JP2014030423A - 脂肪組織由来体性幹細胞の製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、脂肪組織由来体性幹細胞の製造方法であって、固体相に付着した脂肪組織由来の細胞を、固体相から剥離しやすい細胞と固体相から剥離しにくい細胞とに分離し、分離した剥離しやすい細胞を低酸素培養する工程を含むことを特徴とする、製造方法を提供する。
【選択図】なし
Description
ヒト腹部より吸引法にて脂肪組織を摘出した。脂肪組織は細かく刻んだ後、0.075%コラゲナーゼタイプI(Sigma Aldrich,St.Louis,MO)を含む、ハンクス緩衝溶液(HBSS,GIBCO Invitrogen,Grand Island,NY)中で37℃1時間インキュベートし、細胞を分散させた。分散させた細胞はセルストレーナー(BD Bioscience,San Jose,CA)を用いてフィルターにかけ、800g、10分間遠心し、細胞を得た。細胞に含まれる赤血球は、Gymphoprep(d=1.077;Nycomed,Oslo,Norway)を用いて密度勾配遠心をして取り除いた。残りの細胞を、10%ウシ血清(FBS,GIBCO Invitrogen)含有ダルベッコ改変イーグル培地(Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM)(GIBO Invitrogen))でCO2インキュベータ中37℃、24時間培養した。24時間後、接着した細胞を0.2g/Lのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)溶液(ナカライテスク、京都、日本)で処理し、浮遊してきた細胞を1×インシュリン−トランスフェリン−セレニウム(ITS,GIBCO Invitrogen)、1nMデキサメタゾン(Sigma−Aldrich)、100μMアスコルビン酸−2−リン酸塩(Sigma−Aldrich)、10ng/mL上皮成長因子(EGF,Peprotech,Rocky Hill,NJ)、および5%胎児ウシ血清(Gibco Invitrogen)を含有するStem Cell Medium(ニプロ、大阪、日本)に懸濁し、ヒトフィブロネクチンコートディッシュ(AGC、東京、日本)上に10,000細胞/cm2の密度で播種し、培養を行った。培養はチャンバー内をProOx110(協同インターナショナル、東京、日本)を用いて5%二酸化炭素、5%酸素濃度に設定し、37℃で行った(低酸素培養)。培地は2日おきに交換し、セミコンフルエント(細胞密度が80〜90%程度)な状態で継代を行った。酸素濃度を5%の代わりに20%とした他は同様のものを比較対照として用いた(通常培養)。
Click−iT EdU Proliferation Flow Cytometry Kit(Invitrogen)を用いて、実施例1で製造された5日目の細胞集団のうち、S期にある細胞の割合を調べた。
結果をグラフとして図2に示す。図2に示されるように、低酸素培養の場合には、S期にある細胞の比率が高く、DNA複製能が亢進していることがわかる。
実施例1で製造された継代培養8回後の細胞集団について、1.7μM インスリン、2.5μM デキサメタゾン、0.5mM IBMX(Isobutylmethylxanthine)を含有する脂肪分化誘導培地の添加によって脂肪組織への分化を誘導し、オイルレッドO染色を行った。また、脂肪組織への分化誘導率を比色定量法によって計測した。
染色後の細胞集団の代表的な写真を、図3の左図に示し、脂肪組織への分化誘導率を、グラフとして図4に示す。図3の左図および図4に示されるように、低酸素培養の場合には、染色された細胞の割合が高く、通常培養の場合に比して、油滴形成能を持つ脂肪組織への分化効率が高いことがわかる。
実施例1で製造された継代培養8回後の細胞集団について、0.1μM デキサメタゾン、50mg/mL L−アスコルビン酸、10mM βグリセロリン酸を含有する骨分化培地の添加によって骨組織への分化を誘導し、アリザリンレッド染色を行った。
染色後の細胞集団の代表的な写真を、図3の右図に示す。図3の右図に示すように、低酸素培養の場合には、染色された細胞の割合が高く、通常培養の場合に比して、骨組織への分化効率が高いことがわかる。
実施例1で製造された12日目の細胞集団について、Neural Differentiation Medium(Hyclone Fisher Scientific, MA, USA)によって神経組織への分化を誘導し、βIIIチューブリン、NF200、およびDAPIを用いて染色を行った。
染色した細胞の代表的な写真を、図5に示す。図5に示すように、低酸素培養条件下で製造された実施例1の細胞集団は、神経細胞への分化能を有していることがわかる。
酸素濃度を代えたほかは実施例1と同様の実験を行い、ヒト脂肪由来体性幹細胞を増殖させた。増殖曲線を図6に示す。図6の増殖曲線における12日目の倍加時間を図7に示す。また、5日目の細胞におけるHIF1αタンパク質の発現量を、抗ヒトHIF1αマウスモノクローナル抗体(BD Bioscience)を用いてウェスタンブロッティング法によって調べた。発現量の結果を図8に示す。
図7に示すように、5%から2%に酸素濃度が低下するにつれて、倍加時間が長くなっている。また、図8に示すように、5%から2%に酸素濃度が低下するにつれて、HIF1αタンパク質の発現量が増大している。そして、HIF1αタンパク質の発現量の増大傾向と、倍加時間の増大傾向は、類似している。
このように、増殖度の高さは、HIF1αタンパク質の発現量の低さと相関関係があった。このことから、細胞内における低酸素誘導因子の発現量が所定の値を超えないことを指標として酸素濃度を設定することによって、細胞の増殖度が高い培養条件に設定することができることが分かる。
Claims (6)
- 脂肪組織由来体性幹細胞の製造方法であって、固体相に付着した脂肪組織由来の細胞を、固体相から剥離しやすい細胞と固体相から剥離しにくい細胞とに分離し、分離した剥離しやすい細胞を低酸素培養する工程を含むことを特徴とする、製造方法。
- 細胞内における低酸素誘導因子の発現量が所定の値を超えないことを指標として、低酸素培養の条件が設定される、請求項1に記載の製造方法。
- 固体相から剥離しやすい細胞と固体相から剥離しにくい細胞との分離が、脂肪組織由来の細胞が付着した固体相に細胞剥離剤を添加して、付着した細胞を部分的に剥離させ、剥離した細胞を取得することによって行われる、請求項1または2に記載の製造方法。
- 細胞剥離剤が、EDTAを含む、請求項3に記載の製造方法。
- 固体相に付着した脂肪組織由来の細胞が、脂肪組織から赤血球を除く工程を含む方法によって得られたものである、請求項1〜4のいずれか1項に記載の製造方法。
- 請求項1〜5のいずれか1項に記載の製造方法によって製造された脂肪由来体性幹細胞。
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