JP2005154425A - 抗腫瘍剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 1,5−D−アンヒドロフルクトースおよび/またはアスコピロンを含有する抗腫瘍剤。
【選択図】なし
Description
アスコピロンP(以下、APPと略すことがある)は1,5−D−アンヒドロフルクトースと同様に抗酸化活性、抗菌活性を有することが報告されている(特許文献7、特許文献8および特許文献9参照)。
本発明の他の目的は、1,5−D−アンヒドロフルクトースおよび/またはアスコピロンを活性成分とし、炎症を抑制することが期待される、予後に優れた抗腫瘍剤を提供することにある。
本発明のさらに他の目的および利点は、以下の説明から明らかになろう。
すなわち、生体内に腫瘍細胞を保有する個体に本発明の剤を適当量しかるべき方法で投与することにより、有意に腫瘍の増殖ないし転移を抑制することが可能である。
投与方法としては、例えば、注射や点滴などにより静脈内や皮下、腹腔内、あるいは経口投与などによることができ、特別に制限されない。
また、本発明の剤を食品に添加し、その食品を摂取して体内に取り込む形態をとることも可能である。
また、この一回の投与量を数回に分けて投与することもできる。
以下に本発明について検討した結果を詳述する。なお、以下の試験においては1,5−D−アンヒドロフルクトースおよびアスコピロンは、公知の方法に基づいて調製したものを使用した。
細胞株および培養方法
接着系癌細胞株のC57 BL/6 マウスメラノーマ細胞株(B16 melanoma)、ヒト肺腺癌細胞株(A549)、ヒトケラチノサイト由来腫瘍様細胞株(HaCaT)、ヒト子宮頚部癌細胞株(HeLa)は10%FCS(ウシ胎児血清)と2%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDMEM培地中で、37℃、CO2濃度5%の条件下で培養した。浮遊系腫瘍細胞のTHP−1(前骨髄性白血病細胞株)は10%FCSと2%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むRPMI 1640培地中で、37℃、CO2濃度5%の条件下で培養した。
生細胞数の測定方法
6ウェルのプレート上に増殖したB16 melanoma細胞を2%グルタルアルデヒドで固定した後、4%クリスタルバイオレットで染色し、その染色性のある細胞を生細胞と判定した。
細胞培養液を種々の濃度のアスコピロンP溶液(アスコピロンPをジメチルスルホキシド(DMSO)に溶解したもの)で刺激し、所定の時間培養後、トリプシンを用い細胞を浮遊した状態で回収した。その後、4℃で30分間70%エタノールで固定した後、50μg/mlプロピジウムヨード(PI)溶液で染色した。30分後、FACSを用いて、DNAヒストグラムを作成し、細胞死の割合および細胞周期について調べた。
THP−1細胞培養液に1,5−D−アンヒドロフルクトース溶液(1,5−D−アンヒドロフルクトースをDMSOに溶解したもの)を添加し、次いでホルボールエステル(PMA;phorbol myristate acetate)で刺激した。37℃、5%CO2条件下で一時間培養後、Giemsa染色法で接着した細胞を染色した。
1)アスコピロンPによる細胞増殖抑制効果
5×103個/mlのB16 melanoma細胞(C57 BL/6 マウスメラノーマ細胞)を6ウェルのプレートに播種し、細胞が底面に接着後(24hr)、培養液中の最終濃度が0〜0.70mM になるようアスコピロンP溶液(溶媒としてDMSOを使用)を等量ずつ添加した。37℃、5%CO2条件下で一週間培養後、生細胞数を測定した。
結果を図2に示す。コントロール(DMSOのみを添加)での生存細胞を100%としたとき、アスコピロンPを添加することで、生細胞の数は濃度依存的に顕著に減少し、最終濃度(0.70mM)ではその割合は50%以下まで低下した。これらの結果から、アスコピロンPは腫瘍細胞の増殖抑制能を有すると考えられた。
B16 melanoma細胞に対するアスコピロンPの腫瘍細胞増殖抑制効果の機序が、他の抗腫瘍剤においてみられるような殺細胞効果によるものであるかを検討した。本検討項目において、B16 melanoma細胞以外に4種類のヒト癌細胞株(THP−1:前骨髄性白血病、HeLa:子宮頚癌、A549:肺胞上皮癌、HaCaT:皮膚癌モデル細胞)を加えて、アスコピロンPの刺激により誘導される死細胞の割合を調べた。なお、ここでは各癌細胞培養液に対し、アスコピロンPを1.4mMになるように添加し、48時間後の死細胞の割合を測定した。結果を表1に示す。
HaCaT細胞は、10%FCSの存在下では腫瘍細胞としての特徴を有しているが、低濃度のFCS存在下(1%以下)では、正常細胞に近い性格をもつことが知られている。この性質を利用して、アスコピロンPが正常細胞に及ぼす影響を検討した。結果を図5に示す。腫瘍様に増殖しているFCS10%条件下ではアスコピロンP添加後(1.4mM)、48時間以内で約30%もの細胞死を誘導したのに対し(図5(c))、正常細胞様の特徴をもつFCS1%では1.4mMのアスコピロンP存在下においても、ほとんど死細胞は認められなかった(図5(b))。これより、アスコピロンPは増殖性の高い細胞(腫瘍細胞)に特異的に作用し、増殖の遅い細胞(正常細胞)にはほとんど影響を及ぼさないことが示唆された。
一方、FCS10%で腫瘍様に増殖しているHeLa細胞において、アスコピロンP添加後(1.4mM)24時間では、顕著なS期細胞集団の増加およびG2/M期の細胞集団の減少が観察され(図6)、その後、48時間では先に示したように約10%の細胞死を誘導した。このことから、アスコピロンPの細胞周期上の作用点はDNA合成期間であるS期であり、G2/M期への移行を阻害し、結果として細胞死を誘導することが示唆される。したがって、アスコピロンPが抗腫瘍剤として生体に投与された場合、大半が細胞周期上のG0/1期にあると考えられる正常細胞に障害を与えることなく、腫瘍細胞にのみ特異的に殺細胞効果を発揮することが期待される。
白血病細胞株をホルボールエステル(PMA)で刺激すると、接着分子インテグリンの活性化がみられ、その結果,細胞現象として活性酸素生成、細胞接着亢進、細胞浸潤が誘導されることが知られている。そこで、1,5−D−アンヒドロフルクトース存在下で、THP−1細胞株を培養し、ホルボールエステルで刺激後の接着細胞数を指標としてインテグリン機能を評価した。
結果を図7に示す。12.3mMの1,5−D−アンヒドロフルクトースはホルボールエステルによる細胞接着性を約25%程度に抑制した。従って、腫瘍細胞の転移において重要な役割を果たすと考えられるインテグリン分子の機能を1,5−D−アンヒドロフルクトースは抑制しうることが推察された。
C57 BL/6 マウスにB16 melanoma細胞(5×106個)を腹腔内に播種した後,15日目から毎日PBS(燐酸緩衝液)ならびにアスコピロンP溶液を腹腔内投与し(投与量は200mg/kg)、生存率を調べた(癌性腹膜炎モデル)。この実験系において、予めB16 melanoma細胞をマウスの腹腔内に播種すると、無投与ならびにPBS投与の場合、14日目以降から個体(マウス)は死亡することが確認された。本実験系を用いて、アスコピロンPの末期癌モデルに対する延命効果について検討した結果を図8に示す。平均生存日数はアスコピロンP投与群では8日、PBS群は4日であり、生体内においても抗腫瘍効果を有することが証明された。さらに、アスコピロンP投与群の40%(n=2)において、コントロール(PBS群)と比較して3倍以上ものアスコピロンP投与後の生存期間の延長がみられた。このことは,アスコピロンPのin vivoにおける抗腫瘍効果を意味するものである。
実施例1と同様にC57 BL/6マウスにB16 melanoma細胞(5×106個)を腹腔内に播種した後、2日目から毎日PBSならびに1,5−D−アンヒドロフルクトースを腹腔内投与した(投与量は200mg/kg)。生存率を図9に示す。腫瘍細胞播種後の平均生存日数は1,5−D−アンヒドロフルクトース群が19日、コントロールのPBS群が14日であった。この結果から、1,5−D−アンヒドロフルクトースの担癌マウスに対する延命効果が認められた。
次に、C57 BL/6 マウスにB16 melanoma細胞(1×105個)を背中に皮下播種し、3日目から13日目までPBSならびにアスコピロンPを1日おきに腫瘍局所に皮下注射し(PBSに溶かした溶液を用い投与量は25mg/kgとした),腫瘍の容積(長径×短径2×0.52)で抗腫瘍効果を評価した(図10). 腫瘍細胞播種後、7日目まではいずれも差は認められなかったが、7日目以降アスコピロンP投与群はPBS投与群と比べて顕著に腫瘍の容積が少ないことがわかった。一般に,臨床の場では腫瘍の増大速度が遅いものほど予後が良好といわれる。すなわち,アスコピロンPのin vivoにおける抗腫瘍効果を示すものである。また、アスコピロンP投与群の屠殺後の解剖所見では腫瘍の転移はほとんど観察されなかった。
前骨髄性白血病細胞(THP−1細胞)の細胞培養液を種々の濃度のアスコピロンP溶液(アスコピロンPをDMSOに溶解したもの)、シスプラチン溶液(同様にDMSOで溶解)、さらにアスコピロンPとシスプラチンの混合溶液で刺激し、48時間培養後、十分にピペッティングして均一な単一細胞からなる浮遊液の状態で回収した。ここで一部は血球計算板を用い顕微鏡下で細胞数を測定した。残りの細胞浮遊液は4℃で30分間70%エタノール固定した後、最終50μg/mlプロピジウムヨード(PI)溶液で染色した。30分後、FACSを用いてDNAヒストグラムを作成し、細胞死の割合を調べ各々の生細胞数を算出した(図11)。コントロール(DMSOのみを添加)での生細胞を100%としたとき、アスコピロンPを添加することでその割合は30%前後から約50%まで減少し、細胞の増殖抑制効果が確認された。一方、シスプラチンとアスコピロンPを併用した群の生細胞の割合は、10%前後であり、アスコピロンPとシスプラチンとの相乗効果が確認された。
Claims (4)
- 1,5−D−アンヒドロフルクトースおよび/またはアスコピロンを抗腫瘍成分として含有することを特徴とする腫瘍の抗腫瘍剤。
- アスコピロンがアスコピロンPである、請求項1に記載の抗腫瘍剤。
- 1,5−D−アンヒドロフルクトースおよび/またはアスコピロンの、腫瘍の増殖ないし転移の抑制のための使用。
- アスコピロンがアスコピロンPである、請求項3に記載の使用。
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