JPH09328431A - 抗炎症活性を有する硫酸化ポリサッカライド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 抗炎症治療のための医薬的又は獣医学的組成
物を提供する。 【解決手段】 ヘパリン及びデキストランサルフェート
を除く、エンドグリコシダーゼ活性を妨害又は阻害する
少なくとも１種の硫酸化ポリサッカライドと共に、その
医薬的又は獣医学的に許容しうる担体又は希釈剤とを含
む、抗炎症治療のための医薬的又は獣医学的組成物。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は抗炎症活性を有する
化合物に関する。特に、抗炎症剤として動物およびヒト
にこれらの化合物を使用することに関する。

【０００２】

【従来の技術】炎症および腫瘍転移における鍵となるこ
との１つは、白血球又は腫瘍細胞が血管壁に粘着し、次
に組織内へ移ることである。血管壁の浸透は特異的分解
酵素による内皮内の細胞接合点および内皮下のマトリッ
クスの局部的崩壊を必要とすることは一般的に認められ
ているが、これらの過程の分子的基礎はよく理解されて
いない。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題・課題を解決するための
手段】ある硫酸化ポリサッカライドは腫瘍細胞転移を阻
害できることが分った。これらの硫酸化ポリサッカライ
ド（ヘパリンなど）のいくつかは抗凝固活性を示すが、
抗転移活性はこれらの抗凝固活性とは無関係で、ポリサ
ッカライドは血管壁への腫瘍細胞の付着を阻害せず、血
管壁の浸透を抑止すると思われる。その後の研究は硫酸
化ポリサッカライドが内皮下の細胞外マトリックス（Ｅ
ＣＭ）を崩壊し、腫瘍細胞の浸透および通行を可能にす
る腫瘍細胞由来のエンドグリコシダーゼを妨害すること
を示した。特に、これらの硫酸化ポリサッカライドはＥ
ＣＭのヘパランサルフェート側鎖を分解するヘパランサ
ルフェート特異グリコシダーゼ（ヘパラナーゼ）の作用
を阻害することが分った。本発明に導く研究はヘパリン
およびフコイダンのような硫酸化ポリサッカライドの連
続的注入は、試験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）、
ヒトの多発性硬化症と同じ動物炎症を、完全に予防でき
ることも示した。第１の面では、本発明は抗炎症剤とし
てある硫酸化ポリサッカライドの使用に関する。この面
では、本発明は動物又はヒトの患者の抗炎症治療方法を
供する。この方法はエンドグリコシダーゼ活性を妨害す
る少なくとも１種の硫酸化ポリサッカライドの有効量を
患者に投与することを含む。別の面では、本発明は抗炎
症治療に対する医薬組成物の製造にこれらの硫酸化ポリ
サッカライドを使用することに関する。この面では、エ
ンドグリコシダーゼ活性を妨害する少なくとも１種の硫
酸化ポリサッカライドを医薬的に許容しうるその担体又
は稀釈剤と一緒に含む医薬組成物が供される。本発明は
特にヘパラナーゼ活性を妨害する硫酸化ポリサッカライ
ドの使用に関する。適当な硫酸化ポリサッカライドはヘ
パリン、フコイダン、ペントサンサルフェート、および
カラギーナン−ラムダを含む。上記のように、エンドグ
リコシダーゼ阻害活性を示すことがわかった１種の硫酸
化ポリサッカライドはヘパリンであり、本発明の特に好
ましい一態様では活性成分はヘパリン、又はこの抗凝固
活性を減少させるために適当に修飾した抗凝固活性を有
する同様の硫酸化ポリサッカライドである。このような
修飾ポリサッカライドの例は（ａ）抗凝固活性で２０倍
の減少および抗転移活性でほとんどロスのない脱カルボ
キシル化ヘパリンおよび（ｂ）抗凝固活性はほとんどな
いが、有力な抗転移剤である過沃素酸塩により酸化し、
還元したヘパリンである。（ａ）および（ｂ）の双方共
ポリサッカライドのエンドグリコシダーゼ阻害活性は保
有する。次例は（ａ）ある種類の硫酸化ポリサッカライ
ドは乳房腺癌１３７６２ＭＡＴを抑制できる、（ｂ）硫
酸化ポリサッカライドの抗転移活性はこれらの抗凝固活
性と相関しない、および（ｃ）硫酸化ポリサッカライド
は血管内皮に腫瘍細胞の粘着を抑止しないが、腫瘍細胞
が血管壁を通過することを妨害するらしいことを実証す
る。

【０００４】

【実施例】

材料および方法例 １ ポリサッカライド ヒアルロン酸（ヒトの臍帯からのＧｒａｄｅ ＩＩＩ−
Ｓ）、コンドロイチン−４−硫酸（鯨の軟膏からのコン
ドロイチン硫酸タイプＡ）、コンドロイチン−６−硫酸
（サメ軟膏からのコンドロイチン硫酸タイプＣ）、フコ
イダン（Ｆｕｃｕｓ ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓから）、
ペントサン ポリサルフェート、カラギーナン−カッパ
（Ｅｕｃｈｅｕｍａ ｃｏｔｔｏｎｉｉからのタイプＩ
ＩＩ）、カラギーナン−ラムダ（Ｇｉｇａｒｔｉｎａ
ａｃｉｃｕｌａｉｒｅおよびＧｉｇａｒｔｉｎａ ｐｉ
ｓｔｉｌｌａｔａからのタイプＩＶ）はすべてＳｉｇｍ
ａＣｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ．Ｍ
ｏ．）から購入した。ヘパリン（粘膜）はＥｖａｎｓ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｔｄ．（Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ，Ｕ．
Ｋ．）から供給を受けた。ヘパリンＣＳＬはＣｏｍｍｏ
ｎｗｅａｌｔｈ Ｓｅｒｕｍ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ
ｓ（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）から得
た。デキストランサルフェート（２．３サルフェート／
モノサッカライド、ＭＷ５００，０００）はＰｈａｒｍ
ａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｕｐｐｓａ
ｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）から購入し、アルデパロン（Ｌｕ
ｉｔｐｏｌｄ Ｗｅｒｋ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｗ．Ｇｅｒｍ
ａｎｙ）はＤｒ Ｐ．Ｇｈｏｓｈ，Ｒｏｙａｌ Ｎｏｒ
ｔｈ Ｓｈｏｒｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｓｔ．Ｌｅｏｎ
ａｒｄ，Ｓｙｄｎｅｙ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）の寛大な
贈物であった。溶液として購入したヘパリンＣＳＬを除
いて、０．１５Ｍ ＮａＣｌ溶液に溶解し、大部分の場
合２０ｍｇ／ｍｌの貯蔵濃度に溶解した。溶液の粘度の
ためにヒアルロン酸およびカラギーナンはそれぞれ１０
ｍｇ／ｍｌおよび２ｍｇ／ｍｌの濃度に０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌに溶解した。すべてのポリサッカライド溶液は−
２０°で貯蔵した。動物および細胞系 雌のＦｉｓｈｅｒ Ｆ３４４近交系ラットはＭｅｄｉｃ
ａｌ ＲｅｓｅａｒｃｈのＪｏｈｎ Ｃｕｒｔｉｎ Ｓ
ｃｈｏｏｌで繁殖させ、これを１０週令で使用した。１
３７６２ＭＡＴ細胞系は仔牛胎児血清１０％（ＦＣＳ，
Ｆｌｏｗ Ｌａｂｓ．），１００ユニット／ｍｌペニシ
リン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンサル
フェートを上記のように追加したＲＰＭｌ １６４０培
地（Ｇｉｂｃｏ）で試験管培養に適応させたＦｉｓｈｅ
ｒ ３４４ラットの乳房腺癌である（４）。これらの細
胞は高転移性で多数の継代培養にわたって安定な転移性
を示す。血液原性転移試験 １３７６２ＭＡＴ細胞は烈しく振盪して組織培養びんの
表面から除き、次に細胞は洗滌し、完全培地に再懸濁し
た。０．６ｍｌ中の２×１０⁵ 生存細胞はＦｉｓｈｅｒ
３４４ラットの尾の静脈に注射した。注射後１２日に
動物を殺し、肺を取り出し、ブーアン液に固定し、表面
転移フォーカス数を測定した。この注射経路では転移は
肺に限定される。ソフト寒天平板培養 ソフト寒天の細胞平板培養は本質的にＲｅｉｄの記載の
ように行なった（５）。簡単には、１０％仔牛血清を含
有する１６４０培地の２ｍｌの０．５％Ｄｉｆｃｏ Ｂ
ａｃｔｏ−寒天から成る下層を６０ｍｍペトリ皿（Ｓｔ
ｅｒｉｌｉｎ，Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ Ｍｉｄｄｌｅｓ
ｅｘ）に注ぎ入れ、４°で１時間固化させた。平板培養
する細胞は１６４０培地および１０％仔牛血清０．３３
％寒天に懸濁し、６ｍｌのこの混合物を下層上に注い
だ。プレートは最初４℃に１時間置いて寒天を凝固さ
せ、次に加湿５％ＣＯ₂ 雰囲気で３７°で１４日培養し
た。コロニーは３７°で７〜１０日後見ることができ、
１４日に計数できる。

【０００５】硫酸化ポリサッカライドに対する細胞表面
受容体のロゼッテ分析 ロゼッテ分析を９６個の穴を有する円底ミクロプレート
（Ｌｉｎｂｒｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）で、以前
報告された方法（３）に基いて行なった。１３７６２Ｍ
ＡＴ細胞を洗滌し、０．１％牛血清アルブミン（ＰＢＳ
／ＢＳＡ）を追加した０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ７）
のリン酸塩緩衝液に再懸濁した。氷冷却１３７６２ＭＡ
Ｔ細胞（１×１０⁶ ／ｍｌ、ＰＢＳ／ＢＳＡ中）の２５
μｌに洗滌した羊の赤血球又は上記のように（３）Ｃｒ
Ｃｌ₃ を使用して硫酸化ポリサッカライドと連結した羊
赤血球の１％ＰＢＳ／ＢＳＡサスペンジョンの２５μｌ
を添加した。この混合物は１分／４°で１，０００ｒｐ
ｍで遠心分離してペレットにし、１時間氷上に置きロゼ
ッテを安定化させた。次にこの細胞ペレットは短かいパ
スツールピペットにより穏かに再懸濁し、メチルバイオ
レットにより染色した。５０μｌの０．０５％のメチル
バイオレットを穴に添加する。細胞試料は血球計室に移
し、ロゼッテ形成細胞％を算定した。最少１００〜２０
０個の腫瘍細胞をロゼッテに対し試験した。６個又はそ
れ以上の付加赤血球を有する腫瘍細胞はロゼッテと見な
した。１３７６２細胞のヘキスト染料Ｎｏ．３３３４２による
標識化 ヘキスト染料Ｎｏ．３３３４２（Ｈ３３３４２；Ｃａｌ
ｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ，Ｋｉｎｇｓｇｒｏｖ
ｅ，ＮＳＷ，Ａｎｓｔｒａｌｉａ）は４°で６００μｇ
／ｍｌの蒸留水貯蔵溶液として貯蔵した。標識化に対
し、１３７６２ＭＡＴ細胞を洗滌し、１０％ＦＣＳを追
加したＲＰＭｌ １６４０培地に５×１０ ⁷ 細胞／ｍｌ
の濃度に再懸濁した。細胞は３７°の水浴に移し、６μ
ｇ／ｍｌのＨ３３３４２を添加した。標識化は１５分継
続し、その後細胞は冷ＲＰＭｌ １６４０培地により２
回洗滌し、注射用に再懸濁した。ロッジメント腫瘍細胞の定量化 使用方法はＢｒｅｎａｎおよびＰａｒｉｓｈの方法と同
じであった（２）。２００ユニットのＣＳＬヘパリン
（約１．６ｍｇ）又は４ｍｇのコンドロイチン−４−硫
酸を含有する０．６ｍｌのＲＰＭｌ １６４０培地の１
３７６２ＭＡＴ細胞（２×１０⁶ ）をラットに静脈注射
した。ＲＰＭｌ単独を注射した標識細胞は対照として供
した。注射後の各種時間にラットを麻酔し、心臓穿刺に
より採血し、肺は取り出し、洗滌し、塩水中に置いた。
各肺は次いでＰＢＳ中で細切し、組織断片を微細篩に通
して穏かに圧縮することにより単一細胞サスペンジョン
にした。細胞サスペンジョンを遠心分離し、ＰＢＳで洗
滌し、４ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。血球計を使用して
各肺内の蛍光性細胞数を概算した。少なくとも３匹の動
物を各時点および各処理に対し使用した。

【０００６】抗凝固剤および凝血促進剤の分析 ラットの血漿を得るために、血液を麻酔ラットの心臓穿
刺により集めた。ラット血液の容量を３．８％クエン酸
ナトリウム１容量中に取り出す。赤血球は遠心分離（１
０，０００ｇ、４℃）により除き、血漿を集め、使用す
るまで−７０°で貯蔵した。血漿の凝固状態に及ぼす硫
酸化ポリサッカライドの効果は次のように測定した。
０．１５Ｍ ＮａＣｌに稀釈した１００μｌのポリサッ
カライドを５０ｍｌの通常の血漿および５０μｌの０．
１５Ｍ ＮａＣｌと混合し、混合物は３７℃で２分間加
温した。凝固過程を活性化するために、１．５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ中の３０ＮＩＨユニット／ｍｌの濃度の２０μｌの
牛トロンビン（Ｓｉｇｍａ）又は２０μｌの活性化「Ｔ
ｈｒｏｍｂｏｆａｘ」最高化試薬（活性剤による部分ト
ロンボプラスチン、Ｏｒｔｈｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ
Ｓｙｓｔｅｍ Ｉｎｃ．）を混合物に添加した。次い
で１００μｌの３０ｍＭ ＣａＣｌ₂ を添加して凝血反
応を開始させ、血餅の形成に要する時間、秒を記録し
た。これらの値は硫酸化ポリサッカライドが存在しない
場合、すなわち１００μｌのポリサッカライドを１００
μｌの塩水と置換した場合、血漿が凝血するに要する時
間と比較した。凝結時間に対し検知できない効果を有す
るポリサッカライドの最高濃度を終点とした。トロンビ
ン又は「Ｔｈｒｏｍｂｏｆａｘ」の添加は表面接触が凝
固段階を活性化する唯一の作因である場合、生ずる固有
過程の不完全な活性化により導入される変動性を除くた
めに必要であった。同様の分析を使用して１３７６２Ｍ
ＡＴ細胞の凝血促進活性に及ぼす硫酸化ポリサッカライ
ドの効果を測定した。１００μｌの通常のラットの血漿
に０．１５Ｍ ＮａＣｌ中の５０μｌのポリサッカライ
ドおよび１６４０培地（血清を含まず）中の２×１０⁴
１３７６２ＭＡＴ細胞を含有する５０μｌを添加した。
２分３７℃で加温後、１００μｌの３０ｍＭ ＣａＣｌ
₂ を添加し、血餅形成時間（秒）を測定した。凝血段階
がポリサッカライドの不存在下に（５０μｌのポリサッ
カライドを５０μｌの塩水と置換した）２×１０⁴ １３
７６２ＭＡＴにより活性化する場合血漿の凝血時間を対
照として供した。対照に対し記録した上記凝血時間に検
知しうる増加を生じないポリサッカライドの最高濃度は
終点であった。両分析に対し各ポリサッカライド濃度の
効果は二重反復試験で測定し、対照値は少なくとも８つ
の凝血時間の平均から決定した。

【０００７】結 果硫酸化ポリサッカライドによる転移の抑止 硫酸化ポリサッカライドは１３７６２ＭＡＴ細胞の肺転
移数を変えうるか否かを調査するために次の試験を行な
った。１３７６２ＭＡＴ細胞の１個の細胞サスペンジョ
ンはラットの尾静脈に注射直前にＲＰＭｌ １６４０培
地の４ｍｇの硫酸化ポリサッカライドと混合した。注射
後１２日に目で見うる表面肺病変数を測定した。目で見
うる病変数は肺内の全病変数を表わさないが、転移腫瘍
のコロニー化の程度の信頼しうる評価と見なされる
（８）。ある硫酸化ポリサッカライドは実質的に肺病変
数を減少させることは第Ｉ表から明らかである。ヘパリ
ンはもっとも有効なポリサッカライドであり、次いでカ
ラギーナン−ラムダ、ペントサンサルフェートおよびフ
コイダンであった。硫酸化ポリサッカライドの明白な抗
転移効果は腫瘍細胞に対する直接毒性により生ずる可能
性を排除することは必要であった。従って、１３７６２
ＭＡＴ細胞試料は転移の抑止が示された各糖の１つと３
７°で１時間培養した。インキュベーション後細胞は洗
滌し、ソフト寒天に平板培養した。細胞および糖濃度は
ラットの注射に使用したものと同じ、すなわちカラギー
ナンの場合３．３×１０⁵ 細胞／６．６ｍｇ糖／ｍｌ又
は３．３×１０⁵ 細胞／３．３ｍｇ糖／ｍｌであった。
ＲＰＭｌ １６４０培地単独に培養した細胞は対照とし
て供した。腫瘍細胞の生存能力に及ぼす糖の効果は平面
培養後１４日に生存細胞コロニー数から評価した。デキ
ストランサルフェートは１３７６２ＭＡＴ細胞コロニー
（第ＩＩ表）の大きさ又は数を減少させることがわかっ
た唯一の糖であった。他の糖は試験管内で腫瘍細胞の生
存能力に対し検知しうる効果を有しない。デキストラン
サルフェートを除いて、これは転移数の減少がいくつか
のポリサッカライドの試験管内の作用の結果であること
を示唆する。この解釈の妥当性を決定するためにヘパリ
ンを静脈注射腫瘍細胞と無関係に投与した。腹腔内、皮
下又は別の尾静脈経由によるヘパリン注射経路は結果を
変更しないことが分った。それぞれの場合対照の１０％
より少ない転移数に減少を続け（データは示さない）、
こうしてヘパリンは少なくとも生体内で作用して転移数
を減少させることが確証される。

【０００８】１３７６２ＭＡＴ細胞の硫酸化ポリサッカ
ライドに対する受容体の検出 硫酸化ポリサッカライドは内皮細胞の細胞外マトリック
スの主要成分を構成する。従って１３７６２ＭＡＴ細胞
はこれらの分子に対する受容体により肺内皮に付着する
ことができる。１３７６２ＭＡＴ細胞の表面と連合した
分子が硫酸化ポリサッカライドを結合するかどうかを決
定するためにロゼッテ分析を使用した。多種の起源から
の硫酸化ポリサッカライドは羊赤血球の表面に連結し、
これらの赤血球が１３７６２ＭＡＴ細胞に付着する能力
を評価した。未連結羊赤血球は対照として供した。グリ
コサミノグリカン（ＧＡＧ）、コンドロイチン−４−硫
酸およびコンドロイチン−６−硫酸と連結した赤血球は
１３７６２ＭＡＴ細胞の表面に強く結合し、一方ヒアル
ロン酸（非硫酸塩化ＧＡＧ）と連結した赤血球は適度に
結合した。７７％の１３７６２ＭＡＴ細胞はロゼッテと
して分類される（第ＩＩＩ表）。対照的にアルテパロン
（牛の肺からの人為的に過度硫酸塩化ＧＡＧ）およびヘ
パリン−連結赤血球は１３７６２ＭＡＴ細胞にきわめて
弱く結合した。同様の選択的付着パターンを硫酸化ポリ
サッカライドと連結した非−哺乳動物起源からの赤血球
に対し１３７６２ＭＡＴ細胞が示した。カラギーナンカ
ッパおよびラムダは１３７６２ＭＡＴ細胞に非常に強く
結合するが、これら細胞の再区分集団（約３２％）は一
貫してカラギーナンラムダを結合しない。ペントサンサ
ルフェート−連結赤血球の結合は検出できなかった。１
３７６２ＭＡＴ細胞の再区分集団（約５０％）はデキス
トランサルフェート−連結赤血球にむしろ弱く結合し
た。１３７６２ＭＡＴ細胞が示す結合パターンの選択性
は結合が単にポリサッカライドのアニオン性に基づくも
のでないことを示す。例えば、腫瘍細胞はコンドロイチ
ン硫酸と強く反応し、尚はるかに高い荷電密度を有する
ヘパリンＧＡＧを結合しない。同様にヒアルロン酸、比
較的低荷電密度を有する分子は１３７６２ＭＡＴ細胞に
非常に強く付着することが分った。従って、１３７６２
ＭＡＴ細胞は特別の硫酸化ポリサッカライドを結合する
表面連合分子（受容体）を有することが結論できる。し
かし糖の抗転移性および腫瘍細胞表面に結合するこれら
の能力間に正の相関はなかった（第Ｉ表および第ＩＩＩ
表）。実際に、カラギーナンラムダを除いて、負の相関
は明らかであった。これは大部分の硫酸化ポリサッカラ
イドの抗転移活性は１３７６２ＭＡＴ細胞表面の硫酸化
ポリサッカライドの特異的受容体の遮断によるものでは
ないことを示唆する。

【０００９】硫酸化ポリサッカライドの抗凝固活性 １３７６２ＭＡＴ細胞は試験管内で凝血促進活性を示す
ことが知られる（１）。ある性質はこれらの細胞が器官
の微少循環系で捕集されるようになる確率を増加するこ
とにより腫瘍細胞の転移能力に寄与すると信じられる
（６）。抗転移剤としてもっとも有効な糖は、全く低濃
度で１３７６２ＭＡＴ細胞の抗凝固剤活性を示し、凝血
促進活性を阻害する双方を示すことが分った（第ＩＶ
表）。それにも拘らず、抗転移活性および抗凝固活性間
の相関は絶対的ではないことは注目すべきである。例え
ば、デキストランサルフェートはカラギーナンラムダと
同じ低さの１〜０．５μｇ／ｍｌの濃度で血漿の凝固を
抑止した（第ＩＶ表）が、尚カラギーナンラムダはデキ
ストランサルフェートより転移の抑止に実質的に一層有
効であった（第Ｉ表）。さらに、デキストランサルフェ
ートは１３７６２ＭＡＴ細胞の生存能力を損なうことが
分った（第ＩＩ表）、こうしてこの糖により観察された
転移の５０％減少はその毒性の反映であることは事実の
ようである。ペントサンサルフェートおよびアルテパロ
ンは抗凝固活性分析で同様に同一の終点を示したが、抗
転移剤としてのそれらの効力は有意に異なった。抗凝固
剤および凝血促進剤分析は、糖濃度の狭い範囲が対照と
同一の一定凝固時間から無凝固状態に血漿を変え得るの
で正確な終点を示すことは注目する価値がある（データ
は示さず）。

【００１０】肺内の腫瘍細胞のアレストに対する硫酸化
ポリサッカライドの効果 転移を減少させる硫酸化ポリサッカライドは腫瘍細胞が
肺内皮にアレストおよび／又は付着することを妨害でき
るか、又は転移過程の後期段階で作用するか？この疑問
を調査するために蛍光染料（Ｈ３３３４２）により標識
した１３７６２ＭＡＴ細胞の肺におけるアレストに対す
るヘパリンおよびフコイダンの効果を測定した。この染
料は以前にリンパ球の再循環を追跡するために使用し、
毒性もないし、細胞表面を修飾もしないことが報告され
る（２）。蛍光標識した１３７６２ＭＡＴ細胞（２×１
０⁶ ）は塩水又はフコイダン（４ｍｇ）を含み又はヘパ
リン（４ｍｇおよび１．６ｍｇ）を添加して静脈注射し
た。注射後１５，９０又は３６０分にラットは心臓穿刺
により採血し、次いで殺し、肺を取り出した。洗滌後肺
は２０時間室温で５％中性ホルマリン中で固定した。固
定組織の手による断片は低倍率（１００×）蛍光顕微鏡
検査を使用して試験した。すべての場合、細胞は肺葉中
に拡がった斑点状分布を示し（図１ａおよびｂ）、およ
び１５分後アレスト細胞数の定性的差異は検知できなか
った。しかし、注射後６時間の肺に見ることができる細
胞数は、ヘパリン又はフコイダンを投与した場合実質的
に下向した（図１ｃおよびｄ）。次の試験では肺の１３
７６２ＭＡＴ細胞のアレストおよびロッジメントに及ぼ
す硫酸化ポリサッカライドの効果を２２時間にわたって
定量化した。Ｈ３３３４２により標識した腫瘍細胞に
糖、ヘパリン（１．６ｍｇ）又はコンドロイチン−４−
硫酸（４ｍｇ）、又はＲＰＭｌ １６４０単独で注射
し、特定時（図２）に肺に残留する標識細胞数を評価し
た。各時点で採取した血液試料から製造した血漿はラッ
トの抗凝固剤状態を監視するために使用した。１．６ｍ
ｇのヘパリンは動物を有意に抗凝固性にし、３〜５時腫
瘍細胞の凝血促進活性を抑制した。ヘパリン注射後５時
間でラットから採取した血漿は通常の血漿と区別できる
凝血パターンを示した。コンドロイチン−４−硫酸はラ
ットの凝血状態に全く効果がなかった。本試験の結果は
定性的評価を確証した。ヘパリンは腫瘍細胞の初めのア
レストを妨害しなかったが、２２時間後に初めにアレス
トされた細胞の３８％のみしか検出できない程これらの
細胞は肺から消滅する割合を増加した。対照的に、抗凝
固活性および抗転移活性を有しない糖であるコンドロイ
チン−４−硫酸は肺に腫瘍細胞を保留する効果を全く有
しなかった（図２）。ヘパリンおよびフコイダンの双方
により観察された肺からの細胞の移動は、こうして単に
硫酸化ポリサッカライドそれ自体の導入によるものでは
なく、一層特異的であると思われる。細胞の移動は糖の
抗凝血活性によるかどうかは明らかではない。しかし、
データはヘパリンおよびフコイダンが凝血促進活性の有
力な阻害剤であるので、１３７６２ＭＡＴ細胞の凝血促
進活性は腫瘍細胞アレストの初めの段階に対しほとんど
影響を有しないことを示唆する（第ＩＶ表）。

【００１１】抗転移活性に及ぼすヘパリン投与時期の効
果 肺に残留する１３７６２ＭＡＴ細胞数に対するヘパリン
の効果は注射後１〜２時間で最初に明らかになった（図
２）。ヘパリンは細胞が肺毛細管に留まった後で、脈管
内皮の浸透前に転移過程を妨害すると論じることができ
よう。転移を妨害するもっとも有効なヘパリン投与時期
を決定するために、ヘパリンは腫瘍細胞および肺病変部
の形成数の記録前又は後に与えた。ヘパリンは、腫瘍細
胞の静脈注射直後、異なる尾の静脈に注射する場合転移
の形成を有効に抑制した。しかし、約７０％の転移抑制
は腫瘍細胞１時間前又は３時間後までにヘパリンを与え
た場合尚達成できる（第Ｖ表）。上記のようにラットは
ヘパリン注射後３時間有意に抗凝血性であったが、６時
間後これらの凝血状態は塩水注射対照ものに戻った（デ
ータは示さず）。

【００１２】ヘパリンの抗転移効果および抗凝血効果の
分離 上記データから抗凝固性は硫酸化ポリサッカライドの抗
転移効果に対する完全な説明ではないことは明らかであ
る。硫酸化ポリサッカライドの市販製剤は分子の不均質
セットから成り、同じポリサッカライドの異なる製剤は
分子の僅かに異るセットを有する。従って、ヘパリンバ
ッチは抗転移剤としてその効力は変化するが、尚同じ抗
凝固性を有することができる。これは事実であることが
分った。２つの異なる起源からのヘパリン製剤は同一の
抗凝固性を有するが、これらの抗移転能力は約１０倍異
った（第ＶＩ表）。５０％だけ肺転移数を低下するのに
必要なＥｖａｎｓ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｌｔｄのヘパリン
およびＣＳＬヘパリン量はそれぞれ０．５３ｍｇおよび
０．０６ｍｇであった。これらの結果が抗転移効果が少
なくとも一部抗凝固性に対し必要とするものとは別個の
何かの成分によることを示す。

【００１３】

【表１】

【００１４】

【表２】 １３７６２ＭＡＴ細胞は寒天に添加し、平板培養前に１
６４０培地のポリサッカライド（カラギーナンカッパお
よびラムダでは３．３ｍｇ／ｍｌ、他では６．６ｍｇ／
ｍｌ）中で３７°で１時間インキュベートした。４つの
反復平板培地を各糖に対し調製した。

【００１５】

【表３】

【００１６】

【表４】

【００１７】

【表５】

【００１８】

【表６】

【００１９】次例は硫酸化ポリサッカライドが腫瘍細胞
由来のエンドグリコシダーゼを阻害することにより腫瘍
の転移を抑制することを実証する。例 ２ 第ＶＩＩ表は異る硫酸化ポリサッカライドのエンドグリ
コシダーゼ阻害活性および腫瘍転移を抑制するこれらの
能力間に相関があることを実証するエンドグリコシダー
ゼ阻害試験からの結果を示す。抗転移活性を示す５種の
ポリサッカライドは腫瘍細胞由来のエンドグリコシダー
ゼの匹敵する阻害剤であった。対照的に、腫瘍転移を抑
制できなかった４種のポリサッカライドのうち、３種は
検知できるエンドグリコシダーゼ阻害活性を有せず、１
種のポリサッカライド（カラギーナン−カッパ）は抗転
移ポリサッカライドとして腫瘍エンドグリコシダーゼの
阻害で約７〜４倍有効性が低かった。上記例１記載の試
験は硫酸化ポリサッカライドの抗凝固活性がこれらの抗
転移活性にほとんど又は全く役割を演じないことを示唆
するが、これは真に実際である一層直接的証拠を得るこ
とは重要であった。第ＶＩＩＩ表はヘパリンを抗−トロ
ンビンＩＩＩカラム（ヘパリンは血漿の抗−トロンビン
ＩＩＩと相互作用することにより抗凝固活性を働かせ
る）を通すことにより抗凝固剤の豊富な画分および抗凝
固剤の消耗した画分に分離した試験の結果を示す。この
試験で使用したヘパリン製剤の約４０％は抗−トロンビ
ンＩＩＩカラムに結合し、２Ｍ ＮａＣｌにより溶離し
た（高親和性ヘパリンと称する）。抗−トロンビンＩＩ
Ｉに対し高および低親和性を有するヘパリン画分は同一
のエンドグリコシダーゼ阻害活性、ほとんど同一の抗転
移活性（分画しないヘパリンに匹敵する）を有するが、
これらの抗凝固活性が約３００〜５００倍少ないことで
異ることがわかった。これらの結果はヘパリンの抗凝固
活性がポリサッカライドの抗転移性にほとんど又は全く
役割を演じないことを明白に示す。付加的試験で、ポリ
サッカライドの抗凝固活性は破壊するが、分子の抗転移
活性は保有するように化学的にヘパリンを修飾する試験
を行なった。このような処理は（ｉ）抗転移および抗炎
症薬品として臨床的に使用する場合ヘパリンの望ましく
ない抗凝固性を排除し、（ｉｉ）抗−トロンビンＩＩＩ
画分と異なって、有効な薬品を製造する商業的に育成で
きるアプローチを供する。２つの化学的に修飾した実際
に抗凝固活性を欠くヘパリン製剤により得た結果は第Ｉ
Ｘ表に示す。両製剤は実質的抗転移活性を示したが、こ
れらは未修飾ヘパリンより効果が少なかった。

【００２０】

【表７】

【００２１】

【表８】

【００２２】化学的に修飾したヘパリンの製造 ヘパリンは過沃素酸塩により酸化しＦｒａｎｓｓｏｎの
方法に基づいてボロハイドライドにより還元した
（９）。４０ｍＭ過沃素酸ナトリウムを含有する５０ｍ
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中のヘパリン（１０ｍｇ／ｍ
ｌ、牛肺）は３７℃で２０時間、暗所でインキュベート
した。反応はＤ−マンニトール（５ｍｇ／ｍｌ）の添加
により停止させた。低分子量反応生成物は蒸留水に対し
透析することにより除去した。次に酸化ヘパリンは２０
ｍｇ／ｍｌのＫＢＨ₄ の添加および２０℃で３時間イン
キュベーションすることにより還元した。過剰のボロハ
イドライドは２０μｌ／ｍｌの氷酢酸の添加により分解
した。酸化し、還元したヘパリンを２容のエタノールの
添加により４℃で２回沈澱させ、最後に０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌに再溶解した。Ｎ−脱硫酸塩化ヘパリンは１００
℃で９０分０．０４Ｍ ＨＣｌ中で材料を加熱すること
により製造した。Ｎ−アセチル化ヘパリンは上記のよう
にＮ−脱硫酸化ヘパリンを無水酢酸により処理すること
により得た（１０）。

【００２３】

【表９】

【００２４】次例は硫酸化ポリサッカライド、ヘパリ
ン、フコイダンおよびペントサンサルフェートの抗炎症
活性を実証する。例 ３ 材料および方法 ラット、ルイス（ＲＴ−１¹ ）ラットをＭｅｄｉｃａｌ
ＲｅｓｅａｒｃｈのＪｏｈｎ Ｃｕｒｔｉｎ Ｓｃｈ
ｏｏｌで繁殖させた。８〜１０週令の雄および雌の双方
を使用した。各試験において対照および試験ラットは交
配した。ＥＡＥの誘導 能動。 モルモットＢＰをＤｅｉｂｌｅｒら（１１）の
方法に従って製造し、塩水中のＢＰは４ｍｇ／ｍｌ添加
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍを含
有する不完全フロインド補助液の等容量に乳化した。ラ
ットの両後肢の１つの肉趾に０．１ｍｌエマルジョンを
与えた。与えた全用量は５０μｇＢＰおよび４００μｇ
Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｕｔｙｒｉｃｕｍであ
った。受動。 受動的移入に対する細胞はＰａｎｉｔｃｈおよ
びＭｃＦａｒｌｉｎの方法に従って産生した。単一細胞
のサスペンジョンは上記のようにＢＰ−ＣＦＡにより１
２日前に感作した供給体ラットの脾臓から調製した。細
胞はＲＰＭｌ１６４０＋５％仔牛胎児血清、５×１０^-5
Ｍ ２−メルカプトエタノール、２００ｍＭ Ｌ−グル
タミンおよびペニシリンおよびストレプトマイシンに２
×１０ ⁶ ／ｍｌで培養した。ＣｏｎＡは２μｇ／ｍｌで
添加し、カルチャーは１０％ＣＯ₂ 、７％Ｏ₂ およびバ
ランスＮ₂ の雰囲気で３７℃でインキュベートした。細
胞は７２時間後に採取し、Ｈａｎｋｓのバランス化塩溶
液（ＢＳＳ）により洗浄し、尾の側方静脈を経て受容体
に移した。すべての移行菌数は３×１０⁶ 生存細胞を含
有した。臨床ＥＡＥの評価 臨床ＥＡＥは次の案に従って格付けした。０、無症候
性；１、尾の末端半分の弛緩性；２、尾全体の弛緩性；
３は運動失調症、正向の困難性；４、後肢の弱さ；５、
後肢の麻痺。大部分の試験で病気初期の平均日（ＭＤ
Ｏ）、平均臨床点数（ＭＣＳ）および病気の平均的永さ
又は期間（ＭＬＤ）を計算した。値は平均の標準誤差を
表わした。組織学 ラットは１０％中性緩衝ホルマリンにより灌流した。こ
れらの脊髄を取り出し、標準組織学技術により調製し
た。スライドはＨおよびＥにより染色した。

【００２５】ポリサッカライド コンドロイチン−４−硫酸、フコイダン（Ｆｕｃｕｓ
ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓから）、ペントサンポリサルフ
ェートおよびヘパリン（牛肺からのナトリウム塩）はす
べてＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し
た。ポリサッカライドは０．１５Ｍ ＮａＣｌに溶解
し、−２０℃で貯蔵した。これらは解凍し、次に使用直
前に２分煮沸した。抗凝固活性を欠くヘパリンはＦｒａ
ｎｓｓｏｎ記載と同じ方法を使用して過沃素酸塩による
酸化およびボロハイドレートによる還元により製造した
（９）。牛肺ヘパリン（１０ｍｇ／ｍｌ）は４０ｍＭ過
沃素酸ナトリウムを含有する０．０５Ｍリン酸ナトリウ
ム緩衝液、ｐＨ７．０に溶解し、３７℃で１８時間暗所
に放置し反応させた。反応は固体Ｄ−マンニトール（５
ｍｇ／ｍｌ）を添加して停止させ、次に溶液は室温で２
時間蒸留水に対し透析した。透析物は３０分毎に変え
る。次にオキシヘパリンは固体ポタシウムボロハイドラ
イド（２ｍｇ／ｍｌヘパリン）を添加して還元した。還
元反応は室温で３時間放置し、次に氷酢酸（１μｌ／ｍ
ｇのボロハイドライド）を添加して終結させた。次にヘ
パリンはエタノールにより２回沈澱させ（２容エタノー
ル、４℃，１８時間）、最後に２０ｍｇ／ｍｌの濃度に
０．１５Ｍ ＮａＣｌに溶解した。約５０％のヘパリン
は過沃素塩酸化、ボロハイドライド還元製剤として回収
した。ヘパリンおよび過沃素酸塩酸化ヘパリンの抗凝固
剤活性を活性化部分トロンボプラスチン時間およびトロ
ンビン時間試験ラット血漿を使用して測定した。これら
の分析基準で過沃素酸塩酸化はヘパリンの抗凝固剤活性
の５００〜２０００倍減少の結果となった。硫酸化ポリサッカライドの受渡し 生体内のいくつかのポリサッカライドの短かい半減期の
ために、用量の反復投与が必要であると考えた。最初に
１２時間毎にヘパリンのｉｐ注射を試みた。不幸なこと
に、これは許容しえない出血レベルおよびいくつかの動
物の死亡さえ生じた。従って、ミニ浸透圧ポンプ（タイ
プ２ＭＬ、ＡＬＺＡ Ｃｏｏｐ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔ
ｏ，Ｃａｌｉｆ）を使用することを選択し、これは背の
皮下に移植した。ポンプは２ｍｌ能力を有し、７日間約
１０μｌ／時間を送る。ヘパリンの血漿レベルは２０ｍ
ｇ／ｍｌを含有する浸透圧ポンプを移植したラットで測
定した。使用方法は本質的にＦａｒｎｄａｌｅらのジメ
チルメチレンブルー方法であった（１３）。１０〜２０
μｇ／ｍｌの恒常状態濃度はポンプ移植零日後２４時間
までに達し、ヘパリンは８日目、すなわちポンプが送る
ことを中止した後２４時間で検出できなかった。

【００２６】結 果 受容体ラットは３０×１０⁶ ＥＡＥ作動体細胞を受け、
同時に浸透圧ポンプは背の皮下に入れた。ポンプは１０
ｍｇ／ｍｌ又は２０ｍｇ／ｍｌで２ｍｌのヘパリンを含
有した。第Ｘ表に示すように、両ヘパリン処理群にある
程度の保護があった。１０ｍｇ／ｍｌのヘパリンを受け
る６匹のうち３匹のみが発病し、２０ｍｇ／ｍｌを受け
る５匹のうち１匹のみが発病した。後者の場合、発病し
なかった１匹の動物は細胞の移行後それ程遅くなく、又
おだやかな病気を示した。次の試験では、ヘパリンおよ
び３種の別の硫酸塩化ポリサッカライド、フコイダン、
コンドロイチン−４−硫酸およびペントサンサルフェー
トを使用し、処理の開始が３日遅れても尚保護を供する
かどうかを求めた。フコイダンおよびヘパリンは処理が
細胞移行後３日まで遅れた場合でさえＥＡＥに対し完全
な保護を与えた（第ＸＩ表）。ペントサンサルフェート
は発病の遅れ、おだやかな臨床病、および一層短期間の
病気により証明されるように部分保護を与えた。コンド
ロイチン−４−硫酸は全く保護効果を有しなかった。し
ばしば、ＥＡＥの各種薬剤による治療研究は臨床病が阻
害され、それでも尚組織病理学試験は全く広汎な炎症病
変を現わすことを実証する（１４，１５）。本発明に関
しこれを試験するために、第ＸＩ表記載の試験から３匹
の対照および３匹のヘパリンと処理動物を細胞移行後８
日に殺し、炎症病変に対し試験した。実際に対照ラット
の下部胸部／上部腰部帯を経た２ｃｍの縦断面の各低倍
率視野は多数の血管周囲の病変を示した。対照的に、３
匹のヘパリン処理ラットの同じ部分からの８０断面のい
ずれにも病変は見られなかった。硫酸化ポリサッカライ
ドは移行細胞を単に殺すことにより養子ＥＡＥを阻害す
るかどうかを測定するために、処理ラットの能力を試験
し、ＢＰ−ＣＦＡによる挑戦に記憶を示した。本発明者
ら（１６〜１７）および他のもの（１８〜１９）は受動
的に誘導したＥＡＥから回復後、又は新生児のない場
合、細胞移行後最初の病気徴候のない場合、ＰＢ−ＣＦ
Ａによる後者の能動的挑戦はＥＡＥ作働体細胞を受けた
ことのない対照動物に見られるよりはるかに早期の病気
徴候の開始に導くことを報告した。これらのデータの解
釈は早期の開始は動物に残存する記憶細胞の活性化の結
果であり、初めの移行集団から生ずることである。従っ
て第ＸＩ表に示した動物は細胞移行を受けた後１４日に
５０ｇのＰＢ−ＣＦＡにより挑戦された。細胞を受けた
ことのない対照ラットも挑戦された。結果は第ＸＩＩ表
に示す。純真な動物は能動免疫後、１０〜１１日に発病
した。他方細胞受容体は処理養生法又は初めの臨床徴候
の存在又は不存在に拘らず挑戦後記憶応答を示した。こ
うして処理は細胞を殺すことにより養子移入した病気を
抑制しなかった。ヘパリンおよび恐らくは他のポリサッ
カライドは養子移入したＥＡＥに対しこれらの抗凝固剤
活性機能を有することは効果であるか？この疑問に回答
するために、抗凝固性を有しないヘパリンを材料と方法
に記載の過沃素酸酸化とボロハイドライド還元により製
造し、次にそのＥＡＥ阻害活性に対し試験した。第ＸＩ
ＩＩ表で示したように、抗凝固剤を含まぬヘパリンを受
けた動物はＥＡＥを現わした。しかし、発病期に、臨床
的烈しさの低減および病気徴候期間の減少に有意の遅延
があった。これらの結果はヘパリンのＥＡＥ阻害効果が
単にその抗凝固剤活性によるものでないことを強く示唆
する。能動的誘導ＥＡＥに対するヘパリンの効果も試験
し、結果は第ＸＩＶ表に示した。ヘパリン処理が感作時
に始まった場合、発病時に有意の遅延があったが、得た
臨床点数又は病気期間は対照動物と異らなかった。６日
の遅延はポンプがヘパリンを送達するおよその時間の永
さ、７日であることを注目することは興味がある。

【００２７】

【表１０】

【００２８】

【表１１】

【００２９】

【表１２】

【００３０】

【表１３】

【００３１】

【表１４】

【００３２】引用文献 1. BADENOCH-JONES, P. and RAMSHAW, I.A., Aust,
J. Exp. Biol. Med. Sci, ６３，９１−９８（１９８
５）． 2. BRENAN, M., and PARISH, C. R. J. Immunol. Met
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J. Immunol. １２６：１８５７（１９８１）．

【図面の簡単な説明】

【図１】静脈注射したＨ３３３４２標識ＭＡＴ細胞のラ
ット肺内のロッジメントパターンを示す顕微鏡写真であ
る。細胞は塩水のみ（ＡおよびＣ）又は１．６ｍｇヘパ
リン含有塩水（ＢおよびＤ）として注射した。１３７６
２ＭＡＴ細胞ロッジメントパターンは注射後１５分（Ａ
およびＢ）および３６０分（ＣおよびＤ）で示す。倍率
×５５。

【図２】２２時間にわたるラット肺内のＨ３３３４２標
識、１３７６２ＭＡＴ細胞のロッジメント部分に対する
硫酸化ポリサッカライド効果の定量的評価である。試験
１：細胞は塩水のみ（●）又は１．６ｍｇのヘパリン含
有塩水（▲）でｉ．ｖ．注射した。試験２：塩水のみ
（○）又は４ｍｇのコンドロイチン−４−硫酸含有塩水
（△）で静脈注射した。少なくとも３回の反復試験のラ
ットの肺内の蛍光性腫瘍細胞数の平均および標準誤差を
示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スノウデン，ジョン，マッキンノン オーストラリア国6155 ウエスタン オー ストラリア，リーミング，ダンクトン コ ート ４

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヘパリン及びデキストランサルフェート
   を除く、エンドグリコシダーゼ活性を妨害又は阻害する
   少なくとも１種の硫酸化ポリサッカライドと共に、その
   医薬的又は獣医学的に許容しうる担体又は希釈剤とを含
   む、抗炎症治療のための医薬的又は獣医学的組成物。
2. 【請求項２】 硫酸化ポリサッカライドが、ヘパラナー
   ゼ活性を妨害又は阻害するものである、請求項第１項に
   記載の組成物。
3. 【請求項３】 硫酸化ポリサッカライドが、フコイダ
   ン、ペントサンサルフェート及びカラギーナン−ラムダ
   からなる群から選択される、請求項第１項に記載の組成
   物。
4. 【請求項４】 硫酸化ポリサッカライドが、低い抗凝固
   活性を有する修飾ヘパリンである、請求項第１項に記載
   の組成物。
5. 【請求項５】 修飾ヘパリンが、Ｎ−アセチル化ヘパリ
   ン、脱カルボキシル化ヘパリン及び過ヨウ素酸塩で酸化
   され、還元されたヘパリンからなる群から選択される、
   請求項第４項に記載の組成物。