JP2701904B2 - 抗転移活性を有する硫酸化ポリサッカライド - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は抗転移活性を有する化合物に関する。特に、
抗転移剤として動物およびヒトにこれらの化合物を使用
することに関する。

炎症および腫瘍転移における鍵となることの１つは、
白血球又は腫瘍細胞が血管壁に粘着し、次に組織内へ移
ることである。血管壁の浸透は特異的分解酵素による内
皮内の細胞接合点および内皮下のマトリツクスの局部的
崩壊を必要とすることは一般的に認められているが、こ
れらの過程の分子的基礎はよく理解されていない。

ある硫酸化ポリサツカライドは腫瘍細胞転移を阻害で
きることが分つた。これらの硫酸化ポリサツカライド
（ヘパリンなど）のいくつかは抗凝固活性を示すが、抗
転移活性はこれらの抗凝固活性とは無関係で、ポリサツ
カライドは血管壁への腫瘍細胞の付着を阻害せず、血管
壁の浸透を抑止すると思われる。その後の研究は硫酸化
ポリサツカライドが内皮下の細胞外マトリツクス（EC
M）を崩壊し、腫瘍細胞の浸透および通行を可能にする
腫瘍細胞由来のエンドグリコシダーゼを妨害することを
示した。特に、これらの硫酸化ポリサツカライドはECM
のヘパランサルフエート側鎖を分解するヘパランサルフ
エート特異グリコシダーゼ（ヘパラナーゼ）の作用を阻
害することが分つた。

本発明に導く研究はヘパリンおよびフコイダンのよう
な硫酸化ポリサツカライドの連続的注入は、試験的アレ
ルギー性脳脊髄炎（EAE）、ヒトの多発性硬化症と同じ
動物炎症を、完全に予防できることも示した。

第１の面では、本発明は抗転移剤および／又は抗炎症
剤としてある硫酸化ポリサツカライドの使用に関する。
この面では、本発明は動物又はヒトの患者の抗転移およ
び／又は抗炎症治療方法を供する。この方法はエンドグ
リコシダーゼ活性を妨害する少なくとも１種の硫酸化ポ
リサツカライドの有効量を患者に投与することを含む。

別の面では、本発明は抗転移および／又は抗炎症治療
に対する医薬組成物の製造にこれらの硫酸化ポリサツカ
ライドを使用することに関する。この面では、エンドグ
リコシダーゼ活性を妨害する少なくとも１種の硫酸化ポ
リサツカライドを医薬的に許容しうるその担体又は稀釈
剤と一緒に含む医薬組成物が供される。

本発明は特にヘパリナーゼ活性を妨害する硫酸化ポリ
サツカライドの使用に関する。適当な硫酸化ポリサツカ
ライドはヘパリン、フコイダン、ペントサンサルフエー
ト、およびカラギーナン−ラムダを含む。上記のよう
に、エンドグリコシダーゼ阻害活性を示すことがわかつ
た１種の硫酸化ポリサツカライドはヘパリンであり、本
発明の特に好ましい一態様では活性成分はヘパリン、又
はこの抗凝固活性を減少させるために適当に修飾した抗
凝固活性を有する同様の硫酸化ポリサツカライドであ
る。このような修飾ポリサツカライドの例は（ａ）抗凝
固活性で20倍の減少および抗転移活性でほとんどロスの
ない脱力カルボキシル化ヘパリンおよび（ｂ）抗凝固活
性はほとんどないが、有力な抗転移剤である過沃素酸塩
により酸化し、還元したヘパリンである。（ａ）および
（ｂ）の双方共ポリサツカライドのエンドグリコシダー
ゼ阻害活性は保有する。

次例は（ａ）ある種類の硫酸化ポリサツカライドは乳
房腺癌13762MATを抑制できる、（ｂ）硫酸化ポリサツカ
ライドの抗転移活性はこれらの抗凝固活性と相関しな
い、および（ｃ）硫酸化ポリサツカライドは血管内皮に
腫瘍細胞の粘着を抑止しないが、腫瘍細胞が血管壁を通
過することを妨害するらしいことを実証する。

材料および方法 例１ ポリサツカライド ヒアルロン酸（ヒトの臍帯からのGarde III−Ｓ）、
コンドロイチン−４−硫酸（鯨の軟骨からのコンドロイ
チン硫酸タイプＡ）、コンドロイチン−６−硫酸（サメ
軟骨からのコンドロイチン硫酸タイプＣ）、フコイダン
（Fucus vesiculosusから）、ベントサン ポリサルフ
エート、カラギーナン−カツパ（Eucheuma cottoniiか
らのタイプIII）、カラギーナン−ラムダ（Gigartina a
ciculaireおよびGigartina pistillataからのタイプI
V）はすべてSigma Chmical Co.（St.Louis.MO.）から購
入した。ヘパリン（粘膜）はEans Medical Ltd.（Liver
pool,U.K.）から供給を受けた。ヘパリンCSLはCommonwe
alth Serum Laboratories（Melbourne,Australia）から
得た。デキストランサルフエート（2.3サルフエート／
モノサツカライド、MW500,000）はPharmacia Fine Chem
icals（Uppsala,Sweden）から購入し、アルデパロン（L
uitpold Werk,Munich,W.Germany）はDr P.Ghosh,Royal
North Shore Hospital（St.Leonard,Sydney,Australi
a）の寛大な贈物であつた。溶液として購入したヘパリ
ンCSLを除いて、0.15M NaCl溶液に溶解し、大部分の場
合20mg/mlの貯蔵濃度に溶解した。溶液の粘度のために
ヒアルロン酸およびカラギーナンはそれぞれ10mg/mlお
よび2mg/mlの濃度に0.15M NaClに溶解した。すべての
ポリサツカライド溶液は−20゜で貯蔵した。

動物および細胞系 雌のFisher F344近交系ラツトはMedical Researchの
John Curtin Schoolで繁殖させ、これを10週令で使用し
た。

13762MAT細胞系は仔牛胎児血清10％（FCS,Flow Lab
s.）,100ユニツト/mlペニシリン、および100μg/mlスト
レプトマイシンサルフエートを上記のように追加したRP
M11640培地（Gibco）で試験管培養に適応させたFisher
344ラツトの乳房腺癌である（４）。これらの細胞は
高転移性で多数の継代培養にわたつて安定な転移性を示
す。

血液原性転移試験 13762MAT細胞は烈しく振盪して組織培養びんの表面か
ら除き、次に細胞は洗滌し、完全培地に再懸濁した。0.
6ml中の２×10⁵生存細胞はFisher344ラツトの尾の静脈
に注射した。注射後12日に動物を殺し、肺を取り出し、
ブーアン液に固定し、表面転移フオーカス数を測定し
た。この注射経路では転移は肺に限定される。

ソフト寒天平板培養 ソフト寒天の細胞平板培養は本質的にReidの記載のよ
うに行なつた（５）。簡単には、10％仔牛血清を含有す
る1640培地の2mlの0.5％Difco Bacto−寒天から成る下
層を60mmペトリ皿（Sterilin,Teddington Middlesex）
に注ぎ入れ、４゜で１時間固化させた。平板培養する細
胞は1640培地および10％仔牛血清0.33％寒天に懸濁し、
6mlのこの混合物を下層上に注いだ。プレートは最初４
℃に１時間置いて寒天を凝固させ、次に加湿５％CO₂雰
囲気で37゜で14日培養した。コロニーは37゜で７〜10日
後見ることができ、14日に計数できる。

硫酸化ポリサツカライドに対する細胞表面受容体のロゼ
ツテ分析 ロゼツテ分析を96個の穴を有する円底ミクロプレート
（Linbro Chemical Co.）で、以前報告された方法
（３）に基いて行なつた。13762MAT細胞を洗滌し、0.1
％牛血清アルブミン（PBS/BSA）を追加した0.15M NaCl
（pH7）のリン酸塩緩衝液に再懸濁した。氷冷却13762MA
T細胞（１×10⁶/ml、PBS/BSA中）の25μに洗滌した羊
の赤血球又は上記のように（３）CrCl₃を使用して硫酸
化ポリサツカライドと連結した羊赤血球の１％PBS/BSA
サスペンジヨンの25μを添加した。この混合物は１分
/4゜で1,000rpmで遠心分離してペレツトにし、１時間氷
上に置きロゼツテを安定化させた。次にこの細胞ペレツ
トは短かいパスツールピペツトにより穏かに再懸濁し、
メチルバイオレツトにより染色した。50μの0.05％の
メチルバイオレツトを穴に添加する。細胞試料は血球計
室に移し、ロゼツテ形成細胞％を算定した。最少100〜2
00個の腫瘍細胞をロゼツテに対し試験した。６個又はそ
れ以上の付加赤血球を有する腫瘍細胞はロゼツテと見な
した。

13762細胞のヘキスト染料No.33342による標識化 ヘキスト染料No.33342（H33342;Calbiochem−Behrin
g,Kingsgrove,NSW,Anstralia）は４゜で600μg/mlの蒸
留水貯蔵溶液として貯蔵した。標識化に対し、13762MAT
細胞を洗滌し、10％FCSを追加したRPM11640培地に５×1
0⁷細胞/mlの濃度に再懸濁した。細胞は37゜の水浴に移
し、６μg/mlのH33342を添加した。標識化は15分継続
し、その後細胞は冷RPM11640培地により２回洗滌し、注
射用に再懸濁した。

ロツジメント腫瘍細胞の定量化 使用方法はBrenanおよびParishの方法と同じであつた
（２）。200ユニツトのCSLヘパリン（約1.6mg）又は4mg
のコンドロイチン−４−硫酸を含有する0.6mlのRPM1164
0培地の13762MAT細胞（２×10⁶）をラツトに静脈注射し
た。RPM1単独を注射した標識細胞は対照として供した。
注射後の各種時間にラツトを麻酔し、心臓穿刺により採
血し、肺は取り出し、洗滌し、塩水中に置いた。各肺は
次いでPBS中で細切し、組織断片を微細篩に通して穏か
に圧縮することにより単一細胞サスペンジヨンにした。
細胞サスペンジヨンを遠心分離し、PBSで洗滌し、4mlの
PBSに再懸濁した。血球計を使用して各肺内の蛍光性細
胞数を概算した。少なくとも３匹の動物を各時点および
各処理に対し使用した。

抗凝固剤および凝血促進剤の分析 ラツトの血漿を得るために、血液を麻酔ラツトの心臓
穿刺により集めた。ラツト血液の容量を3.8％クエン酸
ナトリウム１容量中に取り出す。赤血球は遠心分離（1
0,000g、４℃）により除き、血漿を集め、使用するまで
−70℃で貯蔵した。

血漿の凝固状態に及ぼす硫酸化ポリサツカライドの効
果は次のように測定した。0.15M NaClに稀釈した100μ
のポリサツカライドを50mlの通常の血漿および50μ
の0.15M NaClと混合し、混合物は37℃で２分間加温し
た。凝固過程を活性化するために、1.5M NaCl中の30NI
Hユニツト/mlの濃度の20μの牛トロンビン（Sigma）
又は20μの活性化「Thrombofax」最高化試薬（活性剤
による部分トロンボプラスチン、Ortho Diagnostic Sys
tem Inc.）を混合物に添加した。次いで100μの30mM
CaCl₂を添加して凝血反応を開始させ、血餅の形成に
要する時間、秒を記録した。これらの値は硫酸化ポリサ
ツカライドが存在しない場合、すなわち100μのポリ
サツカライドを100μの塩水と置換した場合、血漿が
凝血するに要する時間と比較した。凝結時間に対し検知
できない効果を有するポリサツカライドの最高濃度を終
点とした。トロンビン又は「Thrombofax」の添加は表面
接触が凝固段階を活性化する唯一の作因である場合、生
ずる固有過程の不完全な活性化により導入される変動性
を除くために必要であつた。

同様の分析を使用して13762MAT細胞の凝血促進活性に
及ぼす硫酸化ポリサツカライドの効果を測定した。100
μの通常のラツトの血漿に0.15M NaCl中の50μの
ポリサツカライドおよび1640培地（血清を含まず）中の
２×10⁴13762MAT細胞を含有する50μを添加した。２
分37℃で加温後、100μの30mM CaCl₂を添加し、血餅
形成時間（秒）を測定した。凝血段階がポリサツカライ
ドの不存在下に（50μのポリサツカライドを50μの
塩水と置換した）２×10⁴13762MATにより活性化する場
合血漿の凝血時間を対照として供した。対照に対し記録
した上記凝血時間に検知しうる増加を生じないポリサツ
カライドの最高濃度は終点であつた。両分析に対し各ポ
リサツカライド濃度の効果は二重反復試験で測定し、対
照値は少なくとも８つの凝血時間の平均から決定した。

第１図−静脈注射したH33342標識MAT細胞のラツト肺
内のロツジメントパターン。細胞は塩水のみ（Ａおよび
Ｃ）又は1.6mgヘパリン含有塩水（ＢおよびＤ）として
注射した。13762MAT細胞ロツジメントパターンは注射後
15分（ＡおよびＢ）および360分（ＣおよびＤ）で示
す。倍率×55。

第２図−22時間にわたるラツト肺内のH33342標識、13
762MAT細胞のロツジメント部分に対する硫酸化ポリサツ
カライド効果の定量的評価。試験1:細胞は塩水のみ
（●）又は1.6mgのヘパリン含有塩水（▲）でi.v.注射
した。試験2:細胞は塩水のみ（○）又は4mgのコンドロ
イチン−４−硫酸含有塩水（△）で静脈注射した。少な
くとも３回の反復試験のラツトの肺内の蛍光性腫瘍細胞
数の平均および標準誤差を示す。

結果 硫酸化ポリサツカライドによる転移の抑止 硫酸化ポリサツカライドは13762MAT細胞の肺転移数を
変えうるか否かを調査するために次の試験を行なつた。
13762MAT細胞の１個の細胞サスペンジヨンはラツトの尾
静脈に注射直前にRPM11640培地の4mgの硫酸化ポリサツ
カライドと混合した。注射後12日に目で見うる表面肺病
変数を測定した。目で見うる病変数は肺内の全病変数を
表わさないが、転移腫瘍のコロニー化の程度の信頼しう
る評価と見なされる（８）。

ある硫酸化ポリサツカライドは実質的に肺病変数を減
少させることは第Ｉ表から明らかである。ヘパリンはも
つとも有効なポリサツカライドであり、次いでカラギー
ナン−ラムダ、ペントサンサルフエートおよびフコイダ
ンであつた。

硫酸化ポリサツカライドの明白な抗転移効果は腫瘍細
胞に対する直接毒性により生ずる可能性を排除すること
は必要であつた。従つて、13762MAT細胞試料は転移の抑
止が示された各糖の１つと37゜で１時間培養した。イン
キユベーシヨン後細胞は洗滌し、ソフト寒天に平板培養
した。細胞および糖濃度はラツトの注射に使用したもの
と同じ、すなわちカラギーナンの場合3.3×10⁵細胞/6.6
mg糖/ml又は3.3×10⁵細胞/3.3mg糖/mlであつた。RPM116
40培地単独に培養した細胞は対照として供した。腫瘍細
胞の生存能力に及ぼす糖の効果は平面培養後14日に生存
細胞コロニー数から評価した。デキストランサルフエー
トは13762MAT細胞コロニー（第II表）の大きさ又は数を
減少させることがわかつた唯一の糖であつた。他の糖は
試験管内で腫瘍細胞の生存能力に対し検知しうる効果を
有しない。

デキストランサルフエートを除いて、これは転移数の
減少がいくつかのポリサツカライドの試験管内の作用の
結果であることを示唆する。この解釈の妥当性を決定す
るためにヘパリンを静脈注射腫瘍細胞と無関係に投与し
た。腹腔内、皮下又は別の尾静脈経由によるヘパリン注
射経路は結果を変更しないことが分つた。それぞれの場
合対照の10％より少ない転移数に減少を続け（データは
示さない）、こうしてヘパリンは少なくとも生体内で作
用して転移数を減少させることが確証される。

13762MAT細胞の硫酸化ポリサツカライドに対する受容体
の検出 硫酸化ポリサツカライドは内皮細胞の細胞外マトリツ
クスの主要成分を構成する。従つて13762MAT細胞はこれ
らの分子に対する受容体により肺内皮に付着することが
できる。13762MAT細胞の方面と連合した分子が硫酸化ポ
リサツカライドを結合するかどうかを決定するためにロ
ゼツテ分析を使用した。

多種の起源からの硫酸化ポリサツカライドは羊赤血球
の表面に連結し、これらの赤血球が13762MAT細胞に付着
する能力を評価した。未連結羊赤血球は対照として供し
た。グリコサミノグリカン（GAG）、コンドロイチン−
４−硫酸およびコンドロイチン−６−硫酸と連結した赤
血球は13762MAT細胞の表面に強く結合し、一方ヒアルロ
ン酸（非硫酸塩化GAG）と連結した赤血球は適度に結合
した。77％の13762MAT細胞はロゼツテとして分類される
（第III表）。対照的にアルテパロン（牛の肺からの人
為的に過度硫酸塩化GAG）およびヘパリン−連結赤血球
は13762MAT細胞にきわめて弱く結合した。同様の選択的
付着パターンを硫酸化ポリサツカライドと連結した非−
哺乳動物起源からの赤血球に対し13762MAT細胞が示し
た。カラギーナンカツパおよびラムダは13762MAT細胞は
非常に強く結合するが、これら細胞の再区分集団（約32
％）は一貫してカラギーナンラムダを結合しない。ペン
トサンサルフエート−連結赤血球の結合は検出できなか
つた。13762MAT細胞の再区分集団（約50％）はデキスト
ランサルフエート−連結赤血球にむしろ弱く結合した。

13762MAT細胞が示す結合パターンの選択性は結合が単
にポリサツカライドのアニオン性に基づくものでないこ
とを示す。例えば、腫瘍細胞はコンドロイチン硫酸と強
く反応し、尚はるかに高い荷電密度を有するヘパリンGA
Gを結合しない。同様にヒアルロン酸、比較的低荷電密
度を有する分子は13762MAT細胞に非常に強く付着するこ
とが分つた。従つて、13762MAT細胞は特別の硫酸化ポリ
サツカライドを結合する表面連合分子（受容体）を有す
ることが結論できる。しかし糖の抗転移性および腫瘍細
胞表面に結合するこれらの能力間に正の相関はなかつた
（第Ｉ表および第III表）。実際に、カラジーナンラム
ダを除いて、負の相関は明らかであつた。これは大部分
の硫酸化ポリサツカライドの抗転移活性は13762MAT細胞
表面の硫酸化ポリサツカライドの特異的受容体の遮断に
よるものではないことを示唆する。

硫酸化ポリサツカライドの抗凝固活性 13762MAT細胞は試験管内で凝血促進活性を示すことが
知られる（１）。ある性質はこれらの細胞が器官の微少
循環系で捕集されるようになる確率を増加することによ
り腫瘍細胞の転移能力に寄与すると信じられる（６）。
抗転移剤としてもつとも有効な糖は、全く低濃度で1376
2MAT細胞の抗凝固剤活性を示し、凝血促進活性を阻害す
る双方を示すことが分つた（第IV表）。それにも拘ら
ず、抗転移活性および抗凝固活性間の相関は絶対的では
ないことは注目すべきである。例えば、デキストランサ
ルフエートはカラギーナンラムダと同じ低さの１〜0.5
μg/mlの濃度で血漿の凝固を抑止した（第IV表）が、尚
カラギーナンラムダはデキストランサルフエートより転
移の抑止に実質的に一層有効であつた（第Ｉ表）。さら
に、デキストランサルフエートは13762MAT細胞の生存能
力を損なうことが分つた（第II表）、こうしてこの糖に
より観察された転移の50％減少はその毒性のは反映であ
ることは事実のようである。ペントサンサルフエートお
よびアルテパロンは抗凝固活性分析で同様に同一の終点
を示したが、抗転移剤としてのそれらの効力は有意に異
なつた。抗凝固剤および凝血促進剤分析は、糖濃度の狭
い範囲が対照と同一の一定凝固時間から無凝固状態に血
漿を変え得るので正確な終点を示すことは注目する価値
がある（データは示さず）。

肺内の腫瘍細胞のアレストに対する硫酸化ポリサツカラ
イドの効果 転移を減少させる硫酸化ポリサツカライドは腫瘍細胞
が肺内皮にアレストおよび／又は付着することを妨害で
きるか、又は転移過程の後期段階で作用するか？この疑
問を調査するために蛍光染料（H33342）により標識した
13762MAT細胞の肺におけるアレストに対するヘパリンお
よびフコイダンの効果を測定した。この染料は以前にリ
ンパ球の再循環を追跡するために使用し、毒性もない
し、細胞表面を修飾もしないことが報告される（２）。
蛍光標識した13762MAT細胞（２×10⁶）は塩水又はフコ
イダン（4mg）を含み又はヘパリン（4mgおよび1.6mg）
を添加して静脈注射した。注射後15,90又は360分にラツ
トは心臓穿刺により採血し、次いで殺し、肺を取り出し
た。洗滌後肺は20時間室温で５％中性ホルマリン中で固
定した。固定組織の手による断片は低倍率（100×）蛍
光顕微鏡検査を使用して試験した。すべての場合、細胞
は肺葉中に拡がつた斑点状分布を示し（第1aおよびｂ
図）、および15分後アレスト細胞数の定性的差異は検知
できなかつた。しかし、注射後６時間の肺に見ることが
できる細胞数は、ヘパリン又はフコイダンを投与した場
合実質的に下向した（第1cおよびｄ図）。

次の試験では肺の13762MAT細胞のアレストおよびロツ
ジメントに及ぼす硫酸化ポリサツカライドの効果を22時
間にわたつて定量化し。H33342により標識した腫瘍細胞
に糖、ヘパリン（1.6mg）又はコンドロイチン−４−硫
酸（4mg）、又はRPMI1640単独で注射し、特定時（第２
図）に肺に残留する標識細胞数を評価した。各時点で採
取した血液試料から製造した血漿はラツトの抗凝固剤状
態を監視するために使用した。1.6mgのヘパリンは動物
を有意に抗凝固性にし、３〜５時腫瘍細胞の凝血促進活
性を抑制した。ヘパリン注射後５時間でラツトから採取
した血漿は通常の血漿と区別できる凝血パターンを示し
た。コンドロイチン−４−硫酸はラツトの凝血状態に全
く効果がなかつた。

本試験の結果は定性的評価を確証した。ヘパリンは腫
瘍細胞の初めのアレストを妨害しなかつたが、22時間後
に初めにアレストされた細胞の38％のみしか検出できな
い程これらの細胞は肺から削減する割合を増加した。対
照的に、抗凝固活性および抗転移活性を有しない糖であ
るコンドロイチン−４−硫酸は肺に腫瘍細胞を保留する
効果を全く有しなかつた（第２図）。ヘパリンおよびフ
コイダンの双方により観察された肺からの細胞の移動
は、こうして単に硫酸化ポリサツカライドそれ自体の導
入によるものではなく、一層特異的であると思われる。
細胞の移動は糖の抗凝血活性によるかどうかは明らかで
はない。しかし、データはヘパリンおよびフコイダンが
凝血促進活性の有力な阻害剤であるので、13762MAT細胞
の凝血促進活性は腫瘍細胞アレストの初めの段階に対し
ほとんど影響を有しないことを示唆する（第IV表）。

抗転移活性に及ぼすヘパリン投与時期の効果 肺に残留する13762MAT細胞数に対するヘパリンの効果
は注射数１〜２時間で最初に明らかになつた（第２
図）。ヘパリンは細胞が肺毛細管に留まつた後で、脈管
内皮の浸透前に転移過程を妨害すると論じることができ
よう。転移を妨害するもつとも有効なヘパリン投与時期
を決定するために、ヘパリンは腫瘍細胞および肺病変部
の形成数の記録前又は後に与えた。

ヘパリンは、腫瘍細胞の静脈注射直後、異なる尾の静
脈に注射する場合転移の形成を有効に抑制した。しか
し、約70％の転移抑制は腫瘍細胞１時間前又は３時間後
までにヘパリンを与えた場合尚達成できる（第Ｖ表）。
上記のようにラツトはヘパリン注射後３時間有意に抗凝
血性であつたが、６時間後これらの凝血状態は塩水注射
対照ものに戻つた（データは示さず）。

ヘパリンの抗転移効果および抗凝血効果の分離 上記データから抗凝固性は硫酸化ポリサツカライドの
抗転移効果に対する完全な説明ではないことは明らかで
ある。硫酸化ポリサツカライドの市販製剤は分子の不均
質セツトから成り、同じポリサツカライドの異なる製剤
は分子の僅かに異るセツトを有する。従つて、ヘパリン
バツチは抗転移剤としてその効力は変化するが、尚同じ
抗凝固性を有することができる。これは事実であること
が分つた。２つの異なる起源からのヘパリン製剤は同一
の抗凝固性を有するが、これらの抗転移能力は約10倍異
つた（第VI表）。50％だけ肺転移数を低下するのに必要
なEvans Medical LtdのヘパリンおよびCSLヘパリン量は
それぞれ0.53mgおよび0.06mgであつた。これらの結果は
抗転移効果が少なくとも一部抗凝固性に対し必要とする
ものとは別個の何かの成分によることを示す。

13762MAT細胞は寒天に添加し、平板培養前に1640培地
のポリサツカライド（カラギーナンカツパおよびラムダ
では3.3mg/ml、他では6.6mg/ml）中で37゜で１時間イン
キユベートした。４つの反復平板培地を各糖に対し調製
した。

次例は硫酸化ポリサツカライドが腫瘍細胞由来のエン
ドグリコシダーゼを阻害することにより腫瘍の転移を抑
制することを実証する。

例 ２ 第VII表は異る硫酸化ポリサツカライドのエンドグリ
コシダーゼ阻害活性および腫瘍転移を抑制するこれらの
能力間に相関があることを実証するエンドグリコシダー
ゼ阻害試験からの結果を示す。抗転移活性を示す５種の
ポリサツカライドは腫瘍細胞由来のエンドグリコシダー
ゼの匹敵する阻害剤であつた。対照的に、腫瘍転移を抑
制できなかつた４種のポリサツカライドのうち、３種は
検知できるエンドグリコシダーゼ阻害活性を有せず、１
種のポリサツカライド（カラギーナン−カツパ）は抗転
移ポリサツカライドとして腫瘍エンドグリコシダーゼの
阻害で約７〜４倍有効性が低かつた。

上記例１記載の試験は硫酸化ポリサツカライドの抗凝
固活性がこれらの抗転移活性にほとんど又は全く役割を
演じないことを示唆するが、これは真に実際である一層
直接的証拠を得ることは重要であつた。第VIII表はヘパ
リンを抗−トロンビンIIIカラム（ヘパリンは血漿の抗
−トロンビンIIIと相互作用することにより抗凝固活性
を働かせる）を通すことにより抗凝固剤の豊富な画分お
よび抗凝固剤の消耗した画分に分離した試験の結果を示
す。この試験で使用したヘパリン製剤の約40％は抗−ト
ロンビンIIIカラムに結合し、2M NaClにより溶離した
（高親和性ヘパリンと称する）。抗−トロンビンIIIに
対し高および低親和性を有するヘパリン画分は同一のエ
ンドグリコシダーゼ阻害活性、ほとんど同一の抗転移活
性（分画しないヘパリンに匹敵する）を有するが、これ
らの抗凝固活性が約300〜500倍少ないことで異ることが
わかつた。これらの結果はヘパリンの抗凝固活性がポリ
サツカライドの抗転移性にほとんど又は全く役割を演じ
ないことを明白に示す。

付加的試験で、ポリサツカライドの抗凝固活性は破壊
するが、分子の抗転移活性は保有するように化学的にヘ
パリンを修飾する試験を行なつた。このような処理は
（ｉ）抗転移および抗炎症薬品として臨床的に使用する
場合ヘパリンの望ましくない抗凝固性を排除し、（ii）
抗−トロンビンIII画分と異なつて、有効な薬品を製造
する商業的に育成できるアプローチを供する。２つの化
学的に修飾した実際に抗凝固活性を欠くヘパリン製剤に
より得た結果は第IX表に示す。両製剤は実質的抗転移活
性を示したが、これらは未修飾ヘパリンおよび効果が少
なかつた。

化学的に修飾したヘパリンの製造 ヘパリンは過沃素酸塩により酸化しFranssonの方法に
基づいてボロハイドライドにより還元した（９）。40mM
過沃素酸ナトリウムを含有する50mMリン酸ナトリウム緩
衝液中のヘパリン（10mg/ml、牛肺）は37℃で20時間、
暗所でインキユベートした。反応はＤ−マンニトール
（5mg/ml）の添加により停止させた。低分子量反応生成
物は蒸留水に対し透析することにより除去した。次に酸
化ヘパリンは20mg/mlのKBH₄の添加および20℃で３時間
インキユベーシヨンすることにより還元した。過剰のボ
ロハイドライドは20μ/mlの氷酢酸の添加により分解
した。酸化し、還元したヘパリンを２容のエタノールの
添加により４℃で２回沈澱させ、最後に0.15M NaClに
再溶解した。

Ｎ−脱硫酸塩化ヘパリンは100℃で90分0.04M HCl中
で材料を加熱することにより製造した。Ｎ−アセチル化
ヘパリンは上記のようにＮ−脱硫酸化ヘパリンを無水酢
酸により処理することにより得た（10）。

次例は硫酸化ポリサツカライド、ヘパリン、フコイダ
ンおよびペントサンサルフエートの抗炎症活性を実証す
る。

例 ３ 材料および方法 ラツト、ルイス（RT−1¹）ラツトをMedical Research
のJohn Curtin Schoolで繁殖させた。８〜10の週令の雄
および雌の双方を使用した。各試験において対照および
試験ラツトは交配した。

EAEの誘導 能動。モルモツトBPをDeiblerら（11）の方法に従つ
て製造し、塩水中のBPは4mg/ml添加Mycobacterium but
yricumを含有する不完全フロインド補助液の等容量に乳
化した。ラツトの両後肢の１つの内趾に0.1mlエマルジ
ヨンを与えた。与えた全用量は50μg/BPおよび400μg M
ycobacterium butyricumであつた。

受動。受動的移入に対する細胞はPanitchおよびMcFar
linの方法に従つて産生した。単一細胞のサスペンジヨ
ンは上記のようにBP−CFAにより12日前に感作した供給
体ラツトの脾臓から調製した。細胞はRPM1 1640＋５％
仔牛胎児血清、５×10^-5M2−メルカプトエタノール、20
0mM Ｌ−グルタミンおよびペニシリンおよびストレプ
トマイシンに２×10⁶/mlで培養した。ConAは２μg/mlで
添加し、カルチヤーは10％CO₂、７％O₂およびバランスN
₂の雰囲気で37℃でインキユベートした。細胞は72時間
後に採取し、Hanksのバランス化塩溶液（BSS）により洗
浄し、尾の側方静脈を経て受容体に移した。すべての移
行菌数は３×10⁶生存細胞を含有した。

臨床EAEの評価 臨床EAEは次の案に従つて格付けした。０、無症候性;
1、尾の末端半分の弛緩性;2、尾全体の弛緩性;3は運動
失調症、正向の困難性;4、後肢の弱さ;5、後肢の麻痺。

大部分の試験で病気初期の平均日（MDO）、平均臨床
点数（MCS）および病気の平均的永さ又は期間（MLD）を
計算した。値は平均の標準誤差を表わした。

組織学 ラツトは10％中性緩衝ホルマリンにより潅流した。こ
れらの背髄を取り出し、標準組織学技術により調製し
た。スライドはＨおよびＥにより染色した。

ポリサツカライド コンドロイチン−４−硫酸、フコイダン（Fucus vesi
culosusから）、ペントサンポリサルフエートおよびヘ
パリン（牛肺からのナトリウム塩）はすべてSigma（St.
Louis,MO）から購入した。ポリサツカライドは0.15M N
aClに溶解し、−20℃で貯蔵した。これらは解凍し、次
に使用直前に２分煮沸した。

抗凝固活性を欠くヘパリンはFransson記載と同じ方法
を使用して過沃素酸塩による酸化およびボロハイドレー
トによる還元により製造した（９）。牛肺ヘパリン（10
mg/ml）は40mM過沃素酸ナトリウムを含有する0.05Mリン
酸ナトリウム緩衝液、pH7.0に溶解し、37℃で18時間暗
所に放置し反応させた。反応は固体Ｄ−マンニトール
（5mg/ml）を添加して停止させ、次に溶液は室温で２時
間蒸留水に対し透析した。透析物は30分毎に変える。次
にオキシヘパリンは固体ポタシウムボロハイドライド
（2mg/mlヘパリン）を添加して還元した。還元反応は室
温で３時間放置し、次に氷酢酸（μ/mgのボロハイド
ライド）を添加して終結させた。次にヘパリンはエタノ
ールにより２回沈澱させ（２容エタノール、４℃,18時
間）、最後に20mg/mlの濃度に0.15M NaClに溶解した。
約50％のヘパリンは過沃素塩酸化、ボロハイドライド還
元製剤として回収した。

ヘパリンおよび過沃素酸塩酸化ヘパリンの抗凝固剤活
性を活性化部分トロンボプラスチン時間およびトロンビ
ン時間試験ラツト血漿を使用して測定した。これらの分
析基準で過沃素酸塩酸化はヘパリンの抗凝固剤活性の50
0〜2000倍減少の結果となつた。

硫酸化ポリサツカライドの受渡し 生体内のいくつかのポリサツカライドの短かい半減期
のために、用量の反復投与が必要であると考えた。最初
に12時間毎にヘパリンのip注射を試みた。不幸なこと
に、これは許容しえない出血レベルおよびいくつかの動
物の死亡さえ生じた。従つて、ミニ浸透圧ポンプ（タイ
プ2ML、ALZA Coop.,Palo Alto,Calif）を使用すること
を選択し、これは背の皮下に移植した。ポンプは2ml能
力を有し、７日間約10μ／時間を送る。ヘパリンの血
漿レベルは20mg/mlを含有する浸透圧ポンプを移植した
ラツトで測定した。使用方法は本質的にFarndaleらのジ
メチルメチレンブルー方法であつた（13）。10〜20μg/
mlの恒常状態濃度はポンプ移植零日後24時間までに達
し、ヘパリンは８日目、すなわちポンプが送ることを中
止した後24時間で検出できなかつた。

結果 受容体ラツトは30×10⁶EAE作動体細胞を受け、同時に
浸透圧ポンプは背の皮下に入れた。ポンプは10mg/ml又
は20mg/mlで2mlのヘパリンを含有した。第Ｘ表に示すよ
うに、両ヘパリン処理群にある程度の保護があつた。10
mg/mlのヘパリンを受ける６匹のうち３匹のみが発病
し、20mg/mlを受ける５匹のうち１匹のみが発病した。
後者の場合、発病しなかつた１匹の動物は細胞の移行後
それ程遅くなく、又おだやかな病気を示した。

次の試験では、ヘパリンおよび３種の別の硫酸塩化ポ
リサツカライド、フコイダン、コンドロイチン−４−硫
酸およびペントサンサルフエートを使用し、処理の開始
が３日遅れても尚保護を供するかどうかを求めた。フコ
イダンおよびヘパリンは処理が細胞移行後３日まで遅れ
た場合でさえEAEに対し完全な保護を与えた（第XI
表）。ペントサンサルフエートは発病の遅れ、おだやか
な臨床病、および一層短期間の病気により証明されるよ
うに部分保護を与えた。コンドロイチン−４−硫酸は全
く保護効果を有しなかつた。

しばしば、EAEの各種薬剤による治療研究は臨床病が
阻害され、それでも尚組織病理学試験は全く広汎な炎症
病変を現わすことを実証する（14,15）。本発明に関し
これを試験するために、第XI表記載の試験から３匹の対
照および３匹のヘパリンと処理動物を細胞移行後８日に
殺し、炎症病変に対し試験した。実際に対照ラツトの下
部胸部／上部腰部帯を経た2cmの縦断面の各低倍率視野
は多数の血管周囲の病変を示した。

対照的に、３匹のヘパリン処理ラツトの同じ部分から
の80断面のいずれかも病変は見られなかつた。

硫酸化ポリサツカライドは移行細胞を単に殺すことに
より養子EAEを阻害するかどうかを測定するために、処
理ラツトの能力を試験し、BP−CFAによる挑戦に記憶を
示した。本発明者ら（16〜17）および他の者（18〜19）
は受動的に誘導したEAEから回復後、又は新生児のない
場合、細胞移行後最初の病気徴候のない場合、PB−CFA
により後者の能動的挑戦はEAE作働体細胞を受けたこと
のない対照動物に見られるよりはるかに早期の病気徴候
の開始に導くことを報告した。これらのデータの解釈は
早期の開始は動物の残存する記憶細胞の活性化の結果で
あり、初めの移行集団から生ずることである。従つて第
XI表に示した動物は細胞移行を受けた後14日に50gのPB
−CFAにより挑戦された。細胞を受けたことのない対照
ラツトも挑戦された。結果は第XII表に示す。純真な動
物は能動免疫後、10〜11日に発病した。他方細胞受容体
は処理養生法又は初めの臨床徴候の存在又は不存在に拘
らず挑戦後記憶応答を示した。こうして処理は細胞を殺
すことにより養子移入した病気を抑制しなかつた。

ヘパリンおよび恐らくは他のポリサツカライドは養子
移入したEAEに対しこれらの抗凝固剤活性機能を有する
ことは効果であるか？この疑問に回答するために、抗凝
固性を有しないヘパリンを材料と方法に記載の過沃素酸
酸化とボロハイドライド還元により製造し、次にそのEA
E阻害活性に対し試験した。第XIII表で示したように、
抗凝固剤を含まぬヘパリンを受けた動物はEAEを現わし
た。しかし、発病期に、臨床的烈しさの低減および病気
徴候期間の減少に有意の遅延があつた。これらの結果は
ヘパリンのEAE阻害効果が単にその抗凝固剤活性による
ものでないことを強く示唆する。

能動的誘導EAEに対するヘパリンの効果も試験し、結
果は第XIV表に示した。ヘパリン処理が感作時に始まつ
た場合、発病時に有意の遅延があつたが、得た臨床点数
又は病気期間は対照動物と異らなかつた。６日の遅延は
ポンプがヘパリンを送達するおよその時間の永さ、７日
であることを注目することは興味がある。

引用文献 1. BADENOCH−JONES,P.and RAMSHAW,I.A., Aust, J.E
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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スノウデン，ジョン，マッキンノン オーストラリア国6155 ウエスタン オ ーストラリア，リーミング，ダンクトン コート ４ (56)参考文献 特開 昭63−88128（ＪＰ，Ａ) 国際公開86／6729（ＷＯ，Ａ１)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】抗−トロンビンIIIに対し低い親和性を有
   するヘパリン画分及び過ヨウ素酸塩で酸化され、還元さ
   れたヘパリンから選択される、エンドグリコシダーゼ活
   性を妨害又は阻害する少なくとも１種の硫酸化ポリサッ
   カライドと共に、その医薬的又は獣医学的に許容しうる
   担体又は希釈剤とを含む、抗転移治療のための医薬的又
   は獣医学的組成物。
2. 【請求項２】硫酸化ポリサッカライドが過ヨウ素酸塩で
   酸化され、還元されたヘパリンである、請求項第１項に
   記載の組成物。