （ケラチノサイトに対する１，５−ＡＦの細胞保護効果の検討）
ヒトケラチノサイト（ＨａＣａＴ）細胞を２４ウェルマイクロプレート（１×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に播種し２４時間培養後、１，５−ＡＦならびに１，５−ＡＧを所定の量加え、直ちにアネロパック・ケンキ／虚血システム（三菱ガス化学（株）製）を用いて４８時間低酸素培養（Ｏ_２濃度１％以下，ＣＯ_２濃度５％前後）を行った｛培地：ＦＢＳ１０％とペニシリン・ストレプトマイシン２％を含むＤ−ＭＥＭ（Ｌｏｗ ｇｌｕｃｏｓｅ）｝。低酸素培養後、接着細胞を８０％エタノールで固定した後、０．４％クリスタルバイオレットで染色した。染色後プレートを水でよく洗浄した後、ｄｙｅ（色素）をメタノールで抽出しマイクロプレートリーダーを用いて５７０ｎｍの波長で吸光度を測定した。なお、細胞生存率は低酸素培養開始前の吸光度を１００％として算出した。
結果を図３に示した。４８時間低酸素培養後の１，５−ＡＦが５００ならびに１，０００μｇ／ｍｌの生細胞率は、他の群と比較して有意に高く（５００μｇ／ｍｌ：５５．７±１０．９％、１，０００μｇ／ｍｌ：７３．４±１４．８％）、低酸素培養での細胞死を有意に抑制した。このことから、１，５−ＡＦは低酸素培養条件下でのケラチノサイトに対して、細胞保護効果を有することがわかった。

実施例４ （筋芽細胞に対する１，５−ＡＦの細胞保護効果の検討）
マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）を２４ウェルマイクロプレート（１×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に播種し２４時間培養後、１，５−ＡＦならびに１，５−ＡＧを所定の量加え、直ちにアネロパック・ケンキ／虚血システム（三菱ガス化学（株）製）を用いて２４時間低酸素培養（Ｏ_２濃度１％以下，ＣＯ_２濃度５％前後）を行った｛培地：ＦＢＳ１０％とペニシリン・ストレプトマイシン２％を含むＤ−ＭＥＭ（Ｌｏｗ ｇｌｕｃｏｓｅ）｝。低酸素培養後、接着細胞を８０％エタノールで固定した後、０．４％クリスタルバイオレットで染色した。染色後プレートを水でよく洗浄した後、ｄｙｅ（色素）をメタノールで抽出しマイクロプレートリーダーを用いて５７０ｎｍの波長で吸光度を測定した。なお、細胞生存率は低酸素培養開始前の吸光度を１００％として算出した。同時に培養上澄中のＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）をＥＬＩＳＡキット（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ社製）、乳酸値をラクテート・プロＬＴ−１７１０（アークレイ（株）製）を用いて測定した。

細胞生存率の結果を図４のＡに示した。２４時間低酸素培養後の生細胞は、１，５−ＡＦが０、１２５、ならびに１，５−ＡＧ群（１，０００μｇ／ｍｌ）ではほとんど認められなかった。しかしながら、１，５−ＡＦが２５０、５００、１，０００μｇ／ｍｌでは生細胞率は約６０〜７０％であり（２５０μｇ／ｍｌ：６２．３±４．８％、５００μｇ／ｍｌ：６８．８±２．９％、１，０００μｇ／ｍｌ：６６．２±８．５％）、低酸素培養での細胞死を有意に抑制した。このことから、１，５−ＡＦは低酸素培養条件下での筋芽細胞に対して、細胞保護効果を有することがわかった。

２４時間低酸素培養後の上澄中のＶＥＧＦ含量を図４のＢに示した。低酸素培養によって、培養上澄中のＶＥＧＦは有意に増加するが、１，５−ＡＦは低酸素培養によるＶＥＧＦの産生に影響を与えないことがわかった。この傾向は心筋細胞でも認められた。虚血部位での低酸素組織中のＶＥＧＦ産生の減少は例えば血液供給の補填としての血管新生や新血管新生など血管の再構築を先延ばしにすることから、１，５−ＡＦがＶＥＧＦの産生に影響を与えないことは非常に有用であると思われる。一方、培養上澄中の乳酸値は低酸素培養により有意に増加するが、これに対して１，５−ＡＦは濃度依存的に乳酸の産生を抑制することが認められた（図４のＣ）。

実施例５ （前処理による１，５−ＡＦの細胞保護効果の検討）
マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２）およびラット心筋由来細胞株（Ｈ９ｃ２）を２４ウェルマイクロプレート（１×１０^５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）に播種し２４時間培養後、１，５−ＡＦならびに１，５−ＡＧを所定の量加え、さらに２４時間培養した｛培地：ＦＢＳ１０％とペニシリン・ストレプトマイシン２％を含むＤ−ＭＥＭ（Ｌｏｗ ｇｌｕｃｏｓｅ）｝。その後、培養上澄を洗浄し１，５−ＡＦならびに１，５−ＡＧを除去して、同上培地を加えて、アネロパック・ケンキ／虚血システム（三菱ガス化学（株）製）を用いて低酸素培養（Ｏ_２濃度１％以下，ＣＯ_２濃度５％前後）を行った。低酸素培養後、接着細胞を８０％エタノールで固定した後、０．４％クリスタルバイオレットで染色した。染色後プレートを水でよく洗浄した後、ｄｙｅ（色素）をメタノールで抽出しマイクロプレートリーダーを用いて５７０ｎｍの波長で吸光度を測定した。なお、細胞生存率は低酸素培養開始前の吸光度を１００％として算出した。

２４時間低酸素培養後のＣ２Ｃ１２細胞の生存率を（図５のＡ）に示した。５００μｇ／ｍｌと１，０００μｇ／ｍｌの１，５−ＡＦで前処理することで、低酸素培養に伴う細胞壊死が有意に抑制された。また、７２時間低酸素培養後のＨ９ｃ２細胞においても１，０００μｇ／ｍｌの１，５−ＡＦで同じ結果が得られた（図５のＢ）。これらのことから、１，５−ＡＦを予め摂取することは虚血性疾患の予防に繋がることが示唆された。

心筋細胞低酸素培養条件下での１，５−ＡＦの細胞保護作用の評価 神経細胞低酸素培養条件下での１，５−ＡＦの細胞保護作用の評価 ケラチノサイト低酸素培養条件下での１，５−ＡＦの細胞保護作用の評価 筋芽細胞低酸素培養条件下での１，５−ＡＦの細胞保護作用の評価と培養上澄中のＶＥＧＦ含量並びに乳酸値 筋芽・心筋細胞低酸素培養条件下における１，５−ＡＦ前処理による細胞保護作用の評価

Claims (7)

1. １，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースおよび/または１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース誘導体を含有することを特徴とする虚血性疾患の予防または治療剤。
2. １，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース誘導体が
   Ｇ−（Ｇ）_ｎ−ＡＦ ・・・（１）
   上式中、ＡＦは１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース残基を表し、Ｇはグルコース残基を表し、ｎは０〜２０の整数である
   で表される重合体である、請求項１に記載の虚血性疾患の予防または治療剤。
3. 虚血性疾患の予防または治療用の薬剤組成物を調製するための１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースまたは１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース誘導体の使用。
4. １，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースおよび／または１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース誘導体を含有することを特徴とする動物細胞または動物組織の保存剤。
5. １，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースおよび／または１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース誘導体を含有することを特徴とする臓器保存剤。
6. １，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースおよび／または１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース誘導体の低酸素状態下での細胞または組織の保護または保存のための使用。
7. 人間以外の哺乳動物に１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトースおよび／または１，５−Ｄ−アンヒドロフルクトース誘導体を投与することを特徴とする虚血性疾患の予防または治療方法。

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