CN107429295A

CN107429295A - 通过检测微小RNA(miRNA)的表达水平来确定患乳腺癌的风险的方法

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Publication number: CN107429295A
Application number: CN201680014611.9A
Authority: CN
Inventors: 朱兴奋; 周砺寒; 邹瑞阳
Original assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Current assignee: Agency for Science Technology and Research Singapore
Priority date: 2015-03-09
Filing date: 2016-03-09
Publication date: 2017-12-01
Anticipated expiration: 2036-03-09
Also published as: EP3268494B1; CN116064801A; EP3916106A1; SG10201908277TA; CN107429295B; ES2882104T3; CN116064800A; US20180230544A1; WO2016144265A1; HK1249555A1; SG11201707325RA; EP3268494A4; EP3268494A1

Abstract

本公开描述了确定受试者患乳腺癌的风险或确定受试者是否患有乳腺癌的方法。所述方法可以包括检测从所述受试者获得的体液样品中微小RNA(miRNA)hsa‑miR‑186‑5p(SEQ ID NO:77)和/或hsa‑miR‑409‑3p(SEQ ID NO:178)的表达水平；以及确定它与对照相比是上调还是下调，其中hsa‑miR‑186‑5p(SEQ ID NO:77)上调和/或hsa‑miR‑409‑3p(SEQ ID NO:178)下调表示所述受试者患有乳腺癌或有患乳腺癌的风险。还涵盖了乳腺癌的预后或诊断的方法，所述方法是通过检测miRNA的组合的表达水平以及使用基于一组miRNA标志物的分数来实现的。

Description

通过检测微小RNA(miRNA)的表达水平来确定患乳腺癌的风险的方法

对相关申请的交叉引用

本申请要求2015年3月9日提交的SG临时申请号1201501781W的优先权益，该SG临时申请的内容在此以引用的方式整体并入本文用于所有目的。

技术领域

本发明大体上涉及分子生物学领域。具体来说，本发明涉及使用生物标志物检测和诊断癌症。

背景技术

尽管在癌症筛查方面有所改进，但是乳腺癌仍是全世界最常见的困扰女性的癌症。目前，用于乳腺癌筛查的最广泛使用的方法是乳房X线照相术，灵敏度从71％到96％不等并且特异性在94％至97％的范围内，但是在较年轻的女性中灵敏度较低。假阳性乳房X线照片是乳腺癌筛查程序中常见的事件，这造成不必要的另外的乳腺成像和活检，并且对许多女性造成心理困扰。乳腺癌的诊断主要依赖于对组织活检的组织学检查、或对细针抽吸物(FNA)的细胞学检查。一种有吸引力的替代方案是使用基于血液的测试。迄今为止，血清肿瘤标志物，如CA15.3或BR27.29具有低灵敏度，并且因此不用于乳腺癌检测。因此，需要微创方法来改进对乳腺癌的检测和早期诊断。

发明内容

在一个方面，本发明涉及一种确定受试者患乳腺癌的风险或确定受试者是否患有乳腺癌的方法，所述方法包括检测从所述受试者获得的体液样品中hsa-miR-186-5p(SEQID NO:77)和/或hsa-miR-409-3p(SEQ ID NO:178)的表达水平；以及确定它与对照相比是上调还是下调，其中hsa-miR-186-5p(SEQ ID NO:77)上调和/或hsa-miR-409-3p(SEQ IDNO:178)下调表示所述受试者患有乳腺癌或有患乳腺癌的风险。

在另一个方面，本发明涉及一种确定受试者患乳腺癌的风险或确定受试者是否患有乳腺癌的方法，所述方法包括以下步骤：检测从所述受试者获得的体液样品中miRNA的存在；测量所述体液样品中列于表14中的至少两种miRNA的表达水平；以及使用基于先前所测量的miRNA的表达水平的分数来预测所述受试者患有或具有乳腺癌的可能性，其中所述列于表14中的miRNA之一是hsa-miR-409-3p(SEQ ID NO:178)、hsa-miR-382-5p(SEQ ID NO:177)、hsa-miR-375(SEQ ID NO:173)、或hsa-miR-23a-3p(SEQ ID NO:112)并且其中与对照相比，所述hsa-miR-409-3p(SEQ ID NO:178)、hsa-miR-382-5p(SEQ ID NO:177)、hsa-miR-375(SEQ ID NO:173)、或hsa-miR-23a-3p(SEQ ID NO:112)在所述受试者中下调。

在又一个方面，本发明涉及一种确定受试者患乳腺癌的风险或确定受试者是否患有乳腺癌的方法，所述方法包括以下步骤：检测从所述受试者获得的体液样品中miRNA的存在；测量所述体液样品中列于表13中的至少一种miRNA的表达水平；以及使用基于先前所测量的miRNA的表达水平的分数来预测所述受试者患有或具有乳腺癌的可能性。

附图说明

在结合非限制性实施例和附图考虑时，通过参考详细说明将更好地理解本发明，其中：

图1示出了由本文所述的研究所鉴定的miRNA的数目的示意性汇总。关于如何确立结果的详细说明提供于本公开中。C：对照(无癌症(正常)受试者)；BC：所有乳腺癌受试者；LA：管腔A亚型；HER：Her2亚型；TN：三阴性亚型。

图2示出了高通量miRNA RT-qPCR测量工作流程的过程的示意图。所示的步骤如下：分离：从血清样品中分离和纯化miRNA；掺入miRNA：将非天然合成miRNA模拟物(具有22个-24个碱基范围内的长度的小单链RNA)添加到样品中以监测包括分离、逆转录、扩大以及qPCR的各个步骤的效率；多重设计：将miRNA测定在计算机中有意分成多个多重组(每组45个-65个miRNA)以使RT和扩大过程期间的非特异性扩增和引物-引物相互作用减到最低限度；多重逆转录：将各种逆转录引物池组合并且添加到不同的多重组中以产生cDNA；扩大：将PCR引物池组合并且添加到每一个由某个多重组产生的cDNA池中并且进行优化的递减PCR以同时提高所述组中所有cDNA的量；单重qPCR：将扩大的cDNA池分配到384孔板的各个孔中，然后进行单重qPCR反应；合成miRNA标准曲线：连同样品一起测量合成miRNA标准曲线以用于所有测量中的绝对拷贝数的插值。

图3示出了所有可靠检测到的miRNA的表达水平热图。热图表示所有可靠检测到的miRNA(表4)；miRNA的表达水平(拷贝数/毫升)是以log2标度呈现的并且相对于零平均值标准化。点的颜色表示浓度。基于欧几里德距离针对两个维度(miRNA和样品)进行分层聚类。对于水平维度，使用各种颜色表示各种类型的受试者。C：对照(无癌症(正常)受试者)；BC：所有乳腺癌受试者；LA：管腔A亚型；HER：Her2亚型；TN：三阴性亚型。

图4示出了三种亚型的乳腺癌受试者之间所有miRNA的表达水平热图。热图表示三种亚型的乳腺癌受试者中所有可靠检测到的miRNA(表4)；miRNA的表达水平(拷贝数/毫升)是以log2标度呈现的并且相对于零平均值标准化。灰度表示miRNA的浓度。基于欧几里德距离针对两个维度(miRNA和样品)进行分层聚类。对于水平维度，使用各种颜色表示各种类型的受试者。LA：管腔A亚型；HER：Her2亚型；TN：三阴性亚型。

图5示出了乳腺癌受试者中受调节的miRNA的表达水平热图。热图表示所有乳腺癌受试者中所有受调节的miRNA(表5，C相比于BC，p值<0.01)；miRNA的表达水平(拷贝数/毫升)是以log2标度呈现的并且相对于零平均值标准化。灰度表示miRNA的浓度。基于欧几里德距离针对两个维度(miRNA和样品)进行分层聚类。对于水平维度：黑色：乳腺癌(BC)受试者；白色：对照(无癌症(正常)受试者)。

图6示出了管腔A亚型乳腺癌受试者中受调节的miRNA的表达水平热图。热图表示管腔A亚型乳腺癌受试者中所有受调节的miRNA(表5，C相比于LA，p值<0.01)；miRNA的表达水平(拷贝数/毫升)是以log2标度呈现的并且相对于零平均值标准化。灰度表示miRNA的浓度。基于欧几里德距离针对两个维度(miRNA和样品)进行分层聚类。对于水平维度：黑色：管腔A亚型乳腺癌受试者；白色：对照(无癌症(正常)受试者)。

图7示出了Her2亚型乳腺癌受试者中受调节的miRNA的表达水平热图。热图表示Her2亚型乳腺癌受试者中所有受调节的miRNA(表5，C相比于HER，p值<0.01)；miRNA的表达水平(拷贝数/毫升)是以log2标度呈现的并且相对于零平均值标准化。灰度表示miRNA的浓度。基于欧几里德距离针对两个维度(miRNA和样品)进行分层聚类。对于水平维度：黑色：Her2亚型乳腺癌受试者；白色：对照(无癌症(正常)受试者)。

图8示出了三阴性亚型乳腺癌受试者中受调节的miRNA的表达水平热图。热图表示三阴性亚型乳腺癌受试者中所有受调节的miRNA(表5，C相比于TN，p值<0.01)；miRNA的表达水平(拷贝数/毫升)是以log2标度呈现的并且相对于零平均值标准化。灰度表示miRNA的浓度。基于欧几里德距离针对两个维度(miRNA和样品)进行分层聚类。对于水平维度：黑色：三阴性亚型乳腺癌受试者；白色：对照(无癌症(正常)受试者)。

图9是箱线图和接受者操作特征曲线图表的组合，示出了正常与乳腺癌之间最高的上调miRNA和下调miRNA。与正常受试者相比，所有乳腺癌受试者中最高的上调miRNA和下调miRNA和第二高(基于AUC)的上调miRNA和下调miRNA的箱线图和接受者操作特征曲线。AUC：接受者操作特征曲线下面积。箱线图呈现了log2标度表达水平(拷贝数/毫升)的分布中的第25个、第50个、以及第75个百分位数。C：对照；LA：管腔A亚型；HER：Her2亚型；TN：三阴性亚型。

图10示出了描绘了乳腺癌的生物标志物之间的重叠的维恩图。这些示意图图示了与对照相比在乳腺癌的各种亚型中差异表达的miRNA的重叠(基于表6)。C：对照；LA：管腔A亚型；HER：Her2亚型；TN：三阴性亚型。

图11示出了散点图和热图，示出了所有可靠检测到的miRNA之间相关性分析的结果。基于log2标度表达水平(拷贝数/毫升)，在所有241种可靠检测到的miRNA靶标(表4)之间计算皮尔森氏线性相关效率。每一个点表示一对miRNA，其中相关效率高于0.5(左图，正相关)或低于-0.5(右图，负相关)。在乳腺癌中差异表达的miRNA在水平维度上被示为黑色。C：对照；LA：管腔A亚型；HER：Her2亚型；TN：三阴性亚型。

图12示出了概述了多变量生物标志物组的鉴定/发现的箱线图。在计算机中四折交叉验证期间的发现和验证阶段中多变量生物标志物组(miRNA的数目＝2个-10个)的诊断能力(AUC)的箱线图。使用线性支持向量机作为模型，基于样品的发现集，使用序列前向浮动搜索来鉴定具有2个至10个miRNA的生物标志物组，并且在样品的另一个独立集中验证。进行多次四折交叉验证。箱线图呈现了用于正常受试者和乳腺癌受试者的分类的AUC中的第25个、第50个、以及第75个百分位数。

图13示出了描绘了计算的多变量生物标志物组的曲线下面积(AUC)值的线图。在交叉验证过程期间在发现集(黑色)和验证集(灰色)中各种多变量生物标志物组的平均AUC。误差棒表示AUC的标准偏差。为了测试当将更多的miRNA包括在组中时验证集中AUC提高的显著性，进行右尾t检验来比较所有相邻的灰色条柱。*：p值<0.05；**：p值<0.01；***：p值<0.001。

图14示出了描绘了5个-10个miRNA的生物标志物组(包括各种数目的高度选择的miRNA)的百分比的柱状图。在搜索过程中所发现的所有5个-10个miRNA的生物标志物组(具有各种数目的高度选择的miRNA(总共44个，表8))的百分比。具有上部10％AUC和下部10％AUC的组被排除在外。

图15以散点图的形式示出了所有被频繁选择的miRNA之间相关性分析的结果。基于log2标度表达水平(拷贝数/毫升)，在44种被频繁选择的miRNA靶标(表8)之间计算皮尔森氏线性相关效率。每一个点表示一对miRNA，其中相关效率高于0.5(黑色，正相关)或低于-0.5(灰色，负相关)。miRNA是基于它们的偏好来排序的(表8)。

图16以热图的形式示出了包括hsa-miR-409-3p的所有5个-10个miRNA的生物标志物组中hsa-miR-382-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-23a-3p、hsa-miR-122-5p的分布。具有hsa-miR-409-3p的所有所选择的5个-10个miRNA的生物标志物组中hsa-miR-382-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-23a-3p以及hsa-miR-122-5p的分布；黑色方块表示生物标志物组中miRNA的存在。百分比表示在所有组中的比例。

定义

如本文所用的术语“miRNA”指的是微小RNA，即小的非编码RNA分子，它们在一些实施例中含有约22个核苷酸，并且存在于植物、动物以及一些病毒中。已知miRNA在RNA沉默和基因表达的转录后调节中具有功能。这些高度保守的RNA通过与特异性mRNA的3'-非翻译区(3'-UTR)结合来调节基因的表达。举例来说，每一种miRNA被认为调节多种基因，并且由于数百种miRNA基因被预测存在于高等真核生物中。miRNA倾向于从基因组中的几个不同的基因座转录。这些基因编码具有发夹结构的长RNA，这些长RNA在由一系列RNA酶III酶(包括Drosha和Dicer)加工时形成在3'末端上具有2个核苷酸突出端的通常约22核苷酸长的miRNA双链体。

如本文所用的术语“调节”指的是细胞响应于外部变量增加或减少细胞组分如RNA或蛋白质的量的过程。细胞组分的增加被称作上调，而细胞组分的减少被称作下调。如本文所用的术语“失调”或“错调”意指上调或下调。下调的实例是细胞中诸如激素或神经递质的分子的受体数目减少，这会降低细胞对所述分子的敏感性。这种现象是局部作用的负反馈机制的实例。上调的实例是当施用诸如二氧杂环己烯的异型生物质分子时肝细胞中细胞色素P450酶的数量增加，从而引起这些分子的更大降解。上调和下调也可以作为对毒素或激素的响应而发生。妊娠中上调的实例是引起子宫中的细胞变得对催产素更敏感的激素。

如本文所用的术语“差异表达”指的是测量细胞组分以与对照或另一个样品相比较，从而确定所述细胞组分的例如浓度、存在或强度的差异。这样的比较的结果可以绝对值给出，即组分存在于样品中而不存在于对照中；或以相对值给出，即组分的表达或浓度与对照相比增加或减少。在这种情况下，术语“增加”和“减少”可以与本公开中也使用的术语“上调”和“下调”互换。

如本文所用的术语“HER”或“Her2”指的是人类表皮生长因子2，它是参与正常细胞生长的人类表皮生长因子受体(HER/EGFR/ERBB)家族的成员。它存在于一些类型的癌细胞中，包括乳腺癌细胞和卵巢癌细胞。可以测试从体内取出的癌细胞中HER2/neu的存在以帮助确定最佳治疗类型。HER2/neu是一种类型的受体酪氨酸激酶。也被称作c-erbB-2、人类EGF受体2、以及人类表皮生长因子受体2。

如本文所用的术语“管腔A”或“LA”指的是根据许多遗传标志物的乳腺癌的亚分类。除了被确定为雌激素受体(ER)阳性、孕激素受体(PR)阳性和/或激素受体(HR)阴性等之外，乳腺癌还可以被确定为管腔A或管腔B。管腔A癌症的临床定义是呈ER阳性和PR阳性，但是呈HER2阴性的癌症。管腔A乳腺癌有可能受益于激素治疗并且也可能受益于化学治疗。管腔B癌症是呈ER阳性、PR阴性以及HER2阳性的癌症。管腔B乳腺癌有可能受益于化学治疗并且可以受益于激素治疗和靶向HER2的治疗。

如本文所用的术语“三阴性”或“TN”指的是已经被测试和发现没有激素表皮生长因子受体2(HER-2)、雌激素受体(ER)、以及孕激素受体(PR)(或呈阴性)的乳腺癌。也已知三阴性癌症被称作“基底样”癌。由于三阴性乳腺癌中的肿瘤细胞没有必要的受体，因此常见的治疗，例如激素治疗和靶向雌激素、孕激素、以及HER-2的药物是无效的。使用化学治疗来治疗三阴性乳腺癌仍是有效的选择方案。实际上，三阴性乳腺癌在更早期的阶段可以比许多其它形式的癌症对化学治疗作出甚至更好的响应。

如本文所用的术语“(统计)分类”指的是基于含有观测结果(或实例)的训练数据集鉴定新观测结果属于一组类别(亚群)中的哪一个的问题，所述类别的类别成员是已知的。实例是如通过所观测到的患者的特征(性别、血压、某些症状的存在或不存在等)所述，为给定的患者指定诊断。在机器学习的术语中，分类被认为是监督学习的一个实例，即其中正确鉴定的观测结果的训练集可供使用的学习。相应的无监督程序被称为聚类，并且涉及基于固有相似性或距离的某个量度将数据分组成类别。常常，将单个观测结果分析为一组可定量的特性，这些特性被不同地称为解释变量或特征。这些特性可以不同地是分类的(例如对于血型来说，“A型”、“B型”、“AB型”或“O型”)、顺序的(例如“大”、“中”或“小”)、整数值的(例如电子邮件中部分词语的出现次数)或实值的(例如血压的测量结果)。其它分类器通过借助于相似性或距离函数将观测结果与先前的观测结果相比较来起作用。执行分类，特别是在具体执行中的算法被称为分类器。术语“分类器”有时也指的是通过分类算法执行的数学函数，它将输入数据映射到类别。

如本文所用的术语“预训练”或“监督(机器)学习”指的是从标记的训练数据推断函数的机器学习任务。所述训练数据可以由一组训练实例组成。在监督学习中，每一个实例是由输入对象(通常是向量)和期望输出值(也被称作监督信号)组成的对。监督学习算法是待训练的算法，分析训练数据并且产生推断的函数，这可以用于映射新的实例。最佳的方案将允许该算法来正确地确定看不见的实例的类标签。这需要学习算法以“合理”的方式从训练数据推广到看不见的情形。

如本文所用的术语“分数”指的是整数或数字，它可以是以数学方式，例如通过使用本领域已知的计算模型(可以包括但不限于SMV作为一个实例)来确定的，并且是使用本领域已知的许多数学方程式和/或算法中的任一种来计算的以实现统计分类的目的。这样的分数用于列举可能结果的范围上的一个结果。这样的分数的相关性和统计显著性取决于用于建立结果范围的基础数据集的大小和质量。举例来说，可以将盲样输入到算法中，进而基于通过分析所述盲样所提供的信息来计算分数。这使得所述盲样的分数产生。基于该分数，可以作出决定，例如产生该盲样的患者患有癌症或没有癌症的可能性如何。范围的端值可以基于所提供的数据在逻辑上限定或根据实验人员的要求任意限定。在这两种情况下，所述范围需要在测试盲样之前被限定。因此，由这样的盲样产生的分数，例如数字“45”可以基于被限定为从1到50的量表的范围表示相应的患者患有癌症，“1”被限定为无癌症并且“50”被限定为患有癌症。

如由国家卫生研究院的国家癌症研究所所描述的乳腺癌分期的说明如下。

0期(原位癌)

有3种类型的原位乳腺癌：原位导管癌(DCIS)是非侵袭性病况，其中在乳腺导管的内层中发现异常的细胞。所述异常细胞没有扩散到导管以外乳腺的其它组织中。在一些情况下，DCIS可以变成侵袭性癌症并且扩散到其它组织。此时，无法知道哪些病变可能变成侵袭性的。原位小叶癌(LCIS)是其中在乳腺的小叶中发现异常细胞的病况。这种病况很少会变成侵袭性癌症。乳头的佩吉特病是其中仅在乳头中发现异常细胞的病况。

1期：在I期中，癌症已经形成。I期被分成IA期和IB期：

在IA期中，肿瘤是2厘米或更小的。癌症没有扩散到乳腺以外。在IB期中，在淋巴结中发现小簇的乳腺癌细胞(大于0.2毫米，但不大于2毫米)并且要么在乳腺中没有发现肿瘤；要么肿瘤是2厘米或更小的。

II期：II期被分成IIA期和IIB期。

在IIA期中：在乳腺中没有发现肿瘤或肿瘤是2厘米或更小的。在1个至3个腋窝淋巴结中或在接近胸骨的淋巴结中发现癌症(大于2毫米)(在前哨淋巴结活检期间发现)；或肿瘤大于2厘米，但不大于5厘米。癌症没有扩散到淋巴结。在IIB期中，肿瘤大于2厘米，但不大于5厘米。在淋巴结中发现小簇的乳腺癌细胞(大于0.2毫米，但不大于2毫米)；或大于2厘米，但不大于5厘米。癌症已经扩散到1个至3个腋窝淋巴结或接近胸骨的淋巴结(在前哨淋巴结活检期间发现)；或大于5厘米。癌症没有扩散到淋巴结。

III期：III期被分成IIIA期、IIIB期以及IIIC期。

在IIIA期中：在乳腺中没有发现肿瘤或肿瘤可以具有任何尺寸。在4个至9个腋窝淋巴结中或在接近胸骨的淋巴结中发现癌症(在成像测试或身体检查期间发现)；或肿瘤大于5厘米。在淋巴结中发现小簇的乳腺癌细胞(大于0.2毫米，但不大于2毫米)；或肿瘤大于5厘米。癌症已经扩散到1个至3个腋窝淋巴结或接近胸骨的淋巴结(在前哨淋巴结活检期间发现)。在IIIB期中：肿瘤可以具有任何尺寸并且癌症已经扩散到胸壁和/或乳腺的皮肤并且引起肿胀或溃疡。而且，癌症可能已经扩散到：多达9个腋窝淋巴结；或接近胸骨的淋巴结。已经扩散到乳腺的皮肤的癌症也可能是炎症性乳腺癌。在IIIC期中，在乳腺中没有发现肿瘤或肿瘤可以具有任何尺寸。癌症可能已经扩散到乳腺的皮肤并且引起肿胀或溃疡和/或已经扩散到胸壁。而且，癌症已经扩散到：10个或更多个腋窝淋巴结；或锁骨上方或下方的淋巴结；或腋窝淋巴结和接近胸骨的淋巴结。

IV期：在IV期中，癌症已经扩散到身体其它器官，最常见是骨、肺、肝或脑。

具体实施方式

假阳性结果的风险在乳房X线照片中屡见不鲜，所述乳房X线照片是全世界乳腺癌筛查程序的常规部分。因此，对癌症的诊断主要依赖于对经由例如细针抽吸(FNA)所获得的样品的组织学分析。因此，需要改进对乳腺癌的检测和早期诊断，从而产生用于早期诊断乳腺癌的微创方法。结合乳房X线照相术使用miRNA来分析乳腺癌的集成多维方法可以提供一种提高诊断准确度的新型方法。为此，本公开包括用于诊断早期阶段的乳腺癌和对乳腺癌受试者的各种亚型和分期进行分类的miRNA生物标志物/生物标志物组的列表和组合。

微小RNA(miRNA)是在基因表达调节中起重要作用的小的非编码RNA，并且异常的表达牵涉到多种癌症的发病。从1993年发现它们以来，已经估计miRNA调节多于60％的所有人类基因中，许多miRNA被鉴定为诸如增殖和细胞凋亡的关键的细胞功能中的关键作用因子。在癌症患者的血清和血浆中发现循环miRNA已经提高了使用循环miRNA作为生物标志物用于多种癌症的诊断、预后、以及治疗决定的可能性。

最近，已经进行各种尝试来鉴定血清或血浆中的循环无细胞miRNA生物标志物以用于对乳腺癌受试者和正常的无癌症受试者进行分类(表1)。

表1：用于乳腺癌的血清/血浆miRNA生物标志物研究的汇总

测量无细胞血清/血浆miRNA或全血的研究被包括在表1中。仅示出了用实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR或qPCR)验证的结果。BC：乳腺癌受试者。C：对照受试者。

许多研究已经显示一些miRNA的表达在癌症受试者中被差异地调节，并且这些研究之间的一致性令人失望是不佳的(表1)。这些研究中缺乏一致性可能是由于许多原因，包括使用小样品量或所研究的样品来源的变异性。包括实验设计和工作流程在内的这些分析前的问题对于生物标志物的发现预计是至关重要的。对于实验设计，迄今为止大部分的研究常常从高通量阵列开始筛选一组有限的样品(n＝10-40)。由于在这些筛选操作中所用的技术的灵敏度以及再现性的限制，通常仅鉴定一小组的靶标(少于10种miRNA)来进行进一步的验证。或者，尝试通过定量聚合酶链反应(qPCR)在更大的一组样品上验证候选miRNA(先前选自文献)。已经证实，在用于miRNA的各种测量平台的性能方面存在显著的差异，并且因此，显著地造成来自各种报道的结果的不一致。因此，迄今为止，在可以用作生物标志物来检测乳腺癌的循环血清/血浆miRNA的类型上没有达成共识。很可能的是，将多变量生物标志物用于乳腺癌将具有高度技术依赖性并且可能在所有平台上都不容易重复。因此，从发现到最终验证生物标志物组，还需要在预先指定的技术平台上构建整个工作流程。

在本公开中，在160个早期阶段(1期-2期，管腔A(LA)、Her2(HER)以及三阴性(TN)亚型)乳腺癌受试者和88个未患乳腺癌健康受试者(对照组)的血清中通过实时定量聚合酶链反应(qPCR)定量约600种miRNA。对于在该研究中所使用的各种所提出的方法所鉴定的miRNA的数目的汇总描述于图1中。

如本公开中所述的miRNA中的任一种的差异比较的结果可以使得所述miRNA的表达状态被称作上调、或下调、或不变或不变。至少一种或多种miRNA的表达状态的组合结果因此使得作出受试者患有乳腺癌、没患乳腺癌或无癌症的诊断。这样的诊断可以是在与对照或第二比较样品相比，特定miRNA表达被认为是上调或下调的基础上作出的。因此，在一个实施例中，所述方法进一步包括测量至少一种miRNA的表达水平，在与对照相比时，所述表达水平在所述受试者中没有发生改变。在另一个实施例中，如本文所述的方法进一步包括测量至少一种miRNA的表达水平，其中与对照相比，如在例如表12中被列为“上调”的miRNA的上调诊断所述受试者患有乳腺癌。在另一个实施例中，与对照相比，如在例如表12中被列为“下调”的miRNA的下调诊断所述受试者患有乳腺癌。在又一个实施例中，本公开描述了一种确定受试者患乳腺癌的风险或确定受试者是否患有乳腺癌的方法，所述方法包括检测从所述受试者获得的体液(或细胞外液)样品中例如hsa-miR-186-5p和/或hsa-miR-409-3p的表达水平；以及确定它与对照相比是上调还是下调，其中例如hsa-miR-186-5p的上调和/或hsa-miR-409-3p的下调表示所述受试者患有乳腺癌或有患乳腺癌的风险。在一个实施例中，所述miRNA包括hsa-miR-186-5p(SEQ ID NO:77)。在另一个实施例中，所述miRNA包括hsa-miR-409-3p(SEQ ID NO:178)。在另一个实施例中，所述miRNA包括hsa-miR-409-3p(SEQ ID NO:178)和hsa-miR-186-5p(SEQ ID NO:77)。在又一个实施例中，所述miRNA包括hsa-miR-382-5p(SEQ ID NO:177)。在又一个实施例中，所述miRNA包括hsa-miR-375(SEQ ID NO:173)。

在又一个实施例中，所述miRNA包括hsa-miR-23a-3p(SEQ ID NO:112)。

在又一个实施例中，所述miRNA包括hsa-miR-409-3p(SEQ ID NO:178)、hsa-miR-382-5p(SEQ ID NO:177)、hsa-miR-375(SEQ ID NO:173)、以及hsa-miR-23a-3p(SEQ IDNO:112)。

在另一个实施例中，本发明涉及一种确定受试者患乳腺癌的风险或确定受试者是否患有乳腺癌的方法，所述方法包括以下步骤：检测从所述受试者获得的体液样品中miRNA的存在；测量所述体液样品中列于例如表13中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种、至少五种或更多种miRNA的表达水平；以及使用基于先前所测量的miRNA的表达水平的分数来预测所述受试者患有或具有乳腺癌的可能性。有可能例如从表12中选择一种miRNA，然后从表11中选择3种miRNA并且从表9中选择另一种miRNA。因此，有可能从如本文所提供的各个表中选择不同数目的miRNA。掌握本公开的本领域技术人员将能够确定哪种组合将有效确定受试者中癌症的存在并且还将知晓所述miRNA中的一些是可互换的。作为一个示例性实例，已经获得来自受试者的样品的本领域技术人员将例如根据本文所公开的方法着手测量从本文所公开的表中选择的6种miRNA。已经进行了测量，在例如所选择的6种miRNA中的一种特定的miRNA的信号不是会产生可靠结果的浓度的情况下，本领域技术人员将能够基于如本文所提供的表选择替代miRNA并且因此将不可读的miRNA与另一种交换。因此，本文公开了许多组合，其中可以使用不同的miRNA组来确定相同的结果，即所述受试者是否患有癌症，以及如果需要的话，所述癌症是什么亚型。

在例如选择5种miRNA，并且其中只有4种产生可行的读数的情况下，本领域技术人员将仍能够基于给予每一种miRNA的显著性来确定受试者是否患有癌症。举例来说，表14列出了(统计学上)显著的miRNA和(统计学上)不显著的miRNA这两者，后者是该表的最后7行。这种将miRNA分成显著的miRNA和不显著的miRNA是基于统计显著性和概率(呈例如p值的形式)，它们是基于统计验证过程而被赋予每一种miRNA，如本文所公开的那样。因此，如果要根据表14测量3种显著的miRNA和2种不显著的miRNA，并且不显著的miRNA的结果是不确定的，那么仍将有可能基于其余3种显著的miRNA来获得统计学上可靠的确定结果。然而，从统计学上讲，正是为了统计稳健性考虑，测量与实际同样多的miRNA以使结果实现所需或期望的可靠性。

在另一个实施例中，所述方法如本文所公开，其中当与对照相比时表达水平在所述受试者中不发生改变的miRNA是如在表14中被列为“不显著”的miRNA中的任一种。在又一个实施例中，本发明涉及一种确定受试者患乳腺癌的风险或确定受试者是否患有乳腺癌的方法，所述方法包括以下步骤：检测从所述受试者获得的体液样品中miRNA的存在；测量所述体液样品中列于例如表14中的至少两种miRNA的表达水平；以及使用基于先前所测量的miRNA的表达水平的分数来预测所述受试者患有或具有乳腺癌的可能性，其中所述列于例如表14中的miRNA之一是hsa-miR-409-3p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-375、或hsa-miR-23a-3p并且其中所述hsa-miR-409-3p、hsa-miR-382-5p、hsa-miR-375、或hsa-miR-23a-3p与对照相比在所述受试者中下调。在又一个实施例中，所述miRNA是hsa-miR-122-5p。

如本公开中所公开的方法中所述的miRNA表达水平的比较包括比较来自从患有癌症的受试者获得的样品的miRNA和对照组的miRNA之间miRNA表达水平。所述对照组被定义为一组受试者，其中所述受试者没有癌症。在另一个实施例中，所述对照组是无癌症组。在一个实施例中，所述对照组是一组受试者，其中所述受试者没有乳腺癌。在另一个实施例中，所述对照组是一组正常的无癌症的受试者。在另一个实施例中，所述对照是选自由未患乳腺癌对照(正常)和乳腺癌患者组成的组的至少一种。

因此本公开包括用于诊断乳腺癌患者的方法，所述方法是通过以下步骤实现的：测量血液(血清)中循环miRNA的水平，例如可以用于对患有和没有早期阶段乳腺癌的受试者进行分类的循环miRNA的列表；和/或可以用于对患有乳腺癌的各种亚型的受试者进行分类的循环miRNA的列表；和/或用于诊断乳腺癌的血清miRNA生物标志物组。

公知的是，癌症是一种在多种基因/途径的表达方面存在异常的异质性疾病。因此，组合多种遗传靶标可以为癌症的诊断、预后、以及治疗决定提供更好的预测。当分析血清/血浆中的循环无细胞靶标，如miRNA时，尤其是这样，其中已知这些miRNA是由多种组织来源所提供，而不是所有这些都是与肿瘤相关的。因此，预期多种miRNA的表达与疾病的相关性比仅使用单个miRNA作为生物标志物提供更多的信息。

在本公开中，miRNA被鉴定为生物标志物以用于开发多变量指数测定，所述测定用于对用于乳腺癌的生物标志物的多维鉴定。这些多变量指数测定由联邦药物管理局定义为如下的测定，所述测定“使用解释函数组合多个变量的值以产生旨在用于诊断疾病或其它病况、或治愈、减轻、治疗或预防疾病的单个患者特异性结果(例如“分类”、“分数”、“指数”等)，并且提供如下的结果，所述结果的推导是不明显的并且不能由最终用户独立地推导或验证”。因此，高度可靠的定量数据是先决条件并且使用现有技术数学工具对于同时确定这些多个变量的相互关系是必要的。

如本文先前所定义的术语“分数”指的是数学分数，它可以使用本领域已知的用于统计分类的目的的多种数学方程式和/或算法中的任一种来计算。这样的数学方程式和/或算法的实例可以是但不限于选自由以下各项组成的组的(统计)分类算法：支持向量机算法、逻辑回归算法、多项逻辑回归算法、费舍尔氏线性判别算法、二次分类器算法、感知器算法、k-最近邻算法、人工神经网络算法、随机森林算法、决策树算法、朴素贝叶斯算法、自适应贝叶斯网络算法、以及组合了多种学习算法的集成学习方法。在另一个实施例中，使用对照的表达水平预训练所述分类算法。在另一个实施例中，所述分类算法将所述受试者的表达水平与对照的表达水平相比较并且返回数学分数，所述数学分数鉴定了所述受试者属于所述对照组中的任一个的可能性。

存在多种用于测量miRNA和miRNA表达的方法，包括但不限于基于杂交的方法，例如微阵列、RNA印迹、生物发光、测序方法以及实时定量聚合酶链反应(qPCR或RT-qPCR)。由于miRNA的小尺寸(约22个核苷酸)，因此提供精确的、可再现的以及准确的定量结果和最高的动态范围的最稳健的技术是qPCR，它目前被认为是通常用于验证其它技术的结果的标准。这样的方法的变化形式是例如数字聚合酶链反应(数字PCR)，它也可以被使用。因此，在一个实施例中，如本文所公开的方法进一步包括测量如表9、表10、表11、表12、或表13中的任一个中所列的至少一种miRNA(miRNA)的表达水平。在另一个实施例中，所述方法测量了如表12或表13中所列的至少一种miRNA的差异表达水平。

本公开论述了在建立miRNA的组中的miRNA的表达水平的差异比较，基于所述miRNA组，可以确定受试者是否有患乳腺癌的风险或确定受试者是否患有乳腺癌。如其中所公开，如本文所公开的方法需要对通常来自不同的组的miRNA表达水平进行差异比较。在一个实施例中，所述比较是在两组之间进行的。这些比较组可以被限定为但不限于乳腺癌、无癌症(正常)。在乳腺癌组内，可以存在进一步的子组，例如但不限于HER、管腔A以及三阴性。差异比较也可以在这些本文所述的任何组中的至少两个之间进行。在一个实施例中，miRNA的表达水平可以被表示为但不限于浓度、log(浓度)、阈值循环/定量循环(Ct/Cq)数、2的阈值循环/定量循环(Ct/Cq)数次方等。

可以根据本公开的方法使用从受试者获得的任何样品，只要所考虑的样品含有核酸序列即可。更确切地说，所述样品将含有RNA。在一个实施例中，所述样品是从可能患有或可能没有癌症的受试者获得的。在另一个实施例中，所述样品是从患有癌症的受试者获得的。在另一个实施例中，所述样品是从无癌症的受试者获得的。在又一个实施例中，所述样品是从未患乳腺癌的受试者获得的。在另一个实施例中，所述样品是从正常的并且未患乳腺癌的受试者获得的。

在所述受试者患有乳腺癌的情况下，所述受试者的乳腺癌可以被归于特定的癌症子集，即乳腺癌亚型可以是但不限于管腔A亚型、HER亚型、三阴性(TN)亚型、基底样/基底亚型或其组合。因此，在一个实施例中，所述方法如本文所述，其中与对照相比，从所述受试者获得的样品中miRNA表达的差异表达表示所述受试者患有选自由以下各项组成的组的乳腺癌亚型中的任一种：管腔A乳腺癌亚型、Her2过表达(HER)乳腺癌亚型以及三阴性(TN或基底)乳腺癌亚型。在另一个实施例中，所述方法如本文所述，其中与对照相比，如在例如表9中被列为“上调”的miRNA的上调诊断所述受试者患有管腔A乳腺癌亚型。在另一个实施例中，与对照相比，如在例如表9中被列为“下调”的miRNA的下调诊断所述受试者患有管腔A乳腺癌亚型。在又一个实施例中，与对照相比，如在例如表10中被列为“上调”的miRNA的上调诊断所述受试者患有HER乳腺癌亚型。在另一个实施例中，与对照相比，如在例如表10中被列为“下调”的miRNA的下调诊断所述受试者患有HER乳腺癌亚型。在另一个实施例中，与对照相比，如在例如表11中被列为“上调”的miRNA的上调诊断所述受试者患有三阴性(TN)乳腺癌亚型。在又一个实施例中，与对照相比，如在例如表11中被列为“下调”的miRNA的下调诊断所述受试者患有三阴性(TN)乳腺癌亚型。

更确切地说，根据本公开的方法所使用的样品预期含有核糖核酸序列。活检样品，例如细针抽吸物(FNA)等可以含有执行如本文所述的方法所需的核糖核酸序列。然而，这样的样品将需要进一步的操作以可根据本文所述的方法使用。此外，基于本文的公开内容，优选的是，使用在性质上不是固体的样品，这是因为本文所述的鉴定方法可能不适用。此外，相比之下，使用本领域已知的方法进行的分析，例如对活检样品的组织学分析容易产生假阳性，这是因为这些组织学分析是由例如组织病理学家进行的，因此在分析样品时导致可能的基于处理人员的偏差。这意味着有可能在组织学分析肿瘤活检样品时，使用相同的分析方法的两个不同的人可能得出不同的结论。因此，本文所述的方法公开了体液或细胞外液的使用。尽管如此，如本文所述的样品可以是但不限于体液样品或细胞外液的样品。体液或细胞外液的细胞组分和非细胞组分的实例是但不限于羊水、乳汁、支气管灌洗液、脑脊髓液、初乳、间质液、腹膜液、胸膜液、唾液、精液、尿液、泪液、全血、血浆、血清血浆、血红细胞、白细胞以及血清。在一个实施例中，所述体液是血清。

具有多层技术控制的良好设计的工作流程使得能够同时可靠和定量测量所有miRNA而使交叉和技术噪音减到最低限度。通过这样的测量，在所有的血清样品中可靠地检测到241种miRNA，其中161种提供信息的miRNA被鉴定为在乳腺癌受试者(不论分期和亚型如何)与正常的无癌症受试者之间发生显著的改变，其中错误发现校正的P值低于0.01。因此，在一个实施例中，所述方法如本文所公开，其中所述方法测量如在例如表12中所列的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少2种到至少20种、至少10种到至少50种、至少40种到至少100种、至少50种到至少150种、至少60种到至少163种、或所有miRNA的差异表达。在另一个实施例中，所述方法测量如在例如表9中所列的miRNA中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少2种到至少20种、至少10种到至少50种、至少40种到至少100种、至少50种到至少134种、或全部的差异表达。在又一个实施例中，所述方法测量如在例如表10中所列的miRNA中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少2种到至少20种、至少10种到至少50种、至少40种到至少100种、至少50种到至少143种、或全部的差异表达。在另一个实施例中，所述方法测量如在例如表11中所列的miRNA中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种、至少10种、至少11种、至少12种、至少13种、至少14种、至少15种、至少2种到至少20种、至少10种到至少50种、至少40种到至少100种、至少50种到至少145种、或全部的差异表达。

本公开还考虑了其中所鉴定和/或测量的miRNA与本公开中所要求保护的miRNA不具有100％同一性的情况。因此，在一个实施例中，所测量的miRNA与在表8、表9、表10、表11、表12、表13或表14中的任一个中所列的miRNA具有至少90％、95％、97.5％、98％、或99％的序列同一性。

在将所有亚型的乳腺癌与正常的无癌症的受试者分层时发现更大数目的miRNA(总共161种)是提供信息的。在集中于将乳腺癌的各种亚型(所述亚型是管腔A(LA)、HER、三阴性(TN))与正常的乳腺组织分层时，分别发现131种miRNA(LA)、141种miRNA(HER)以及143种miRNA(TN)是提供信息的。在这些所鉴定的miRNA中，其中发现80种miRNA在乳腺癌的所有三种亚型的血清中是失调的。然后在计算机中使用多次交叉验证，使用对于241种miRNA的表达所获得的所有定量数据，通过序列前向浮动搜索和支持向量机来制定多变量miRNA生物标志物组。使用至少5种miRNA，在接受者操作特征(ROC)图中被表示为曲线下面积(AUC)时，生物标志物组始终产生≥0.93的值。因此本公开描述了用于在指定的技术平台上检测乳腺癌的新型方法和基于血清的miRNA/miRNA组的组合物这两者。因此，在一个实施例中，所述方法如本文所公开，其中所述乳腺癌。在另一个实施例中，所述乳腺癌处在如由国家卫生研究院的国家癌症研究所所述的任何分期。在又一个实施例中，所述乳腺癌是早期阶段乳腺癌(1期或2期乳腺癌)。

如本文所公开的方法可以用于确定癌症的存在，不论所述癌症的分期如何。如上述定义部分中所提供的癌症分期的定义不仅描述了癌细胞的表型外观和乳腺癌的其它标志，而且还暗示了其中癌症发展的时间线。因此，举例来说，只要是III期癌症，1期癌症就不会存在于受试者中。这对于用于确定受试者中癌症的存在的方法具有启示，这是因为例如活检的一些方法需要对肿瘤组织的阳性组织学鉴定来进行可靠的确定。除此以外，这些诊断方法受到样品量的阻碍或因不得不等待某些生理变化发生而受到阻碍，这需要时间并且在某种程度上导致一些乳腺癌只能在晚期阶段被鉴定，从而可能不利地影响受试者的预后。因此，本公开描述了对癌症的早期检测、以及对乳腺癌的早期阶段的检测。这是因为本领域已知的并且目前用于诊断癌症的方法是基于可能老旧的技术。因此，这些如同本领域技术人员可用的所有技术一样，受到由作为所述方法的基础的技术的物理限制所提供的检测水平的限制。举例来说，有可能浓度相关的方法，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)依赖于所使用的抗体的灵敏度以及样品中分析物的浓度，从而导致假阳性结果被推断出。就如本文所公开的方法来说，miRNA经由各种方法被分泌到血液或其它体液中并且被理解成一旦存在癌细胞，就存在于那些流体中，从而使得能够使用诸如但不限于聚合酶链反应(PCR)和RNA印迹的方法来检测这些miRNA。

本文所公开的miRNA和方法用于对乳腺癌作出早期诊断。因此，作为基于本文所提供的方法的确定的结果，已经使用本文所述的方法被诊断为患有乳腺癌的受试者可以由于所述诊断而接受必要的和相关的药物(例如化学治疗剂)的治疗或被安排必要的治疗方案，例如放射治疗。因此，本发明所公开的方法使得用本领域已知有效治疗乳腺癌的化合物和组合物来治疗被诊断为患有乳腺癌的受试者。因此，在一个实施例中，如本文所公开的方法使得受试者被诊断为患有乳腺癌，其中然后向所述受试者施用如本领域已知的用于乳腺癌的治疗。如本文所公开的方法因此可以使得对乳腺癌进行治疗。

如本文所述的受试者可以是哺乳动物，所述哺乳动物可以是但不限于人类、狗、猫等。在所述受试者是人类的情况下，所述人类的种族可以是但不限于非裔美国人、亚洲人、白种人、欧洲人、西班牙裔以及太平洋岛民。在一个实施例中，所述人类是白种人。

拥有本公开的本领域技术人员将能够实施本发明。提供本发明使用的示例性实例如下：已经获得来自受试者的样品，不知道所述受试者是否患有乳腺癌或是否未患乳腺癌，分析所述样品，并且根据本公开以及如表9至表14中的任一个中所述的一组miRNA确定miRNA的差异表达。然后将该差异表达数据与如本文所提供的表9至表12中所提供的差异表达水平相比较，并且本领域技术人员将理解所述数据。任选地，可以确定另外的数学分数，这还将考虑到与提高所提供的数据集的显著性和准确度有关的另外的统计参数。然后基于该信息，本领域技术人员将能够确定所考虑的受试者是否无癌症或患有癌症。此外，如果发现所述受试者患有癌症，那么基于该信息，本领域技术人员还将能够确定所述受试者是否患有落入如本文所公开的三种癌症亚型中的任一种的癌症。这些是管腔A(LA)、HER2以及三阴性(TN，也被称为基底样)。例如有可能通过选择主要出现于限定特定癌症亚型的miRNA的表中的miRNA来确认受试者是否患有某种类型的癌症亚型。举例来说，如本文所示的表9提供了关于癌症亚型管腔A的受调节的miRNA的数据。因此，如果本领域技术人员主要从该表中选择miRNA，并且调节指示所述受试者患有癌症，则有可能认为所述患者不仅患有癌症，而且所考虑的癌症亚型是管腔A。在参考其它表，例如关于HER癌症亚型的表10和关于三阴性(TN)癌症亚型的表11时，可以得出相同的结论。虽然可能不能确定所述癌症处在什么阶段，这是因为这将需要对活检样品进行组织学分析，但是还将有可能基于如本领域技术人员已知的亚型的临床严重程度来对被确定为患有乳腺癌的受试者作出预后。

本文说明性描述的发明可以在不存在本文没有具体公开的任何一个或多个要素、一个或多个限制条件的情况下被适当地实施。因此，举例来说，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当被宽泛地并且不加限制地解读。此外，本文所用的术语和措辞已经被用作描述性术语而非限制性术语，并且并不意图在使用这些术语和措辞时排除所示的以及所述的特征或其部分的任何等同方案，但应当认识到的是，各种改动方案在要求保护的本发明的范围内是可能的。因此，应当了解的是，尽管已经通过优选的实施方案和任选的特征明确地公开了本发明，但是本文所公开的其中所体现的发明的改动方案和变化方案可以由本领域技术人员所采取，并且这些改动方案和变化方案被认为落入本发明的范围内。

本发明已经在本文中被广泛地并且一般地描述。落入一般性公开内的较缩小内容和亚类分组中的每一个也形成本发明的一部分。这包括以从所述类中去除任何主题的附带条件或负面限制条件来一般性地说明本发明，不论所排除的内容是否在本文被具体地叙述。

其它实施方案落入下列权利要求书和非限制性实施例内。此外，在本发明的特征或方面以马库什组来描述的情况下，本领域技术人员将认识到的是，本发明也因此以马库什组的任何单个成员或成员的子组来描述。

实验部分

I-研究设计

进行良好设计的临床研究(病例对照研究)以确保准确鉴定用于诊断乳腺癌的生物标志物。在该研究中使用平均年龄是57.5岁的总共160名患有乳腺癌的白种女性患者：1期(n＝79)和2期(n＝81)；LA亚型(n＝62)、HER亚型(n＝49)以及TN亚型(n＝49)并且与用作对照组的另外88名年龄匹配的、正常无癌症(健康)白种女性受试者进行比较。所有样品均购自美国病理学家协会(CAP)认可的生物样品库Asterand公司。通过活检确认了所有的癌症受试者并且在任何治疗之前采集血清样品。通过随访确认所有的对照样品均没有任何类型的癌症。所述受试者的详细临床信息列于表2(癌症)和表3(对照)中。在使用之前将所有血清样品储存在-80℃。

表2：乳腺癌受试者的临床信息

160名乳腺癌受试者的临床信息；所有受试者都是白种人和女性。在任何治疗之前采集所有血清并且在使用之前储存在-80℃。空白单元格表示没有进行那些测量。ER：雌激素受体；PR：孕激素受体；her2：人类表皮生长因子受体2；LA：管腔A亚型；HER：Her2亚型；TN：三阴性亚型。

表3：正常(无癌症)受试者的临床信息

88名正常的无癌症的受试者的临床信息；所有受试者都是白种人和女性。所有血清在使用之前储存在-80℃。

血液中循环的无细胞miRNA源自于不同的组织来源。因此，由实体肿瘤的存在所引起的miRNA水平的变化可能由于来自其它来源的相同miRNA的存在而变得复杂。因此，确定在癌症和对照组中所发现的miRNA表达水平的差异将是有挑战性的并且预计不太明显。此外，由于大体积血液(在成年人中是5升)的稀释效应，因此已知大部分无细胞miRNA在血液中有非常低的丰度。因此，从有限体积的血清/血浆样品中准确测量多种miRNA靶标是关键的并且提出了非常显著的挑战。为了最好地促进对显著改变的miRNA表达的发现以及对用于诊断例如早期阶段乳腺癌的多变量miRNA生物标志物组的鉴定，选择使用良好设计的工作流程进行基于qPCR的测定，而不是使用低灵敏度或半定量筛选方法，例如像微阵列或测序。

将所有的反应以单重方式对于miRNA靶进行至少两次并且对于合成RNA‘掺入’对照进行至少四次。为了确保这些高通量定量聚合酶链反应(qPCR)研究中的结果的准确度，设计和建立了用于发现循环生物标志物的稳健的工作流程(图2)。在这一新型工作流程中，使用各种人工设计的‘掺入’对照来监测和校正分离、逆转录、扩大以及定量聚合酶链反应(qPCR)过程中的技术变异。所有的掺入对照均是非天然的合成miRNA模拟物，它们是具有例如约22个至约24个碱基的长度范围的小单链RNA，并且在计算机中被设计成在序列上与所有已知的人类miRNA具有非常低的相似性，从而使与所述测定中所用的引物中的任一种的可能的交叉杂交减到最低限度。此外，miRNA测定在计算机中被有意分成多个多重组以使非特异性扩增和引物-引物相互作用减到最低限度。使用合成miRNA来构建标准曲线以用于所有测量中绝对拷贝数的内插，从而进一步校正技术变异。使用这一具有多个水平的对照的高度稳健的工作流程，有可能可靠地和可再现地鉴定循环中miRNA的低表达水平。

II-miRNA生物标志物

用于鉴定生物标志物的步骤是比较患病状态和正常无癌症状态下每一种miRNA的表达水平。使用上述稳健的工作流程和高灵敏度定量实时聚合酶链反应(qPCR)测定来定量测量所有248个血清样品(乳腺癌样品和非癌正常样品)中578种人类miRNA(根据miRBase)的表达水平。

在实验设计中，对200μL的血清进行提取并且将总RNA逆转录并且通过递减扩增来扩大以增加cDNA的量，但是却不改变miRNA表达水平的表示(图2)。然后稀释扩大的cDNA以进行qPCR测量。基于稀释效应的简单计算揭示在血清中以≤500个拷贝/毫升的水平表达的miRNA将以接近单重qPCR测定的检测限度的水平(≤10个拷贝/孔)被定量。在这样的浓度下，由于技术限制，例如吸移中的误差和qPCR测量的灵敏度，因此测量提出了一个显著的挑战。因此，以≤500个拷贝/毫升的浓度表达的miRNA被排除在分析之外并且被认为在后续的研究中是不可检出的。

发现所测定的总共578种miRNA中有约42％在血清中是高表达的。其中，在多于90％的样品中可靠地检测到241种miRNA(表达水平≥500个拷贝/毫升；表4)。这是比先前所报道的使用其它技术的研究更高数目的miRNA，突出了使用新型实验设计和良好控制的工作流程的重要性。

表4：241种可靠检测到的成熟miRNA的序列

表4列出了已经在血清样品中可靠检测到的241种成熟miRNA。“可靠检测”的定义是至少90％的血清样品具有高于每毫升500个拷贝的浓度的特定miRNA。miRNA是根据miRBase V18版本命名的。

然后构建热图以表示所有241种所检测到的血清miRNA的表达水平(图3)。基于无监督分层聚类，大部分的对照受试者被分组在一起，这表明乳腺癌受试者的血清中的miRNA谱不同于正常无癌症受试者的血清中的miRNA谱。进行更仔细的研究，揭示在所有乳腺癌受试者当中，管腔A(LA)亚型也被分组在一起(图3，水平指示的第二行)。

不包括所有对照受试者，基于所有241种所检测到的血清miRNA构建乳腺癌的三种亚型的热图(图4)以研究乳腺癌的各种亚型之间的差异。基于无监督分层聚类，大部分的管腔A(LA)亚型受试者被明确地聚类在集中区域中，而其它两种亚型在其它区域中混合在一起。那些结果表明管腔A(LA)亚型与其它两种其余亚型(TN和HER)之间在血清miRNA谱方面存在一定的区别。

然后在正常(无癌症)组与乳腺癌组之间比较所述241种血清miRNA的表达水平，由此单个亚型或所有亚型被分组在一起。基于t检验(p值<0.01)计算两组之间差异表达的显著性，所述t检验是使用邦费罗尼型多重比较程序针对错误发现率(FDR)估计进一步校正的。

将来自临床上被确诊为患有乳腺癌亚型(LA亚型、HER亚型或TN亚型)中的任一种的患者的血清分组在一起并且与来自正常(无癌症)供体的血清相比较。注意到各种亚型之间的差异，还在乳腺癌的每一种亚型与正常之间进行比较，这意味着，例如首先将乳腺癌亚型(LA+HER+TN)与正常的无癌症样品相比较。随后，将所述亚型中的每一种与正常的无癌症样品进行单独比较，即LA相比于正常无癌症；HER相比于正常无癌症；以及TN相比于正常无癌症。用于各种比较的显著的miRNA的数目汇总于表5中。

表5：差异表达的miRNA的数目

用于各种形式的比较的差异表达的miRNA的数目；C：对照；LA：管腔A亚型；HER：Her2亚型；TN：三阴性亚型。使用邦费罗尼方法针对错误发现率校正来调整p值。

鉴定出161种在对照与所有癌症之间显示出显著的差异表达(p值<0.01；表6，C相比于BC)的miRNA的池。与其它报道相一致(表1)，本研究证实，与60种下调的miRNA相比，在癌症受试者中更多的miRNA上调(上调miRNA的总数：101种)(表5)。然而，在所述研究中通过qPCR验证的差异表达的miRNA的数目(161种miRNA)显著高于先前所报道(在表6中，C相比于BC，总共63种)。因此，本文所概述的实验设计使得能够鉴定更多的受调节的生物标志物。

表6：对照受试者与乳腺癌受试者之间差异表达的miRNA。

对于在正常(无癌症)受试者与所有乳腺癌受试者(C相比于所有BC)之间、正常(无癌症)受试者与管腔A亚型的乳腺癌受试者(C相比于LA)之间、正常(无癌症)受试者与her2亚型的乳腺癌受试者(C相比于HER)之间、正常(无癌症)受试者与三阴性亚型的乳腺癌受试者(C相比于TN)之间进行的比较，示出了在错误发现率校正(邦费罗尼方法)之后具有低于0.01的p值的那些miRNA。FC(倍数变化)：癌症群体中miRNA的平均表达水平(拷贝数/毫升)除以正常的无癌症群体中miRNA的平均表达水平。BC：乳腺癌；LA：管腔A亚型；HER：Her2亚型；TN：三阴性亚型。调节：在所有比较中与前一组相比后一组的变化方向。具有高于0.01的p值的miRNA被认为没有发生变化(无变化)。

在先前已经报道的总共63种miRNA(表1)中，它们中的三种已经从后期版本的miRBase中去除，另一种miRNA没有在任何版本的miRBase中找到，并且另外三种miRNA在癌症受试者中的变化方向上显示出矛盾的观测结果(hsa-miR-145-5p、hsa-miR-133a、hsa-miR-92a-3p)(表7)。比较先前在表6的C相比于BC中的结果，在其余56种miRNA中，只有16种miRNA(hsa-miR-21-5p、hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-16-5p、hsa-miR-195-5p、hsa-miR-1、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-15a-5p、hsa-miR-214-3p、hsa-miR-25-3p、hsa-miR-29a-3p、hsa-miR-324-3p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-425-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-589-5p、hsa-miR-93-5p)被发现通常上调并且两种miRNA(hsa-miR-199a-5p和hsa-miR-411-5p)被发现通常下调(表7)。所报道的miRNA的其余部分被发现没有变化或在不同的方向上变化。因此，文献中声称的差异调节的miRNA中的大部分在本研究中没有得到确认。有趣的是，所鉴定的143种新型miRNA已经被鉴定为乳腺癌的潜在生物标志物。

表7：当前研究与其它文献报道之间的比较

表4中没有列出的miRNA(表达水平≥500个拷贝/毫升)被认为低于本研究的检测限度(N.D.)。所述miRNA中的一些在miRBase的后期版本中被去除(被示为去除)并且所述miRNA中的一种(miR-196a2)在miRBase(成熟miRNA列表)中没有找到。对于某些miRNA，来自各种文献报道的乳腺癌受试者的变化方向存在矛盾(在表中相应地示为矛盾)。

类似地，当比较对照和乳腺癌的各种亚型时，发现132种miRNA在管腔A(LA)亚型中差异表达，发现141种miRNA在HER亚型中差异表达并且发现143种miRNA在三阴性(TN)亚型中差异表达(表5)。再次，发现比先前所示的miRNA更多的miRNA上调。

使用这组161种生物标志物，在miRNA谱的热图中观测到乳腺癌受试者与无癌症受试者之间更明显的聚类(图5)。观察水平维度，大部分的乳腺癌受试者(黑色)被聚类到离开大部分无癌症受试者朝向图中其余空间的集中区域中。并且在使用显著改变的miRNA来构建热图以在对照与管腔A亚型(图6)、对照与HER亚型(图7)、对照与三阴性亚型(图8)之间进行比较时，观测到甚至更好的分离。几乎所有的癌症受试者被聚类在一起，这强烈地表明了癌症受试者具有不同的miRNA谱。

对于所有亚型，在乳腺癌中排序最高的上调miRNA(hsa-miR-25-3p)和排序第二高的上调miRNA(hsa-miR-186-5p)的AUC值分别是0.86和0.83(图9)。对于所有亚型，在乳腺癌中排序最高的下调miRNA(hsa-miR-409-3p)和排序第二高的下调miRNA(hsa-miR-324-5p)的AUC值仅具有0.81的值(图9)。因此，不受理论所束缚，预期以多变量方式组合多种miRNA将为乳腺癌诊断提供具有增强性能的生物标志物组。

研究管腔A亚型、HER亚型以及三阴性亚型中受调节的miRNA之间的重叠，发现80种miRNA对于所有亚型具有统计显著性，在错误发现率校正之后具有<0.01的p值；56种miRNA在错误发现率校正之后具有<0.001的p值(图10)。这80种miRNA(如表6中所示的前80种miRNA)中的每一种或几种的组合可以在例如多变量指数测定中用作生物标志物或用作生物标志物组以用于诊断早期阶段乳腺癌。

发现miRNA的表达聚类成如图3至图8中所示的热图中所示的子组。每一个集群具有约10种至20种miRNA(图3-图8虚线)。所有可检测的miRNA的分析揭示，基于皮尔森相关效率>0.5，这些miRNA中有许多呈正相关(图11)，特别是在乳腺癌受试者中发生改变的那些miRNA与无癌症受试者中的那些miRNA之间。在图11中，这些miRNA在x轴上朝向x轴的右手侧以黑色示出。该数据因此验证了实体乳腺肿瘤的存在是血清中miRNA水平变化的主要原因的情况。观测结果证实某些miRNA组在所有受试者中被相似地调节。因此，可以通过用另外的miRNA替代一种或多种不同的miRNA来聚集一组miRNA以提高诊断性能。此外，所有显著改变的miRNA都被认为对于乳腺癌的多变量指数诊断测定的开发来说是关键的。

III-搜索多变量生物标志物组

如上文所述，癌症的各种亚型中的每一种存在不同的miRNA谱。聚集这样的多变量组的一个重要的标准是包括来自癌症的每一种亚型的特异性列表的至少一种miRNA以确保所有的癌症子组被覆盖。然而，限定癌症的三种亚型的miRNA并不是完全不同的，这是因为在它们之间类似地发现了相同的miRNA(图10)。同时，大量的与癌症相关或与癌症无关的miRNA被发现呈正相关(图11)，这使得对用于早期乳腺癌诊断的最具统计显著性的miRNA组合的选择成为挑战。

鉴于任务的复杂性，决定使用序列前向浮动搜索算法来鉴定具有最高AUC值的miRNA的组。现有技术线性支持向量机是一种用于构建变量组的良好利用和公认的建模工具，它也用于帮助选择miRNA的组合。所述模型基于说明了每一个成员的表达水平和它们的权重的线性公式得出分数。这些线性模型在临床实践中是容易被接受和应用的。

癌症风险分数的计算

可以组合miRNA形成生物标志物组以根据如下文所示的式1计算癌症风险分数。举例来说，可以将在多变量生物标志物组鉴定过程中被频繁选择的具有普遍性>20％的12种miRNA(例如表8)组合以形成生物标志物组来计算癌症风险分数。此处的公式表明了乳腺癌风险预测的线性模型的使用，其中癌症风险分数(对于每一个受试者来说是独特的)指示了受试者患有胃癌的可能性。这是通过对例如12种miRNA的加权测量值和50的常数进行求和来计算的。

式1：

log₂拷贝数_miRNA_i：12种单个miRNA的对数变换的拷贝数(每毫升血清的拷贝数)。K_i：用于对多个miRNA靶加权的系数。K_i的值是使用支持向量机法优化的并且按比例缩放到0至100的范围。具有低于0的癌症风险分数的受试者将被认为是0并且具有高于100的癌症风险分数的受试者将被认为是100。

作为一个示例性实例，在这些研究中对照受试者和癌症受试者具有基于上文所示的公式计算的不同的癌症风险分数值。对照受试者和癌症受试者的癌症风险分数的拟合概率分布显示可以发现两组之间的明显分离。在这一示例性研究中，对照受试者是选自具有0.0067的患有乳腺癌的概率的高风险群体的非癌症受试者。基于这一先验概率和先前确定的拟合概率分布，未知的受试者患有癌症的概率(风险)可以基于他们的癌症风险分数值来计算。所述受试者的分数越高，患有乳腺癌的风险越高。此外，与例如高风险群体中的癌症发病率相比，癌症风险分数可以例如告知未知的受试者患有乳腺癌的概率(风险)的倍数变化。举例来说，具有70的癌症风险分数的未知高风险受试者将有14.6％的概率患有乳腺癌，这是高风险群体的平均风险的约22倍。

这样的过程成功的关键要求是高质量数据的可用性。在大量明确限定的临床样品中所有所检测到的miRNA的定量数据不仅提高了结果的准确度以及精确度，而且还确保了用于使用定量聚合酶链反应(qPCR)的进一步临床应用的所鉴定的生物标志物组的一致性。

使用大量的临床样品(总共248个)，在建模期间数据过度拟合的潜在问题被减到最低限度，这是因为只有241种候选miRNA要被选出。此外，为了确保结果的真实性，进行多次四折交叉验证以将基于发现集(在每一次折叠时样品的3/4)的所鉴定的生物标志物组的性能在验证样品的独立集(在每一次折叠时样品的剩余1/4)中测试。在交叉验证过程期间，针对亚型和分期匹配样品。

代表结果(即在发现阶段和验证阶段这两者中生物标志物组的AUC)的箱线图示于图12中。AUC值在各个发现集(箱的大小<0.01)中是相当接近的并且它们随着组中miRNA的数目增加而趋于一致(100％AUC)。如所预测，对于每一次搜索，验证集的AUC值降低(0.02-0.05)。尽管在验证阶段中数据的箱的大小更大(指示值的扩展)，但是差值≤0.5AUC值。

结果的更定量的表示示于图13中。尽管在增加生物标志物组中miRNA的数目时在发现阶段中AUC始终逐渐增加，但是当miRNA的数目大于5时，在验证阶段中AUC值没有进一步的提高。因此，产生约0.93的AUC值的5个或更多个miRNA的生物标志物组被认为可用于早期阶段乳腺癌诊断。

IV-多变量miRNA生物标志物组的组成

为了研究多变量生物标志物组的组成，对所有含有5个至10个miRNA的组中miRNA的普遍性进行计数，由此排除具有前10％和后10％的AUC值的组。这样做以避免由于来自由交叉验证分析中的随机化过程所产生的亚群的不准确数据的拟合而包括错误发现的生物标志物。通过排除在少于2％的组中所选择的这些miRNA，在发现过程中选择了总共44种miRNA(表8)，其中还发现这些miRNA中的37种的表达在癌症中显著改变(表6)。发现当来自所述列表的这些miRNA中的至少一种(51.0％)被包括在内时，尽管7种其它miRNA在癌症中没有发生改变，但是它们的包括显著地提高了超过一半的组的AUC值。在没有直接和定量测量所有miRNA靶的情况下，这些miRNA决不会在高通量筛选研究(例如微阵列、测序)中被选择并且将被排除在进一步的定量聚合酶链反应(qPCR)验证之外。

表8：在多变量生物标志物组鉴定过程中所鉴定的miRNA

汇总了被选用于组合具有5个、6个、7个、8个、9个、以及10个miRNA的生物标志物组的miRNA的身份。普遍性是通过所有组中miRNA的计数除以组的总数来定义的。具有前10％AUC和后10％AUC的组被排除以避免由于来自由交叉验证分析中的随机化过程所产生的亚群的不准确数据的拟合而对错误发现的生物标志物进行计数。仅列出超过2％的组中所用的miRNA。乳腺癌的各个分期中miRNA的变化是基于表6来限定的。

被选择以形成多变量组的miRNA(表8)在检测各种癌症亚型方面显示出变异性(表6)。对于列表中具有高于10％的普遍性的前13种频繁选择的miRNA，这些miRNA中只有6种被发现在所有癌症亚型中被共同调节，即hsa-miR-1291、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-378a-5p、hsa-miR-125b-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-409-3p，而其余部分只对于所述亚型中的一种或两种是显著的。在比较用于多变量组的所选择的miRNA和作为诊断标志物的单一miRNA的身份时，它们不一定相同。举例来说，最高下调miRNA(hsa-miR-409-3p)被高度表示(96.6％)，而最高上调miRNA(hsa-miR-25-3p)仅在2.8％的组中被使用(图9)。因此，不可能仅将对于各个分期所鉴定的最佳生物标志物组合以形成最佳的生物标志物组，而是通过审查给出最佳结果的补充信息来形成标志物的组。

在排除了前10％AUC值和后10％AUC值内的那些miRNA之后，所有5个至10个miRNA的生物标志物组均包括来自被频繁选择的列表的至少3种miRNA(表8)，其中93.5％的组包括来自被频繁选择的列表的5种或更多种miRNA(图14)。基于相关性分析，被频繁选择的列表中的许多miRNA彼此相关(图15)。如所论述，这些miRNA可以在生物标志物组中用作彼此的替换物或替代物，并且在交叉验证过程期间的各个循环中被选择。总之，具有来自被频繁选择的列表(表8)的至少5种miRNA的生物标志物组被用于诊断早期阶段乳腺癌。

对具有高于40％的普遍性的前5种被最频繁选择的miRNA(表8)的进一步研究显示，排名最前的一种miRNA，即hsa-miR-409-3p在96.6％的组中被发现，从而强调了这种特定的miRNA的重要性。在包括hsa-miR-409-3p的所有组中后四种miRNA(hsa-miR-382-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-23a-3p以及hsa-miR-122-5p)的分布示于图16中，其中所测试的组中的非常小的一部分被发现没有这些miRNA(0.69％)或具有所有这四种miRNA(2.2％)。对于任何一对miRNA，没有明显的共存或相互排斥的迹象，从而表明了这四种miRNA在提高hsa-miR-409-3p在生物标志物组中的性能方面是同样重要的。因此，最频繁的生物标志物组包括hsa-miR-409-3p和来自hsa-miR-382-5p、hsa-miR-375、hsa-miR-23a-3p以及hsa-miR-122-5p的至少一种miRNA。

单变量分析(t检验)：

发现115种新型miRNA适用于检测管腔A亚型乳腺癌，它们先前没有被报道(表9)，其中与正常的无癌症受试者相比，在癌症患者中73种miRNA上调并且42种miRNA下调。发现125种新型miRNA适用于检测HER2亚型乳腺癌，它们先前没有被报道(表10)，其中与正常的无癌症受试者相比，在癌症患者中78种miRNA上调并且47种miRNA下调。发现125种新型miRNA适用于检测三阴性亚型乳腺癌，它们先前没有被报道(表11)，其中与正常的无癌症受试者相比，在癌症患者中70种miRNA上调并且55种miRNA下调。发现141种新型miRNA适用于检测乳腺癌(不论亚型如何)，它们先前没有被报道(表12)，其中与正常的无癌症受试者相比，在癌症患者中83种miRNA上调并且58种miRNA下调。发现67种新型miRNA适用于检测乳腺癌的所有三种亚型(表9、表10以及表11的重叠)，它们先前没有被报道(表13)。来自所述列表的miRNA中的任一种或其它组合可以用于检测乳腺癌。

表9：在无癌症(正常)与管腔A亚型乳腺癌之间差异表达的新型miRNA。

在正常无癌症与乳腺癌的管腔A亚型之间差异表达(表6，C相比于LA)，但是在其它文献(表1)中没有被报道的miRNA。上调：与没有乳腺癌的对照受试者相比，在乳腺癌受试者中上调。下调：与没有乳腺癌的对照受试者相比，在乳腺癌受试者中下调。FC：倍数变化。

表10：在无癌症(正常)与HER2亚型乳腺癌之间差异表达的新型miRNA。

在正常无癌症与乳腺癌的HER2亚型之间差异表达(表6，C相比于HER)，但是在其它文献(表1)中没有被报道的miRNA。上调：与没有乳腺癌的对照受试者相比，在乳腺癌受试者中上调。下调：与没有乳腺癌的对照受试者相比，在乳腺癌受试者中下调。FC：倍数变化。

表11：在无癌症(正常)与三阴性亚型乳腺癌之间差异表达的新型miRNA。

在正常(无癌症)与乳腺癌的三阴性亚型之间差异表达(表6，C相比于TN)，但是在其它文献(表1)中没有被报道的miRNA。上调：与没有乳腺癌的对照受试者相比，在乳腺癌受试者中上调。下调：与没有乳腺癌的对照受试者相比，在乳腺癌受试者中下调。FC：倍数变化。

表12：在正常与乳腺癌之间差异表达的新型miRNA

在正常与乳腺癌(不论亚型如何)之间差异表达(表6，C相比于所有BC)，但是在其它文献(表1)中没有被报道的miRNA。上调：与没有乳腺癌的对照受试者相比，在乳腺癌受试者中上调。下调：与没有乳腺癌的对照受试者相比，在乳腺癌受试者中下调。FC：倍数变化。

表13：在正常与乳腺癌的所有三种亚型之间差异表达的新型miRNA

在正常与乳腺癌的所有三种亚型(管腔A、HER2以及三阴性)之间差异表达(表6，C相比于LA、C相比于HER、C相比于TN的重叠)，但是在其它文献(表1)中没有被报道的67种新型miRNA。

表14：用于乳腺癌检测的多变量生物标志物组的新型miRNA

被频繁选用于多变量生物标志物组以用于乳腺癌检测(表8)，但是在其它文献(表1)中没有被报道的miRNA的列表。所述miRNA的表达水平在乳腺癌受试者中发生改变(显著的miRNA)或在乳腺癌受试者中没有发生改变(不显著的miRNA)。

多变量生物标志物组搜索：

被频繁选择的新型miRNA中的38种与乳腺癌有关，其中发现与正常的无癌症受试者相比，这些miRNA的表达水平在癌症患者中是不同的(表14，显著的miRNA)。

方法

分析前(样品采集和miRNA提取)：来自正常的无癌症受试者和乳腺癌受试者的血清样品购自商业生物样品库Asterand公司并且在使用之前冷冻储存在-80℃。使用公认的TRI试剂，遵循制造商的方案从200μl的每一个血清样品中分离总RNA。由于血清含有微量的RNA，因此在分离之前将合理设计的分离增强子(MS2)和掺入对照RNA(MiRXES)添加到标本中以减少RNA的损失以及监测提取效率。

实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)：在优化的多重逆转录反应中将分离的总RNA和合成RNA标准品转化成cDNA，其中使用第二组掺入对照RNA来检测抑制剂的存在以及监测聚合酶链反应的效率。遵循制造商的说明书，使用Improm II逆转录酶进行逆转录。然后对合成的cDNA进行多重扩大步骤并且使用基于Sybr Green的单重qPCR测定(符合MIQE；MiRXES)来定量。使用ViiA 7 384实时PCR系统或CFX384 Touch实时PCR检测系统来进行实时定量聚合酶链反应(RT-qPCR)。miRNA RT-qPCR测量工作流程的概述和细节汇总于图2中。

数据处理：处理原始的达到阈值时的循环数(Ct)值并且通过合成miRNA标准曲线的内插/外推来确定每一个样品中靶miRNA的绝对拷贝数。通过掺入对照RNA将在RNA分离和RT-qPCR过程期间所引入的技术变异归一化。对于单一miRNA的分析，进一步通过在所有对照和疾病样品当中稳定表达的一组验证的内源性参考miRNA来将生物变异归一化。

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序列表

<110> 新加坡科技研究局

<120> 用于诊断早期阶段乳腺癌的血清微小RNA生物标志物

<130> 9869SG3738

<160> 241

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-let-7a-5p

<400> 1

ugagguagua gguuguauag uu 22

<210> 2

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-let-7b-3p

<400> 2

cuauacaacc uacugccuuc cc 22

<210> 3

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-let-7b-5p

<400> 3

ugagguagua gguugugugg uu 22

<210> 4

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-let-7d-3p

<400> 4

cuauacgacc ugcugccuuu cu 22

<210> 5

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-let-7d-5p

<400> 5

agagguagua gguugcauag uu 22

<210> 6

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-let-7e-3p

<400> 6

cuauacggcc uccuagcuuu cc 22

<210> 7

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-let-7f-1-3p

<400> 7

cuauacaauc uauugccuuc cc 22

<210> 8

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-let-7f-5p

<400> 8

ugagguagua gauuguauag uu 22

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-let-7g-3p

<400> 9

cuguacaggc cacugccuug c 21

<210> 10

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-let-7g-5p

<400> 10

ugagguagua guuuguacag uu 22

<210> 11

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-let-7i-5p

<400> 11

ugagguagua guuugugcug uu 22

<210> 12

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-1

<400> 12

uggaauguaa agaaguaugu au 22

<210> 13

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-101-3p

<400> 13

uacaguacug ugauaacuga a 21

<210> 14

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-101-5p

<400> 14

caguuaucac agugcugaug cu 22

<210> 15

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-103a-3p

<400> 15

agcagcauug uacagggcua uga 23

<210> 16

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-106b-3p

<400> 16

ccgcacugug gguacuugcu gc 22

<210> 17

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-106b-5p

<400> 17

uaaagugcug acagugcaga u 21

<210> 18

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-107

<400> 18

agcagcauug uacagggcua uca 23

<210> 19

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-10a-3p

<400> 19

caaauucgua ucuaggggaa ua 22

<210> 20

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-10a-5p

<400> 20

uacccuguag auccgaauuu gug 23

<210> 21

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-10b-5p

<400> 21

uacccuguag aaccgaauuu gug 23

<210> 22

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-122-5p

<400> 22

uggaguguga caaugguguu ug 22

<210> 23

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-1226-3p

<400> 23

ucaccagccc uguguucccu ag 22

<210> 24

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-124-5p

<400> 24

cguguucaca gcggaccuug au 22

<210> 25

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-125a-3p

<400> 25

acaggugagg uucuugggag cc 22

<210> 26

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-125b-5p

<400> 26

ucccugagac ccuaacuugu ga 22

<210> 27

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-126-3p

<400> 27

ucguaccgug aguaauaaug cg 22

<210> 28

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-126-5p

<400> 28

cauuauuacu uuugguacgc g 21

<210> 29

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-127-3p

<400> 29

ucggauccgu cugagcuugg cu 22

<210> 30

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-128

<400> 30

ucacagugaa ccggucucuu u 21

<210> 31

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-1280

<400> 31

ucccaccgcu gccaccc 17

<210> 32

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-1285-3p

<400> 32

ucugggcaac aaagugagac cu 22

<210> 33

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-1291

<400> 33

uggcccugac ugaagaccag cagu 24

<210> 34

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-1299

<400> 34

uucuggaauu cugugugagg ga 22

<210> 35

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-130a-3p

<400> 35

cagugcaaug uuaaaagggc au 22

<210> 36

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-130b-3p

<400> 36

cagugcaaug augaaagggc au 22

<210> 37

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-130b-5p

<400> 37

acucuuuccc uguugcacua c 21

<210> 38

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-133a

<400> 38

uuuggucccc uucaaccagc ug 22

<210> 39

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-135a-5p

<400> 39

uauggcuuuu uauuccuaug uga 23

<210> 40

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-136-3p

<400> 40

caucaucguc ucaaaugagu cu 22

<210> 41

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-136-5p

<400> 41

acuccauuug uuuugaugau gga 23

<210> 42

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-139-5p

<400> 42

ucuacagugc acgugucucc ag 22

<210> 43

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-140-3p

<400> 43

uaccacaggg uagaaccacg g 21

<210> 44

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-140-5p

<400> 44

cagugguuuu acccuauggu ag 22

<210> 45

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-141-3p

<400> 45

uaacacuguc ugguaaagau gg 22

<210> 46

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-142-5p

<400> 46

cauaaaguag aaagcacuac u 21

<210> 47

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-143-3p

<400> 47

ugagaugaag cacuguagcu c 21

<210> 48

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-144-3p

<400> 48

uacaguauag augauguacu 20

<210> 49

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-144-5p

<400> 49

ggauaucauc auauacugua ag 22

<210> 50

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-145-5p

<400> 50

guccaguuuu cccaggaauc ccu 23

<210> 51

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-146a-5p

<400> 51

ugagaacuga auuccauggg uu 22

<210> 52

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-146b-5p

<400> 52

ugagaacuga auuccauagg cu 22

<210> 53

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-148a-3p

<400> 53

ucagugcacu acagaacuuu gu 22

<210> 54

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-148a-5p

<400> 54

aaaguucuga gacacuccga cu 22

<210> 55

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-148b-3p

<400> 55

ucagugcauc acagaacuuu gu 22

<210> 56

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-148b-5p

<400> 56

aaguucuguu auacacucag gc 22

<210> 57

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-150-3p

<400> 57

cugguacagg ccugggggac ag 22

<210> 58

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-150-5p

<400> 58

ucucccaacc cuuguaccag ug 22

<210> 59

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-151a-3p

<400> 59

cuagacugaa gcuccuugag g 21

<210> 60

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-151a-5p

<400> 60

ucgaggagcu cacagucuag u 21

<210> 61

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-152

<400> 61

ucagugcaug acagaacuug g 21

<210> 62

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-154-5p

<400> 62

uagguuaucc guguugccuu cg 22

<210> 63

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-15a-3p

<400> 63

caggccauau ugugcugccu ca 22

<210> 64

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-15a-5p

<400> 64

uagcagcaca uaaugguuug ug 22

<210> 65

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-15b-3p

<400> 65

cgaaucauua uuugcugcuc ua 22

<210> 66

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-15b-5p

<400> 66

uagcagcaca ucaugguuua ca 22

<210> 67

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-16-5p

<400> 67

uagcagcacg uaaauauugg cg 22

<210> 68

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-17-3p

<400> 68

acugcaguga aggcacuugu ag 22

<210> 69

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-17-5p

<400> 69

caaagugcuu acagugcagg uag 23

<210> 70

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-181a-2-3p

<400> 70

accacugacc guugacugua cc 22

<210> 71

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-181a-5p

<400> 71

aacauucaac gcugucggug agu 23

<210> 72

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-181b-5p

<400> 72

aacauucauu gcugucggug ggu 23

<210> 73

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-181d

<400> 73

aacauucauu guugucggug ggu 23

<210> 74

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-1825

<400> 74

uccagugccc uccucucc 18

<210> 75

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-183-5p

<400> 75

uauggcacug guagaauuca cu 22

<210> 76

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-185-5p

<400> 76

uggagagaaa ggcaguuccu ga 22

<210> 77

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-186-5p

<400> 77

caaagaauuc uccuuuuggg cu 22

<210> 78

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-18a-3p

<400> 78

acugcccuaa gugcuccuuc ugg 23

<210> 79

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-18a-5p

<400> 79

uaaggugcau cuagugcaga uag 23

<210> 80

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-18b-5p

<400> 80

uaaggugcau cuagugcagu uag 23

<210> 81

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-191-5p

<400> 81

caacggaauc ccaaaagcag cug 23

<210> 82

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-192-5p

<400> 82

cugaccuaug aauugacagc c 21

<210> 83

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-193a-5p

<400> 83

ugggucuuug cgggcgagau ga 22

<210> 84

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-193b-3p

<400> 84

aacuggcccu caaagucccg cu 22

<210> 85

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-194-5p

<400> 85

uguaacagca acuccaugug ga 22

<210> 86

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-195-5p

<400> 86

uagcagcaca gaaauauugg c 21

<210> 87

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-196a-5p

<400> 87

uagguaguuu cauguuguug gg 22

<210> 88

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-196b-5p

<400> 88

uagguaguuu ccuguuguug gg 22

<210> 89

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-197-3p

<400> 89

uucaccaccu ucuccaccca gc 22

<210> 90

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-199a-3p

<400> 90

acaguagucu gcacauuggu ua 22

<210> 91

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-199a-5p

<400> 91

cccaguguuc agacuaccug uuc 23

<210> 92

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-199b-3p

<400> 92

acaguagucu gcacauuggu ua 22

<210> 93

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-19a-3p

<400> 93

ugugcaaauc uaugcaaaac uga 23

<210> 94

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-19b-3p

<400> 94

ugugcaaauc caugcaaaac uga 23

<210> 95

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-200b-3p

<400> 95

uaauacugcc ugguaaugau ga 22

<210> 96

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-200c-3p

<400> 96

uaauacugcc ggguaaugau gga 23

<210> 97

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-205-5p

<400> 97

uccuucauuc caccggaguc ug 22

<210> 98

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-206

<400> 98

uggaauguaa ggaagugugu gg 22

<210> 99

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-20a-5p

<400> 99

uaaagugcuu auagugcagg uag 23

<210> 100

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-20b-5p

<400> 100

caaagugcuc auagugcagg uag 23

<210> 101

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-21-3p

<400> 101

caacaccagu cgaugggcug u 21

<210> 102

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-214-3p

<400> 102

acagcaggca cagacaggca gu 22

<210> 103

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-21-5p

<400> 103

uagcuuauca gacugauguu ga 22

<210> 104

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-219-5p

<400> 104

ugauugucca aacgcaauuc u 21

<210> 105

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-221-3p

<400> 105

agcuacauug ucugcugggu uuc 23

<210> 106

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-221-5p

<400> 106

accuggcaua caauguagau uu 22

<210> 107

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-222-3p

<400> 107

agcuacaucu ggcuacuggg u 21

<210> 108

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-223-3p

<400> 108

ugucaguuug ucaaauaccc ca 22

<210> 109

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-22-3p

<400> 109

aagcugccag uugaagaacu gu 22

<210> 110

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-224-5p

<400> 110

caagucacua gugguuccgu u 21

<210> 111

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-2355-3p

<400> 111

auuguccuug cuguuuggag au 22

<210> 112

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-23a-3p

<400> 112

aucacauugc cagggauuuc c 21

<210> 113

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-23a-5p

<400> 113

gggguuccug gggaugggau uu 22

<210> 114

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-23b-3p

<400> 114

aucacauugc cagggauuac c 21

<210> 115

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-23c

<400> 115

aucacauugc cagugauuac cc 22

<210> 116

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-24-3p

<400> 116

uggcucaguu cagcaggaac ag 22

<210> 117

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-25-3p

<400> 117

cauugcacuu gucucggucu ga 22

<210> 118

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-26a-5p

<400> 118

uucaaguaau ccaggauagg cu 22

<210> 119

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-26b-3p

<400> 119

ccuguucucc auuacuuggc uc 22

<210> 120

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-26b-5p

<400> 120

uucaaguaau ucaggauagg u 21

<210> 121

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-27a-3p

<400> 121

uucacagugg cuaaguuccg c 21

<210> 122

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-27a-5p

<400> 122

agggcuuagc ugcuugugag ca 22

<210> 123

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-27b-3p

<400> 123

uucacagugg cuaaguucug c 21

<210> 124

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-28-3p

<400> 124

cacuagauug ugagcuccug ga 22

<210> 125

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-28-5p

<400> 125

aaggagcuca cagucuauug ag 22

<210> 126

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-299-3p

<400> 126

uaugugggau gguaaaccgc uu 22

<210> 127

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-29a-3p

<400> 127

uagcaccauc ugaaaucggu ua 22

<210> 128

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-29b-2-5p

<400> 128

cugguuucac augguggcuu ag 22

<210> 129

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-29b-3p

<400> 129

uagcaccauu ugaaaucagu guu 23

<210> 130

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-29c-3p

<400> 130

uagcaccauu ugaaaucggu ua 22

<210> 131

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-29c-5p

<400> 131

ugaccgauuu cuccuggugu uc 22

<210> 132

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-301a-3p

<400> 132

cagugcaaua guauugucaa agc 23

<210> 133

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-30a-5p

<400> 133

uguaaacauc cucgacugga ag 22

<210> 134

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-30b-5p

<400> 134

uguaaacauc cuacacucag cu 22

<210> 135

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-30c-5p

<400> 135

uguaaacauc cuacacucuc agc 23

<210> 136

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-30d-3p

<400> 136

cuuucaguca gauguuugcu gc 22

<210> 137

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-30d-5p

<400> 137

uguaaacauc cccgacugga ag 22

<210> 138

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-30e-3p

<400> 138

cuuucagucg gauguuuaca gc 22

<210> 139

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-30e-5p

<400> 139

uguaaacauc cuugacugga ag 22

<210> 140

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-320a

<400> 140

aaaagcuggg uugagagggc ga 22

<210> 141

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-320b

<400> 141

aaaagcuggg uugagagggc aa 22

<210> 142

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-320c

<400> 142

aaaagcuggg uugagagggu 20

<210> 143

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-320d

<400> 143

aaaagcuggg uugagagga 19

<210> 144

<211> 18

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-320e

<400> 144

aaagcugggu ugagaagg 18

<210> 145

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-324-3p

<400> 145

acugccccag gugcugcugg 20

<210> 146

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-324-5p

<400> 146

cgcauccccu agggcauugg ugu 23

<210> 147

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-32-5p

<400> 147

uauugcacau uacuaaguug ca 22

<210> 148

<211> 20

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-326

<400> 148

ccucugggcc cuuccuccag 20

<210> 149

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-328

<400> 149

cuggcccucu cugcccuucc gu 22

<210> 150

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-330-3p

<400> 150

gcaaagcaca cggccugcag aga 23

<210> 151

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-331-5p

<400> 151

cuagguaugg ucccagggau cc 22

<210> 152

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-335-3p

<400> 152

uuuuucauua uugcuccuga cc 22

<210> 153

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-335-5p

<400> 153

ucaagagcaa uaacgaaaaa ugu 23

<210> 154

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-337-3p

<400> 154

cuccuauaug augccuuucu uc 22

<210> 155

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-337-5p

<400> 155

gaacggcuuc auacaggagu u 21

<210> 156

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-338-5p

<400> 156

aacaauaucc uggugcugag ug 22

<210> 157

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-339-3p

<400> 157

ugagcgccuc gacgacagag ccg 23

<210> 158

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-339-5p

<400> 158

ucccuguccu ccaggagcuc acg 23

<210> 159

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-340-5p

<400> 159

uuauaaagca augagacuga uu 22

<210> 160

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-342-5p

<400> 160

aggggugcua ucugugauug a 21

<210> 161

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-34a-5p

<400> 161

uggcaguguc uuagcugguu gu 22

<210> 162

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-34b-5p

<400> 162

uaggcagugu cauuagcuga uug 23

<210> 163

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-361-5p

<400> 163

uuaucagaau cuccaggggu ac 22

<210> 164

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-362-3p

<400> 164

aacacaccua uucaaggauu ca 22

<210> 165

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-362-5p

<400> 165

aauccuugga accuaggugu gagu 24

<210> 166

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-363-3p

<400> 166

aauugcacgg uauccaucug ua 22

<210> 167

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-365a-3p

<400> 167

uaaugccccu aaaaauccuu au 22

<210> 168

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-369-5p

<400> 168

agaucgaccg uguuauauuc gc 22

<210> 169

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-370

<400> 169

gccugcuggg guggaaccug gu 22

<210> 170

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-374a-3p

<400> 170

cuuaucagau uguauuguaa uu 22

<210> 171

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-374a-5p

<400> 171

uuauaauaca accugauaag ug 22

<210> 172

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-374b-5p

<400> 172

auauaauaca accugcuaag ug 22

<210> 173

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-375

<400> 173

uuuguucguu cggcucgcgu ga 22

<210> 174

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-376a-5p

<400> 174

guagauucuc cuucuaugag ua 22

<210> 175

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-378a-3p

<400> 175

acuggacuug gagucagaag g 21

<210> 176

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-378a-5p

<400> 176

cuccugacuc cagguccugu gu 22

<210> 177

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-382-5p

<400> 177

gaaguuguuc gugguggauu cg 22

<210> 178

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-409-3p

<400> 178

gaauguugcu cggugaaccc cu 22

<210> 179

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-411-3p

<400> 179

uauguaacac gguccacuaa cc 22

<210> 180

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-411-5p

<400> 180

uaguagaccg uauagcguac g 21

<210> 181

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-423-5p

<400> 181

ugaggggcag agagcgagac uuu 23

<210> 182

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-424-5p

<400> 182

cagcagcaau ucauguuuug aa 22

<210> 183

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-425-3p

<400> 183

aucgggaaug ucguguccgc cc 22

<210> 184

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-425-5p

<400> 184

aaugacacga ucacucccgu uga 23

<210> 185

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-429

<400> 185

uaauacuguc ugguaaaacc gu 22

<210> 186

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-4306

<400> 186

uggagagaaa ggcagua 17

<210> 187

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-431-5p

<400> 187

ugucuugcag gccgucaugc a 21

<210> 188

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-432-5p

<400> 188

ucuuggagua ggucauuggg ugg 23

<210> 189

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-450a-5p

<400> 189

uuuugcgaug uguuccuaau au 22

<210> 190

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-451a

<400> 190

aaaccguuac cauuacugag uu 22

<210> 191

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-452-5p

<400> 191

aacuguuugc agaggaaacu ga 22

<210> 192

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-454-3p

<400> 192

uagugcaaua uugcuuauag ggu 23

<210> 193

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-454-5p

<400> 193

acccuaucaa uauugucucu gc 22

<210> 194

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-4732-3p

<400> 194

gcccugaccu guccuguucu g 21

<210> 195

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-483-3p

<400> 195

ucacuccucu ccucccgucu u 21

<210> 196

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-483-5p

<400> 196

aagacgggag gaaagaaggg ag 22

<210> 197

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-484

<400> 197

ucaggcucag uccccucccg au 22

<210> 198

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-485-3p

<400> 198

gucauacacg gcucuccucu cu 22

<210> 199

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-485-5p

<400> 199

agaggcuggc cgugaugaau uc 22

<210> 200

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-486-5p

<400> 200

uccuguacug agcugccccg ag 22

<210> 201

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-487b

<400> 201

aaucguacag ggucauccac uu 22

<210> 202

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-491-5p

<400> 202

aguggggaac ccuuccauga gg 22

<210> 203

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-493-5p

<400> 203

uuguacaugg uaggcuuuca uu 22

<210> 204

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-497-5p

<400> 204

cagcagcaca cugugguuug u 21

<210> 205

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-499a-5p

<400> 205

uuaagacuug cagugauguu u 21

<210> 206

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-500a-3p

<400> 206

augcaccugg gcaaggauuc ug 22

<210> 207

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-500a-5p

<400> 207

uaauccuugc uaccugggug aga 23

<210> 208

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-501-5p

<400> 208

aauccuuugu cccuggguga ga 22

<210> 209

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-502-3p

<400> 209

aaugcaccug ggcaaggauu ca 22

<210> 210

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-505-3p

<400> 210

cgucaacacu ugcugguuuc cu 22

<210> 211

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-532-3p

<400> 211

ccucccacac ccaaggcuug ca 22

<210> 212

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-532-5p

<400> 212

caugccuuga guguaggacc gu 22

<210> 213

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-551b-3p

<400> 213

gcgacccaua cuugguuuca g 21

<210> 214

<211> 24

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-573

<400> 214

cugaagugau guguaacuga ucag 24

<210> 215

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-576-5p

<400> 215

auucuaauuu cuccacgucu uu 22

<210> 216

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-584-5p

<400> 216

uuaugguuug ccugggacug ag 22

<210> 217

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-589-5p

<400> 217

ugagaaccac gucugcucug ag 22

<210> 218

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-596

<400> 218

aagccugccc ggcuccucgg g 21

<210> 219

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-616-3p

<400> 219

agucauugga ggguuugagc ag 22

<210> 220

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-616-5p

<400> 220

acucaaaacc cuucagugac uu 22

<210> 221

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-618

<400> 221

aaacucuacu uguccuucug agu 23

<210> 222

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-627

<400> 222

gugagucucu aagaaaagag ga 22

<210> 223

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-629-3p

<400> 223

guucucccaa cguaagccca gc 22

<210> 224

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-629-5p

<400> 224

uggguuuacg uugggagaac u 21

<210> 225

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-650

<400> 225

aggaggcagc gcucucagga c 21

<210> 226

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-651

<400> 226

uuuaggauaa gcuugacuuu ug 22

<210> 227

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-652-3p

<400> 227

aauggcgcca cuaggguugu g 21

<210> 228

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-660-5p

<400> 228

uacccauugc auaucggagu ug 22

<210> 229

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-668

<400> 229

ugucacucgg cucggcccac uac 23

<210> 230

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-720

<400> 230

ucucgcuggg gccucca 17

<210> 231

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-874

<400> 231

cugcccuggc ccgagggacc ga 22

<210> 232

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-885-5p

<400> 232

uccauuacac uacccugccu cu 22

<210> 233

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-92a-3p

<400> 233

uauugcacuu gucccggccu gu 22

<210> 234

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-92b-3p

<400> 234

uauugcacuc gucccggccu cc 22

<210> 235

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-93-3p

<400> 235

acugcugagc uagcacuucc cg 22

<210> 236

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-93-5p

<400> 236

caaagugcug uucgugcagg uag 23

<210> 237

<211> 23

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-96-5p

<400> 237

uuuggcacua gcacauuuuu gcu 23

<210> 238

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-98

<400> 238

ugagguagua aguuguauug uu 22

<210> 239

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-99a-5p

<400> 239

aacccguaga uccgaucuug ug 22

<210> 240

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-99b-3p

<400> 240

caagcucgug ucuguggguc cg 22

<210> 241

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工生物体

<220>

<223> hsa-miR-99b-5p

<400> 241

cacccguaga accgaccuug cg 22

Claims

1.一种确定受试者患乳腺癌的风险或确定受试者是否患有乳腺癌的方法，所述方法包括检测从所述受试者获得的体液样品中hsa-miR-186-5p(SEQ ID NO:77)和/或hsa-miR-409-3p(SEQ ID NO:178)的表达水平；以及确定它与对照相比是上调还是下调，其中hsa-miR-186-5p(SEQ ID NO:77)上调和/或hsa-miR-409-3p(SEQ ID NO:178)下调表示所述受试者患有乳腺癌或有患乳腺癌的风险。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法进一步包括测量表9、表10、表11、表12、或表13中的任一个所列的至少一种另外的微小RNA(miRNA)的表达水平，其中所述另外的微小RNA(miRNA)不同于根据权利要求1所选择的miRNA，并且其中所述上调或下调示于各自的表中。

3.如权利要求2所述的方法，其中所述方法测量表12或表13中所列的至少一种另外的miRNA的差异表达水平。

4.如权利要求3所述的方法，其中与所述对照相比，从所述受试者获得的所述样品中miRNA表达的差异表达表示所述受试者患有乳腺癌。

5.如权利要求4所述的方法，其中与所述对照相比，在表12中被列为“上调”的miRNA的上调诊断所述受试者患有乳腺癌。

6.如权利要求4或5所述的方法，其中与所述对照相比，在表12中被列为“下调”的miRNA的下调诊断所述受试者患有乳腺癌。

7.如权利要求2所述的方法，其中与对照相比，从所述受试者获得的所述样品中miRNA表达的差异表达表示所述受试者患有选自由以下各项组成的组的乳腺癌亚型中的任一种：管腔A乳腺癌亚型、Her2过表达(HER)乳腺癌亚型以及三阴性(TN或基底)乳腺癌亚型。

8.如权利要求7所述的方法，其中与所述对照相比，在表9中被列为“上调”的miRNA的上调诊断所述受试者患有管腔A乳腺癌亚型。

9.如权利要求7或8所述的方法，其中与所述对照相比，在表9中被列为“下调”的miRNA的下调诊断所述受试者患有管腔A乳腺癌亚型。

10.如权利要求7所述的方法，其中与所述对照相比，在表10中被列为“上调”的miRNA的上调诊断所述受试者患有HER乳腺癌亚型。

11.如权利要求7或10所述的方法，其中与所述对照相比，在表10中被列为“下调”的miRNA的下调诊断所述受试者患有HER乳腺癌亚型。

12.如权利要求7所述的方法，其中与所述对照相比，在表11中被列为“上调”的miRNA的上调诊断所述受试者患有三阴性(TN)乳腺癌亚型。

13.如权利要求7或12所述的方法，其中与所述对照相比，在表11中被列为“下调”的miRNA的下调诊断所述受试者患有三阴性(TN)乳腺癌亚型。

14.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述对照是从未患乳腺癌的受试者获得的样品。

15.一种确定受试者患乳腺癌的风险或确定受试者是否患有乳腺癌的方法，所述方法包括以下步骤：

-检测从所述受试者获得的体液样品中miRNA的存在；

-测量所述体液样品中列于表14中的至少两种miRNA的表达水平；以及

-使用基于先前所测量的miRNA的表达水平的分数来预测所述受试者发展或具有乳腺癌的可能性，

其中列于表14中的所述miRNA之一是hsa-miR-409-3p(SEQ ID NO:178)、hsa-miR-382-5p(SEQ ID NO:177)、hsa-miR-375(SEQ ID NO:173)、或hsa-miR-23a-3p(SEQ ID NO:112)，并且其中与对照相比，所述hsa-miR-409-3p(SEQ ID NO:178)、hsa-miR-382-5p(SEQ IDNO:177)、hsa-miR-375(SEQ ID NO:173)、或hsa-miR-23a-3p(SEQ ID NO:112)在所述受试者中下调。

16.如权利要求15所述的方法，其中用于比较所述列于表14中的至少两种miRNA的表达水平的对照是未患乳腺癌受试者。

17.如权利要求15所述的方法，其中所述方法进一步包括测量至少一种另外的miRNA的表达水平，当与对照相比时，所述表达水平在所述受试者中不发生改变。

18.如权利要求17所述的方法，其中在与对照相比时表达水平在所述受试者中不发生改变的所述另外的miRNA是在表14中被列为“不显著”的miRNA中的任一种。

19.如权利要求17或18所述的方法，其中所述另外的miRNA是hsa-miR-122-5p。

20.一种确定受试者患乳腺癌的风险或确定受试者是否患有乳腺癌的方法，所述方法包括以下步骤：

-检测从所述受试者获得的体液样品中miRNA的存在；

-测量所述体液样品中列于表13中的至少一种miRNA的表达水平；以及

-使用基于先前所测量的miRNA的表达水平的分数来预测所述受试者发展或具有乳腺癌的可能性。

21.如权利要求15至20所述的方法，其中所述分数是使用选自由以下各项组成的组的分类算法计算的：支持向量机算法、逻辑回归算法、多项逻辑回归算法、费舍尔氏线性判别算法、二次分类器算法、感知器算法、k-最近邻算法、人工神经网络算法、随机森林算法、决策树算法、朴素贝叶斯算法、自适应贝叶斯网络算法、以及组合了多种学习算法的集成学习方法。

22.如权利要求21所述的方法，其中使用所述对照的表达水平预训练所述分类算法。

23.如权利要求22所述的方法，其中所述对照是选自由未患乳腺癌对照和乳腺癌患者组成的组的至少一种。

24.如权利要求21至23中任一项所述的方法，其中所述分类算法比较所述受试者的表达水平与所述对照的表达水平并且返回数学分数，所述数学分数鉴定所述受试者属于所述对照组中的任一个的可能性。

25.如权利要求15至24中任一项所述的方法，其中所述miRNA的表达水平是浓度、log(浓度)、Ct/Cq数、2的Ct/Cq数次方等中的任一种。

26.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述乳腺癌是早期阶段乳腺癌。

27.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述体液选自由以下各项的细胞组分和非细胞组分组成的组：羊水、乳汁、支气管灌洗液、脑脊髓液、初乳、间质液、腹膜液、胸膜液、唾液、精液、尿液、泪液、全血、血浆、血清血浆、血红细胞、白细胞以及血清。